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Cuantificación y comportamiento de la acrilamida en café Colombiano tipo

excelso según origen y altura de cosecha

Trabajo de grado para optar al título de Magíster en Innovación Alimentaria

y Nutrición

Jeniffer Calderón Giraldo

Química Farmacéutica

Asesor:
Rafael Álvarez Quintero
Químico Farmacéutico, PhD.

Corporación Universitaria Lasallista

Facultad de Ingeniería
Maestría en Innovación Alimentaria y Nutrición
Grupo de Investigación y Desarrollo Colcafé S.A.S
Caldas – Antioquia
2015
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Dedicatoria

“A Dios y a mi Madre”
 3

Agradecimientos

A la Compañía Colombiana de café, Colcafé S.A.S por la financiación del

proyecto, el apoyo técnico y logístico en la consecución del café y en el desarrollo de

las metodologías de análisis. Al área de compras, materia prima, bodega, materiales y

de catación por su colaboración en los distintos procesos.

A mi jefe, Mauricio Naranjo Director de Investigación y Desarrollo, por la

aprobación y apoyo en el desarrollo de esta investigación.

A la Cooperativa de Andes por su gestión y acompañamiento en la ubicación de

las fincas de muestreo y a los amables caficultores, muchas gracias.

Al grupo de Investigación y Desarrollo de Colcafé, especialmente a Nelson

Taborda por su asesoramiento en el tema de tostado y a Ángela Tilano del área de

producción por sus valiosos aportes estadísticos.

Al Dr. Luis Fernando Garcés, Vicerrector de Investigación por su apoyo

incondicional a los estudiantes y a todos los proyectos que soñamos llevar a cabo.

Al profesor Julián Londoño, por sus valiosos aportes académicos y su apoyo en

el proceso de este posgrado y en la realización de la pasantía en La Salle Beauvais.

Al profesor Frédéric Tessier por recibirme en su laboratorio en mi pasantía en La

Salle Beauvais, Francia.

Al Grupo de Investigación en Sustancias Bioactivas por permitirme desarrollar

ciertas pruebas en su laboratorio.

De manera especial quiero agradecer a mi asesor, el profesor Rafael Álvarez por

su acompañamiento y valiosos aportes científicos y a quien he considerado un modelo

a seguir desde la primera clase que recibí… ¡Muchas gracias!

 4

Abreviaturas

3-APA: 3-aminopropionamida

3CQA: 3-cafeoilquinic acid (ácido 3-cafeoilquínico)

4CQA: 4-cafeoilquinic acid (ácido 4-cafeoilquínico)

5CQA: 5-cafeoilquinic acid (ácido 5-cafeoilquínico)

5-HMF: 5-hidroximetilfurfural

ACGS: ácidos clorogénicos

ANOVA: analysis of variance (análisis de varianza)

APCI: atmospheric pressure chemical ionization (ionización química a presión

atmosférica)

Aprox.: aproximadamente

BRC: British Retail Consortium

BSTFA: N,O-bis(trimetillsilil) trifluoroacetamida

CQA: cafeoilquinic acid (ácido cafeoilquínco)

CV: coefficient of varince (coeficiente de variación)

DAD: diode array detector (detector de arreglo de diodos)

EFSA: European Food Safaety Authority

ESI: electrospray ionization (ionización de electro-spray)

FDA: Food and Drug Administration

GC/MS: gas chromatography / mass detector (cromatografía de gases / detector de

masas)

He: helio

HPLC: high performance liquid chromatography

 5

HPLC/MS: high performance liquid chromatography / mass detector (cromatografía

líquida de alta eficiencia / detector de masas)

HPLC/UV: high performance liquid chromatography / ultraviolet visible detector

(cromatografía líquida de alta eficiencia / detector ultravioleta-visible)

IARC: International Agency for Research of Cancer

min: minutos

MRP´s: Maillard reaction products (productos de la reacción de Maillard)

MSD: mass selective detector (detector de masas selectivo)

MTBSTFA: N-tert-Butildimetilsilil-N-metiltrifluoroacetamida

OIC: Organización Internacional del Café

PCA: principal component analysis (análisis de componentes principales)

PFT: polifenoles totales

PLS: partial least squares regression (regresión de mínimos cuadrados parciales)

ppb: partes por billón

rpm: revoluciones por minuto

RSD: relative standar desviation (desviación estándar relativa)

SIM: single ion monitoring (monitoreo de iones individuales)

SNFA: Swedish National Food Administration

SPE: solid phase extraction (extracción en fase sólida)

T&M: tostado y molido

UHPLC/MS: ultra high performance liquid chromatography / mass detector

(cromatografía líquida de ultra alta eficiencia / detector de masas)
 6

Tabla de contenido

Resumen ...................................................................................................................... 13

Introducción ................................................................................................................ 14

Interés y motivación del estudio ................................................................................ 17

Objetivos ...................................................................................................................... 18
Objetivo general ......................................................................................................... 18
Objetivos específicos ................................................................................................. 18

Marco teórico ............................................................................................................... 19

Café............................................................................................................................ 19
Café tipo excelso ..................................................................................................... 20
Importancia del origen del café en su expresión metabólica y calidad ....................... 21
Reacción de Maillard como origen del sabor y el aroma del café .............................. 23
Acrilamida .................................................................................................................. 25
Acrilamida y café ..................................................................................................... 31
Acrilamida e industria del café:............................................................................. 32

Capítulo 1: Caracterización de la materia prima....................................................... 34

Materiales y métodos ................................................................................................. 36
Material vegetal ....................................................................................................... 36
Preparación de la muestra: molienda y extracción .................................................. 37
Parámetros fisicoquímicos ...................................................................................... 37
Contenido de polifenoles totales (PFT) ................................................................... 38
Contenido de ácidos clorogénicos (ACGS) ............................................................. 38
Contenido de L-α-aminoácidos ............................................................................... 39
Contenido de azúcares reductores.......................................................................... 41
Análisis estadístico .................................................................................................. 42
Resultados y discusión............................................................................................... 43
Caracterización de la materia prima ........................................................................ 43

Capítulo 2: Cuantificación de la acrilamida en el café tostado y molido:

evaluación de su comportamiento ............................................................................ 59
Materiales y métodos ................................................................................................. 61
 7

Tostado de la materia prima .................................................................................... 61

Caracterización de la muestra: molienda, extracción y determinación de los
parámetros fisicoquímicos ....................................................................................... 61
Perfil sensorial de las muestras............................................................................... 63
Contenido de polifenoles totales y ácidos clorogénicos .......................................... 63
Contenido de L-α-aminoácidos residuales y azúcares reductores residuales ......... 63
Desarrollo y validación de una nueva metodología analítica por GC/MS para la
cuantificación de acrilamida .................................................................................... 63
Preparación de la muestra: .................................................................................. 64
Validación de la metodología analítica: ................................................................ 65
Concentración mínima detectable (Límite de detección)................................... 65
Concentración mínima cuantificable (Límite de cuantificación). ........................ 65
Linealidad. ......................................................................................................... 66
Precisión............................................................................................................ 66
Exactitud............................................................................................................ 67
Selectividad / Especificidad. .............................................................................. 68
Análisis estadístico .................................................................................................. 69
Resultados y discusión............................................................................................... 70
Cuantificación de la acrilamida en el café tostado y molido: evaluación de su
comportamiento....................................................................................................... 70

Conclusiones ............................................................................................................... 97

Perspectivas y recomendaciones ............................................................................ 100

Referencias bibliográficas........................................................................................ 101

Apéndices .................................................................................................................. 113

 8

Listado de tablas

Tabla 1. Composición química promedio del grano de café según especie (base seca).
...................................................................................................................................... 20

Tabla 2. Codificación de la materia prima y parámetros de inspección. ....................... 37

Tabla 3. Condiciones cromatográficas para la cuantificación de L-α-aminoácidos en

café por GC/MS-SIM. .................................................................................................... 40

Tabla 4. Condiciones cromatográficas para la cuantificación de azúcares reductores en

café por GC/MS-SIM. .................................................................................................... 42

Tabla 5. Parámetros fisicoquímicos de la materia prima. ............................................. 44

Tabla 6. Contenido de polifenoles totales y ácidos clorogénicos en la materia prima. . 45

Tabla 7. Contenido de L-α-aminoácidos en la materia prima........................................ 46

Tabla 8. Contenido de azúcares reductores en la materia prima. ................................. 47

Tabla 9. Parámetros de ANOVA para diferencias significativas en materia la prima. ... 50

Tabla 10. Matriz de correlaciones para la materia prima. ............................................. 54

Tabla 11. Niveles de tostado y codificación de las muestras. ....................................... 62

Tabla 12. Condiciones cromatográficas para la cuantificación de acrilamida en café

tostado y molido. ........................................................................................................... 65

Tabla 13. Distribución de concentraciones en seis niveles de las curvas de calibración

de acrilamida. ................................................................................................................ 66

Tabla 14. Parámetros fisicoquímicos del café tostado y molido. .................................. 72

Tabla 15. Contenido de azúcares reductores y L-α-aminoácidos en el café tostado y

molido............................................................................................................................ 74

Tabla 16. Contenido de polifenoles totales, ácidos clorogénicos y perfil sensorial

(impresión global) del café tostado y molido. ................................................................ 76

Tabla 17. Resultados de validación para el método de acrilamida. .............................. 80

Tabla 18. Parámetros de ANOVA para diferencias significativas de efectos principales

e interacciones de orden 2 en café tostado y molido. ................................................... 86

Tabla 19. Matriz de correlaciones para el café tostado y molido. ................................. 89

 9

Tabla 20. Análisis PLS para café de tostado bajo. ....................................................... 92

Tabla 21. Análisis PLS para café de tostado medio...................................................... 93

Tabla 22. Análisis PLS para café de tostado alto. ........................................................ 95

 10

Listado de figuras

Figura 1. Adaptación de las etapas de la reacción de Maillard por van Boekel, 2006,
231. ............................................................................................................................... 24

Figura 2. Adaptación de los mecanismos de la formación de acrilamida propuestos por

Medeiros Vinci et al., 2012, 1139. ................................................................................. 27

Figura 3. Gráfica de puntuación (PCA) en la materia prima para todos los parámetros
cuantificados. ................................................................................................................ 48

Figura 4. Gráfica de cargas (PCA) en la materia prima para todos los parámetros
cuantificados. ................................................................................................................ 49

Figura 5. Gráficas de efectos principales para los parámetros con diferencias

significativas en la materia prima. ................................................................................. 51

Figura 6. Gráfica de puntuación (PCA) para los aminoácidos y azúcares en la materia

prima. ............................................................................................................................ 52

Figura 7. Gráfica de cargas (PCA) para los aminoácidos y azúcares en la materia

prima. ............................................................................................................................ 52

Figura 8. Cromatograma (SCAN-SIM) acrilamida y propionamida. .............................. 68

Figura 9. Contenido de acrilamida en las muestras de café T&M. ............................... 81

Figura 10. Gráfica de puntuación (PCA) en el café tostado y molido para todos los
parámetros cuantificados. ............................................................................................. 83

Figura 11. Gráfica de cargas (PCA) en el café tostado y molido para todos los
parámetros cuantificados. ............................................................................................. 84

Figura 12. Gráfica de efectos principales para la acrilamida. ....................................... 88

Figura 13. Gráfica de predictores para la formación de acrilamida con 1) L-glicina, 2) L-

valina, 3) L-leucina, 4) L-5-oxoprolina, 5) L-metionina, 6) L-treoina, 7) L-asparagina para
café de tostado bajo. ..................................................................................................... 92

Figura 14. Gráfica de respuesta de los predictores para la formación de acrilamida en

café de tostado bajo. ..................................................................................................... 93

Figura 15. Gráfica de predictores para la formación de acrilamida con 1) L-glicina, 2) L-

valina, 3) L-leucina, 4) L-5-oxoprolina, 5) L-metionina, 6) L-treoina, 7) L-asparagina para
café de tostado medio. .................................................................................................. 94
 11

Figura 16. Gráfica de respuesta de los predictores para la formación de acrilamida en

café de tostado medio. .................................................................................................. 94

Figura 17. Gráfica de predictores para la formación de acrilamida con 1) L-glicina, 2) L-

valina, 3) L-leucina, 4) L-5-oxoprolina, 5) L-metionina, 6) L-treoina, 7) L-asparagina para
café de tostado alto. ...................................................................................................... 95

Figura 18. Gráfica de respuesta de los predictores para la formación de acrilamida en

café de tostado alto. ...................................................................................................... 96
 12

Apéndices

Apéndice A. Matriz de correlación para la materia prima........................................... 113

Apéndice B. Matriz de correlación para el café tostado y molido. .............................. 115

Apéndice C. Calificación sensorial muestras Finca 1................................................. 116

Apéndice D. Calificación sensorial muestras Finca 2................................................. 117

Apéndice E. Calificación sensorial muestras Finca 3. ................................................ 118

 13

Resumen

El origen geográfico del café tiene incidencia directa sobre su desarrollo y

expresión metabólica, lo que a su vez afecta la calidad de la materia prima y del

producto final. Sus metabolitos precursores de colores, aromas y sabores son

transformados mediante reacciones químicas que ocurren principalmente en el proceso

de tostado, destacándose la reacción de Maillard la cual utiliza aminoácidos y azúcares

reductores como precursores de condensación para dar compuestos neoformados

relacionados con el flavor y otros como la acrilamida que ha sido catalogada como

“probablemente cancerígena” por la IARC. El café es un producto de consumo masivo

a nivel global adaptado a la dieta humana y del cual se recibe cierta cantidad de

acrilamida, lo que es de preocupación para la salud pública mundial. Por lo tanto esta

investigación está enfocada en tratar de elaborar un café con bajos niveles de

acrilamida para lo que fue necesario el desarrollo y validación de una nueva

metodología analítica para su cuantificación mediante GC/MS. En el desarrollo de la

investigación se pudieron establecer correlaciones entre el origen del café, el grado de

tostado y la expresión metabólica con la producción de acrilamida. Se determinó que

existen diferencias significativas (p<0,05) entre los contenidos de L-5-oxoprolina, L-

serina, L-ácido glutámico, D-(+)-ribosa y el pH entre las materias primas procedentes

de las diferentes alturas, y que los niveles de los precursores influyen sobre los

contenidos de acrilamida, la cual también cambia por efecto de la altura y el grado de

tostado. Por último se propone un modelo preliminar con capacidad predictiva sobre la

producción de acrilamida a partir de un grupo de aminoácidos en café verde.

 14

Introducción

Las materias primas vegetales empleadas en la elaboración de alimentos

difieren ampliamente en términos de especie, procedencia y calidad; como

consecuencia de ello presentan una variable composición química que resulta, con la

combinación de los procesos industriales, en el desarrollo de diferentes características

organolépticas y nutricionales (Masson, Liberto, Brevard, Bicchi, & Rubiolo, 2014, 143).

El café no es una excepción a este suceso, pues numerosos autores han

establecido que su lugar y altura de cosecha, prácticas agrícolas y pos-cosecha,

influyen en la cantidad y desarrollo de matabolitos de actividad biológica, los que a su

vez sufren una serie de transformaciones químicas a través de su proceso industrial,

principalmente en el tostado (Avelino et al., 2005, 1869; Barbosa et al., 2012, 181; B

Bertrand et al., 2012, 2575; Decazy et al., 2003, 2356; Joët et al., 2010, 2575; Oliveira,

Franca, Glória, & Borges, 2005, 287).

El tostado del café es el momento en el que una cadena de reacciones químicas,

principalmente la reacción de Maillard, da origen al desarrollo de los compuestos que

se expresan en su agradable color, aroma y sabor, pero lastimosamente, es en este

mismo proceso donde también se expresan ciertas sustancias no deseadas y

catalogadas como potencialmente perjudiciales para la salud, como es el caso de la

acrilamida.

La acrilamida es un compuesto con un amplio espectro de efectos tóxicos según la

IARC, la cual en el año de 1994 la clasificó como 2A o “probablemente cancerígena

para los humanos” (IARC, 1994, 389), pero solo hasta abril de 2002 (Claus et al., 2008,
 15

119) científicos suecos con el apoyo de investigadores de la Universidad de Estocolmo

alertaron sobre los altos niveles de acrilamida que superaban en algunos casos las

1000 ppb en productos alimenticios que sufren procesos térmicos por encima de los

100°C, como el tostado del café el cual se lleva a cabo a temperaturas entre los 150-

250 °C a las que la acrilamida cuenta con las condiciones óptimas para su formación.

El café es una de las bebidas de mayor consumo a nivel mundial y el producto

agrícola de mayor exportación en Colombia donde según cifras de la Federación

Nacional de Cafeteros y la OIC, para el año 2014 se alcanzaron los 10.954 mil sacos

de 60Kg de café exportados en todas sus presentaciones, principalmente a Estados

Unidos y países europeos los cuales vienen trabajando arduamente desde el 2002 en

la investigación de esta sustancia mediante constantes monitoreos por parte de la

EFSA (EFSA, 2015a, 2015b; “No Title,” n.d., 1-48; States, Ferrari, Busk, & Doerge,

2010, 1-30; The, Of, & Commission, 2013, 1-2; Valsta, Pesci, Wenzl, & Doerge, 2011,

1-6), por lo que no es de extrañar que se esté planteando la posibilidad de implementar

una legislación a cerca de los niveles máximos permisibles de acrilamida en café,

abriendo la posibilidad a que nuestras exportaciones se vean seriamente afectadas. En

Colombia, existe el documento “concepto de acrilamida en panela” (Social, 2012, 5-37)

y en el año 2015 se elaboró el “Plan nacional subsectorial de vigilancia y control de

acrilamida para el año 2015”, en el cual se estratifica el País por zonas de muestreo de

aquellos alimentos que contienen mayores niveles de acrilamida, esperándose que

cuando el estudio concluya y se tengan resultados, se emita el comunicado sobre el

posible riesgo y probablemente una ley teniendo en cuenta la recomendación

2013/647/UE del 08 de noviembre de 2014 (Alimentos & El, 2015, 1-9).

 16

Debido a lo anteriormente descrito, se hace necesaria la implementación de

medidas estratégicas que nos permitan tener herramientas con las cuales podamos

estar preparados para las exigencias de los mercados nacionales e internacionales,

contando con un producto que siga siendo competitivo, sin que se vean afectadas sus

bondades como el contenido de sustancias antioxidantes y sin olvidar que Colombia es

un país cafetero desde el punto de vista económico hasta el socio-cultural.

En ese sentido, este proyecto de investigación pretende identificar si hay

correlación entre los parámetros: origen y altura de cosecha, sustancias precursoras,

sustancias antioxidantes y grado de tostado en la formación de acrilamida. Igualmente,

se plantea llevar a cabo el estudio en café tipo excelso, el cual es nuestra variedad de

mayor exportación a nivel internacional y mediante el desarrollo in house de una nueva

metodología analítica por GC/MS.

 17

Interés y motivación del estudio

Aunque son muchos los estudios llevados a cabo sobre acrilamida, a la fecha en

Colombia no se cuenta con mayor información al respecto de esta sustancia en

ninguna matriz alimenticia, incluido el café, nuestro producto insignia. Es por ello que

esta investigación pretende encontrar si existe alguna correlación entre los niveles de

acrilamida formados con la región y altura de cosecha de un café Colombiano tipo

excelso y con los niveles de sustancias precursoras en su formación, así como con las

principales sustancias antioxidantes del café. Para lograr lo anterior se hace necesario

el desarrollo y la validación de una metodología analítica por GC/MS para la

cuantificación de acrilamida, previa caracterización de la materia prima antes de ser

sometida a tres grados diferentes de tostado. Adicionalmente, los resultados derivados

de este estudio nos permitirán contar con nuevo conocimiento y con herramientas para

la toma de decisiones a la hora de elaborar y exportar un producto de alta calidad,

apuntando siempre a la reducción del contenido de acrilamida ya que en el País, a la

fecha, no se han reportado estudios de este tipo.

 18

Objetivos

Objetivo general

Evaluar el comportamiento de la acrilamida formada durante el proceso de

tostado de café tipo excelso proveniente de diferentes alturas en una región del País,

mediante su cuantificación por GC/MS.

Objetivos específicos

Caracterizar las muestras de café verde mediante la cuantificación de los

precursores de acrilamida, y cuantificar los posibles remanentes en el café tostado.

Evaluar tres tipos de tostado (bajo, medio y alto), y establecer la posible relación

con la formación y el comportamiento de la acrilamida en el café según altura y origen

de cosecha.

Desarrollar y validar una nueva metodología analítica por GC/MS para la

identificación y cuantificación de acrilamida formada durante el proceso de tostado del

café.
 19

Marco teórico

Café

El café es el segundo commodity más comercializado del mundo después del

petróleo; es producido y exportado por más de 60 naciones siendo Brasil, Vietnam,

Colombia e Indonesia sus mayores productores (Outline, 2008, 33). El café es un árbol

perenne perteneciente a la familia Rubiaceae y cuenta con un solo tronco principal y

ramas horizontales en las que se albergan flores y sus frutos comúnmente llamados

“cereza”, los cuales, en condiciones tropicales aparecen en paralelo. A pesar de que

existen más de 100 especies, únicamente dos de ellas, la Coffea arabiga conocida

como café arábiga y la Coffea canephora conocida como café robusta se emplean en la

producción de la bebida (S. Oestreich-Janzen, Gmbh, 2010, 4). La composición

química promedio de ambas especies se ilustra a continuación (Tabla 1) (Farah, 2012,

28; Puerta, 2011, 3).

 20

Tabla 1. Composición química promedio del grano de café según especie (base
seca).
Arábiga Robusta
Componente químico
g/100g
Carbohidratos/Fibra
Sacarosa 6,0-9,0 0,9-4,0
Azúcares reductores 0,1 0,4
Polisacáridos 34,0-44,0 48,0-55,0
Lignina 3 3
Pectina 2 2
Compuestos nitrogenados
Proteína/péptidos 10,0-11,0 11,0-15,0
Aminoácidos libres 0,5 0,8-1,0
Cafeína 0,9-1,3 1,5-2,5
Trigonelina 0,6-2,0 0,6-0,7
Lípidos
Triglicéridos 15,0-17,0 7,0-10,0
Diterpenos (libres y esterificados) 0,5-1,2 0,2-0,8
Minerales 3,0-4,2 4,4-4,5
Ácidos y esteres
Ácidos clorogénicos 4,1-7,9 6,1-11,3
Ácidos alifáticos 1 1
Ácidos quínicos 0,4 0,4
Compuestos aromáticos trazas trazas

Café tipo excelso

El café excelso es conocido como el de más alta calidad; el Comité Nacional de

Cafeteros lo ha descrito de la siguiente manera: “compuesto de grano grande,

principalmente plano, parejo, retenido por encima de malla catorce (14), con tolerancia

del uno punto cinco (1,5) por ciento (%) inferior a esa malla, pero retenido por la malla

doce (12), de esmerado beneficio y debidamente seleccionado. En todo caso este café

debe tener por lo menos un cincuenta (50) por ciento (%) de granos retenidos sobre la

malla quince (15), de acuerdo con lo previsto en las normas de la Green Coffee

Association of New York City, Inc.” (Hospitalarios, 2002).

 21

Importancia del origen del café en su expresión metabólica y calidad

El sabor y frescura de una taza de café es el resultado final de la expresión de

una larga cadena que ocurre entre la semilla y la bebida final. Las semillas de café

contienen todos los precursores necesarios para generar el aroma durante su proceso

de tostado tales como polisacáridos, lípidos, aminoácidos, proteínas y ácidos

clorogénicos, entre otros, los cuales juegan un papel crucial en su compleja química.

Por ejemplo, los aminoácidos y proteínas son esenciales para la conversión de

azúcares en precursores de aromas vía reacción de Maillard, los ácidos clorogénicos y

la cafeína son los responsables de la acidez, etc.

Numerosos estudios han demostrado que ciertos factores como las condiciones

climáticas, la composición del suelo, la temperatura media, la pluviosidad, las

condiciones lumínicas, la altura de siembra, las prácticas agrícolas y pos-cosecha,

influyen en la composición química de la semilla (Decazy et al., 2003, 2356; Joët et al.,

2010, 2575).

Por ejemplo, la sombra y la altitud tienen influencias dramáticas en la frescura

del ambiente, lo cual tiene efectos positivos para el café, pues esta condición retarda el

proceso de maduración aproximadamente un mes, lo que se traduce en la acumulación

de mayores precursores del aroma; también, cafés que son cultivados a mayores

alturas suelen acumular un mayor contenido de ácidos clorogénicos (Avelino et al.,

2005, 1869). Se ha reportado que cafés cultivados en suelos volcánicos producen

bebidas de mayor acidez, las cuales son muy apetecidas en ciertos públicos; así mismo

se ha reportado que la distribución de la luz solar tiene una fuerte influencia en la

 22

floración, la expansión del grano, la madurez, el contenido de azúcares, trigonelina y

ácidos clorogénicos aumentando la astringencia de la bebida, y aunque la sombra

puede reducir hasta en un 20% la productividad del árbol, esta condición es positiva en

la conservación y tamaño del grano (Benoit Bertrand et al., 2006, 1239-1240).

Los compuestos volátiles responsables del agradable aroma del café son

metabolitos secundarios como isoprenoides, fenilpropanoides, aminoácidos y ácidos

grasos; de los casi 300 que hacen parte del grano verde, cerca de 200 están presentes

aún luego del proceso de tostado y hoy en día se conoce que sus proporciones varían

según la altura de cosecha, por lo que investigadores han estudiado como la elevación,

los gradientes de temperatura y condiciones de suelo afectan el desarrollo de estos

volátiles, incidiendo de manera directa en la calidad del café (B Bertrand et al., 2012,

2575, 2576; Kwon et al., 2015, 67).

También se ha demostrado como la variedad del café influye sobre la expresión

metabólica del mismo, y esta a su vez, sobre la calidad de la materia prima y el

producto final. Se sabe que la variedad arábiga contiene más azúcares y trigonelina,

pero menos cafeína y ácidos clorogénicos que la robusta, siendo esta última muy

cultivable a bajas alturas debido a su fuerte resistencia contra enfermedades (Kwon et

al., 2015, 66).

 23

Reacción de Maillard como origen del sabor y el aroma del café

El agradable color, aroma y sabor de una bebida de café, tienen su origen en

una reacción química: la reacción de Maillard, que puede considerarse como una de las

más importantes durante el procesamiento de los alimentos que son sometidos a

procesos térmicos como el tostado. Esta tiene una influencia directa no solo en sus

propiedades organolépticas, sino también en sus propiedades nutricionales y

fisicoquímicas. La reacción de Maillard (Figura 1), resume todas las reacciones

químicas que ocurren entre los aminoácidos y los azúcares para formar los compuestos

que dan esa tonalidad oscura y agradable aroma al café. Esta reacción se divide

usualmente en las etapas de condensación entre el azúcar y el grupo amino, re-arreglo

del producto de Amadori y la ciclación y polimerización, y se ve afectada por

parámetros del proceso como la temperatura, el pH, la actividad acuosa, el tipo y la

disponibilidad de los reactantes, entre otros (Jaeger, Janositz, & Knorr, 2010, 207;

Rufián-Henares & Pastoriza, 2015, 183; van Boekel, 2006, 230).

 24

Figura 1. Adaptación de las etapas de la reacción de Maillard por van Boekel,

2006, 231.

Lastimosamente mediante la reacción de Maillard, se da la aparición de

compuestos neoformados que no son deseables en los alimentos porque son

catalogados como potencialmente peligrosos para la salud como es el caso de

hidrocarburos aromáticos policíclicos, cloropropanoles y clorésteres, aminas

hereocíclicas, hidroximetil furfural, carboximetil-lisina y la acrilamida (Ciencias &

Sociología, 2012, 27-31; Loaëc, Niquet-Léridon, et al., 2014, 2.-3).

 25

Acrilamida

En las últimas décadas, el estudio de los productos alimentarios ha sufrido

modificaciones importantes. En países occidentales donde las sustancias nutricionales

son casi ilimitadas, se ha dado un cambio hacia la discusión sobre el análisis de los

factores de riesgo desconocidos en un producto para el consumidor, cambio que se ha

venido introduciendo debido a las alarmas generadas por la percepción que tienen los

mismos consumidores sobre el riesgo, las tecnologías emergentes de análisis y el

debate sobre los alimentos saludables y no saludables (Eriksson, 2005, 1; Loaëc,

Jacolot, Helou, Niquet-Léridon, & Tessier, 2014, 1).

En la industria alimentaria de todo el mundo, los conceptos de riesgo e inocuidad

han generado la necesidad de implementar sistemas y organizaciones como la FDA,

EFSA, BCR, entre otras, encargadas de asuntos regulatorios, de vigilancia y control, de

parámetros de calidad etc., y las cuales han clasificado como factores químicos de

riesgo varios tipos de toxinas, B-N-metilamino-L-alanina, metales pesados y muy

importante, los compuestos formados durante el procesamiento de los alimentos o

compuestos neo-formados como es el caso de la acrilamida (Capuano & Fogliano,

2011, 793; Eriksson, 2005, 1-4).

En abril de 2002, un grupo de investigadores de la Universidad de Estocolmo en

conjunto con la SNFA reportaron la presencia de acrilamida (2-propenamida) en un

amplio rango de alimentos fritos, horneados, tostados, etc (Commission, 2002, 3-6;

Pittet, Périsset, & Oberson, 2004, 791) y sus posibles efectos sobre la salud (Anese,

Suman, & Nicoli, 2010, 123; Gökmen, Kocadağlı, Göncüoğlu, & Mogol, 2012, 168;
 26

Granby & Fagt, 2004, 177-178; Guenther, Anklam, Wenzl, & Stadler, 2007, 60-61;

Hoenicke & Gatermann, n.d.; L, 2011, 268; Lineback, Coughlin, & Stadler, 2012, 21-24;

Loaëc et al., 2014, 2; Oracz, Nebesny, & Zyżelewicz, 2011, 23-24; Riboldi, Vinhas, &

Moreira, 2014, 311; Stadler et al., 2002, 449; Taeymans et al., 2004, 324-325; Tardiff,

Gargas, Kirman, Carson, & Sweeney, 2010, 658-659; Zyzak et al., 2003, 5782), los

cuales son ampliamente conocidos en la actualidad debido a la gran preocupación que

causó este hallazgo a nivel mundial (Headquarters, 2002, 3).

La acrilamida (CH2=CH-CO-NH2), es un compuesto cristalino blanco e inodoro,

soluble en agua, acetona y etanol y es empleado como polímero sintetizado a partir de

la hidratación del acrilonitrilo (Dybing & Sanner, 2003, 311) en varias aplicaciones

industriales tales como tratamiento de aguas, manufactura de papel, cosméticos, etc.,

(De Vleeschouwer, Van der Plancken, Van Loey, & Hendrickx, 2007, 116). La

acrilamida se forma en alimentos que sufren procesos térmicos por encima de los

100°C y fue catalogada en 1994 como “probablemente cancerígena para los humanos”

ó 2A según la IARC (States, Ferrari, Busk, & Doerge, 2010, 2).

En los procesos térmicos por encima de los 100 °C a los cuales son sometidos

muchos alimentos durante su manufactura, los azúcares reductores reaccionan con los

aminoácidos iniciando una serie de eventos que generan un característico color pardo y

ciertas notas aromáticas; este proceso es conocido como la reacción de Maillard

(Zyzak et al., 2003, 4785), principal ruta de formación de la acrilamida. A la fecha, es

bien sabido que esto ocurre mediante la condensación de la asparagina con azúcares

reductores (Taeymans et al., 2004, 331), pero debido a la formación de especies

intermediarias altamente reactivas, hoy se sabe que esta no es la única ruta de

 27

formación. Una de las primeras ilustraciones de cómo ocurre esta reacción fue

propuesta por (Zyzak et al., 2003, 4784-4785). El primer paso es la condensación de la

asparagina y el carbonilo reactivo, seguido por la deshidratación a una base de Shiff

como intermediario alternativo de baja energía en la formación de un producto de

Amadori; la amina neutra (descaroboxilada del compuesto de Amadori) se forma por

transferencia de protones, y finalmente una β-eliminación de H produce la acrilamida

(Figura 2) (Lineback et al., 2012, 19-20; Medeiros Vinci, Mestdagh, & De Meulenaer,

2012, 1139). Se ha sugerido la 3-aminopropionamida como un posible intermediario en

la formación de acrilamida vía reacción de Maillard, la cual puede formarse también en

materias primas alimentarias por descarboxilación enzimática de la acrilamida bajo

ciertas condiciones (Bagdonaite, Viklund, Skog, & Murkovic, 2006, 215, 218).

Figura 2. Adaptación de los mecanismos de la formación de acrilamida

propuestos por Medeiros Vinci et al., 2012, 1139.
 28

Son numerosos los estudios que tratan sobre los efectos neurotóxicos,

carcinógenos y sobre la reproducción por parte de la acrilamida. Luego de su ingesta,

la acrilamida es rápidamente absorbida en todo el organismo y puede ser encontrada

en el timo, el hígado, el corazón, el cerebro, los riñones e incluso en la placenta. La

acrilamida puede ser metabolizada por el citocromo P450 2E1 a glicinamida o

conjugada a glutatión y posteriormente es convertida a ácidos mercaptúricos

conjugados (Capuano & Fogliano, 2011, 797). La unión de la acrilamida a grupos

sulfhidrilo de los residuos de cisteína de las proteínas que tienen un papel importante

en el proceso de fusión de la membrana, causa degeneración en las terminales

nerviosas y la inhibición del transporte axonal, iniciando reacciones de estrés oxidativo

y daños presinápticos. Este estrés oxidativo comienza con la oxidación de lípidos y

posteriormente con la de proteínas, haciendo que el daño sea acumulativo (Erkekoglu

& Baydar, 2014, 49).

Desde que la IARC catalogó la acrilamida como probablemente cancerígena,

muchos estudios en modelos animales, principalmente en roedores y estudios

epidemiológicos en humanos (Lineback et al., 2012, 27), han soportado esta teoría

encontrado la capacidad que tiene de formar tumores en órganos como el cerebro, las

mamas, la piel, los pulmones, etc. (Capuano & Fogliano, 2011, 798; Tardiff et al., 2010,

660). La investigación llevada a cabo por Tardiff y Col (2010, 658), demostró que la

tolerancia a la ingesta diaria de acrilamida es de 40µg/kg día y se sabe que en países

nórdicos aproximadamente un 39% de esta ingesta proviene del café (Guenther et al.,

2007, 61). En cuanto a los efectos genotóxicos y reproductivos, la acrilamida reacciona

lentamente con el ADN vía reacción de Michael para formar aductos, los cuales se
 29

cree, están más relacionados con la exposición ocupacional y no con la ingesta

mediante la dieta (Wilson, Mucci, Rosner, & Willett, 2010, 2513- 2514).

La investigación relacionada con los riesgos de la acrilamida para la salud ha

incentivado la aplicación de metodologías analíticas que permitan su cuantificación; de

acuerdo con E. Food & Authority (2012, 14), las metodologías de análisis más

empleadas para la cuantificación de acrilamida entre el 2007 y el 2010 fueron:

HPLC/MS (56 %), GC/MS (37 %) y el porcentaje restante se dividió entre HPLC/UV,

UHPLC/MS, electroforesis capilar y bioensayos como test inmunoenzimáticos. Debido

a la existencia de estas múltiples técnicas de análisis se ha demostrando que un

procedimiento de extracción universal del analito no es posible pues cada matriz de es

un mundo complejo y de ello dependerán los reactivos a emplear o el procedimiento de

limpieza de la muestra previo al análisis por cualquiera de estas tecnologías (Oracz et

al., 2011, 28). Los métodos de cromatografía líquida son los más empleados debido a

su simplicidad y menor consumo de tiempo; en ellos el clean-up de la muestra

dependerá del tipo de detector a emplear y de la matriz objeto de análisis como ya se

mencionó (Eriksson & Karlsson, 2006, 394). La mayoría de los métodos de

cromatografía líquida usan detectores MSD cuadrupolares, ESI y unos pocos emplean

detectores APCI (Albishri & El-Hady, 2014, 130; Jezussek & Schieberle, 2003, 7868-

7870; Kuncewicz & Michalak, 2013, 71-73; Wang et al., 2013, 7). Matrices alimentarias

analizadas por GC/MS generalmente requieren derivatización del analito, lo cual suele

ser interpretado como una desventaja pues este procedimiento debe llevarse a cabo

bajo estrictos controles de tiempo, temperatura y cantidad del derivatizante para

asegurar el éxito de la reacción, pero se ha demostrado que los porcentajes de

 30

recuperación, desviaciones estándar y límites de cuantificación son bastante

aceptables (Sun, Fang, & Xia, 2012, 222), lo que no constituye un inconveniente si el

analista cuenta con el cuidado y la experticia necesaria.

A partir de la detección de la acrilamida, se ha dado lugar a intensos esfuerzos

de investigación, principalmente en las metodologías analíticas de cuantificación

mencionadas anteriormente, (Jin et al., 2013, 612; Medeiros Vinci, Mestdagh, & De

Meulenaer, 2012, 1145-1146), mecanismos de formación y precursores (De

Vleeschouwer et al., 2009, 116) y las posibles estrategias de mitigación en los

alimentos que sufren procesos térmicos, las cuales se han enfocado en los últimos

años en los siguientes aspectos: aplicación de aditivos como sales de calcio y

magnesio, pirofosfato ácido de sodio, ácido cítrico, ácido láctico y acético (Mestdagh et

al., 2008, 26), tratamientos pre y pos cosecha (De Wilde et al., 2006, 404-405),

procesos térmicos llevados al vacío (Claus et al., 2008, 122), uso de metodologías de

fermentación (Akıllıoglu & Gökmen, 2013, 1), uso de asparaginasa (Capuano &

Fogliano, 2011; Cb, 2002, 795), modificaciones al proceso de tostado (Anese et al.,

2014, p. 169; Guenther et al., 2007, 65) y extracción y remoción por medo de fluidos

supercríticos (Banchero et al., 2013, 292).

 31

Acrilamida y café

El tostado es un proceso térmico en la manufactura de café en el cual se

desarrollan todas sus características fisicoquímicas y organolépticas (Akıllıoglu &

Gökmen, 2013, 1). Este proceso varía entre los 150-250 °C (Summa, de la Calle,

Brohee, Stadler, & Anklam, 2007, 1850), según el tipo de café que se quiera obtener,

ya sea tostado y molido, soluble, en extracto, etc., o el tipo de tueste que se quiera

conseguir, claro, medio u oscuro, según el perfil de taza deseado. En el café verde, la

acrilamida es formada natural y rápidamente durante el inicio del tueste. Se han

encontrado valores entre 200-958 µg/Kg en café tostado y molido y entre 188-1047

µg/Kg en café instantáneo (Pastoriza, Ángel, & Morales, 2012, 198). De esta manera, el

grado de tostado es de considerarse como un factor clave en el contenido de

acrilamida, por lo que modificaciones a este proceso, como llevarlo a cabo al vacío, han

sido estudiados (Anese et al., 2014, 168).

Aunque el café ha sido catalogado dentro del grupo de los alimentos donde “la

reducción de acrilamida es poco probable sin afectar su calidad”, se han llevado a cabo

metodologías como adición de asparaginasa, uso de sales de calcio y magnesio y

modificación en los parámetros de tueste, entre otros (Akıllıoglu & Gökmen, 2013, 1).

Si bien se conoce el esfuerzo que se ha realizado con las metodologías

mencionadas anteriormente, el foco de las investigaciones sobre acrilamida en café se

ha orientado en conocer sus niveles en el grano tostado; la prioridad ahora se ha

tornado en cuantificar la cantidad que efectivamente ingieren los consumidores, pues la

acrilamida es altamente soluble en agua, por lo que es transferida fácilmente a las

 32

bebidas de café, especialmente a las que son preparadas a altas presiones como el

café espresso (Alves, Soares, Casal, Fernandes, & Oliveira, 2010, 929). De igual

manera, las materias primas son el centro de muchos estudios; para el café es de

suma importancia la evaluación de cómo afectan las condiciones geográficas la

producción de los precursores de la acrilamida, es decir, la asparagina y los azúcares

reductores, puesto que los atributos del terreno tales como elevación, clima, periodos

de lluvia, calidad y fertilización del suelo, etc., pueden influir significativamente sobre su

formación (De Wilde et al., 2006, 404; Loaëc, Niquet-Léridon, et al., 2014, 2; Oberthür

et al., 2011, 785).

Acrilamida e industria del café:

Como es sabido, el café es el principal producto de exportación agrícola de

nuestro País; según cifras de la Federación Nacional de Cafeteros y la OIC, para el año

2014 se alcanzaron los 10.954 mil sacos de 60Kg de café exportados en todas sus

presentaciones, además una de las bebidas de mayor consumo a nivel mundial

especialmente en países como Finlandia, Noruega, Islandia, Dinamarca, Estados

Unidos y Brasil, entre otros (Bortolomeazzi et al., 2012, 2687). Se presume que la

contribución del café en la ingesta diaria de acrilamida es bastante significativa en

países con una alta tasa de consumo de café, por ejemplo se ha reportado que una

taza de 30 mL de café espresso elaborado con variedad arábiga contiene

aproximadamente 0,98 µg (Alves et al., 2010, 932). Esta situación, contrasta un poco

con los beneficios derivados de sus sustancias antioxidantes como la disminución de

enfermedades cardiovasculares (O’Keefe et al., 2013, 1043). disminución de procesos

 33

neurodegenerativos (Prakash & Tan, 2011, 127), (Machado, Parise, & de Carvalho,

2014, 170), etc., motivo por el cual la industria cafetera debe destinar mayores

esfuerzos en la investigación de esta sustancia, evaluar qué cantidades de acrilamida

son ingeridas a partir del café, cómo mitigar los valores actuales desde los procesos

industriales y como en el caso de esta investigación, determinar cómo el origen y la

calidad del café pueden o no correlacionarse con su formación.

 34

Capítulo 1: Caracterización de la materia prima

La manera cualitativa y cuantitativa como se expresan algunas sustancias de

interés biológico en los alimentos está directamente relacionada con sus sustancias

precursoras y estas a su vez, con el origen de las materias primas. Si bien los cambios

más drásticos ocurren durante los procesos industriales, es la calidad en sí de dichas

materias primas la que es determinante en el contenido final de los compuestos tanto

de valor nutritivo y organoléptico como de aquellos que no son tan deseables. Es por

ello que la caracterización juiciosa de las mismas, así como la clara trazabilidad en su

consecución, permitirá contar con herramientas suficientes para poder concluir como su

origen, su calidad y el contenido inicial de sustancias precursoras pueden o no estar

relacionadas con el contenido final de acrilamida en el café objeto de investigación.

Debido al objetivo principal de este estudio, determinar la posible correlación

entre la acrilamida formada con un gran número de factores, entre ellos la calidad de la

materia prima y las sustancias precursoras de la misma, y debido también a que no se

conocen reportes sobre la cuantificación de acrilamida mediante GC/MS en café

colombiano tipo excelso, se decidió llevarlo a cabo entrelazando las necesidades

comerciales de Colcafé y la máxima trazabilidad posible sobre la materia prima. Así los

criterios de selección de las fincas fueron establecidos de manera tal que se tuviera

conocimiento sobre todo aquello que puede afectar la materia prima, por lo que se tuvo

en cuenta que las tres fincas (alturas) manejaran igual variedad de café (Colombia),

calidad (excelso) el cual es el tipo de café de más alta calidad que se pueda producir y

el de mayor exportación, beneficio (húmedo), secado (al sol), similares prácticas

 35

agrícolas y que la colección se llevara a cabo en el mismo mes para tratar de que los

factores climáticos fueran los mismos sobre todo el café colectado.

Luego de que el café verde llegó a la compañía, se realizó la correspondiente

inspección para verificar que se trataba de café excelso, seguido se procedió con la

medición de los parámetros fisicoquímicos del mismo y de la cuantificación de los

metabolitos de interés biológico. No solo se llevó a cabo la cuantificación de los

precursores en la formación de acrilamida, la aspargina y la glucosa y/o fructosa, sino

que también se determinó un set de L-α-aminoácidos, seis azúcares reductores y el

contenido de polifenoles totales y ácidos clorogénicos (3, 4 y 5 CQA), para identificar

mediante estos la posible expresión de marcadores y evidenciar si se presenta o no

una alta variedad en la composición química de los mismos con respecto al café entre

las diferentes fincas. Conociendo las diferencias en este café, se podrá establecer en el

futuro la manera en que se comporta la acrilamida, luego del proceso tostado de este.
 36

Materiales y métodos

Material vegetal

Para esta investigación se realizó un muestreo aleatorizado del café en el

municipio de Andes, departamento de Antioquia (5° 39' 29'' N, 75° 52' 51'' O) ubicado a

1350 msnm, temperatura media de 22° C y precipitación anual media de 2099 mm;

este se estratificó en tres alturas diferentes y de cada altura se seleccionó una finca, las

que a su vez se estratificaron en tres alturas o zonas de colección para cubrir todos los

lotes de producción y asegurar la aleatoriedad el muestreo. El café de traviesa como es

conocida la cosecha secundaria que se da entre los meses de marzo y mayo,

corresponde a la especie Arábiga, variedad Colombia, con un proceso de beneficio

húmedo y secado al sol. La cantidad necesaria de café pergamino, o como se conoce

al café con la cascarilla antes del proceso de trilla, fue acopiado en la misma trilladora

la cual entregó la respectiva carga de café calidad excelso. Luego de recibida la

materia prima, esta se codificó y se inspeccionó según los parámetros descritos en la

NTC 5938 de café verde para uso industrial (ICONTEC Internacional, n.d., 4-6),

mediante los que se verificó que correspondía a la calidad excelso (Tabla 2).
 37

Tabla 2. Codificación de la materia prima y parámetros de inspección.

Zona de
Altura Codificación Parámetros inspeccionados según norma NTC 5938
muestreo

Baja F1A1CV
Finca 1 Media F1A2CV
Alta F1A3CV
Baja F2A1CV Grano bueno, grano negro, grano con defecto, grano vinagre,
Finca 2 Media F2A2CV ripio, impurezas, materia extraña, grano brocado, grano foráneo,
Alta F2A3CV grano guayaba, densidad, sabor y humedad en balanza
Baja F3A1CV
Finca 3 Media F3A2CV
Alta F3A3CV

Preparación de la muestra: molienda y extracción

Los granos de café verde se molieron en un molino Probat Emmerich

(Brabender® Germany) a tamaño de partícula según parámetros de perfiles de

producto en Colcafé; luego de tener la muestra en fino polvo, 30g fueron sometidos a

extracción en una cafetera doméstica marca SAMURAI Café City 12 con 500 mL de

agua ultra pura durante 7 minutos; esta relación agua/café también corresponde a un

parámetro de perfil de producto en Colcafé.

Parámetros fisicoquímicos

Luego de la molienda de las muestras se determinó la densidad y el porcentaje

de humedad en una balanza de humedades Halogen HR83 (Mettler Toledo,

Switzerland). Con la extracción del café o preparación de las bebidas según el apartado

anterior se determinó su pH en un pH-metro SevenEasy 8603 (Mettler Toledo,

Switerland).
 38

Contenido de polifenoles totales (PFT)

La cuantificación de polifenoles totales se llevó a cabo mediante el método de

Folin-Ciocalteu con ligeras modificaciones (Alvarez et al., 2012). Se mezclaron 15 µL

de la muestra (con un factor de dilución 20) con 128 µL de agua ultra pura, luego se

adicionaron 37 µL el reactivo de Folin Ciocalteu, se dejó reposar por 1 minuto y se

adicionaron 120 µL de una solución de carbonato de sodio al 9,0 % p/v. Cada mezcla se

alicuotó en un pozo de 300 µL en una placa de 96 pozos marca Costar Ref. 3628. Esta

placa se llevó a un espectrofluorímetro Biotek Sinergy HT (USA), en el cual se agitó

automáticamente por un minuto, se incubó en oscuridad por 60 minutos a temperatura

ambiente y se determinó la absorbancia a 760 nm. El análisis cuantitativo se realizó por

el método del estándar externo mediante una curva de calibración de ácido gálico

(20,0-500,0 mg/L) y los resultados se expresaron en términos de miligramos

equivalentes de ácido gálico (GAE).

Contenido de ácidos clorogénicos (ACGS)

En un tubo cónico de 15 mL se adicionaron 6,0 mL del la bebida preparada con

3,0 mL de una mezcla 70:30 de metanol / ácido fórmico al 0,3% v/v más 200 µL de

solución de Carrez I y II (100 µL de cada una). Posteriormente se centrifugaron a 4000

rpm durante 10 min a temperatura ambiente; el sobrenadante se diluyó en ácido

fórmico al 0,3% v/v a un factor de dilución 7,5 y se filtró a través de un acrodisco de

nylon de 0,45 µm.

 39

La cuantificación de los ácidos clorogénicos correspondiente a la suma de los

ácidos 3CQA, 4CQA y 5CQA, se llevó a cabo mediante HPLC en un cromatógrafo de

líquidos marca Agilent serie 1260 Infinity con un detector DAD VL61315D (Germany)

empleando el método del estándar externo y siguiendo la metodología propuesta por

Mills y Col (2013, 3357), con algunas modificaciones. Se empleó una columna Zorbax

Eclipse XDB C18 (4,6 x 150 mm, 3,5 µm) a flujo de 1,0 mL/min usando una mezcla de

ácido fórmico al 0,3% v/v y acetonitrilo como fase móvil; la detección se llevó a cabo a

λ= 325 nm y el tiempo de corrida fue de 18 min.

Contenido de L-α-aminoácidos

A 200 mg de la muestra de café se adicionaron 1,5 mL de medio de extracción

(Metano / HCl 0,1N 80:20) y se sometieron a ultrasonido por 40 min; se recuperó el

sobrenadante y se centrifugó a 13000 rpm por 10 min, de allí se tomaron 50 µL de

extracto y se evaporaron a 45 °C en horno de convexión. Al residuo seco se

adicionaron 100 µL de acetonitrilo y 50 µL de derivatizante MTBSTFA (N-tert-

Butildimetilsilil-N-metiltrifluoroacetamida) dejándolo actuar por 24 horas; luego del

tiempo de reacción se adicionaron 100 µL de cloroformo quedando la muestra lista para

la inyección en el cromatógrafo de gases.

El contenido L-α-aminoácidos en la materia prima se llevó a cabo en un

cromatógrafo gaseoso Marca Agilent modelo 7098A acoplado a un detector de masas

simple modelo 5975C equipado con sistema de inyección automática de líquidos,

puerto de inyección capilar split/splitless, sistema de detección MSD de alta

sensibilidad y especificidad operando en modo SIM. Para la cuantificación de los

 40

analitos se empleó método del estándar interno usando norvalina, una columna Zebron

ZB-5MSi Guardian 5M. (35 m x 250 µm x 0.25 µm), He como gas portador a un flujo de

1,0 mL/min y un tiempo de corrida de 38,14 min. Los iones empleados para

cuantificación e identificación, así como los niveles de detección para la prueba se

encuentran resumidos en la Tabla 3. Las condiciones de procesamiento de muestra y

de adquisición de las señales fueron adaptadas a partir de la nota de aplicación Sigma-

Aldrich (Katerine K. Stenerson, 2011, 9-11).

Tabla 3. Condiciones cromatográficas para la cuantificación de L-α-aminoácidos

en café por GC/MS-SIM.

1 2 3 4
Compuesto Tr . (min) m/z (ion 100%) LD (µg/L) LC (µg/L)

L-alanina 13,037 158,1; 232,2; 260,1 0,20 0,4

L-glicina 13,415 147,1; 218,1; 246,2 0,20 0,4
L-valina 15,004 186,2; 260,1; 288,1 0,20 0,4
DL-norvalina 15,206 186,2; 260,1; 288,1 0,20 0,4
L-leucina 15,668 200,2; 274,1; 302,1 0,20 0,4
L-isoleucina 16,159 200,2; 274,1; 302,1 0,20 0,4
L-prolina 16,67 184,2; 258,1 0,20 0,4
L-5-oxo prolina 19,403 272,1; 300,1 0,20 0,4
L-methionina 19,644 218,1; 292,1; 320,2 0,20 0,4
L-serina 19,982 288,1; 362,3; 390,3 0,20 0,4
L-threonina 20,41 303,1; 302,1 0,20 0,4
L-fenilalanina 21,279 302,1; 234,2; 366,2 0,20 0,4
L-ácido aspártico 22,163 302,1; 418,3 0,20 0,4
L-ácido glutámico 23,63 432,3; 330,3 0,20 0,4
L-asparagina 24,006 417,3; 30,1 0,20 0,4
L-lisina 24,901 300,1; 188,2 0,22 0,4
L-histidina 27,277 196,2; 440,3; 338,3 0,23 0,4
L-tirosina 27,813 302,1; 303,1 0,25 0,5
L-triptófano 28,24 302,130,1; 375,2 0,25 0,5
L-cisteína 33,565 348,2; 188,1 0,25 0,5
1 2 3 4
Tiempo de retención; Relación masa/carga; Límite de detección; Límite
de cuantificación.
 41

Contenido de azúcares reductores

A 200 mg de la muestra de café se adicionaron 1,5 mL de medio de extracción

(Metano / HCl 0,1N 80:20) y se sometieron a ultrasonido por 40 min, 37 KHz y 80% de

potencia en un ultrasonido Elma - Elmasonic P (Elma Schmidbauer GmbH, Germany);

se recuperó el sobrenadante y se centrifugó a 13000 rpm por 10 min, de allí se tomaron

20 µL de extracto, se adicionaron 20 µL de estándar interno y se secó a 45°C en un

horno de convección. Al residuo seco se le adicionaron 100 µL de solución de

metoxiamina dejando reaccionar por una hora a 40 °C; luego del tiempo de reacción se

adicionaron 50 µL de derivatizante BSTFA (N,O-bis(trimetilsilil) trifluoroacetamida) y se

dejó reaccionar por una hora a 50 °C, finalmente se adicionaron 100 µL de cloroformo

quedando la muestra lista para la inyección en el cromatógrafo de gases.

El contenido de azúcares reductores en la materia prima se llevó a cabo en el

mismo equipo empleado para la cuantificación de aminoácidos y con las mismas

características. Se empleó el método del estándar interno usando ribitol, una columna

Zebron ZB-5MSi Guardian 5M. (35 m x 250 µm x 0.25 µm), He como gas portador a un

flujo de 1,0 mL/min y un tiempo de corrida de 33,08 min. Los iones empleados para

cuantificación e identificación se encuentran resumidos en la Tabla 4. Las condiciones

de procesamiento de muestra y de adquisición de las señales fueron adaptadas a partir

de la metodología desarrollada por Desbrosses y Col (2005, 165-174).

 42

Tabla 4. Condiciones cromatográficas para la cuantificación de azúcares

reductores en café por GC/MS-SIM.
1 2
Compuesto Tr . (min) m/z (ion 100%)
D-(+)-xilosa 1MOX; 4 TMS bp 17,37 103, 217, 307
D-(+)-xilosa 1MOX; 4 TMS mp 17,5 103, 217, 308
D-(+)-arabinosa 1MOX; 4 TMS 17,58 103, 217, 307
D-(+)-ribosa 1MOX; 4 TMS 17,8 103, 217, 307
D-ribitol 5 TMS (ISTD) 18,48 217, 103, 205
D-(+)-fructosa 1MOX; 5 TMS mp 20,81 103, 217, 307
D-(+)-fructosa 1MOX; 5 TMS bp 21 103, 217, 307
D-(+)-glucosa 1MOX; 5 TMS mp 21,07 319, 205, 160
D-(+)-glucosa 1MOX; 5 TMS bp 21,16 319, 205, 217
D-(+)-glucosa 1MOX; 5 TMS bp 21,27 319, 205, 160
D-(+)-galactosa 1MOX; 5 TMS bp 21,49 319, 205, 103
D-(+)-manosa 1MOX; 5 TMS bp 21,54 319, 205, 103
D-manitol 6 TMS 21,76 205, 319, 217
myo-inositol 6 TMS 23,62 217, 305, 318
1 2
Tiempo de retención; Relación masa/carga.

Análisis estadístico

Luego de concretar los resúmenes de los resultados de todas las pruebas, se

realizó un análisis multivariado PCA para evaluar la máxima varianza, un análisis

ANOVA y una matriz de correlaciones para los cuales se tuvieron en cuenta tanto los

parámetros fisicoquímicos como las sustancias cuantificadas. El análisis se realizó

mediante el paquete estadístico Minitab 16 amparado bajo licencia de Colcafé.

 43

Resultados y discusión

Caracterización de la materia prima

La elevación o altura de siembra es el factor ambiental más frecuentemente

mencionado con respecto a los efectos de origen. Estudios llevados a cabo en Centro

América han concluido que los cafés que crecen a mayores alturas son aquellos que

representan una mayor calidad y que mínimos cambios climáticos tienen una brusca

incidencia sobre la misma (Benoit Bertrand et al., 2006, 2575-2576; Oberthür et al.,

2011, 783).

El resumen estadístico de los parámetros fisicoquímicos, L-α-aminoácidos,

azúcares reductores y sustancias antioxidantes se ilustran en las tablas 5-8. Todas las

cuantificaciones se llevaron a cabo por gramo de muestra y en base húmeda.

Los resultados de los parámetros fisicoquímicos medidos a la materia prima

(Tabla 5), se encuentran dentro de los valores establecidos por la NTC 5938 de café

verde para uso industrial (ICONTEC Internacional, n.d., 4-6), mediante los que se pudo

corroborar que correspondía a la calidad excelso. Cuando un solo parámetro de los

medidos se encuentra por fuera de esta norma, de inmediato el café es objeto de

rechazo para la calificación de excelso y se procede con denominación de menor

calidad, disminuyendo sus probabilidades de exportación.

 44

Tabla 5. Parámetros fisicoquímicos de la materia prima.

Muestra Densidad (g/L) Humedad (%) pH

F1A1CV 543 12,08 5,74

F1A2CV 528 12,98 5,76
F1A3CV 540 12,23 5,79

F2A1CV 543 11,35 5,86

F2A2CV 534 11,68 5,84
F2A3CV 532 11,54 5,85

F3A1CV 536 12,37 5,80

F3A2CV 534 11,84 5,80
F3A3CV 527 13,14 5,81

Media 535,22 12,13 5,81

Desv.Est. 5,89 0,62 0,04
CoefVar 1,10 5,09 0,69

De los más de 40 ácidos clorogénicos del café, los tres cuantificados en este

estudio aportan aproximadamente el 90% del contenido total, y aunque los valores

encontrados (Tabla 6), se encuentran un poco por debajo de los reportados en la

bibliografía (Puerta, 2011, 4), no se debe concluir que la materia prima es de calidad

deficiente (Avelino et al., 2005, 1869). Generalmente el contenido de ácidos

clorogénicos cuantificados por HPLC como la sumatoria del 3CQA, 4CQA y 5CQA en

café arábiga es de 40 mg/g aprox. (Monteiro & Farah, 2012, 612).

 45

Tabla 6. Contenido de polifenoles totales y ácidos clorogénicos en la materia

prima.

Muestra PFT (mg eq GAE/g muestra) ACGS (mg/g muestra)

F1A1CV 34,25 34,24

F1A2CV 34,76 35,85
F1A3CV 35,85 36,27

F2A1CV 36,60 38,31

F2A2CV 38,36 41,71
F2A3CV 28,96 31,88

F3A1CV 37,27 39,99

F3A2CV 35,57 29,84
F3A3CV 35,14 37,86

Media 35,20 36,22

Desv.Est. 2,66 3,79
CoefVar 7,57 10,47

En el caso de algunos aminoácidos, se pudo evidenciar en la Tabla 7 que

mediante la técnica de cuantificación empleada no fueron detectables, lo que no quiere

decir que no estén presentes, pues estos son inherentes al metabolismo del café.

Según estudios reportados previamente en café verde arábiga usando GC/MS para la

cuantificación de estas sustancias, el valor medio de asparagina, quien es el

aminoácido precursor en la formación de acrilamida es de 0,2 mg/g (Murkovic & Derler,

2006a, 29); en este estudio los contenidos globales más altos, aunque distan de este

valor son los de la Finca 3, por lo que es de esperarse que la materia prima de esta

procedencia contenga luego del tostado del café, los valores más altos de acrilamida.

Es probable que los valores de aminoácidos que están un poco bajos con respecto a

los reportados se deban a las condiciones agroclimáticas y ontogénicas de la planta.

 46

Tabla 7. Contenido de L-α-aminoácidos en la materia prima.

L-α-Aminoácidos (mg/g muestra)
Muestra
Alanina Glicina Valina Leucina Isoleucina Prolina 5-oxoprolina Metionina Serina Treonina Fenilalanina Ácido aspártico Ácido glutámico Asparagina

F1A1CV 1,36 0,18 0,37 0,25 0,30 0,64 0,2 0,03 0,6 n.d. 0,31 0,44 1,02 0,05
F1A2CV 2,02 0,25 0,61 0,44 0,49 0,93 0,27 0,04 0,82 0,04 0,46 0,55 1,16 0,04
F1A3CV 1,92 0,25 0,52 0,36 0,43 1,06 0,3 0,02 0,99 0,04 0,39 0,77 1,16 0,04

F2A1CV 1,79 0,19 0,42 0,29 0,35 0,85 0,19 0,05 0,41 0,03 0,37 0,41 0,76 0,08
F2A2CV 1,66 0,17 0,42 0,29 0,35 0,80 0,14 0,05 0,4 0,03 0,36 0,37 0,49 n.d.
F2A3CV 1,69 0,18 0,41 0,27 0,34 0,78 0,13 0,04 0,39 0,03 0,37 0,32 0,14 n.d.

F3A1CV 1,83 0,24 0,49 0,36 0,38 0,81 0,3 0,03 0,67 0,04 0,39 0,56 1,83 0,07
F3A2CV 1,74 0,22 0,47 0,35 0,38 0,79 0,23 0,04 0,53 0,03 0,33 0,38 1,26 0,03
F3A3CV 2,51 0,25 0,55 0,4 0,43 1,06 0,31 0,04 0,78 0,04 0,39 0,61 1,96 0,11

Media 1,83 0,21 0,47 0,33 0,38 0,86 0,23 0,04 0,62 0,03 0,37 0,49 1,09 0,05
Desv.Est. 0,31 0,04 0,08 0,06 0,06 0,14 0,07 0,01 0,21 0,01 0,04 0,14 0,58 0,04
CoefVar 17,05 16,49 16,51 18,94 15,11 16,03 29,61 22,26 34,24 41,06 11,09 29,07 53,64 77,19
 47

En cuanto al contenido de azúcares reductores (Tabla 8), la glucosa y la fructosa

quienes son los principales azúcares involucrados en la formación de acrilamida,

reportan los valores globales más altos en las fincas 1 y 3 por lo que se espera que

luego del tostado de estas materias primas se produzcan también los niveles más altos

de acrilamida, en especial el café proveniente de la finca 3. La literatura reporta valores

medios de 2,2 mg/g de glucosa y 1,9 mg/g fructosa cuantificados por GC/MS en café

arábiga (Murkovic & Derler, 2006a, 30); es probable que los valores de azúcares un

poco bajos con respecto a los reportados se deban a las condiciones agroclimáticas y

ontogénicas de la planta, o a que el proceso de secado al sol como parte del beneficio

del café fue algo corto (Kleinwächter & Selmar, 2010, 500). Es importante anotar que la

Finca 2 contiene los niveles globales más bajos de todos los azúcares y que no se

detectaron niveles de D-(+)-ribosa.

Tabla 8. Contenido de azúcares reductores en la materia prima.

Azúcares reductores (mg/100 g muestra)
Muestra
D-(+)-ribosa D-(+)-fructosa D-(+)-glucosa D-(+)-galactosa D-manitol myo-inositol

F1A1CV 0,47 12,45 9,15 1,13 0,89 9,57

F1A2CV 0,33 7,19 4,97 0,68 5,8 7,99
F1A3CV 0,42 8,81 4,56 0,63 4,28 5,85

F2A1CV n.d. 2,08 1,66 0,24 0,52 7,33

F2A2CV n.d. 1,92 1,71 0,26 12,96 7,59
F2A3CV n.d. 1,90 1,60 0,24 0,63 7,01

F3A1CV 0,25 5,82 2,50 0,37 0,35 5,93

F3A2CV 0,33 27,55 11,08 1,39 0,53 7,07
F3A3CV 0,35 35,28 12,72 1,54 0,89 7,99

Media 0,24 11,44 5,55 0,72 2,98 7,37

Desv.Est. 0,19 12,01 4,35 0,51 4,22 1,13
CoefVar 79,23 104,98 78,32 70,96 141,43 15,36
 48

Una vez se tuvieron todos estos resúmenes estadísticos (parámetros

fisicoquímicos, L-α-aminoácidos, azúcares reductores y sustancias antioxidantes), se

realizó un screening inicial mediante PCA (Figuras 3 y 4) en el que se emplearon los

dos primeros componentes que explican 65,8% de la variabilidad. La gráfica de

puntuación (Figura 3), mostró como la Finca 2 se agrupó de manera muy marcada en

comparación con las otras dos fincas, comportamiento que se da probablemente según

los bajos contenidos de azúcares reductores y aminoácidos encontrados en las

muestras procedentes de esta finca; de ser así, esto debería reflejarse en la gráfica de

cargas.

Figura 3. Gráfica de puntuación (PCA) en la materia prima para todos los

parámetros cuantificados.

5 F 1A 1C V
A ltu r a
Segundo componente (20,3%)

F in c a 1
F in c a 2
4
F in c a 3

3
F 3A 2C V
2

F 3A 3C V
1

0
F 1A 3C V
F 2A 3C V F 3A 1C V
-1
F 2A 1C V F 1A 2C V

-2 F 2A 2C V

-3
- 5,0 -2 ,5 0 ,0 2,5 5,0
P rim e r c o m p o n e n te (4 5 ,5 % )

En la figura 4, en efecto se puede confirmar de manera visual la hipótesis de que

a excepción del myo-inositol, el contenido de todos los azúcares reductores, y el

contenido de algunos aminoácidos como L-metionina, L-asparagina, L-ácido glutámico,

 49

L-serina y L-5-oxoprolina son aquellos que hacen que la Finca 2 se agrupe de manera

marcada y se aleje de las otras dos fincas, pues sus vectores en la gráfica de cargas se

situaron en el mismo cuadrante en el cual ella se agrupa en el gráfico de puntuación y

de manera perpendicular. Este comportamiento también aplica en los valores de pH y

humedad encontrados.

Figura 4. Gráfica de cargas (PCA) en la materia prima para todos los

parámetros cuantificados.

0
0,4
Segundo componente (20,3%)

D-(+)-galactosa
D-(+)-gl ucosa
0,3 D-(+)-ri bosa
m yo-i nosi tol
D-(+)-fructosa
0,2
Densi dad L-áci do gl utám ico
L-asparagina
0,1
Hum edad
L-seri na
L-5-oxoproli na
0,0 L-ái do aspárti co 0
L-gl i ci na
L-l euci na
PFT
-0,1 L-al anina
L-val i na
L-m eti oni na L-prol i na
-0,2 L-isol euci na
pH D-m ani tol ACGS
L-feni lal anina
-0,3
L-treoni na

-0,2 -0,1 0,0 0,1 0,2 0,3

Prim e r com pone nte (45,5% )

Este PCA también mostró que las Fincas 1 y 3 son similares en los parámetros

cuantificados, pero debido a que el análisis PCA es descriptivo, se llevó a cabo un

análisis mediante una ANOVA lineal general para confirmar este modelo y evidenciar si

las diferencias encontradas con la Finca 2 respecto a las otras dos fincas son

significativas (p< 0,05) y qué parámetros hacen que se presente o no esta diferencia

(Tabla 9).
 50

Tabla 9. Parámetros de ANOVA para diferencias significativas en materia la

prima.

Variable Valor F Valor P R cuadrado (%) R cuadrado ajustado (%)

L-5-oxoprolina 6,66 0,030 68,94 58,58
L-serina 6,78 0,029 69,33 59,10
L-ácido glutámico 13,98 0,006 82,33 76,44
D-(+)-ribosa 53,69 0,000 94,71 92,94
pH 22,09 0,002 88,04 84,06

Mediante esta ANOVA lineal general se evaluaron los supuestos estadísticos de

normalidad, homogeneidad de las varianzas e independencia de las muestras sobre los

residuales y se determinó que en realidad los contenidos de D-(+)-ribosa, el pH, el L-

ácido glutámico, la L-serina y la L-5-oxoprolina del café perteneciente a la Finca 2 son

significativamente diferentes (p<0,05), lo que hace que esta finca se comporte

diferente.

En la Figura 5 de efectos principales se mostró como los bajos valores de L-5-

oxoprolina, L-serina, L-ácido glutámico y D-(+)-ribosa son aquellos que hacen que la

Finca 2 se agrupe en un extremo del PCA, pues se encuentran debajo del valor medio

para cada uno de ellos.

Debido a que la formación de acrilamida ocurre por la condensación de la

asparagina, de la cual no se observó diferencia significativa, con los azúcares

reductores, principalmente D-(+)-glucosa y D-(+)-fructosa que tampoco mostraron esta

diferencia, y aunque la D-(+)-ribosa que si mostró diferencia significativa es un azúcar

reductor, no existe literatura que relacione directamente este azúcar con la formación

de acrilamida de manera significativa. La diferencia significativa que se encontró para el

 51

valor de pH, está explicada por el hecho de que posiblemente los granos no tenían el

mismo grado de madurez entre las tres fincas, siendo los de la Finca 2 más inmaduros.

Figura 5. Gráficas de efectos principales para los parámetros con diferencias

significativas en la materia prima.

Gráfica de efectos principales para L-5-oxoprolina Gráfica de efectos principales para serina
Medias ajustadas Medias ajustadas

0,8
0,27

0,7
0,24
Media

Media
0,6
0,21

0,5
0,18

0,15 0,4
Finca 1 Finca 2 Finca 3 Finca 1 Finca 2 Finca 3
Altura Altura

Gráfica de efectos principales para L-ácido glutámico Gráfica de efectos principales para D-(+)-ribosa
Medias ajustadas Medias ajustadas

0,4
1,5
0,3
Media

Media

0,2
1,0

0,1

0,5 0,0
Finca 1 Finca 2 Finca 3 Finca 1 Finca 2 Finca 3
Altura Altura

Como el PCA inicial o de screening contenía todas las variables y sustancias

medidas, se realizó un segundo PCA en el que solo se incluyeran los azúcares

reductores y los aminoácidos como familias que contienen a los compuestos

precursores de la acrilamida (Figuras 6 y 7).

 52

Figura 6. Gráfica de puntuación (PCA) para los aminoácidos y azúcares en la

materia prima.

F 1A 2C V A ltu r a
2 F 2A 2C V
Segundo componente (20,1%)

F in c a 1
F 2A 3C V F in c a 2
F 2A 1C V
F 1A 3C V F in c a 3
1 F 3A 1C V

-1
F 3A 3C V
F 3A 2C V
-2

-3

F 1A 1C V
-4

-4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5
P rim e r c o m p o n e n te (5 0 ,8 % )

Figura 7. Gráfica de cargas (PCA) para los aminoácidos y azúcares en la materia

prima.

0
0 ,4
Segundo componente (20,1%)

L -fe n i l a l a n i n a
0 ,3 L -tre o n i n a
D -m a n i to l
L -m e ti o n i n a L -i so l e u c i n a
0 ,2 L -p ro l i n a
L -va l i n a
L -l e u ci n a
L -a l a n i n a
0 ,1 L -g l i c i n a
L -á ci d o a sp á rti co
L -se ri n a
0 ,0 0
L -5 -o xo p ro l i n a

-0 ,1
L -á ci d o g l u tá m i c o

-0 ,2 L -a sp a ra g i n a

D -(+ )-ri b o sa
-0 ,3 m y o -i n o si to l
D -(+ )-fru c to sa
D -(+ )-g a l a cto sa
-0 ,4 D -(+ )-g l u co sa

-0 ,1 0 ,0 0 ,1 0,2 0 ,3
P rim e r c o m p o n e n te (5 0 ,8 % )
 53

Estos gráficos que explican el 70,9% de la variación en sus dos primeros

componentes, ilustraron nuevamente lo que se observó en las Figuras 3 y 4: la Finca 2

se agrupó de manera muy marcada como se ve en la gráfica de puntuación, lo que no

ocurre para las otras dos fincas, y el gráfico de vectores atribuye esta diferencia de la

Finca 2 a las mismas sustancias que se evidenciaron en la figura 5, pero como ya se

mencionó anteriormente, estas gráficas son descriptivas y solo la ANOVA permitió

corroborar que de estas sustancias, aunque se encuentran en una menor cantidad en

el café de la Finca 2, no todas hacen que la diferencia sea significativa.

Luego de que se establecieron estas diferencias significativas entre los

diferentes metabolitos y parámetros fisicoquímicos de las diferentes fincas, se procedió

con la elaboración de la matriz de correlaciones (Tabla 10), para establecer cuáles

guardaban una correlación significativa entre ellos, teniendo en cuenta como criterio de

aceptación un valor p<0,05 y una correlación superior al 80% (positiva o negativa).

De estas correlaciones es importante destacar que los aminoácidos guardan

correlaciones entre sí al igual que los azúcares pues estos comparten la misma ruta

metabólica. Esto cobra importante relevancia si se toma en cuenta el hecho de que la

condensación entre los aminoácidos y los azúcares vía Maillard, es la que produce los

compuestos volátiles que le confieren el agradable aroma al café y las melanoidinas

que le dan el tono pardo (Ludwig, Sánchez, De Peña, & Cid, 2014, 67-68), además de

constituirse en poderosas sustancias antioxidantes.

 54

Tabla 10. Matriz de correlaciones para la materia prima.

VARIABLE Tipo Alanina Glicina Valina Leucina Isoleucina 5-oxoprolina Metionina Serina D-(+)-ribosa D-(+)-fructosa D-(+)-glucosa

Corr. 0,910
Valina
Valor p 0,001
Corr. 0,922 0,981
Leucina
Valor p 0,000 0,000
Corr. 0,862 0,982 0,943
Isoleucina
Valor p 0,003 0,000 0,000
Corr. 0,866
Prolina
Valor p 0,003
Corr. 0,953 0,820
5-oxoprolina
Valor p 0,000 0,007
Corr. 0,882 0,878
Serina
Valor p 0,002 0,002
Corr. 0,841 0,853
Fenilalanina
Valor p 0,005 0,003
Corr. 0,839 0,870 0,949
Ácido aspártico
Valor p 0,005 0,002 0,000
Corr. 0,901
Ácido glutámico
Valor p 0,001
Corr. -0,806
D-(+)-ribosa
Valor p 0,009
Corr. 0,949
D-(+)-glucosa
Valor p 0,000
Corr. 0,947 0,999
D-(+)-galactosa
Valor p 0,000 0,000
Corr. -0,892
pH
Valor p 0,001
 55

La tabla completa de correlaciones entre los parámetros fisicoquímicos medidos

y las sustancias cuantificadas en la materia prima se encuentra en el Apéndice A.

Desde que empezaron a emerger los café tipo Gourmet, los países productores

han mostrado un aumento en el interés por entender cómo los factores ambientales y

las técnicas locales afectan la calidad del mismo, lo que algunos autores llaman el

efecto terroir o efecto por el territorio (Avelino et al., 2005, 1872). Para el caso particular

de esta investigación, el café estudiado se seleccionó de manera que la variedad,

calidad, fecha de colección, región del País y las prácticas pre y pos cosecha fueran las

mismas; en ese sentido el efecto terroir se dio básicamente por las diferentes alturas de

siembra, con la cual los microclimas y composición de los suelos pueden ser

cambiantes y como resultado se podrían presentar diferencias significativas en el

contenido de los aminoácidos, azúcares reductores y sustancias antioxidantes

cuantificadas, y aunque la asparagina y la glucosa como precursores mayoritarios de

acrilamida son el principal interés, las otras sustancias podrían exhibir una correlación

con la formación de acrilamida y más importante aún, podrían comportarse como

marcadores del metabolismo del café de las diferentes fincas ayudando a entender qué

tan variables son estas materias primas y como esa variación puede afectar la calidad

del producto terminado y del contenido de acrilamida. Probablemente estos resultados

también obedecen a que los granos no poseían el mismo grado de madurez.

En cuanto a los parámetros fisicoquímicos, tanto la densidad como el porcentaje

de humedad permanecen constantes entre las diferentes muestras. En el caso del pH,

el cual está ligado directamente con la cantidad de ácidos orgánicos presentes en el

 56

café, principalmente con los ácidos cítrico y málico (S. Oestreich-Janzen, Gmbh, 2010,

19-23), la Finca 2 mostró una diferencia significativa con respecto a las otras dos

fincas, pero al no contar con una cuantificación exacta de estos ácidos orgánicos, este

parámetro solo podrá ser interpretado como un marcador de calidad en la taza, es

decir, en el producto final luego de tostado y molido para el descriptor “acidez”.

Aunque en una menor proporción, los ácidos clorogénicos también contribuyen

con la percepción de acidez en el café, al no mostrar diferencias significativas en su

contenido para las tres fincas, no se puede decir que estos son los responsables de

que la Finca 2 produzca café con un pH diferente a las demás, sino que probablemente

los granos provenientes de esta finca no tenían el mismo grado de madurez.

Los polifenoles se consideran uno de los grupos de metabolitos secundarios más

grandes entre las materias primas de origen vegetal y su contenido varía tanto con las

condiciones de crecimiento como con los estímulos ambientales. Su papel fisiológico

en las plantas ha sido relacionado con la defensa y sus moléculas pueden ser simples

como complejas al sufrir polimerizaciones (Gil, 2012, 18). Los polifenoles más

abundantes en el café son los ya nombrados ácidos clorogénicos, una familia de más

de 40 compuestos en los que los ácidos 5, 3 y 4 CQA contribuyen con más del 90% del

contenido total (Li Kwok Cheong et al., 2014, 46-47; Suárez-Quiroz et al., 2014, 56-57).

En el café verde, el contenido de polifenoles totales evaluado por método de Folin

Ciocalteu es prácticamente el mismo que de ácidos clorogénicos, esto se da debido a

que el método de Folin es una coloración en la que pueden o no reaccionar más o

menos sustancias de tipo fenólico, por lo que esta medición en el café debe
 57

considerarse como un screening inicial y el contenido exacto debe ser verificado por

una metodología más exacta como HPLC.

Afortunadamente el contenido de sustancias antioxidantes consideradas como

metabolitos de sumo interés en el café debido a sus numerosas propiedades

beneficiosas para la salud, no presentó diferencias significativas entre las diferentes

materias primas, por lo que en términos de calidad escoger una u otra materia prima no

será otro factor a tener en cuenta.

Los aminoácidos y los azúcares del café verde son los principales componentes

que contribuyen con la formación del aroma y color durante el tostado, así como con

sustancias indeseadas como el 5-HMF o la acrilamida, por ello es de suma importancia

tener el conocimiento a cerca de estos precursores que pueden ser transformados a

componentes potencialmente peligrosos (Murkovic & Derler, 2006, 25-32).

En el café verde, el aminoácido que se encuentra en mayor proporción según la

literatura es la alanina (Murkovic & Derler, 2006, 25), lo cual coincide con los resultados

aquí obtenidos y corrobora la calidad de la materia prima, pero más importante aún es

que en términos de calidad, el aminoácido más abundante no muestra diferencias

significativas entre las materias primas estudiadas, lo que conduce a elucidar lo mismo

que en el caso de las sustancias antioxidantes: luego de tostado el café, el contenido

de aminoácidos no será un criterio de discriminación. Es importante también destacar

que aunque si se presentaron diferencias significativas en el contenido de L-5-

oxoprolina, L-ácido glutámico y L-serina, estos aminoácidos no son precursores de

acrilamida ni tampoco son mayoritarios en el café verde, por lo que una vez
 58

cuantificada la acrilamida es necesario establecer un modelo que identifique si estos

están o no correlacionados con su formación.

Los carbohidratos son productos de la fotosíntesis de las plantas y se producen

de manera simultánea tanto en el fruto del café (berry) como en las hojas. Estos se ven

altamente influenciados por la manera en que es beneficiado y secado el café y suelen

concentrase en materias primas más maduras (Kleinwächter & Selmar, 2010, 500); en

este caso, el mismo beneficio húmedo y secado al sol del café en las tres fincas mostró

como el perfil de los azúcares reductores varía un poco, lo que puede atribuirse a

periodos distintos de exposición al sol o al estado de madurez de algunos granos.

De estos azúcares reductores, el único que mostró una diferencia significativa en

su contenido para las tres fincas fue la D-(+)-ribosa, de la cual no se reportan datos

concluyentes sobre una significativa formación de acrilamida a partir de ella, por el

contrario los reportes se han basado principalmente sobre el contenido de glucosa y

fructosa, y para estos, no se evidenció diferencia significativa. Así, parece que estos

metabolitos al igual que los compuestos antioxidantes y aminoácidos no se traducen en

un factor de exclusión de las diferentes materias primas.

 59

Capítulo 2: Cuantificación de la acrilamida en el café tostado y molido:

evaluación de su comportamiento

La calidad organoléptica y el contenido de sustancias de interés en una taza de

café son el resultado final de una serie de eventos que inician con la consecución de

una materia prima de alta calidad (Barbosa et al., 2012, 500-504; Oliveira et al., 2005,

287-288) y termina con el proceso industrial bajo parámetros estrictamente controlados

(Oberthür et al., 2011, 783-794).

Las sustancias de interés biológico consideradas como precursoras de otras que

aparecen en el proceso de tostado del café, pueden ubicarse en dos categorías:

aquellas que son deseadas como por ejemplo algunos ácidos grasos e isopropanoides

que le confieren sus deliciosas notas aromáticas, melanoidinas que le dan el tono

pardo y sabor, o mejor aún, polifenoles que se conservan desde el café verde hasta el

café tostado como los ácidos clorogénicos, a los que se les atribuyen propiedades

antioxidantes, y un segundo grupo de sustancias no deseadas como algunas aminas

biógenas, el 5-HMF o la acrilamida (Loaëc, Jacolot, et al., 2014, 593).

Las cantidades de acrilamida formadas dependen no solo de sus precursores,

sino también del proceso de tostado, pues a medida que se varían el tiempo y la

temperatura algunos reactantes tienden a consumirse de manera diferente, pero estas

variaciones en esta etapa del proceso productivo del café son estrictamente necesarias

pues de ello depende la obtención de diferentes perfiles de taza que son solicitados por

los diversos públicos consumidores de café (Costa et al., 2014, 350).

 60

A nivel mundial, específicamente en Europa y Estados Unidos, la acrilamida ha

sido objeto de estudio por más de una década, sin embrago en Colombia, solo hasta

hace un par de años se ha comenzado a trabajar el tema en algunas matrices

alimenticias, pero desafortunadamente no se han reportado estudios ni en café ni sobre

cómo se da la posible relación entre su calidad y grado de tostado con el contenido

final de acrilamida, situación que es preocupante si consideramos que el café es

nuestro producto insignia y la matriz agrícola de mayor exportación de Colombia, por lo

que es importante estar atentos y listos a las exigencias de los mercados nacionales e

internacionales.

Por ello, teniendo en cuenta la mayor cantidad de factores posibles que puedan

influenciar los contenidos finales de acrilamida en nuestro café, se diseñó un estudio en

el que después de una estricta trazabilidad en la obtención de la materia prima y su

caracterización, se procediera con la validación de una nueva metodología para la

cuantificación de acrilamida en el café tostado a tres grados diferentes y molido.

 61

Materiales y métodos

Tostado de la materia prima

Para el tostado de la materia prima se empleó un tostador automático piloto

marca Diedrich IR (2.5 Germany) con capacidad de carga de 2,5 Kg/h. El tostador fue

programado para iniciar a tostar a 180 °C y se establecieron tres temperaturas finales,

alta, media y baja, dependiendo del grado de tostado deseado: alto, medio y bajo,

siendo el tiempo de tostado dependiente de dicha temperatura final. La carga para el

tostador fue de 500g de muestra y cada tostada se llevó a cabo por triplicado para

tener una muestra representativa. Los niveles de tostado fueron establecidos según

tres perfiles de taza deseados y propuestos por expertos catadores de Colcafé

obedeciendo a propósitos comerciales (Tabla 11).

Caracterización de la muestra: molienda, extracción y determinación de los

parámetros fisicoquímicos

Los granos de café tostado fueron molidos (780-840 micras tostado bajo, 520-

580 micras tostado medio, 430-460 tostado alto) en un molino Mahloköning VTA6S3

(Germany), posteriormente 30g fueron sometidos a extracción en una cafetera

doméstica marca SAMURAI Café City 12 con 500 mL de agua ultra pura durante 7

minutos; esta relación agua/café corresponde a un parámetro de perfil de producto en

Colcafé.
 62

Tabla 11. Niveles de tostado y codificación de las muestras.

Muestra Nivel de tostado Temperatura de carga Codificación

Bajo F1A1TB
F1A1CV Medio F1A1TM
Alto F1A1TA
Bajo F1A2TB
F1A2CV Medio F1A2TM
Alto F1A2TA
Bajo F1A3TB
F1A3CV Medio F1A3TM
Alto F1A3TA
Bajo F2A1TB
F2A1CV Medio F2A1TM
Alto F2A1TA
Bajo F2A2TB
F2A2CV Medio 180 °C F2A2TM
Alto F2A2TA
Bajo F2A3TB
F2A3CV Medio F2A3TM
Alto F2A3TA
Bajo F3A1TB
F3A1CV Medio F3A1TM
Alto F3A1TA
Bajo F3A2TB
F3A2CV Medio F3A2TM
Alto F3A2TA
Bajo F3A3TB
F3A3CV Medio F3A3TM
Alto F3A3TA

Luego de la molienda de las muestras se determinó la densidad, el porcentaje de

humedad en una balanza de humedades Halogen HR83 (Mettler Toledo, Switzerland) y

color en un colorímetro Huter Lab D25LT (USA), y en la bebida se determinó su pH en

un pH-metro SevenEasy 8603 (Mettler Toledo, Switerland).

 63

Perfil sensorial de las muestras

Una vez tostadas y molidas las muestras, estas se perfilaron por los expertos en

catación del panel sensorial de Colcafé compuesto por 61 catadores los cuales

evaluaron los atributos de fragancia, aroma, acidez y cuerpo, para emitir una impresión

global siguiendo la NTC 5938 para la calificación de café excelso (ICONTEC

Internacional, n.d., 6).

Contenido de polifenoles totales y ácidos clorogénicos

Estas cuantificaciones se llevaron a cabo según los mismos métodos descritos

en el capítulo 1.

Contenido de L-α-aminoácidos residuales y azúcares reductores residuales

Estas cuantificaciones se llevaron a cabo según los mismos métodos descritos

en el capítulo 1.

Desarrollo y validación de una nueva metodología analítica por GC/MS para

la cuantificación de acrilamida

Como se mencionó en el marco teórico, la cromatografía gaseosa es la segunda

metodología más empleada en la cuantificación de acrilamida, pero no todos los

laboratorios la desarrollan exactamente igual. En Colombia, esta es la primera vez que

se reporta el desarrollo y validación de esta metodología para la cuantificación de

acrilamida en café por GC/MS.

 64

Para el desarrollo y validación de la metodología se empleó un cromatógrafo

gaseoso marca Agilent modelo 7098A acoplado a un detector de masas simple modelo

5975C equipado con sistema de inyección automática de líquidos, puerto de inyección

capilar split/splitless, sistema de detección MSD de alta sensibilidad y especificidad

operando en modo SIM. El instrumento se sintonizó en modo automático (Atune) al

inicio y durante el desarrollo de los análisis.

En la presente validación se evaluaron los parámetros de límite de detección,

límite de cuantificación, linealidad, precisión, exactitud y selectividad/especificidad en

una matriz de café molido en agua acidulada.

Preparación de la muestra:

1,0g de café tostado y molido se extrajo con 10 mL de ácido fórmico al 0,1% v/v,

se agitó en vortex por 1 min, se llevó a ultrasonido por 20 min, 37 KHz y 80% de

potencia en un ultrasonido Elma - Elmasonic P (Elma Schmidbauer GmbH, Germany);

posteriormente se centrifugó por 10 min a 4000 rpm. El sobrenadante se filtró en

acrodiscos de nylon de 0,45µm y 2,0mL se pasaron a presión atmosférica a través de

un cartucho de SPE de carbón grafitado (Carboprep™ 200, 6 mL, 500 mg) previamente

acondicionado. Se aplicó vacío durante 10 min para eliminar el exceso de agua y por

último se eluyó el cartucho con 3,0 mL de acetona quedando la muestra lista para

inyección en el GC/MS. La cuantificación se llevó a cabo por medio del método de

estándar interno usando propionamida, una columna J&W 122-7032: 2877.29946 DB-

WAX 250 °C (30 m x 250 µm x 0.25 µm), He como gas portador a un flujo de 1,0
 65

mL/min y un tiempo de corrida de 21,727 min. Las condiciones cromatográficas se

ilustran en la Tabla 12.

Tabla 12. Condiciones cromatográficas para la cuantificación de acrilamida en

café tostado y molido.
1 2
Compuesto Tr . (min) m/z
Acrilamida 14,5 55, 71, 20
Propionamida 13,3 57, 72, 73
1 2
Tiempo de retención; Relación masa/carga

Validación de la metodología analítica:

Concentración mínima detectable (Límite de detección).

Es la cantidad de concentración de un analito que proporciona una señal igual a

la señal del blanco (ySB) más tres veces la desviación estándar del blanco SB (Food

and Drug Administration, 2001, 4-8; Ortega, García, & Junca, 2011, 209-249). En esta

validación se inyectaron diferentes niveles de concentración (6 veces cada inyección),

hasta que se llegó a uno de ellos que proporcionaba una RSD<10,0%.

Concentración mínima cuantificable (Límite de cuantificación).

Concentración más baja de un analito que puede ser determinada con aceptable

precisión y exactitud (Food and Drug Administration, 2001, 4-8; Ortega, García, &

Junca, 2011, 209-249). Para metodologías bioanalíticas el límite de cuantificación debe

cumplir los siguientes requisitos:

- La respuesta de la señal del analito debe ser mínimo tres veces el ruido.
 66

- Reproducible con coeficiente de variación menor del 20% y exactitud de 80 a

120%.

En la metodología empleada se realizaron diluciones de acrilamida en el nivel 1

de la curva de calibración, cada dilución con cinco replicas hasta llegar al nivel que

cumpliera los criterios establecidos

Linealidad.

Cuando se varía la concentración de un analito debe haber un cambio

significativo en la respuesta del instrumento de manera proporcional en el rango de

concentraciones estudiadas (Food and Drug Administration, 2001, 4-8; Ortega, García,

& Junca, 2011, 209-249). En esta validación se consideraron seis concentraciones

distribuidas (Tabla 13); se tomaron dos calibraciones, una para cada analito, en un

rango que cubre la respuesta del detector para las muestras de un estudio piloto. Para

esta prueba de linealidad se evaluó la homocedasticidad o prueba para demostrar que

la varianza de los errores es constante, es decir, la homogeneidad de la varianza.

Tabla 13. Distribución de concentraciones en seis niveles de las curvas de

calibración de acrilamida.
Concentración (ng/mL)
Sustancias
N6 N5 N4 N3 N2 N1
Acrilamida 600 400 200 100 50 25
ISTD 1000 1000 1000 1000 1000 1000

Precisión.

Es la concordancia mutua entre datos que se han obtenido de la misma forma e

indica la medida del error aleatorio de un análisis (Food and Drug Administration, 2001,
 67

4-8; Ortega, García, & Junca, 2011, 209-249) y es valorada mediante la repetibilidad y

la reproducibilidad, las cuales se refieren a la concordancia de los resultados

recolectados por el mismo investigador, los mismos reactivos, laboratorio e instrumento

en un corto periodo de tiempo evaluadas determinando el coeficiente de variación

%CV = (s/x) * 100

S: desviación estándar

X: media aritmética.

1. Repetibilidad instrumental

Se preparó una solución stock del estándar interno y acrilamida y se evaluó

posterior a ser preparada, en cada evaluación cromatográfica de las dos sustancias se

inyectó un número superior a 6 veces y se colectaron datos de 4 días diferentes.

2. Reproducibilidad del método

La muestra fue preparada 6 veces independientes en diferentes fechas y cada

muestra fue inyectada por triplicado.

Exactitud.

Se refiere a la concordancia entre el valor verdadero y el valor experimental;

para tal efecto la recuperación del analito en un ensayo es índice de la exactitud de una

medida. La exactitud medida como el porcentaje de recuperación se calcula

comparando su coeficiente de variación mediante comparación del valor G

experimental de las varianzas (Test de Cochran) (Food and Drug Administration, 2001,

4-8; Ortega, García, & Junca, 2011, 209-249). En esta validación, la matriz de café fue

enriquecida (dopada) a tres niveles diferentes de concentración del analito (acrilamida)

 68

y fue sometida al proceso de extracción para posteriormente evaluar qué porcentaje del

analito adicionado es recuperado; la prueba se realizó por triplicado y en fechas

diferentes.

Selectividad / Especificidad.

Se considera selectividad como la habilidad de un método para diferenciar y

cuantificar uno o varios analitos en presencia de otros componentes que se sospecha

puedan estar presentes en la muestra (Food and Drug Administration, 2001, 4-8;

Ortega, García, & Junca, 2011, 209-249). Las sustancias potencialmente interferentes

en una matriz vegetal incluyen componentes endógenos de la matriz, metabolitos,

productos de degradación, impurezas, etc. La selectividad se evaluó inyectando varias

muestras de la matriz vegetal (extractos de café) con el fin de detectar el efecto de la

matriz sobre la pureza espectral. El método se considera selectivo si ninguno de los

blancos u otras sustancias analizadas presenta el mismo tiempo de retención de los

analitos de interés (Figura 8).

Figura 8. Cromatograma (SCAN-SIM) acrilamida y propionamida.

propionamida
acrilamida
 69

Análisis estadístico

Luego de concretar los resúmenes de los resultados de todas las pruebas, se

realizó un análisis multivariado PCA para evaluar la máxima varianza, un análisis

ANOVA y una matriz de correlaciones para los cuales se tuvieron en cuenta tanto los

parámetros fisicoquímicos como las sustancias cuantificadas También se realizó un

análisis PLS el cual se elaboró por grado de tostado. El análisis se realizó mediante el

paquete estadístico Minitab 16 amparado bajo licencia de Colcafé

 70

Resultados y discusión

Cuantificación de la acrilamida en el café tostado y molido: evaluación de

su comportamiento

El tostado del café se puede llevar a cabo a temperaturas entre los 150-300 °C

para convertir ese “green baggy” del café verde en placenteras notas ahumadas.

Sustancias específicas son las encargadas de estos cambios que ocurren durante la

reacción de Maillard, degradación de Streker y pirolisis entre aminoácidos y azúcares,

formando una gran variedad de compuestos monoméricos y poliméricos que

influencian las características organolépticas o que son convertidos en “tóxicos

neoformados” como la acrilamida (Bagdonaite, Derler, & Murkovic, 2008, 6081). En el

presente estudio, los tres niveles de tostado (bajo, medio y alto) corresponden a

perfiles de interés comercial para la Compañía.

Son muchos los factores de los cuales depende la formación de acrilamida en el

café: la cantidad y disponibilidad de sus sustancias precursoras, las cuales a su vez

dependen de múltiples factores descritos en el capítulo 1, el grado y forma de tostado,

la especie de café, la metodología de preparación de la taza, entre otras (Taeymans et

al., 2004, 323-347).

En ese orden de ideas, y tomando desde la literatura que ciertos parámetros

fisicoquímicos pueden estar relacionados con la formación y las cantidades de

acrilamida, la primera medición que se llevó a cabo fue la de estos parámetros en el

café tostado y molido. Esto cobra vital importancia si se tiene en cuenta que muchos

estudios han relacionado el color con el contenido de acrilamida (Alves et al., 2010,
 71

929-931; Gökmen & Şenyuva, 2006, 238); la intrínseca relación entre el color del café

tostado y la acrilamida es evidente pues el color aumenta con el tiempo y temperatura

de tostado, y esto a su vez interviene en la formación de más o menos acrilamida,

además, estudios han determinado que a menor contenido de agua, la acrilamida se

forma de manera más sustancial (De Vleeschouwer et al., 2007, 722), hecho que

guarda relación con los valores de merma obtenidos en este estudio, donde a mayor

valor de la merma, menor contenido de agua y mayor contenido de acrilamida,

entendiéndose la merma del café como el peso perdido por eliminación de agua luego

del tostado.

La densidad está relacionada con la humedad inicial de la materia prima, donde

valores superiores a 14% de humedad en el grano verde son un parámetro de rechazo,

puesto que cuando el café sufre el proceso de tostado se producirá bastante

irregularidad en los granos alterando la densidad y el proceso de molienda y extracción,

lo que se constituye en una alteración en las cualidades organolépticas.

Se observó como los niveles de pH permanecen constantes con respecto al

comportamiento que se mostró de las materias primas en el capítulo 1, lo cual es

positivo tomando en cuenta que las características organolépticas se deben conservar.

El resumen estadístico de las mediciones fisicoquímicas se puede observar en la Tabla

14.
 72

Tabla 14. Parámetros fisicoquímicos del café tostado y molido.

Muestra Color (L) Densidad (g/L) Humedad (%) pH Merma (%)

F1A1TB 23,7 333,7 1,7 4,7 15,5

F1A1TM 15,6 287,3 1,3 5,0 19,4
F1A1TA 11,6 248,0 0,9 5,4 25,9
F1A2TB 23,5 343,0 1,6 4,7 15,3
F1A2TM 15,7 289,2 1,2 5,1 19,4
F1A2TA 11,4 248,3 0,7 5,6 24,4
F1A3TB 23,6 339,1 1,5 4,8 15,3
F1A3TM 16,2 284,0 1,2 5,1 18,9
F1A3TA 11,3 244,1 0,9 5,6 24,9

F2A1TB 25,4 330,7 1,7 4,9 13,5

F2A1TM 18,0 293,7 1,4 5,2 16,5
F2A1TA 12,6 247,9 1,1 5,8 21,8
F2A2TB 26,9 337,8 1,8 4,9 13,7
F2A2TM 18,5 296,6 1,3 5,2 16,7
F2A2TA 12,9 251,1 1,1 5,9 21,8
F2A3TB 26,3 336,0 1,8 4,9 13,8
F2A3TM 17,8 301,1 1,2 5,2 17,0
F2A3TA 12,5 242,8 0,9 5,8 22,1

F3A1TB 26,1 353,0 2,4 4,7 14,2

F3A1TM 16,2 280,9 1,3 5,1 19,0
F3A1TA 12,0 247,1 1,2 5,8 24,3
F3A2TB 23,4 337,1 2,0 4,8 15,3
F3A2TM 16,2 278,0 1,4 5,1 18,6
F3A2TA 11,3 254,7 1,0 5,8 24,4
F3A3TB 23,6 351,2 2,1 4,8 15,2
F3A3TM 15,9 290,2 1,4 5,1 19,0
F3A3TA 11,6 259,5 0,9 5,7 24,7

Media 17,78 292,82 1,38 5,21 18,91

Desv.Est. 5,50 38,47 0,42 0,40 4,01
CoefVar 30,94 13,14 30,25 7,69 21,22
 73

Posterior a la medición de los parámetros fisicoquímicos y con el fin de evaluar si

después del tostado del café persistían algunas cantidades de aminoácidos y azúcares,

se llevó a cabo la cuantificación de estas sustancias (Tabla 15). El único aminoácido

remanente fue la L-5-oxoprolina o ácido piroglutámico, del cual se evidenció una mayor

concentración a medida que se aumenta el grado de tostado; siendo un compuesto

producto de la oxidación de la L-prolina, es de esperarse que a mayor tostado, mayor

proceso de oxidación y formación de L-5-oxoprolina. Maeso y Col (2006, 1095) llevaron

a cabo un estudio que refuerza esta teoría y en el que indicaron que efectivamente este

aminoácido es producto de una conversión térmica y que es sumamente importante al

encontrarse relacionado con procesos cognitivos y de la memoria, reforzando las

bondades del café.

Para el caso de los azúcares, solo se observaron remanentes de D-(+)-fructosa y

de D-(+)-galactosa a tostados bajos, los cuales fueron los azúcares mayoritarios junto

con la D-(+)-glucosa en el café verde, de la cual se observó que definitivamente es el

principal azúcar involucrado en la formación de acrilamida al no encontrarse

remanentes de él luego del tostado. En cuanto al myo-inositol y D-manitol, que son

azúcares alcoholes con intervención nula en la reacción de Maillard y que no sufren

pérdidas por volatilización, también se observó un aumento o concentración a medida

que aumenta el nivel de tostado y disminuye la humedad.

 74

Tabla 15. Contenido de azúcares reductores y L-α-aminoácidos en el café tostado

y molido.
Remanentes de Azúcares reductores (mg/100 g muestra) y Aminoácidos (mg/g
Muestra muestra)
D-(+)-fructosa D-(+)-galactosa D-manitol Myo-inositol 5-oxoprolina
F1A1TB 0,0595 0,0068 0,0027 0,1244 26,81
F1A1TM n.d. n.d. n.d. 0,1515 31,75
F1A1TA n.d. n.d. n.d. 0,1772 139,95
F1A2TB 0,0406 0,0033 n.d. 0,1417 26,04
F1A2TM n.d. n.d. 0,0034 0,1622 35,80
F1A2TA n.d. n.d. 0,0057 0,1707 147,10
F1A3TB 0,0422 0,0051 0,0022 0,1246 24,99
F1A3TM n.d. n.d. 0,0032 0,1624 38,30
F1A3TA n.d. n.d. 0,0282 0,1776 169,78

F2A1TB n.d. n.d. n.d. 0,1275 10,26

F2A1TM n.d. n.d. n.d. 0,1572 21,48
F2A1TA n.d. n.d. n.d. 0,1569 67,88
F2A2TB n.d. n.d. n.d. 0,1232 11,10
F2A2TM n.d. n.d. n.d. 0,1547 22,14
F2A2TA n.d. n.d. n.d. 0,1567 68,95
F2A3TB n.d. n.d. n.d. 0,1340 9,40
F2A3TM n.d. n.d. n.d. 0,1469 25,26
F2A3TA n.d. n.d. n.d. 0,1632 68,55

F3A1TB n.d. n.d. 0,0024 0,1227 15,43

F3A1TM n.d. n.d. n.d. 0,1761 39,63
F3A1TA n.d. n.d. n.d. 0,1610 147,22
F3A2TB 0,0580 0,0049 n.d. 0,1670 18,84
F3A2TM n.d. n.d. n.d. 0,1691 32,18
F3A2TA n.d. n.d. n.d. 0,1808 134,05
F3A3TB 0,0515 0,0044 n.d. 0,1393 17,95
F3A3TM n.d. n.d. n.d. 0,2199 34,10
F3A3TA n.d. n.d. n.d. 0,1995 145,67

Media 0,0093 0,0009 0,0018 0,1573 56,7000

Desv.Est. 0,0202 0,0020 0,0055 0,0237 52,1000
CoefVar 216,89 220,74 309,95 15,04 91,9
 75

Entre los cientos de estudios que giran alrededor de la acrilamida,

específicamente en el café, las sustancias de naturaleza antioxidante han sido

correlacionadas con las tasas de formación/eliminación de la misma (Bassama, Brat,

Bohuon, Boulanger, & Günata, 2010; Jin et al., 2013, 558). Así, estas constituyen no

solo un marcador de calidad en la materia prima y la bebida final por sus propiedades

benéficas para la salud, sino que también podrían vincularse con los contenidos de

acrilamida en el café objeto de estudio. Debido a las fuertes transformaciones químicas

que sufren todas las sustancias del café verde cuando pasan por el proceso industrial,

la prueba para el contenido de polifenoles totales permite tener una mayor visualización

de cómo a medida que se aumenta el grado de tostado los polifenoles van

disminuyendo, y siendo los ácidos clorogénicos los polifenoles más importantes y

abundantes del café, en ellos se observó esta misma tendencia (Tabla 16). Cuando se

compararon los niveles de polifenoles totales y ácidos clorogénicos en el café tostado

con los niveles en el café verde, se observó más claramente este comportamiento.

Una vez medidos los parámetros fisicoquímicos y cuantificados los remanentes

de sustancias precursoras y antioxidantes, las muestras de café tostado fueron

calificadas por expertos del panel de catación de Colcafé los cuales evaluaron los

atributos de fragancia, aroma, acidez y cuerpo, para emitir una impresión global, la

cual, cuando se trata de café excelso no debe ser inferior a 8,0 según la NTC 5938

(Tabla 16) (Apéndices D, E, F).

 76

Tabla 16. Contenido de polifenoles totales, ácidos clorogénicos y perfil sensorial

(impresión global) del café tostado y molido.

PFT (mg eq GAE/g Ácidos Clorogénicos Impresión Global

Muestra
muestra) (mg/g muestra) Sensorial

F1A1TB 28,13 16,12 8,3

F1A1TM 27,24 6,47 8,5
F1A1TA 24,26 1,27 8,5
F1A2TB 34,17 17,33 8,6
F1A2TM 30,74 7,09 8,6
F1A2TA 24,90 1,57 8,6
F1A3TB 33,73 19,38 8,5
F1A3TM 29,27 7,33 8,5
F1A3TA 24,64 1,51 8,5

F2A1TB 34,79 19,86 8,6

F2A1TM 29,34 7,94 8,6
F2A1TA 27,51 1,81 8,6
F2A2TB 35,83 21,56 8,3
F2A2TM 31,41 9,02 8,4
F2A2TA 27,35 1,91 8,4
F2A3TB 35,28 20,11 8,4
F2A3TM 31,92 8,09 8,5
F2A3TA 26,04 1,73 8,6

F3A1TB 35,9 18,66 8,3

F3A1TM 30,76 6,56 8,5
F3A1TA 28,39 1,51 8,5
F3A2TB 39,85 18,34 8,4
F3A2TM 33,26 7,33 8,4
F3A2TA 31,41 1,43 8,4
F3A3TB 35,08 15,43 8,4
F3A3TM 28,08 5,77 8,5
F3A3TA 20,7 1,07 8,4

Media 30,37 9,12 n.a.

Desv.Est. 4,432 7,3 n.a.
CoefVar 14,59 80,02 n.a.
 77

Como se puede observar en la tabla anterior, el contenido de polifenoles y de

ácidos clorogénicos disminuye de forma muy marcada, lo cual obedece a pérdidas o

transformaciones químicas sufridas por el proceso de tostado como ya se ha

mencionado. En cuanto al perfil sensorial, los valores superiores a 8,0 en la calificación

del panel ratifican la buena calidad de este café excelso.

Hasta la fecha, numerosas metodologías analíticas para la cuantificación de

acrilamida en matrices vegetales han sido desarrolladas obedeciendo a la alta

complejidad que estas representan en los procedimientos de extracción y aislamiento

de la sustancia. El café no es una excepción a este suceso, pues su compleja química

hace que en el proceso de extracción de la acrilamida siempre se requiera de un clean-

up exhaustivo de la muestra previa inyección en el equipo de análisis (Bortolomeazzi et

al., 2012, 2688; Delatour, Périsset, Goldmann, Riediker, & Stadler, 2004, 4626;

Eriksson & Karlsson, 2006, 393-394; Go, 2005, 215-216). Para lograr lo anterior, es

recurrente el uso de cartuchos de SPE los cuales están elaborados con un relleno de

carbono grafitado y un gel cargado con distintos grados de polaridad, acidez o

basicidad según la molécula a retener/purificar y según la naturaleza de la matriz, ya

sea liposoluble o hidrosoluble, con alta carga de carbohidratos, ácidos orgánicos, etc,

como en el caso del café.

En la mayoría de los estudios de acrilamida, la metodología analítica de

cuantificación reportada es HPLC/MS/MS gracias a los cortos tiempos de análisis, la

sensibilidad del método y bajo consumo de solventes, sin embargo, la cromatografía

gaseosa es la segunda técnica más empleada debido a que los porcentajes de

 78

recuperación, las desviaciones estándar y los límites de detección son bastante

aceptables (Sun, Fang, & Xia, 2012, 221).

En el presente trabajo se desarrolló una nueva metodología para la

cuantificación de acrilamida en café tostado y molido mediante GC/MS. En este tipo de

análisis el paso más crítico y temido por los investigadores es la derivatización del

analito, debido al estricto control en tiempo, temperatura y volumen de derivatizante

con que debe llevarse a cabo, pues de lo contrario la reacción puede ser incompleta y

no se formará la molécula equivalente a cuantificar o puede formarse también una

“falsa molécula”. En esta investigación, mediante diversos ensayos y luego de un arduo

trabajo en el clean-up de la muestra en los cartuchos de SPE estrictamente

seleccionados se logró obviar este paso; con un proceso selectivo de extracción de la

matriz y con un adecuado acondicionamiento y elución de los cartuchos, la molécula es

purificada en el solvente seleccionado, así, no se tiene que emplear tanto tiempo en la

derivatización y no se incurre con la posibilidad de que la molécula no se forme, o que

se cuantifique la molécula equivocada.

Al validar esta metodología analítica por GC/MS, se tuvo en cuenta que para el

desarrollo experimental debe existir una planeación, que permita seguir de manera

sistemática cada paso de la investigación y con ello lograr obtener resultados

confiables y reproducibles. La validación comprende la determinación de una serie de

parámetros que demuestren que los resultados del método son confiables y

reproducibles. La cuantificación de la acrilamida se llevó a cabo por medio del método

del estándar externo y normalización de las áreas empleando propionamida por su

similitud molecular y facilidad de trabajo.

 79

La acrilamida ha mostrado decaer a lo largo del periodo de almacenamiento

(Hoenicke & Gatermann, n.d., 296), por esta razón, una vez fueron tostadas las

muestras, estas se almacenaron por días en bolsas metalizadas translúcidas con

barrera de oxígeno, selladas al vacío y almacenadas en cava a -8,0 °C con la finalidad

de retrasar reacciones de deterioro inherentes a la inestabilidad de las materias primas

de origen natural y minimizar la variación durante la etapa de validación y cuantificación

en las muestras procedentes de las diferentes alturas (fincas).

Los parámetros evaluados en esta validación fueron: límite de detección, límite

de cuantificación, linealidad, precisión, exactitud y selectividad/especificidad en una

matriz de café tostado y molido en agua acidulada con solución estándar, obteniéndose

muestras enriquecidas. El resumen de los resultados obtenidos en la validación se

ilustra en la Tabla 17.

 80

Tabla 17. Resultados de validación para el método de acrilamida.

Parámetros Resultados Criterio de aceptación

Linealidad
Ecuación de la recta Y= 0.001X-0.0004 n.a
2 2
Coeficiente de determinación r = 0.9991 r = 0.99
Correlación (Pearson) r= 1 r= 0.999
Homogeneidad de varianza G exp.= 0.035 G tablas (a= 0,05, K= 6, n =3) = 0,616
Precisión Resultados Criterio de aceptación
Repetibilidad

R.
Coef. de variación RSD rep inst= 2.4% RSD rep inst= 3,0
Instrumental

R. Método Coef. de variación RS Drep met= 1.81% RSD rep met= 4,0

Exactitud Resultados Criterio de aceptación

Porcentaje de recuperación %R= 99.66±2.33 %R= 100±5
Test de Cochran G exp= 0.23 G tablas (a=0,05, K=3, n=3)= 0,871
Límite de detección Resultados Criterio de aceptación
Concentración 10 ng/mL con S/R= 6:1 n.a
RSD% 1.97% < 20%
Límite de cuantificación Resultados Criterio de aceptación
Concentración 25 ng/mL n.a
RSD% 7.64% <10%
Interferencias Resultados Criterio de aceptación
Selectividad/Especificidad:
No afectan n.a
sustancias relacionadas
Idoneidad del sistema cromatográfico (System suitability)
Resultados Criterio de aceptación
Tiempo de retención 14.5 min n.a
Factor de capacidad k' 3.271 k´> 2
Platos teóricos 1167101.33 N > 1000
Asimetría 1.010 As= 0,8 - 2,5
Resolución Rs > 3.283 Rs > 1,5

Según los parámetros validados y sus valores obtenidos se pudo establecer que

el método es lineal, preciso, reproducible y selectivo.

 81

Una vez se desarrolló y validó la metodología analítica, se procedió con la

cuantificación de los niveles de acrilamida formados en el café tostado y molido. En la

Figura 9 se puede observar la clara diferencia que existe en los niveles formados de

acrilamida dependientes del grado de tostado.

Figura 9. Contenido de acrilamida en las muestras de café T&M.

Contenido de acrilamida en café T&M

700
Acrilamida µg/Kg

600
500
400
Tostión Baja
300 Tostión Media
200 Tostión Alta
100
0
Altura Altura Altura Altura Altura Altura Altura Altura Altura
1 2 3 1 2 3 1 2 3
Finca1 Finca2 Finca3

Según la literatura, a menor grado de tostado, mayor nivel de acrilamida formada

(Alves et al., 2010, 929; Bagdonaite et al., 2008, 6083); este fenómeno obedece a que

al inicio del tostado las sustancias precursoras están disponibles y comienzan a

condensarse rápida y espontáneamente y al final del proceso, muchas pérdidas

químicas y físicas tienen lugar. Las curvas de tostado, se comportan de manera tal que

al principio cuando se inicia la pérdida de agua se da un decaimiento de la temperatura

y luego aumenta de manera exponencial hasta que llegan a un punto en la que se

estabiliza; la acrilamida en cambio, sufre un efecto de campana, es decir, aumenta

exponencialmente hasta que en un punto del proceso de tostado comienza a decaer.

 82

De manera general y si se remite de nuevo a la Figura 6 se puede observar una

tendencia y es que las muestras de tostado bajo contienen los niveles más bajos de

acrilamida y los tostados altos contienen los niveles más altos; esto contrasta un poco

con la literatura pero su explicación es simple y clara: la acrilamida en el café comenzó

a formarse de manera exponencial y seguramente unos instantes luego del último

punto del proceso de tostado es donde esta comienza a decaer, es decir, a un color de

tostado más oscuro que el de estas muestras de tostado alto se daría este proceso.

Esto puede ser visible si los experimentos combinan diferentes tiempos de tostado para

obtener diferentes colores y curvas, pero como se mencionó inicialmente, los perfiles

aquí desarrollados fueron escogidos por expertos en catación y obedecen a intereses

comerciales de la Compañía luego de numerosas pruebas realizadas.

Si se remite al capítulo 1, se puede observar que las muestras de la Finca 2

contienen los niveles más bajos de los precursores de la acrilamida, la asparagina y los

azúcares reductores, especialmente la D-(+)-fructosa y la D-(+)-glucosa, lo que guarda

completa relación con los niveles encontrados de acrilamida, los cuales son también los

más bajos en las muestras de esta finca independientemente del grado de tostado.

Aquí es importante recordar que las diferencias significativas entre las materias primas

fueron atribuidas a los bajos niveles en algunas de las cuantificaciones que se

realizaron a las materias primas de la Finca 2 en el capítulo anterior.

Una vez se contó con los resultados de todas las mediciones y cuantificaciones

realizadas y con sus respectivos resúmenes estadísticos, se procedió con el análisis de

la estadística descriptiva e inferencial para poder observar cómo se comporta la

 83

acrilamida formada en relación a la materia prima y a todos los parámetros descritos

que pueden o no afectarla.

Lo primero que se hizo al igual que en el capítulo 1, fue un screening inicial

mediante un PCA para evaluar la máxima varianza y en el cual se tuvieron en cuenta

tanto los parámetros fisicoquímicos como las sustancias cuantificadas. Este primer

PCA (Figuras 10 y 11) en el que se emplearon los dos primeros componentes que

explican el 75,5% de la variabilidad, se muestra mediante la gráfica de puntuación

como las muestras tienden a agruparse por grado de tostado y no por altura de

cosecha.

Figura 10. Gráfica de puntuación (PCA) en el café tostado y molido para todos los
parámetros cuantificados.

3 F 1A 1T B F in c a
Segundo componente (12,2%)

F in c a 1
F 1A 3T A
F in c a 2
F in c a 3
2 F 3A 2T B
F 3A 3T B
F 1A 3T B

1 F 1A 2T A F 1A 2T B
F 3A 3T A
F 1A 1T A
F 3A 2T A
F 3A 1T A
0
F 2A 3T A F 2A 2T A F 3A 3T M F 1A 2T M
F 1A 3T M
F 2A 1T A F 3A 1T M F 1A 1T M
F 3A 2T M F 2A 3T M
-1 F 2A 2T M
F 3A 1T B
F 2A 1T M
F 2A 3T B F 2A 1T B
F 2A 2T B
-2
-5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4
P rim e r c o m p o n e n te (6 3 ,3 % )
 84

Figura 11. Gráfica de cargas (PCA) en el café tostado y molido para todos los
parámetros cuantificados.

0
0,7
Segundo componente (12,2%)
D -(+)- g alac to sa
0,6 D - (+)- fru c to sa

0,5

0,4 D -m an ito l
L-5- o xo p r o lin a
0,3

0,2
ac r ilam id a
0,1 my o - in o sito l
D en sid ad
0,0 0
pH A C GS
H u med ad
-0,1
C o lo r
PFT
-0,2
-0,4 -0,3 -0,2 -0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4
P rim e r co m p o n e n te (63,3% )

Lo más importante a destacar en la gráfica de cargas (Figura 11) y se remite a la

Tabla 15, es que los valores remanentes de myo-inositol, D-manitol y L-5-oxoprolina

tienden a aumentar cuando el nivel de tostado es más alto, y estas sustancias ubican

sus vectores en el mismo cuadrante donde se agrupan la mayoría de las muestras de

tostado alto. Además, el vector de la acrilamida se sitúa en el mismo lugar donde se

pueden ver las muestras de tostado alto de la Finca 3 en la gráfica de puntuación, para

la que hay una tendencia de valores más altos de acrilamida en los tres niveles de

tostado. También es importante resaltar que las muestras que se ubican en el

cuadrante superior derecho de la gráfica de puntuación corresponden a la mayoría de

tostado bajo para las cuales se conservaron algunos remanentes de azúcares, los que

se puede visualizar en el mismo cuadrante de la gráfica de cargas.

 85

Debido a que el análisis PCA es descriptivo, se llevó a cabo un análisis mediante

una ANOVA lineal general para confirmar este modelo y evidenciar si las diferencias

encontradas para los efectos principales y para las interacciones de orden 2 son

significativas (p< 0,05) y qué parámetros hacen que se presente o no esta diferencia

(Tabla 18).

Mediante esta ANOVA lineal general fueron evaluados los supuestos

estadísticos de normalidad, homogeneidad de las varianzas e independencia de las

muestras sobre los residuales.

 86

Tabla 18. Parámetros de ANOVA para diferencias significativas de efectos

principales e interacciones de orden 2 en café tostado y molido.
Efecto R cuadrado R cuadrado
Variable Valor F Valor P
p.pal/Interacción (%) ajustado (%)
Altura 109,47 0,000
5-oxoprolina Grado de tostado 863,01 0,000 99,44 98,79
Altura*grado de
46,20 0,000
tostado
Altura 4,96 0,027
D-(+)-fructosa Grado de tostado 18,88 0,000 85,97 69,59
Altura*grado de
4,96 0,014
tostado
Altura 5,71 0,018
D-(+)-galactosa Grado de tostado 19,40 0,000 86,82 71,44
Altura*grado de
5,71 0,008
tostado
Myo-Inositol Grado de tostado 23,05 0,000 86,48 70,71
Altura 83,83 0,000
Acrilamida 95,96 91,25
Grado de tostado 47,35 0,000
Altura 16,06 0,000
ACGS Grado de tostado 1290,86 0,000 99,55 99,02
Altura*grado de
3,62 0,037
tostado
Altura 8,95 0,004
PFT 94,11 87,23
Grado de tostado 66,64 0,000
Altura 38,34 0,000
Color 99,59 99,12
Grado de tostado 1421,50 0,000
Grado de tostado 936,39 0,000
Densidad Altura*grado de 99,38 98,65
7,23 0,003
tostado
Altura 21,35 0,000
Humedad Grado de tostado 180,92 0,000 97,32 94,18
Altura*grado de
5,05 0,013
tostado
Altura 119,67 0,000
pH Grado de tostado 2431,13 0,000 99,77 99,5
Altura*grado de
9,12 0,001
tostado
 87

El PCA indicó que el agrupamiento de las muestras ocurre principalmente por el

grado de tostado, pero también que algunas de las sustancias cuantificadas guardan

relación con ciertos agrupamientos, caso de la D-(+)-galactosa, D-(+)-fructosa, D-

manitol, L-5-oxoprolina y la acrilamida; la ANOVA permitió corroborar esta información

mostrando que todas ellas presentan diferencias significativas (p<0,05) a excepción del

D-manitol. La ANOVA también mostró que la D-(+)-galactosa, D-(+)-fructosa, y la L-5-

oxoprolina tienen diferencias significativas tanto para los efectos principales como para

la interacción de orden 2 “altura*grado de tostado”. La acrilamida por su parte, mostró

diferencia significativa por altura y por grado de tostado como efectos principales

individuales.

Para el resto de sustancias o parámetros fisicoquímicos que mostraron una

diferencia significativa existe un factor común: el grado de tostado, hecho que

concuerda con toda la teoría que se ha relacionado a lo largo de este manuscrito.

El contenido de sustancias antioxidantes del café disminuye a medida que

aumenta el grado de tostado debido a la degradación progresiva que sufren como

consecuencia de la reacción de Maillard, para dar paso a la formación de melanoidinas

y productos de degradación (MRPs) (Ludwig, Bravo, De Peña, & Cid, 2013, 553). Los

parámetros fisicoquímicos cambian en relación a la pérdida de agua por aumento

progresivo de la temperatura a medida que avanza la curva de tostado, por lo que es

de esperarse que cambien en virtud de este proceso, además el color aumenta

proporcionalmente con tiempos prolongados de tostado gracias a un mayor tiempo de

reacción de precursores para la formación de estas melanoidinas y productos de

 88

caramelización. Los aminoácidos, como ya se observó, son el reactivo límite y se

condensan con los azúcares para dar paso a esos productos de la reacción de Maillard;

así los aminoácidos incluso a tostados bajos no sobreviven y los azúcares reductores,

que se encuentran en cantidades superiores a los aminoácidos, solo permanecieron

remanentes a tostados bajos.

En la Figura 12 se ilustra el comportamiento de la acrilamida con respecto a la

atura de siembra y el grado de tostado, la altura interna o zona de colección se anexa

al gráfico para ilustrar que no existe una tendencia marcada intra finca (estratificación

por lotes de producción).

Figura 12. Gráfica de efectos principales para la acrilamida.

G rá fic a d e e fe c to s p rin c ip a le s p a ra a c rila m id a

Medias ajus tadas
A ltura A ltura inte rna

400
350
300
250
Media

200
F in ca 1 F in ca 2 F in ca 3 1 2 3
Gra d o d e tue ste

400
350
300
250
200
Ba jo M e d io Alto
 89

Luego de que se establecieron estas diferencias significativas entre los

diferentes metabolitos y parámetros fisicoquímicos de las diferentes muestras por

efecto de altura y grado de tostado, y por la interacción de orden 2 “altura*grado de

tostado”, se procedió con la elaboración de la matriz de correlaciones (Tabla 19), para

establecer cuáles guardaban una correlación significativa entre ellos, teniendo en

cuenta como criterio de aceptación un valor p<0,05 y una correlación superior al 80%

(positiva o negativa). La tabla completa de correlaciones entre los parámetros

fisicoquímicos medidos y las sustancias cuantificadas en el café tostado y molido se

encuentra en el Apéndice B.

Tabla 19. Matriz de correlaciones para el café tostado y molido.

VARIABLES TIPO D-(+)-fructosa ACGS PFT Color

Corr. 0,984
D-(+)-galactosa
Valor p 0,000
Corr. 0,823
PFT
Valor p 0,000
Corr. 0,991 0,813
Color
Valor p 0,000 0,000
Corr. 0,962 0,800 0,971
Densidad
Valor p 0,000 0,000 0,000

De estas correlaciones es importante destacar: los azúcares remanentes

guardan correlaciones entre sí pues estos comparten la misma ruta metabólica además

sufren el mismo cambio por efecto del tostado del café; la densidad guarda correlación

con el contenido de sustancias antioxidantes pues a mayor uniformidad de la partícula

de café, mayor grado de extracción y expresión de los compuestos antioxidantes, lo

que también ocurre para el color, es decir, a mayor uniformidad de la partícula de café,

mayor uniformidad en el color a partir de su medición. Al sufrir el mismo efecto de

 90

degradación por efecto del proceso de tostado, los valores de sustancias antioxidantes

deben estar correlacionados entre sí y estos a su vez con el color, el cual aumenta con

el grado de tostado, por lo que cafés de diferentes colores varían en su composición de

sustancias antioxidantes.

En la tabla completa de correlaciones (Apéndice B) se pudo observar otro tipo de

correlaciones que aunque se presentan, no cumplen con el criterio de inclusión aquí

propuesto (p<0,05 y una correlación superior al 80% positiva o negativa). Estas

correlaciones que aunque no son muy significativas es importante mencionarlas:

correlaciones de la acrilamida con el contenido de ácidos clorogénicos, el color y el pH.

En un apartado anterior se mencionó como según autores a mayor grado de

tostado, mayor color y menor contenido de acrilamida (Bagdonaite et al., 2008, 6085;

Gökmen & Şenyuva, 2006, 242), y se explicó que posiblemente ese efecto no se

observó en este estudio por parar la cinética de tostado justo antes de que esto

ocurriera, pero sin importar el resultado, es clara la intrínseca relación que existe entre

los niveles de acrilamida formados y los colores alcanzados, que la variación de uno

está directamente relacionado con la variación del otro (Summa et al., 2007, 1849).

En el caso de los ácidos clorogénicos como mayores responsables de la

actividad antioxidante del café, estos han mostrado tener efecto en el aumento de la

formación de la acrilamida por tres mecanismos principales: incremento de la formación

de 5-HMF el cual es un potente precursor en la formación de acrilamida; segundo,

disminuye la energía de activación de la 3-APA para su conversión en acrilamida y por

último, mantienen un alto potencial redox durante la reacción de Maillard evitando el

 91

ataque por radicales libres a la acrilamida formada (Cai et al., 2014, 1; Jin et al., 2013,

611; Liu et al., 2015, 46; Zhang & Zhang, 2008, 105). Si se remite al capítulo 1, el

contenido de polifenoles totales y de ácidos clorogénicos no presentó diferencia

estadísticamente significativa, por lo que en este estudio no se debe relacionar los altos

o bajos contenidos de acrilamida formados como dependientes de los niveles de estas

sustancias, además, otros autores mencionan que la acrilamida también puede verse

disminuida por efecto de las sustancias antioxidantes las cuales podrían inhibir su

formación mediante el atrapamiento de compuestos carbonílicos (Liu et al., 2015, 46).

Por último, investigaciones han propuesto como valores bajos de pH podrían

bloquear la adición nucleofílica de la asparagina con el compuesto carbonílico,

previniendo la formación de la respectiva base de Shiff, el intermediario clave en la

formación de acrilamida (Mestdagh et al., 2008, 26), lo que podría estar relacionado

con los bajos niveles de acrilamida formados en el café proveniente de la Finca 2 la

cual también mostró diferencia significativa en los valor de pH en el café verde.

Hasta este punto se estableció que existen diferencias en la composición

química de la materia prima proveniente de diferentes locaciones de cosecha y que

esto tiene un efecto en la formación de acrilamida, así como también se estableció que

los aminoácidos son el reactivo limite en la formación de acrilamida y que esta mostró

diferencias significativas por el efecto de la materia prima y el grado de tostado. Con

todo esto se tuvo plena identificación del comportamiento de la acrilamida en relación a

todos los parámetros y sustancias cuantificados.

 92

Por ello, lo último que se realizó en este estudio con el objetivo de establecer la

correlación directa de aquellas sustancias precursoras con capacidad predictiva sobre

la producción de acrilamida, fue un análisis PLS, el cual se elaboró por grado de

tostado con la finalidad de establecer si independientemente de este, las sustancias

relacionadas con el comportamiento de la acrilamida seguían siendo las mismas al

aumentar o disminuir el grado de tostado (Tablas 20-22) (Figuras 13-18).

Tabla 20. Análisis PLS para café de tostado bajo.

R cuadrado
Componente Varianza X Error R cuadrado Precisión
(predicho)
1 0,430905 71167,2 0,367087 195789 0
2 22285,9 0,801804 430785 0
3 12848,7 0,885732 502959 0
4 5883,2 0,947679 541403 0
5 150,2 0,986640 612925 0
6 17,4 0,999846 637876 0
7 4,1 0,999963 639872 0

Figura 13. Gráfica de predictores para la formación de acrilamida con 1) L-glicina,

2) L-valina, 3) L-leucina, 4) L-5-oxoprolina, 5) L-metionina, 6) L-treoina, 7) L-
asparagina para café de tostado bajo.

600
6
500

400
Coeficientes

300

1 7
200
5
3
100 2
4

2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
P r e d ic t o r e s
 93

Figura 14. Gráfica de respuesta de los predictores para la formación de

acrilamida en café de tostado bajo.

450 V a ria b le
A ju s t a d o
400 C ro s s va l
Respuesta calculada

350

300

250

200

150

100

50
50 100 150 200 250 300 350 400 450
R e s p u e s ta a c tu a l

Tabla 21. Análisis PLS para café de tostado medio.

R cuadrado
Componente Varianza X Error R cuadrado Precisión
(predicho)
1 0,448622 34557,9 0,00430 69944 0
2 17078,7 0,75311 124710 0
3 5119,1 0,92600 144625 0
4 2329,8 0,96632 139367 0
5 834,5 0,98794 152349 0
6 93,8 0,99864 163202 0
7 0,0 1,00000 168486 0
 94

Figura 15. Gráfica de predictores para la formación de acrilamida con 1) L-glicina,

2) L-valina, 3) L-leucina, 4) L-5-oxoprolina, 5) L-metionina, 6) L-treoina, 7) L-
asparagina para café de tostado medio.

400
6
300
1
200
3 5 7
Coeficientes

100 2 4

-1 0 0

-2 0 0

-3 0 0

-4 0 0
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
P re d ic to re s

Figura 16. Gráfica de respuesta de los predictores para la formación de

acrilamida en café de tostado medio.

450 V ariable
A jus tado
400 Cros s val
Respuesta calculada

350

300

250

200

150
150 200 250 300 350 400 450
R e s p u e s ta a c tu a l
 95

Tabla 22. Análisis PLS para café de tostado alto.

R cuadrado
Componente Varianza X Error R cuadrado Precisión
(predicho)
1 0,448164 66674,6 0,44383 137033 0
2 29821,3 0,75124 280837 0
3 10591 0,91165 303223 0
4 4945,3 0,95875 310127 0
5 1741,7 0,98547 344356 0
6 154,7 0,99871 370076 0
7 0,0 1,00000 380118 0

Figura 17. Gráfica de predictores para la formación de acrilamida con 1) L-glicina,

2) L-valina, 3) L-leucina, 4) L-5-oxoprolina, 5) L-metionina, 6) L-treoina, 7) L-
asparagina para café de tostado alto.

500 6

1
250
Coeficientes

3 5 7
2 4

-250

-500
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
Predictores
 96

Figura 18. Gráfica de respuesta de los predictores para la formación de

acrilamida en café de tostado alto.

600 Variable
Ajustado
Crossval
Respuesta calculada

500

400

300

200
200 300 400 500 600
Respuesta Actual

Con este análisis PLS se identificó que es posible predecir el comportamiento

de la acrilamida independientemente del grado de tostado con el mismo set de

aminoácidos (L-glicina, L-valina, L-leucina, L-5-oxoprolina, L-metionina, L-treoina, 7, L-

ssparagina), con coeficientes de correlación de 0,999963; 1,000 y 1,000 y con errores

cercanos a 4,1; 0,0 y 0,0 para las materias primas tostadas a niveles bajo, medio y alto

respectivamente, donde estos coeficientes de correlación y errores corresponden al

séptimo predictor, es decir, la asparagina.

 97

Conclusiones

El café muestreado proveniente del municipio de Andes, Antioquia, en tres

alturas diferentes de cosecha, mostró diferencias en su composición química y

fisicoquímica.

El hecho de que las diferentes alturas de siembra produzcan café diferente, pudo

ser atribuido hipotéticamente a los microclimas de cada zona de colección y su

composición en el suelo, ya que el beneficio y procesamiento para todas fue el mismo.

Los bajos contenidos de L-5-oxoprolina, L-serina, L-ácido glutámico y D-(+)-

ribosa hacen que el café proveniente de la Finca 2 (la cual se agrupa en el PCA), sea

significativamente diferente (p<0,05) al de las otras dos fincas (alturas) de cosecha.

El contenido de sustancias antioxidantes fue similar en las tres materias primas

provenientes de las tres fincas, lo que hace que esta característica sea positiva y no un

criterio de exclusión a la hora de la selección de cualquiera de las mismas.

Se validó una nueva metodología por GC/MS para la cuantificación de acrilamida

en café tipo excelso proveniente de una misma región del País y diferentes alturas de

cosecha. Posterior a esta etapa de validación se pudo establecer que la metodología

fue lineal, precisa, reproducible y selectiva y se implementó como una nueva

metodología de cuantificación y verificación de calidad ya que en Colombia no se

contaba con metodologías por GC/MS para la cuantificación de acrilamida en café;

además esta técnica es novedosa al obviar el paso de derivatización del analito, lo cual

es recurrente en análisis por GC/MS.

 98

Luego de la cuantificación de aminoácidos y azúcares remanentes se evidenció

que los aminoácidos son el reactivo límite en la reacción de Maillard y en la formación

de acrilamida.

Al no encontrar niveles de D-(+)-glucosa remanentes pero si de D-(+)-fructosa,

se concluyó que el azúcar reductor más involucrado en la formación de acrilamida es la

D-(+)-glucosa.

Aunque los contenidos de L-asparagina y glucosa no son significativamente

diferentes en las materias primas, se evidenció que sus ligeros bajos niveles si influyen

en la formación de acrilamida, pues la Finca 2 que obtuvo los menores valores de estos

precursores, también obtuvo los valores más bajos de acrilamida.

Luego del análisis PCA en café tostado y molido se estableció que las fincas se

agrupan no por altura sino por nivel de tostado, y que esto guarda relación con los

niveles de sustancias encontrados, por ejemplo, las muestras de tostado alto se ubican

en el mismo cuadrante donde se ubica la acrilamida, la cual presenta mayores niveles

en estas muestras.

En relación con la merma por el efecto de tostado se evidenció un incremento

progresivo o concentración de sustancias como la L-5-oxoprolina, producto de la

oxidación de la prolina y de los azúcares alcoholes que no participan en la reacción de

Maillard.

El grado de tostado es el efecto principal común que influye directamente y de

manera significativa (p<0,05) tanto en la composición de los precursores como en el

 99

contenido de sustancias antioxidantes, los cuales están relacionados con el contenido

de acrilamida. Los valores de acrilamida son significativamente diferentes (p<0,05)

según el grado de tostado y según la altura de cosecha del café como efectos

principales, variación que está ligada hipotéticamente a la composición del suelo y a los

microclimas.

Mediante un modelo PLS crosvalidado se estableció que los aminoácidos L-

glicina, L-valina, L-leucina, L-5-oxoprolina, L-metionina, L-treoina, L-asparagina, se

pueden postular como predictores para la formación de acrilamida, teniendo la

asparagina coeficientes de correlación de 0,999963; 1,000 y 1,000 y errores cercanos a

4,1; 0,0 y 0,0 para las materias primas tostadas a niveles bajo, medio y alto

respectivamente.

Se evidenció que es posible sumar a los cafés producidos con bajos niveles de

acrilamida altos niveles de L-5-oxoprolina la cual está relacionada con efectos positivos

sobre la cognición humana.

Los tres grados de tostado seleccionados para obtener perfiles de bebida de

interés comercial, pudieron ser empleados para identificar que el café de mayor tostado

contiene los máximos niveles de acrilamida y perfil sensorial adecuado.

Según la alta calidad en taza y el contenido de sustancias antioxidantes, es

posible elaborar un café con excelentes características organolépticas, y con bajos

niveles de acrilamida, una vez se evidenció que existen alturas que producen materias

primas con baja expresión de precursores.

 100

Perspectivas y recomendaciones

Debido a que los niveles de tostado del café de este estudio obedecen a

intereses comerciales, se recomienda evaluar a profundidad diferentes curvas de

tostado y empleando los mismos principios y/o objetivos aquí descritos.

Se recomienda también hacer en la medida de lo posible un mapeo de mayor

cobertura sobre la geografía nacional, que permita alimentar a profundidad un modelo

de regresión (PLS) para la predicción del comportamiento de la acrilamida.

Por último, se recomienda realizar estudios de microambiente y de composición

del suelo que permitan comprender las relaciones entre el genotipo y estos ambientes,

para posteriormente correlacionarlos con los niveles de acrilamida formados.

 101

Referencias bibliográficas

Akıllıoglu, H. G., & Gökmen, V. (2013). Mitigation of acrylamide and hydroxymethyl

furfural in instant coffee by yeast fermentation. Food Research International.
doi:10.1016/j.foodres.2013.07.057

Albishri, H. M., & El-Hady, D. A. (2014). Eco-friendly ionic liquid based ultrasonic
assisted selective extraction coupled with a simple liquid chromatography for the
reliable determination of acrylamide in food samples. Talanta, 118(April 2002),
129–36. doi:10.1016/j.talanta.2013.10.015

Alimentos, E. N., & El, P. (2015). No Title.

Alvarez, R., Carvalho, C. P., Sierra, J., Lara, O., Cardona, D., & Londono-Londono, J.
(2012). Citrus juice extraction systems: effect on chemical composition and
antioxidant activity of clementine juice. J Agric Food Chem, 60(3), 774–781.
doi:10.1021/jf203353h

Alves, R. C., Soares, C., Casal, S., Fernandes, J. O., & Oliveira, M. B. P. P. (2010).
Acrylamide in espresso coffee: Influence of species, roast degree and brew length.
Food Chemistry, 119(3), 929–934. doi:10.1016/j.foodchem.2009.07.051

Anese, M., Nicoli, M. C., Verardo, G., Munari, M., Mirolo, G., & Bortolomeazzi, R.
(2014). Effect of vacuum roasting on acrylamide formation and reduction in coffee
beans. Food Chemistry, 145, 168–172. doi:10.1016/j.foodchem.2013.08.047

Anese, M., Suman, M., & Nicoli, M. C. (2010). Acrylamide removal from heated foods.
Food Chemistry, 119(2), 791–794. doi:10.1016/j.foodchem.2009.06.043

Avelino, J., Barboza, B., Araya, J. C., Fonseca, C., Davrieux, F., Guyot, B., & Cilas, C.
(2005a). Effects of slope exposure, altitude and yield on coffee quality in two
altitude terroirs of Costa Rica, Orosi and Santa Mar??a de Dota. Journal of the
Science of Food and Agriculture, 85(11), 1869–1876. doi:10.1002/jsfa.2188

Avelino, J., Barboza, B., Araya, J. C., Fonseca, C., Davrieux, F., Guyot, B., & Cilas, C.
(2005b). Effects of slope exposure, altitude and yield on coffee quality in two
altitudeterroirs of Costa Rica, Orosi and Santa María de Dota. Journal of the
 102

Science of Food and Agriculture, 85(11), 1869–1876. doi:10.1002/jsfa.2188

Bagdonaite, K., Derler, K., & Murkovic, M. (2008). Determination of acrylamide during
roasting of coffee. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 56(15), 6081–6.
doi:10.1021/jf073051p

Bagdonaite, K., Viklund, G., Skog, K., & Murkovic, M. (2006). Analysis of 3-
aminopropionamide: a potential precursor of acrylamide. Journal of Biochemical
and Biophysical Methods, 69(1-2), 215–21. doi:10.1016/j.jbbm.2006.05.008

Banchero, M., Pellegrino, G., & Manna, L. (2013). Supercritical fluid extraction as a
potential mitigation strategy for the reduction of acrylamide level in coffee. Journal
of Food Engineering, 115(3), 292–297. doi:10.1016/j.jfoodeng.2012.10.045

Barbosa, J. N., Borem, F. M., Cirillo, M. A., Malta, M. R., Alvarenga, A. A., & Alves, H.
M. R. (2012). Coffee Quality and Its Interactions with Environmental Factors in
Minas Gerais, Brazil. Journal of Agricultural Science, 4(5), 181–190.
doi:10.5539/jas.v4n5p181

Bassama, J., Brat, P., Bohuon, P., Boulanger, R., & Günata, Z. (2010). Study of
acrylamide mitigation in model system: Effect of pure phenolic compounds. Food
Chemistry, 123(2), 558–562. doi:10.1016/j.foodchem.2010.04.071

Bertrand, B., Boulanger, R., Dussert, S., Ribeyre, F., Berthiot, L., Descroix, F., & Joët,
T. (2012). Climatic factors directly impact the volatile organic compound fingerprint
in green Arabica coffee bean as well as coffee beverage quality. Food Chemistry,
135(4), 2575–83. doi:10.1016/j.foodchem.2012.06.060

Bertrand, B., Vaast, P., Alpizar, E., Etienne, H., Davrieux, F., & Charmetant, P. (2006).
Comparison of bean biochemical composition and beverage quality of Arabica
hybrids involving Sudanese-Ethiopian origins with traditional varieties at various
elevations in Central America. Tree Physiology, 26(9), 1239–1248. Retrieved from
http://www.scopus.com/inward/record.url?eid=2-s2.0-
33745426636&partnerID=tZOtx3y1

Bortolomeazzi, R., Munari, M., Anese, M., & Verardo, G. (2012). Rapid mixed mode
solid phase extraction method for the determination of acrylamide in roasted coffee
by HPLC-MS/MS. Food Chemistry, 135(4), 2687–93.
 103

doi:10.1016/j.foodchem.2012.07.057
Cai, Y., Zhang, Z., Jiang, S., Yu, M., Huang, C., Qiu, R., … Li, Y. (2014). Chlorogenic
acid increased acrylamide formation through promotion of HMF formation and 3-
aminopropionamide deamination. Journal of Hazardous Materials, 268, 1–5.
doi:10.1016/j.jhazmat.2013.12.067

Capuano, E., & Fogliano, V. (2011). Acrylamide and 5-hydroxymethylfurfural (HMF): A

review on metabolism, toxicity, occurrence in food and mitigation strategies. LWT -
Food Science and Technology, 44(4), 793–810. doi:10.1016/j.lwt.2010.11.002

Cb, A. (2002). Health & Nutrition Acrylamide mitigation in coffee using Novozymes
Acrylaway ® CB L, (April), 1–3.

Ciencias, F. D. E., & Sociología, P. Y. (2012). Universidad complutense de madrid.

Claus, A., Carle, R., & Schieber, A. (2008). Acrylamide in cereal products: A review.
Journal of Cereal Science, 47(2), 118–133. doi:10.1016/j.jcs.2007.06.016

Commission, E. (2002). Opinion of the Scientific Committee on Food on new findings

regarding the presence of acrylamide in food, (July).

Costa, A. S. G., Alves, R. C., Vinha, A. F., Barreira, S. V. P., Nunes, M. A., Cunha, L.
M., & Oliveira, M. B. P. P. (2014). Optimization of antioxidants extraction from
coffee silverskin, a roasting by-product, having in view a sustainable process.
Industrial Crops and Products, 53, 350–357. doi:10.1016/j.indcrop.2014.01.006

De Vleeschouwer, K., Plancken, I. Van der, Loey, A. Van, & Hendrickx, M. E. (2009).
Role of precursors on the kinetics of acrylamide formation and elimination under
low moisture conditions using a multiresponse approach – Part I: Effect of the type
of sugar. Food Chemistry, 114(1), 116–126. doi:10.1016/j.foodchem.2008.09.024

De Vleeschouwer, K., Van der Plancken, I., Van Loey, A., & Hendrickx, M. E. (2007).
Kinetics of acrylamide formation/elimination reactions as affected by water activity.
Biotechnology Progress, 23(3), 722–8. doi:10.1021/bp060389f

De Wilde, T., De Meulenaer, B., Mestdagh, F., Govaert, Y., Vandeburie, S., Ooghe, W.,
… Verhé, R. (2006). Influence of fertilization on acrylamide formation during frying
 104

of potatoes harvested in 2003. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 54(2),

404–8. doi:10.1021/jf0521810

Decazy, F., Avelino, J., Guyot, B., Perriot, J. J., Pineda, C., & Cilas, C. (2003). Quality
of different Honduran coffees in relation to several environments. Journal of Food
Science, 68(7), 2356–2361. Retrieved from
http://www.scopus.com/inward/record.url?eid=2-s2.0-
0141702218&partnerID=tZOtx3y1

Delatour, T., Périsset, A., Goldmann, T., Riediker, S., & Stadler, R. H. (2004). Improved
sample preparation to determine acrylamide in difficult matrixes such as chocolate
powder, cocoa, and coffee by liquid chromatography tandem mass spectroscopy.
Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52(15), 4625–31.
doi:10.1021/jf0498362

Desbrosses, G., & Steinhauser, D. (2005). Metabolome analysis using GC-MS. Lotus
Japonicus Handbook, 4(6), 165–174. doi:10.1007/1-4020-3735-X_17

Dybing, E., & Sanner, T. (2003). Risk assessment of acrylamide in foods. Toxicological
Sciences : An Official Journal of the Society of Toxicology, 75(1), 7–15.
doi:10.1093/toxsci/kfg165

EFSA. (2015a). EFSA Press Release_ Acrylamide in food is a public health concern.

EFSA. (2015b). Scientific Opinion on Acrylamide in food. EFSA Journal, 13(6), 4104.
doi:10.2903/j.efsa.2015.4104.

Eriksson, S. (2005). Acrylamide in food products : Identification , formation and

analytical methodology.

Eriksson, S., & Karlsson, P. (2006). Alternative extraction techniques for analysis of
acrylamide in food: Influence of pH and digestive enzymes. LWT - Food Science
and Technology, 39(4), 393–399. doi:10.1016/j.lwt.2005.03.002

Erkekoglu, P., & Baydar, T. (2014). Acrylamide neurotoxicity. Nutritional Neuroscience,

17(2), 49–57. Retrieved from 10.1179/1476830513Y.0000000065
 105

Farah, A. (2012). Coffee Constituents. Coffee: Emerging Health Effects and Disease
Prevention, 21–58. doi:10.1002/9781119949893.ch2

Food and Drug Administration. (2001). Guidance for Industry: Bioanalytical Method
Validation. U.S. Department of Health and Human Services, (May), 4–10.
doi:http://www.labcompliance.de/documents/FDA/FDA-Others/Laboratory/f-507-
bioanalytical-4252fnl.pdf

Food, E., & Authority, S. (2012). Update on acrylamide levels in food from monitoring
years 2007 to 2010 1, 10(10), 1–38. doi:10.2903/j.efsa.2012.2938.Available

Gil, A. (2012). Estabilidad y Actividad Antioxidante de Catequinas Presentes en Cacaos

Colombianos durante los Procesos de Pre e Industrilización., 16, 119.
doi:10.5334/ai.1615

Go, V. (2005). Study of acrylamide in coffee using an improved liquid chromatography

mass spectrometry method : Investigation of colour changes and acrylamide
formation in coffee during roasting, 22(March), 214–220.
doi:10.1080/02652030500109834

Gökmen, V., Kocadağlı, T., Göncüoğlu, N., & Mogol, B. A. (2012). Model studies on the
role of 5-hydroxymethyl-2-furfural in acrylamide formation from asparagine. Food
Chemistry, 132(1), 168–174. doi:10.1016/j.foodchem.2011.10.048

Gökmen, V., & Şenyuva, H. Z. (2006). Study of colour and acrylamide formation in
coffee, wheat flour and potato chips during heating. Food Chemistry, 99(2), 238–
243. doi:10.1016/j.foodchem.2005.06.054

Granby, K., & Fagt, S. (2004). Analysis of acrylamide in coffee and dietary exposure to
acrylamide from coffee. Analytica Chimica Acta, 520(1-2), 177–182.
doi:10.1016/j.aca.2004.05.064

Guenther, H., Anklam, E., Wenzl, T., & Stadler, R. H. (2007). Acrylamide in coffee:
review of progress in analysis, formation and level reduction. Food Additives and
Contaminants, 24 Suppl 1, 60–70. doi:10.1080/02652030701243119

Headquarters, W. H. O. (2002). Report of a Joint FAO / WHO Consultation, (June).

 106

Hoenicke, K., & Gatermann, R. (n.d.). Studies on the stability of acrylamide in food
during storage. Journal of AOAC International. Retrieved from
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15759751

Hospitalarios, Y. D. L. R. (2002). Resolucion Numero 01164 De 2002.

Alianzaconsultoria.Com, 2002(02), 1–7. Retrieved from
http://www.alianzaconsultoria.com/PDF/Resolucion 1164 gestion residuos.pdf

IARC. (1994). Acrylamide. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks

to Humans Volume 60 Some Industrial Chemicals, 389–433.

ICONTEC Internacional. (n.d.). Norma Tecnica Colombiana NTC 5938-CAFE VERDE

USO INDUSTRIAL.

Jaeger, H., Janositz, A., & Knorr, D. (2010). The Maillard reaction and its control during
food processing. The potential of emerging technologies. Pathologie-Biologie,
58(3), 207–13. doi:10.1016/j.patbio.2009.09.016

Jezussek, M., & Schieberle, P. (2003). A new LC/MS-method for the quantitation of
acrylamide based on a stable isotope dilution assay and derivatization with 2-
mercaptobenzoic acid. Comparison with two GC/MS methods. Journal of
Agricultural and Food Chemistry, 51(27), 7866–71. doi:10.1021/jf0349228

Jin, C., Wu, X., & Zhang, Y. (2013). Relationship between antioxidants and acrylamide
formation : A review. FRIN, 51(2), 611–620. doi:10.1016/j.foodres.2012.12.047

Joët, T., Laffargue, A., Descroix, F., Doulbeau, S., Bertrand, B., kochko, A. de, &
Dussert, S. (2010). Influence of environmental factors, wet processing and their
interactions on the biochemical composition of green Arabica coffee beans. Food
Chemistry, 118(3), 693–701. doi:10.1016/j.foodchem.2009.05.048

Katerine K. Stenerson. (2011). The Derivatization and Analysis of Amino Acids by GC-.
Sigma-Aldrich, 25(2), 9–11. Retrieved from
http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/articles/reporter-
us/pdf/the-derivatization.pdf

Kleinwächter, M., & Selmar, D. (2010). Influence of drying on the content of sugars in
 107

wet processed green Arabica coffees. Food Chemistry, 119(2), 500–504.

doi:10.1016/j.foodchem.2009.06.048

Kuncewicz, A., & Michalak, J. (2013). Journal of Food Composition and Analysis RP-
HPLC-DAD studies on acrylamide in cereal-based baby foods, 32(23701), 68–73.
doi:10.1016/j.jfca.2013.08.006

Kwon, D.-J., Jeong, H.-J., Moon, H., Kim, H.-N., Cho, J.-H., Lee, J.-E., … Hong, Y.-S.
(2015). Assessment of green coffee bean metabolites dependent on coffee quality
using a 1H NMR-based metabolomics approach. Food Research International, 67,
175–182. doi:10.1016/j.foodres.2014.11.010

L, A. C. B. (2011). Acrylamide , a contaminant naturally formed in many food products.

Li Kwok Cheong, J. D., Croft, K. D., Henry, P. D., Matthews, V., Hodgson, J. M., &
Ward, N. C. (2014). Green coffee polyphenols do not attenuate features of the
metabolic syndrome and improve endothelial function in mice fed a high fat diet.
Archives of Biochemistry and Biophysics, 559, 46–52.
doi:10.1016/j.abb.2014.02.005

Lineback, D. R., Coughlin, J. R., & Stadler, R. H. (2012). Acrylamide in foods: a review
of the science and future considerations. Annual Review of Food Science and
Technology, 3, 15–35. doi:10.1146/annurev-food-022811-101114

Liu, Y., Wang, P., Chen, F., Yuan, Y., Zhu, Y., Yan, H., & Hu, X. (2015). Role of plant
polyphenols in acrylamide formation and elimination. Food Chemistry, 186, 46–53.
doi:10.1016/j.foodchem.2015.03.122

Loaëc, G., Jacolot, P., Helou, C., Niquet-Léridon, C., & Tessier, F. J. (2014).
Acrylamide, 5-hydroxymethylfurfural and N(ε)-carboxymethyl-lysine in coffee
substitutes and instant coffees. Food Additives & Contaminants. Part A, Chemistry,
Analysis, Control, Exposure & Risk Assessment, 31(4), 593–604.
doi:10.1080/19440049.2014.885661

Loaëc, G., Niquet-Léridon, C., Henry, N., Jacolot, P., Volpoet, G., Goudemand, E., …
Tessier, F. J. (2014). Effects of variety, agronomic factors, and drying on the
amount of free asparagine and crude protein in chicory. Correlation with the
acrylamide formation during roasting. Food Research International.
 108

doi:10.1016/j.foodres.2014.03.010
Ludwig, I. A., Bravo, J., De Peña, M. P., & Cid, C. (2013). Effect of sugar addition
(torrefacto) during roasting process on antioxidant capacity and phenolics of coffee.
LWT - Food Science and Technology, 51(2), 553–559.
doi:10.1016/j.lwt.2012.12.010

Ludwig, I. A., Sánchez, L., De Peña, M. P., & Cid, C. (2014). Contribution of volatile
compounds to the antioxidant capacity of coffee. Food Research International, 61,
67–74. doi:10.1016/j.foodres.2014.03.045

Machado, S. R., Parise, E. R., & de Carvalho, L. (2014). Coffee has hepatoprotective
benefits in Brazilian patients with chronic hepatitis C even in lower daily
consumption than in American and European populations. The Brazilian Journal of
Infectious Diseases : An Official Publication of the Brazilian Society of Infectious
Diseases, 18(2), 170–6. doi:10.1016/j.bjid.2013.09.001

Maeso, N., del Castillo, C., Cornejo, L., García-Acicollar, M., Alguacil, L. F., & Barbas,
C. (2006). Capillary electrophoresis for caffeine and pyroglutamate determination in
coffees. Study of the in vivo effect on learning and locomotor activity in mice.
Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 41(4), 1095–1100.
doi:10.1016/j.jpba.2006.01.062

Masson, J., Liberto, E., Brevard, H., Bicchi, C., & Rubiolo, P. (2014). A metabolomic
approach to quality determination and authentication of raw plant material in the
fragrance field. Iris rhizomes: a case study. Journal of Chromatography. A, 1368,
143–54. doi:10.1016/j.chroma.2014.09.076

Medeiros Vinci, R., Mestdagh, F., & De Meulenaer, B. (2012). Acrylamide formation in
fried potato products – Present and future, a critical review on mitigation strategies.
Food Chemistry, 133(4), 1138–1154. doi:10.1016/j.foodchem.2011.08.001

Mestdagh, F., Maertens, J., Cucu, T., Delporte, K., Van Peteghem, C., & De Meulenaer,
B. (2008). Impact of additives to lower the formation of acrylamide in a potato
model system through pH reduction and other mechanisms. Food Chemistry,
107(1), 26–31. doi:10.1016/j.foodchem.2007.07.013

Mills, C. E., Oruna-Concha, M. J., Mottram, D. S., Gibson, G. R., & Spencer, J. P. E.
(2013). The effect of processing on chlorogenic acid content of commercially
available coffee. Food Chemistry, 141(4), 3335–40.
 109

doi:10.1016/j.foodchem.2013.06.014

Monteiro, M. C., & Farah, A. (2012). Chlorogenic acids in Brazilian Coffea arabica
cultivars from various consecutive crops. Food Chemistry, 134(1), 611–614.
doi:10.1016/j.foodchem.2012.02.118

Murkovic, M., & Derler, K. (2006a). Analysis of amino acids and carbohydrates in green
coffee. Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 69(1-2), 25–32.
doi:10.1016/j.jbbm.2006.02.001

Murkovic, M., & Derler, K. (2006b). Analysis of amino acids and carbohydrates in green
coffee. Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 69(1-2), 25–32.
doi:10.1016/j.jbbm.2006.02.001

No Title. (n.d.).

O’Keefe, J. H., Bhatti, S. K., Patil, H. R., DiNicolantonio, J. J., Lucan, S. C., & Lavie, C.
J. (2013). Effects of habitual coffee consumption on cardiometabolic disease,
cardiovascular health, and all-cause mortality. Journal of the American College of
Cardiology, 62(12), 1043–51. doi:10.1016/j.jacc.2013.06.035

Oberthür, T., Läderach, P., Posada, H., Fisher, M. J., Samper, L. F., Illera, J., … Jarvis,
A. (2011). Regional relationships between inherent coffee quality and growing
environment for denomination of origin labels in Nariño and Cauca, Colombia. Food
Policy, 36(6), 783–794. doi:10.1016/j.foodpol.2011.07.005

Oliveira, S. D., Franca, A. S., Glória, M. B. A., & Borges, M. L. A. (2005). The effect of
roasting on the presence of bioactive amines in coffees of different qualities. Food
Chemistry, 90(1-2), 287–291. doi:10.1016/j.foodchem.2004.03.056

Oracz, J., Nebesny, E., & Zyżelewicz, D. (2011). New trends in quantification of
acrylamide in food products. Talanta, 86, 23–34. doi:10.1016/j.talanta.2011.08.066

Ortega, L. A., García, F. J. G., & Junca, T. G. (2011). Validacion de metodos analiticos
(AEFI).pdf.
 110

Outline, C. (2008). Chapter 3. Blood, (2007), 33–49.

Pastoriza, S., Ángel, J., & Morales, F. J. (2012). LWT - Food Science and Technology
Reactivity of acrylamide with coffee melanoidins in model systems, 45, 198–203.
doi:10.1016/j.lwt.2011.08.004

Pittet, A., Périsset, A., & Oberson, J.-M. (2004). Trace level determination of acrylamide
in cereal-based foods by gas chromatography–mass spectrometry. Journal of
Chromatography A, 1035(1), 123–130. doi:10.1016/j.chroma.2004.02.037

Prakash, K. M., & Tan, E.-K. (2011). Clinical evidence linking coffee and tea intake with
Parkinson’s disease. Basal Ganglia, 1(3), 127–130.
doi:10.1016/j.baga.2011.07.001

Puerta, G. (2011). Composición química de una taza de café. Avances En Química,

(414), 1–12. Retrieved from
http://www.cenicafe.org/es/index.php/nuestras_publicaciones/avances_tecnicos/pu
blicaciones_avt0414composicion_quimica_de_una_taza_de_cafe

Riboldi, B. P., Vinhas, Á. M., & Moreira, J. D. (2014). Risks of dietary acrylamide
exposure: A systematic review. Food Chemistry, 157, 310–322.
doi:10.1016/j.foodchem.2014.02.046

Rufián-Henares, J. a., & Pastoriza, S. (2015). Melanoidins in Coffee. Coffee in Health

and Disease Prevention. Elsevier Inc. doi:10.1016/B978-0-12-409517-5.00020-6

S. Oestreich-Janzen, Gmbh, C. (2010). Chemistry of Coffee. Comprehensive Natural

Products II Chemistry and Biology. Elsevier Inc. doi:http://dx.doi.org/10.1016/B978-
008045382-8.00708-5

Social, M. D. S. Y. P. (2012). Concepto cientifico acrilamida en panela, 38.

Stadler, R. H., Blank, I., Varga, N., Robert, F., Hau, J., Guy, P. a, … Riediker, S. (2002).
Acrylamide from Maillard reaction products. Nature, 419(6906), 449–50.
doi:10.1038/419449ª
 111

States, M., Ferrari, P., Busk, L., & Doerge, D. (2010). SCIENTIFIC REPORT OF EFSA,
8(5). doi:10.2903/j.efsa.2010.1599.

Suárez-Quiroz, M. L., Alonso Campos, A., Valerio Alfaro, G., González-Ríos, O.,
Villeneuve, P., & Figueroa-Espinoza, M. C. (2014). Isolation of green coffee
chlorogenic acids using activated carbon. Journal of Food Composition and
Analysis, 33(1), 55–58. doi:10.1016/j.jfca.2013.10.005

Summa, C. a., de la Calle, B., Brohee, M., Stadler, R. H., & Anklam, E. (2007). Impact
of the roasting degree of coffee on the in vitro radical scavenging capacity and
content of acrylamide. LWT - Food Science and Technology, 40(10), 1849–1854.
doi:10.1016/j.lwt.2006.11.016

Sun, S., Fang, Y., & Xia, Y. (2012). A facile detection of acrylamide in starchy food by
using a solid extraction-GC strategy. Food Control, 26(2), 220–222.
doi:10.1016/j.foodcont.2012.01.028

Taeymans, D., Wood, J., Ashby, P., Blank, I., Studer, A., Stadler, R. H., … Whitmore, T.
(2004). A review of acrylamide: an industry perspective on research, analysis,
formation, and control. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 44(5), 323–
47. doi:10.1080/10408690490478082

Tardiff, R. G., Gargas, M. L., Kirman, C. R., Carson, M. L., & Sweeney, L. M. (2010).
Estimation of safe dietary intake levels of acrylamide for humans. Food and
Chemical Toxicology : An International Journal Published for the British Industrial
Biological Research Association, 48(2), 658–67. doi:10.1016/j.fct.2009.11.048

The, R., Of, V., & Commission, T. H. E. (2013). AND OF THE EXPERT COMMITTEE "
AGRICULTURAL. doi:10.2903/j.efsa.2012.2938.

Valsta, L., Pesci, M., Wenzl, T., & Doerge, D. (2011). SCIENTIFIC REPORT OF EFSA,
9(4), 1–48. doi:10.2903/j.efsa.2011.2133.Available

van Boekel, M. A. J. S. (2006). Formation of flavour compounds in the Maillard reaction.

Biotechnology Advances, 24(2), 230–3. doi:10.1016/j.biotechadv.2005.11.004

Wang, H., Feng, F., Guo, Y., Shuang, S., & Choi, M. M. F. (2013). HPLC-UV
 112

quantitative analysis of acrylamide in baked and deep-fried Chinese foods. Journal

of Food Composition and Analysis, 31(1), 7–11. doi:10.1016/j.jfca.2013.02.006

Wilson, K. M., Mucci, L. a, Rosner, B. a, & Willett, W. C. (2010). A prospective study on

dietary acrylamide intake and the risk for breast, endometrial, and ovarian cancers.
Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention : A Publication of the American
Association for Cancer Research, Cosponsored by the American Society of
Preventive Oncology, 19(10), 2503–15. doi:10.1158/1055-9965.EPI-10-0391

Zhang, Y., & Zhang, Y. (2008). Effect of natural antioxidants on kinetic behavior of
acrylamide formation and elimination in low-moisture asparagine–glucose model
system. Journal of Food Engineering, 85(1), 105–115.
doi:10.1016/j.jfoodeng.2007.07.013

Zyzak, D. V, Sanders, R. a, Stojanovic, M., Tallmadge, D. H., Eberhart, B. L., Ewald, D.

K., … Villagran, M. D. (2003). Acrylamide formation mechanism in heated foods.
Journal of Agricultural and Food Chemistry, 51(16), 4782–7. doi:10.1021/jf034180i
 113

Apéndices

Apéndice A. Matriz de correlación para la materia prima.

Ácido D-(+) D-(+) D-(+)
VARIABLE Tipo Alanina Glicina Valina Leucina Isoleucina Prolina 5-oxoprolina Metionina Serina Treonina ACGS
glutámico Ribosa Fructosa Glucosa
Corr. 0,751
Glicina Valor
0,020
p
Corr. 0,792 0,910
Valina Valor
0,011 0,001
p
Corr. 0,779 0,922 0,981
Leucina Valor
0,013 0,000 0,000
p
Corr. 0,733 0,862 0,982 0,943
Isoleucina Valor
0,025 0,003 0,000 0,000
p
Corr. 0,866 0,766 0,760 0,695 0,772
Prolina Valor
0,003 0,016 0,017 0,038 0,015
p
Corr. 0,680 0,953 0,779 0,820 0,698 0,665
5-oxoprolina Valor
0,044 0,000 0,013 0,007 0,036 0,051
p
Corr. 0,523 0,882 0,745 0,717 0,729 0,688 0,878 -0,716
Serina Valor
0,149 0,002 0,021 0,030 0,026 0,040 0,002 0,030
p
Corr. 0,745 0,704 0,794 0,767 0,790 0,758 0,523 0,157 0,404
Treonina Valor
0,021 0,034 0,011 0,016 0,011 0,018 0,149 0,687 0,280
p
Corr. 0,632 0,640 0,841 0,751 0,853 0,654 0,478 0,119 0,518 0,776
Fenilalanina Valor
0,068 0,063 0,005 0,020 0,003 0,056 0,193 0,760 0,153 0,014
p
Corr. 0,552 0,839 0,657 0,626 0,634 0,758 0,870 -0,674 0,949 0,448
Ácido
aspártico Valor
0,124 0,005 0,054 0,072 0,067 0,018 0,002 0,047 0,000 0,227
p
Corr. 0,601 0,776 0,582 0,689 0,449 0,415 0,901 -0,408 0,632 0,333
Ácido
glutámico Valor
0,087 0,014 0,100 0,040 0,225 0,267 0,001 0,275 0,068 0,381
p
 114

Corr. 0,572 0,466 0,304 0,370 0,192 0,372 0,639 -0,081 0,327 0,143 0,758
Asparagina Valor
0,108 0,206 0,426 0,327 0,621 0,324 0,064 0,836 0,390 0,713 0,018
p
Corr. 0,165 0,597 0,391 0,442 0,347 0,198 0,695 -0,806 0,774 -0,125 0,646
D-(+) Ribosa Valor
0,672 0,089 0,298 0,234 0,361 0,610 0,038 0,009 0,014 0,749 0,060
p
Corr. 0,353 0,352 0,231 0,326 0,161 0,149 0,435 -0,355 0,337 -0,160 0,586 0,708 0,949
D-(+) Glucosa Valor
0,352 0,352 0,549 0,391 0,679 0,703 0,242 0,349 0,375 0,681 0,097 0,033 0,000
p
Corr. 0,351 0,376 0,253 0,349 0,185 0,155 0,454 -0,372 0,361 -0,145 0,596 0,727 0,947 0,999
D-(+)
Galactosa Valor
0,354 0,319 0,511 0,358 0,634 0,690 0,220 0,325 0,340 0,711 0,090 0,026 0,000 0,000
p
Corr. -0,209 -0,388 -0,258 -0,249 -0,265 -0,406 -0,289 0,117 -0,209 -0,689 -0,111 0,209 0,214 0,431
Myo-Inositol Valor
0,589 0,302 0,503 0,518 0,490 0,278 0,451 0,764 0,590 0,040 0,776 0,590 0,580 0,247
p
Corr. 0,096 0,204 0,144 0,236 0,131 0,159 0,311 0,074 0,146 0,163 0,415 0,075 0,033 -0,015 0,678
PFT Valor
0,806 0,598 0,712 0,541 0,737 0,683 0,416 0,851 0,708 0,676 0,267 0,848 0,934 0,969 0,045
p
 115

Apéndice B. Matriz de correlación para el café tostado y molido.

5- D-(+) D-(+) Myo- Acrilamid ACG Colo Densida
VARIABLES TIPO PFT
oxoprolina Fructosa Galactosa Inositol a S r d
Corr. -0,312
D-(+)
Fructosa Valor
0,113
p
Corr. -0,303 0,984
D-(+)
Galactosa Valor
0,125 0,000
p
Corr. 0,447 -0,067 -0,048
D-Manitol Valor
0,019 0,742 0,812
p
Corr. 0,554 -0,349 -0,385
Myo-Inositol Valor
0,003 0,074 0,048
p
Corr. 0,625 -0,252 -0,292 0,579
Acrilamida Valor
0,000 0,204 0,140 0,002
p
Corr. -0,752 0,532 0,527 -0,738 -0,534
ACGS Valor
0,000 0,004 0,005 0,000 0,004
p
Corr. -0,720 0,410 0,354 -0,565 -0,234 0,823
PFT Valor
0,000 0,034 0,070 0,002 0,240 0,000
p
0,81
Corr. -0,789 0,506 0,499 -0,746 -0,545 0,991
3
Color
Valor 0,00
0,000 0,007 0,008 0,000 0,003 0,000
p 0
0,80
Corr. -0,784 0,593 0,575 -0,671 -0,506 0,962 0,971
0
Densidad
Valor 0,00
0,000 0,001 0,002 0,000 0,007 0,000 0,000
p 0
- 0,70 -
Corr. 0,773 -0,558 -0,550 0,536 0,545 -0,926
0,879 9 0,876
pH
Valor 0,00
0,000 0,002 0,003 0,004 0,003 0,000 0,000 0,000
p 0
 116

Apéndice C. Calificación sensorial muestras Finca 1.

Fragancia
9,0
8,0
7,0
6,0
Imp.Global 5,0 Aroma
4,0
3,0

Cuerpo Acidez
F1A1TB F1A1TM F1A1TA

Fragancia
9,0
8,0
7,0
6,0
Imp.Global 5,0 Aroma
4,0
3,0

Cuerpo Acidez

F1A2TB F1A2TM F1A2TA

Fragancia
9,0
8,0
7,0
6,0
Imp.Global 5,0 Aroma
4,0
3,0

Cuerpo Acidez

F1A3TB F1A3TM F1A2TA

 117

Apéndice D. Calificación sensorial muestras Finca 2.

Fragancia
9,0
8,0
7,0
6,0
Imp.Global 5,0 Aroma
4,0
3,0

Cuerpo Acidez
F2A1TB F2A1TM F2A1TA

Fragancia
9,0
8,0
7,0
6,0
Imp.Global 5,0 Aroma
4,0
3,0

Cuerpo Acidez

F2A2TB F2A2TM F2A2TA

Fragancia
9,0
8,0
7,0
6,0
Imp.Global 5,0 Aroma
4,0
3,0

Cuerpo Acidez
F2A3TB F2A3TM F2A3TA
 118

Apéndice E. Calificación sensorial muestras Finca 3.

Fragancia
9,0
8,0
7,0
6,0
Imp.Global 5,0 Aroma
4,0
3,0

Cuerpo Acidez
F3A1TB F3A1TM F3A1TA

Fragancia
9,0
8,0
7,0
6,0
Imp.Global 5,0 Aroma
4,0
3,0

Cuerpo Acidez

F3A2TB F3A2TM F3A2TA

Fragancia
9,0
8,0
7,0
6,0
Imp.Global 5,0 Aroma
4,0
3,0

Cuerpo Acidez

F3A3TB F3A3TM F3A3TA