CASTIBLANCO-DUEÑAS, LC; MOLINA-MORENO, DM & RAMÍREZ-RODRÍGUEZ, LP
DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS: COMPARACIÓN DE MÉTODOS DE BRADFORD, LOWRY Y
BIURET
DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS: COMPARACIÓN
DE MÉTODOS DE BRADFORD, LOWRY Y BIURET
Castiblanco-Dueñas, Laura Alejandra; Molina-Moreno, Diana Marcela & Ramírez-Rodríguez, Laura
Paola.
RESUMEN
El trabajo a continuación se realizó con el objeto de comparar los métodos (de Biuret, de Lowry y de
Bradford) de determinación cuantitativa de proteínas.
En cada método se hicieron diluciones con la solución patrón de BSA, el extracto problema número 2,
Cloruro de sodio al 0.9%, el reactivo alcalino y el respectivo reactivo (Biuret, Folin y Bradford) para
cada uno de los métodos.
Las diluciones en cada método adquirieron una coloración (Azul o morado para el método de Biuret,
de incoloro a azul claro para el método de Lowry y de café azulado a azul para el método de
Bradford) después de un tiempo, y posteriormente, se tomaron datos de absorbancias de cada una para
realizar las curvas de calibración correspondientes.
PALABRAS CLAVE
Métodos de determinación cuantitativa de proteínas, diluciones, coloración y absorbancias.
ABSTRACT
The work ahead was done in order to compare the methods (Biuret, Lowry and Bradford) of
quantitative protein determination.
In each method, dilutions were made with BSA standard solution, problem extract number 2, 0.9%
sodium chloride, the alkaline reagent and the respective reagent (Biuret, Folin and Bradford) for each
of the methods).
The dilutions in each method acquired a coloration (Blue or purple for the Biuret method, from
colorless to light blue for the Lowry method and from bluish to blue coffee for the Bradford method)
after a while, and subsequently, absorbance data were taken from each one to perform the
corresponding calibration curves.
KEYWORDS
Methods of quantitative determination of proteins, dilutions, coloration and absorbances.
INTRODUCCIÓN
Las proteínas son macromoléculas orgánicas
compuestas por cadenas de aminoácidos. Su
importancia biológica radica en que son las
responsables de las funciones vitales de los
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organismos, como por ejemplo: Proteínas de sustancias interferentes, entre ellas:
transporte, que en el plasma sanguíneo llevan detergentes y soluciones básicas.
y unen moléculas o iones de órgano en órgano. Lo anterior, da lugar a la práctica de
laboratorio realizada y por ende la
La cuantificación de proteínas totales se puede compilación de los datos tomados y su
hacer a través de los métodos de Biuret, de posterior análisis.
Lowry y de Bradford.
MATERIALES Y MÉTODOS
El método de Biuret, se basa en la formación La cuantificación de proteínas se realizó, por
de un complejo coloreado (Morado) entre el colorimetría a través de tres métodos : Biuret,
ion Cu2+ y los enlaces peptídicos de las Lowry y Bradford. Se utilizó la Albúmina
proteínas, en medio básico. La intensidad del Serica Bovina (BSA) como proteína de
color de cada dilución o muestra dependerá de referencia para realizar las curvas de
la cantidad de proteína, según la Ley de calibración . Las lecturas de referencia se
Lambert-Beer A= ε.l.c. Este método tiene baja realizaron en un espectrofotómetro.Por otra
sensibilidad, lo que implica que habrá una alta parte el extracto problema empleado para esta
concentración de proteína. práctica fue el #2.
Método de Biuret
El método de Lowry, es un método Se rotularon 11 tubos, en los cuales se
colorimétrico que se basa en la formación de agregaron los reactivos en el siguiente orden:
un complejo coloreado con las proteínas, en el tubo del blanco se agregaron 2,0 mL de
donde, al igual que en el método anterior, la NaCl 0,9 % y 4,0 mL de reactivo de Biuret; en
intensidad de color es proporcional a la el tubo 1, 0,1 mL de BSA, 1,9 mL de NaCl y
cantidad de proteína, según la Ley de 4,0 mL de reactivo de Biuret; en el tubo 2, 0,3
Lambert-Beer A= ε.l.c. mL de BSA, 1,7 mL de NaCl 0,9% y 4,0 mL
Este método se da en dos etapas: de reactivo de Biuret; en el tubo 3, 0,5 mL de
En la primera etapa, en medio básico, los iones BSA, 1,5 mL de NaCl 0,9% y 4,0 mL de
Cu2+ se unen a las proteínas (Cu2+ - Proteína), reactivo de Biuret; en el tubo 4, 0,7 mL de
produciendo complejos de color azul claro. BSA, 1,3 mL de NaCl 0,9% y 4,0 mL de
También se forman residuos fenólicos de reactivo de Biuret; en el tubo 5, 0,9 mL de
tirosina, que harán parte de la segunda etapa. BSA, 1,1 mL de NaCl 0,9% y 4,0 mL de
Y en la segunda etapa, ocurre la reducción de reactivo de Biuret; en el tubo 6, 1,2 mL de
Reactivo de Folin-Ciocalteau gracias a los BSA, 0,8 mL de NaCl 0,9% y 4,0 mL de
residuos fenólicos de tirosina (que se reactivo de Biuret; en el tubo 7, 1,5 mL de
encuentran en la mayoría de proteínas) y el BSA, 0,5 mL de NaCl 0,9% y 4,0 mL de
cobre interviene, siendo este el catalizador. reactivo de Biuret; en el tubo 8, 2,0 mL de
El principal componente del reactivo de Folin- BSA Y 4,0 mL de reactivo de Biuret; en el
Ciocalteau es el ácido fosfomolibdotúngstico, tubo 9, 0,5 mL del extracto problema, 1,5 mL
que en principio es de color amarillo, pero al de NaCl 0,9% y 4,0 mL de reactivo de Biuret
reaccionar o reducirse con los residuos y por último, en el tubo 10, 1,0 mL del
fenólicos de tirosina, produce una coloración extracto problema, 1,0 de NaCl 0,9% y 4,0 mL
azul intensa. de reactivo de Biuret.
En cuanto al método de Bradford, este se Se mezcló bien, se dejaron en reposo los tubos
realiza por la unión de colorantes a las por 30 minutos, seguido a esto se ajustó el
proteínas, en este caso el Coomassie Brilliant espectrofotómetro en 540 nm y se determinó la
Blue G-250 , basándose en la conversión de la absorbancia de cada tubo
forma leuco del colorante (marrón-naranja) a
una de coloración azul intenso cuando los Método de Lowry
grupos aniónicos de colorante interaccionan
con los grupos funcionales (amino) de las Se rotularon 11 tubos, en los cuales se
proteínas. Este, es uno de los métodos más agregaron los reactivos en el siguiente orden:
usados , gracias a su exactitud, rapidez y pocas en el tubo del blanco 2,0 NaCl 0,9%, 2,0 mL
de reactivo alcalino, se agitó y se esperó 10
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minutos, luego 0,8 mL de NaCl 0,9% y 0,2 mL bradford. Para el tubo 1 50 μl de BSA, 450 μl
de reactivo de Folin; para el tubo 1, 0,2 mL de NaCl y 3 mL de Bradford. Para el tubo 3 150
BSA, 1,8 mL de NaCl 0,9%, 2,0 mL de μl de BSA, y 350 μl de NaCl y 3 mL de
reactivo alcalino, se agitó y se esperó 10 Bradford .Para el tubo 4 200 μl de BSA, 300
minutos, luego 0,8 mL de NaCl 0,9% y 0,2 mL μl de NaCl y 3 mL de Bradford . Para el tubo 5
de reactivo de Folin; para el tubo 2, 0,4 mL de 250 μl de BSA, 250 μl de NaCl y 3 mL de
BSA, 1,6 mL de NaCl 0,9%, 2,0 mL de Bradford . Para el tubo 6 300 μl de BSA, 200
reactivo alcalino, se agitó y se esperó 10 μl de NaCl y 3 mL de Bradford . Para el tubo 7
minutos, luego 0,8 mL de NaCl 0,9% y 0,2 mL 350 μl de BSA, 150 μl de NaCl y 3 mL de
de reactivo de Folin; para el tubo 3, 0,6 mL de Bradford . Para el tubo 8 400 μl de BSA, 100
BSA, 1,4 mL de NaCl 0,9%, 2,0 mL de μl de NaCl y 3 mL de Bradford . Para el tubo 9
reactivo alcalino, se agitó y se esperó 10 450 μl de BSA, 50 μl de NaCl y 3 mL de
minutos, luego 0,8 mL de NaCl 0,9% y 0,2 mL Bradford .Para el tubo 10 500 μl de BSA, 0 μl
de reactivo de Folin; para el tubo 4, 0,8 mL de de NaCl y 3 mL de Bradford .Para el tubo 11
BSA, 1, 2 mL de NaCl 0,9%, 2,0 mL de 15 μl de muestra problema , 485 μl de NaCl y
reactivo alcalino, se agitó y se esperó 10 3 mL de Bradford. Para el tubo 12 25 μl de
minutos, luego 0,8 mL de NaCl 0,9% y 0,2 mL muestra problema , 475 μl de NaCl y 3 mL de
de reactivo de Folin; para el tubo 5, 1,0 mL de Bradford Para el tubo 13y el tubo 15 15 μl de
BSA, 1,0 mL NaCl 0,9%, 2,0 mL de reactivo muestra problema , 485 μl de NaCl y 3 mL de
alcalino, se agitó y se esperó 10 minutos, Bradford . Para el tubo 14 y tubo 16 25 μl de
luego 0,8 mL de NaCl 0,9% y 0,2 mL de muestra problema , 475 μl de NaCl y 3 mL de
reactivo de Folin; para el tubo 6, 1,2 mL de Bradford .Para el tubo 17 25 μl de muestra de
BSA, 0,8 mL de NaCl 0,9%, 2,0 mL de soya 2 , 475 μl de NaCl y 3 mL de
reactivo alcalino, se agitó y se esperó 10 Bradford .Para el tubo 18 15 μl de muestra de
minutos, luego 0,8 mL de NaCl 0,9% y 0,2 mL soya 2 , 485 μl de NaCl y 3 mL de Bradford .
de reactivo de Folin; para el tubo 7, 1,4 mL de
BSA, 0,6 mL de NaCl 0,9%, 2,0 mL de RESULTADOS
reactivo alcalino, se agitó y se esperó 10 mn,
luego 0,8 mL de NaCl 0,9% y 0,2 mL de 1. Método de Biuret
reactivo de Folin; para el tubo 8, 0,5 mL de
extracto problema, 1,5 mL de NaCl 0,9%, 2,0
Tubo Color Absorbancia
mL de reactivo alcalino, se agitó y se esperó
10 minutos, luego 0,8 mL de NaCl 0,9% y 0,2 Blanco 0.096
mL de reactivo de Folin; para el tubo 9, 1,0
mL de extracto problema, 1,0 mL de NaCl 1 0.101
0,9%, 2,0 mL de reactivo alcalino, se agitó y Azul claro
se esperó 10 minutos, luego 0,8 mL de NaCl 2 0.129
0,9% y 0,2 mL de reactivo de Folin, por
último, para el tubo 10, 1,5 mL del extracto 3 0.152
problemas, 0,5 mL de NaCl 0,9%, 2,0 mL de
reactivo alcalino, se agitó y se esperó 10 4 0.168
minutos, luego 0,8 mL de NaCl 0,9% y 0,2 mL
de reactivo de Folin. 5 0.196
Se mezcló bien, se dejaron en reposo los tubos Morado claro
6 0.208
por 30 minutos, seguido a esto se ajustó el
espectrofotómetro en 650 nm y se determinó la 7 0.232
absorbancia de cada tubo
8 Morado más 0.336
Método de Bradford oscuro
Se rotularon 18 tubos en los que se agregaron 9 Morado claro 0.211
los reactivos en el siguiente orden: en el tubo
blanco 500 μl y 3 mL del reactivo de 10 Morado más 0.319
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oscuro
mg
C 1=3.84
mL
Ahora el valor de C1 se multiplica por 25 mL
que corresponden al volumen del balón
aforado empleado .
mg
(3.84 )(25 mL)=96 mg
mL
Se realiza una conversión de mg a g y
obtenemos:
96 mg=0.096 g
Gráfica 1. Curva de calibración por el método Por último, se halla el porcentaje de la proteína
de Biuret. en la muestra:
Cálculos método de Biuret. g proteína
%=( )(100)
Ecuación curva calibración: g muestra problema
(1) y =0.6632 x−0.0043
0.096 g
%=( )(100)=¿4.75 %
De la ecuación (1) se despeja x, y se 2.0199 g
reemplazan valores, siendo “x”=
concentración y “y”=la absorbancia leída en
cada caso. Tubo 10 Para este tubo se realizaron los
mismos cálculos que en el tubo 9, con única
y +0.0043 variación en la absorbancia leída y volumen de
x= extracto problema.
0.6632
0.319+0.0043
Tubo 9 x=
0.211+0.0043 0.6632
x=
0.6632
mg
x=0.48
mg mL
x=0.32
mL
mg
(0.48 )(6 mL)
(2)C 1 V 1=C 2 V 2 mL
C 1=
De la ecuación (2) se despeja C1, y se (1.0 ml)
reemplazan valores, siendo V1= volumen total
de cada tubo, C2=concentración calculada con mg
la ecuación (1), y V2= volumen del extracto C 1=2,88
mL
Problema.
mg
(C 2)(V 2) (2,88 )(25 mL)=72 mg
C 1= mL
(V 1)
0.072 g
mg %=( )(100)=¿3,56 %
(0.32 )(6 mL) 2.0199 g
mL
C 1=
(0.5 ml)
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mg
(0.276 )(5 mL)
mL
2. Método de Lowry C 1=
(0.5 ml)
Tubo Color Absorbancia mg
C 1=2,76
Blanco 0.057 mL
Incoloro
1 0.068 mg
(2,76 )( 25 mL)=69 mg
mL
2 0.103
0,069 g
3 0.238 %=( )(100)=¿3,41 %
2.0199 g
4 0.311
Tubo 9
5 Azul claro 0.318
0.482+0.0127
6 0.361 x=
1,3226
7 0.380
mg
x=0,374
8 0.353 mL
9 Azul oscuro 0.482 mg
(0.374 )(5 mL)
mL
10 0.564 C 1=
(1.0 ml)
mg
C 1=1,87
mL
mg
(1,87 )( 25 mL)=46,7 mg
mL
0,0467 g
%=( )(100)=¿2,31 %
2.0199 g
Tubo 10
0.564+ 0.0127
Gráfica 2. Curva de calibración por el método x=
de Lowry. 1,3226
Cálculos método de Lowry mg
x=0,43
Tubo 8 mL
y=1.3226 x−0.0127
mg
(0 , 43 )(5 mL)
0.353+0.0127 mL
x= C 1=
1,3226 (1.5 ml)
mg mg
x=0,276 C 1=1,43
mL mL
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mg Cálculos método de Bradford
(1,43 )(25 mL)=35,75 mg
mL
Tubo 11
0,03575 g y=0.9611 x +0.1446
%=( )(100)=¿1,76 %
2.0199 g
y−0.1446
x=
3. Método de Bradford 0.9611
0.515−0.1446
Tubo Absorbancia x=
0.9611
Blanco 0.573 mg
x=0.385
mL
1 0.310
mg
2 0.372 (0.385 )−(0.503 mL)
mL
C 1=
3 0.314 (0.015 mL)
4 0.421 mg
C 1=¿7.86
mL
5 0.371
mg
6 0.390 (7.86 )(25 mL)=196.5 mg
mL
7 0.332
(0.196 g)
8 0.961 %= (100)=9.7 %
(2.0199 g)
9 0.317
10 0.376
11 0.515
12 0.361
13 0.331
14 0.412
15 0.410
16 0.369 Tubo 12
17 0.352
18 0.332 0.361−0.1446
x=
0.9611
mg
x=0.225
mL
Gráfica 3. Curva de calibración por el método
de Bradford.
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mg tendencia, por otro lado, las curvas de los otros
(0.225 )−(0.503 mL) métodos no fueron las más adecuadas, pues los
mL
C 1= datos obtenidos de las absorbancia tuvieron
(0.025 mL)
grandes variaciones, lo cual no permite que se
realice la correcta cuantificación de las
mg proteínas.
C 1=¿-11.12
mL
El valor más alto de r2 fue el obtenido con el
mg método de Biuret (r2=0.9632) y el valor más
(11.12 )(25 mL)=278 mg
mL bajo se presentó con el método de Bradford
(r2=0.2339). Hartree (1972) mencionó las
(0.278 g) ventajas del método de Bradford (1976) y sus
%= (100)=13.7 % modificaciones sobre el método de Lowry
(2.0199 g)
(1951). Estas ventajas incluyen una alta
estabilidad, sensibilidad y una respuesta
DISCUSIÓN altamente lineal, encontrando valores de
coeficientes de determinación de 0,994. La
Al comparar los métodos empleados en esta diferencia de este valor con los valores
práctica, dentro de los procedimientos reportados en este trabajo puede deberse a
colorimétricos de alta sensibilidad, los más errores experimentales como el uso de
utilizados son el de Bradford y el de Lowry. detergentes en el lavado del material, ya que
De estos, el primero (Bradford) constituye el pudo haber causado interferencias , y errores
método más elegido, por su exactitud y las de lectura en la absorbancia de las muestras,
pocas interferencias (Fiorentino,1994). Sin como se dijo anteriormente.
embargo, si se observa la curva de calibración
del método de Bradford, se puede analizar que CONCLUSIONES
se cometieron varios errores experimentales en
el desarrollo y registro de datos de este Se compararon los tres métodos de
procedimiento. cuantificación de proteínas (Biuret, Lowry y
Bradford), considerando diversos factores
.En el caso del método de Biuret, es como la sensibilidad, exactitud, interferencia
considerado un método de baja sensibilidad, por sustancias no proteicas, entre otros.
esto es algo muy significativo para la Además, se cuantificó el porcentaje de
cuantificación de proteínas, puesto que esto proteína del extracto problema.
impide la detección de concentraciones muy
pequeñas en una muestra, mientras que el REFERENCIAS
método de Lowry se considera un método que
tiene una alta sensibilidad, tiene la facultad de https://bioquibi.webs.ull.es/bioquimica
detectar cantidades del orden de diez %20estructural/Marisol/estsecundaria.pdf
microgramos de proteínas, sin embargo, tiene http://www3.uah.es/bioquimica/Sancho/farma
una desventaja, pues al evaluar diferentes tipos cia/practicas/Lowry.pdf
de proteínas las cuales contienen fenoles, la
intensidad de color es muy variada http://www.fagro.edu.uy/~nutrical/ensenanza/
(Fiorentino,1994). Según los resultados, en el AVI%20WEB/cursoema/detdePC.pdf
método de Biuret (4.75%, 3.56%) se
obtuvieron porcentajes más altos que en el de http://www3.uah.es/bioquimica/Sancho/farma
Lowry (3.41, 2.31%, 1.76%), por lo que el cia/practicas/Lowry.pdf
método de Biuret fue el que más exactitud
tuvo, debido a que se registró las lecturas más Fiorentino.Gómez,S.(1994) La inmunología en
altas de proteína en las muestras. Esto también el diagnóstico clínico.Centro Editorial
se puede evidenciar al observar la curva de Javeriano. CEJA..Santafé de Bogotá
calibración, pues esta fue más acertada,
teniendo los puntos de los datos (absorbancia
vs concentración) más cercanos a la línea de
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Hartree, E.F. (1972). Determination of
protein: a modification of the Lowry method
that gives a linear photometric response.
Analytical Biochemistry 48: 422-427.
Bradford, M. M (1976). A rapid and sensitive
method for quantification of microgram
quantities of protein utilizing the principles of
protein-dye binding. Analytical Biochemistry
72: 248-254.
Lowry, O.H., N.J. Rosborough, A.L. Farr y
R.J. Randall (1951). Protein measurement with
the folin phenol reagent. The Journal of
Biological Chemistry 193: 265-275.
tubo 11
y=x −¿
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x=0.515+ ¿ ¿
❑
mg
x=¿
mL
mg
()(5.3 mL)
mL
C 1=
(0.015 mL)
mg
C 1=¿
mL
mg
( )(25 mL)=mg
mL
mg=g
