Año de la Universalización de la Salud
UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS
(Universidad del Perú, DECANA DE AMÉRICA)
FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
Escuela Profesional de Farmacia y Bioquímica
INFORME Nº 3
INTEGRANTES:
-
DOCENTE:
ASIGNATURA:
GRUPO:
2020
INTRODUCCIÓN
En microbiología el microscopio se utiliza de forma rutinaria, ya que proporciona
importante información para la identificación temprana y definitiva de los
microorganismos.1
El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles de
ver con el microscopio óptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la
célula y el medio que la rodea, y el medio más simple de aumentar el contraste es la
utilización de colorantes. Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos
diferentes de células o para revelar la presencia de determinados constituyentes
celulares, tales como flagelos, esporas, cápsulas, paredes celulares, centros de
actividad respiratoria, etc.2
El examen microscópico requiere la utilización del microscopio. Puede hacerse una
visualización microscópica en 2 momentos: a) directamente de la muestra clínica y
b) a partir de los microorganismos obtenidos por cultivo como primer escalón en la
identificación.3
Las tinciones se pueden clasificar como simples cuando toda la muestra se tiñe del
mismo color y se utiliza un solo colorante (azul de lactofenol o tinta china); tinción
diferencial, cuando se visualiza más de un color porque se utiliza más de un
colorante (Gram o Ziehl-Neelsen); tinción específica, cuando se utilizan anticuerpos
marcados con una molécula fluorescente para identificar una estructura celular en
particular (inmunocitoquímico).4
En una bacteria por su menor tamaño es difícil la diferenciación o resolución de
estructuras en su interior, además de que no están tan bien diferenciadas como
sucede en las células superiores.5
Entre algunos tipos de tinciones principales en el laboratorio de microbiología tienen:
a. Tinción simple: colorantes básicos, colorantes ácidos.
b. Tinción diferencial: tinción gram, tinción acidorresistente.
c. Tinción de estructuras: tinción de pared celular, flagelos, endosporas,
cápsulas.5
Las tinciones utilizadas en el laboratorio de microbiología permiten el diagnóstico
oportuno y sugerente de los agentes infecciosos, por lo que juegan un papel
importante en la decisión del tratamiento inicial de las enfermedades infecciosas. Se
debe practicar la tinción adecuada de acuerdo con el agente infeccioso en sospecha
y el tipo de muestra clínica. Las tinciones son herramientas elementales, vigentes y
de uso universal que coadyuvan al diagnóstico microbiológico. 6
OBJETIVOS
● Conocer los pasos para realizar un frotis bacteriano
● Describir las diferentes tinciones de algunas estructuras bacterianas con
énfasis en la tinción simple, gram y ácido - alcohol resistente
● Establecer cuándo se debe utilizar la tinción microbiana
● Comprender las etapas para la observación microscópica de un frotis
bacteriano
METODOLOGÍA
Tinción Negativa
No se trata de una tinción propiamente dicha ya que no se utilizan colorantes
con cromóforos, ni se lleva a cabo ninguna reacción entre estructuras
celulares y los colorantes. En este caso el frotis se hace con una gota de una
solución de nigrosina o tinta china, ambos son productos particulados,
insolubles, que formarán una película opaca a la luz. En este tipo de tinción
se prescinde de la fijación por calor, se deja secar la preparación y se
observan los microorganismos brillantes sobre un fondo oscuro.
Fig 1. Tinción negativa de Bacillus cereus. Microscopía óptica de campo claro
(100x).
Tinción Simple
Materiales: Cultivos bacterianos de Staphylococcus aureus, frasco lavador,
cristalizador, soporte y colorantes (cristal violeta), asa de siembra, aceite de
inmersión.
Procedimiento:
● Poner sobre un portaobjetos una gota de agua y una pequeña alícuota
de un cultivo bacteriano con el asa de siembra estéril.
● Hacer el frotis, formando una película homogénea sobre el
portaobjetos con el asa de siembra.
● Dejar secar.
● Fijar la preparación, pasando a través de la llama del mechero el
portaobjetos.
● Cubrir con una película de colorante (cristal violeta o safranina)
durante 1 minuto.
● Lavar el exceso de colorante con agua.
● Dejar secar al aire.
● Añadir una gota de aceite de inmersión.
● Observar con objetivo de inmersión (100 x).
Fig.2 Tinción simple con cristal violeta de Staphylococcus aureus. Microscopio
óptico de campo claro (100x).
La tinción simple nos proporciona exclusivamente información acerca de la
forma, tamaño y tipo de agrupación de los microorganismos. Sin embargo
tiene la ventaja de ser un método muy sencillo y rápido
Tinción diferencial
Tinción de Gram
Materiales:Cultivos de bacterias gram positivas: Bacillus cereus y gram
negativas: Escherichia coli, frasco lavador, cristalizador, soporte,
portaobjetos, asa de siembra, cristal violeta, safranina, lugol y alcohol,
aceite de inmersión.
Procedimiento:
Tabla 1. Representación esquemática del procedimiento de la tinción de Gram.
Fig 3. Tinción de Gram de Bacillus cereus (bacilos gram positivos). Microscopía de
campo claro (100x)
Fig 4. Tinción de Gram de Escherichia coli (bacilos gram negativos). Microscopía de
campo claro (100x)
La diferente estructura y organización de la pared celular en estos dos
tipos de organismos hace que ambos grupos respondan de manera
distinta, así mientras las bacterias gram positivas mantienen y
conservan el complejo cristal violeta-iodo, las bacterias gram negativas
se decoloran rápidamente con la aplicación del alcohol, admitiendo el
colorante de contraste que proporciona un color entre rosa y rojo que
contrasta con el intenso color violeta
Tinción ácido alcohol-resistente
Materiales: Cultivos de micobacterias: Mycobacterium phlei, vaso
lavador, cristalizador, soporte, portaobjetos, hisopo de lana de vidrio,
asa de siembra, fuchina fenicada, azul de metileno, ácido nitrico al
33% y alcohol de 96 º, aceite de inmersión.
Procedimiento:
Tabla 2. Procedimiento de la tinción ácido-alcohol resistencia
Fig 5. Aplicación de calor a la preparación con un hisopo de lana de vidrio
Fig 6.Tinción de ácido-alcohol resistencia (Ziehl-Neelsen) de Mycobacterium phlei.
Las flechas señalan estos bacilos ácido-alcohol resistentes teñidos de rojo.
Microscopía de campo claro (100x)
Estas bacterias son resistentes al tratamiento con alcoholes y ácidos suaves
conservando el colorante fundamental, mientras que organismos que no posean
esta característica son rápidamente decolorados y pueden teñirse con el colorante
de contraste en este caso azul de metileno.
Tinción de estructuras microbianas
Tinción de cápsulas
Materiales: Azotobacter vinelandii.
Procedimiento: El procedimiento para la realización de la tinción de cápsulas es el
mismo que se ha explicado para la tinción negativa. Las cápsulas aparecen
rodeando a las células como estructuras sin teñir sobre un fondo oscuro .
Fig 7. Tinción de cápsulas de Azotobacter vinelandii. Las flechas
indican estas estructuras. Microscopía de campo claro (100x)
Tinción de esporas
Material: Cultivos de Bacillus subtilis, vaso lavador, cristalizador, soporte,
portaobjetos, asa de siembra, verde malaquita y safranina, hisopo de lana de vidrio,
alcohol de 96, aceite de inmersión.
Procedimiento:
Tabla 3. Procedimiento de la tinción de espora.
Fig 8. Tinción de esporas de Bacillus subtilis. La flecha indica esta estructura
en verde. Microscopía de campo claro (100x).
RESULTADOS
OBSERVACIONES AL MICROSCOPIO
Bacterias Gram (-) en forma de Bacilos Bacterias Gram (+) en forma de
estafilococo
Clostridium tetani Clostridium sp.
Bacteria Gram (+) en forma de bacilo Forma de bacilo Gram (+)
esporulado.
Streptococcus sp. Lactobacillus acidophilus
Bacterias Gram (+) en forma de coco Bacteria Gram (+) en forma de
en cadena. bacilos aislados o también en
pares.
Bacillus anthracis Micrococcus luteus
Bacteria Gram (+) en forma de
Bacterias Gram (+) en forma de racimos de cocos.
Bacilos en cadena
Pseudomonas aeruginosa Escherichia Coli
Bacterias Gram (-) en forma de bacilos Bacteria Gram (-) en forma de
bacilos agrupados
Cápsula de Streptococcus Esporas con verde de malaquita
pneumoniae
Tinción de esporas por la técnica
Tinción negativa de cápsula con de Wirtz
nigrosina
Esporas libre y bacteria
esporulada
DISCUSIÓN
La tinción Gram es un tipo de tinción diferencial. La tinción Gram distingue dos
grupos de bacterias: Las bacterias Grampositivas que presentan una pared celular
gruesa de peptidoglicano, pero no cuenta con membrana celular externa, y las
Gramnegativas, presenta una capa delgada de peptidoglicano a los que se le
superpone una capa denominada membrana externa. 8 La tinción de Gram se basa
en colocar como colorante primario cristal violeta, el cual tiene afinidad con el
peptidoglicano de la pared bacteriana. Posteriormente, se coloca lugol, el cual sirve
como mordiente e impide la salida del cristal violeta por la formación de un complejo
cristal violeta-yodo que satura los espacios del peptidoglicano de la pared
bacteriana. En seguida, se coloca una mezcla de alcohol-acetona, la cual deshidrata
la pared bacteriana y cierra los poros de la misma, también destruye la membrana
externa de las bacterias Gram negativas debido a que ésta es soluble a la acción de
solventes orgánicos, como la mezcla de alcohol-acetona. Las bacterias
Grampositivas, al contener una gran cantidad de peptidoglicano, retienen con mayor
fuerza este complejo, mientras que las Gramnegativas no lo pueden retener por
tener menos cantidad de peptidoglicano. Por último, se coloca safranina, la cual
funciona como un colorante secundario o de contratinción y sirve para teñir las
bacterias que no pudieron retener el complejo cristal violeta-yodo. Las bacterias
Grampositivas se observan de color azul oscuro a morado, mientras que las
Gramnegativas se observan de color rosa a rojo.9
Según la tinción Gram en la bacteria Clostridium tetani, se observó un
microorganismo de forma alargada con un notorio bulto en su interior y una
coloración violeta. El Clostridium tetani es una bacteria Grampositiva en forma de
bacilo y en su forma esporulada se presenta como Gramnegativo. Es por esto que
en la práctica se observó esta coloración violeta por ser Grampositiva, que al
contener una gran cantidad de peptidoglicano, retienen con mayor fuerza el
complejo cristal violeta-yodo. La endospora de Clostridium tetani no se tiñen con los
colorantes, requieren de colorantes especiales como la de Wirtz, con la tinción de
Gram solo se observa el perfil de la espora sin teñir. 10
Los Streptococcus sp. son bacterias esféricas u ovoides que crecen en pares o en
cadenas, son Gram Positivos, no formadores de esporos. En la práctica se apreció
la bacteria en forma de cocos en cadena y una coloración violeta, característica por
ser una bacteria Gram positiva.10
Los Bacillus Anthracis son bacilos Gram positivos de 1 a 1.3 mm de diámetro por 3
a 10 mm de largo, con bordes cuadrados o cóncavos que forman cadenas cortas.
En la práctica se observó estas características de la bacteria, siendo notorio el color
violeta por la tinción de Gram, debido a que es una Gram positiva. 11
Micrococcus luteus es una bacteria Gram positiva con forma de esférica, con un
diámetro aprox. de 0.5-3.5 micras. Generalmente se agrupan en tétradas. En su
superficie no presenta ni cilios ni flagelos. en la tinción Gram adquiere una
coloración violeta, debido a la presencia del peptidoglucano en su pared celular, el
cual retiene las partículas del colorante.11
La pseudomona aeruginosa es un bacilo corto Gram negativo aerobio, en pareja, en
cadena o aislados, el flagelo polar monotrico no es visible en la tinción de Gram ya
que el flagelo es muy delgado. Por ser Gramnegativa no puede retener el cristal
violeta-yodo por medio de la tinción de Gram, por tener menos cantidad de
peptidoglicano. Por esta razón, se coloca safranina, este funcionará como un
colorante secundario o de contratinción, tiñendo las bacterias que no pudieron
retener el complejo cristal violeta-yodo, como en este caso. 12
El Streptococcus pneumoniae es un coco Gram Positivo, capsulado. Se presenta
forma lanceolada y se caracteriza por su agrupación en pares o en cadenas cortas.
Tiene una pared de peptidoglicano que rodea a la membrana citoplasmática. La
tinción negativa nos permite observar las características estructurales de la bacteria,
es un tipo de tinción simple, ya que solo se necesita de un colorante (nigrosina) nos
permite visualizar sobre un fondo oscuro la forma de la bacteria, como también una
característica estructural, la presencia de cápsulas. 12
Para la tinción de esporas por técnica de Wirtz se compara con la técnica de
Shaeffer-Fulton, el verde de malaquita es un colorante débilmente básico (tiene una
carga positiva débil) y por tanto, se une débilmente a la bacteria. Penetra en las
células vegetativas. Cuando se calienta la preparación también penetra las
endosporas. Esta técnica confirma que se observa Esporas teñidas de verde y
células vegetativas teñidas de rosa. De la misma manera la forma, tamaño relativo
y posición de la espora en la célula vegetativa. 13
CONCLUSIONES
● Se conocieron los tres pasos para la frotis bacteriana siendo el primero
extension, secado y fijación.
● En la tinción simple se utiliza un solo colorante, por lo que todas las
estructuras celulares se tiñen con la misma tonalidad a diferencia de la tinción
ácido - alcohol - resistente estas bacterias no se tiñen con los colorantes
convencionales sino que se fuerza la tinción con fucsina a través del
calentamiento de la preparación.
● Para ver varias estructuras de las células bacterianas deben usarse métodos
de tinción especiales como: tinción de endosporas, tinción de pared celular,
tinción de flagelos y tinción de cápsula.
● Se comprendió las etapas de la frotis bacteriana siendo la primera la
extensión en el cual se toma la muestra con el asa estéril y se suspende en
solución salina fisiológica, la segunda de secado en donde se deja secar la
lámina a temperatura ambiente y la tercera de fijación en el que la lámina se
pasa tres veces por la llama de mechero con la capa de frotis hacia arriba.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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3.Keller PJ. Imaging morphogenesis: technological advances and biological insights.
Science. 2013; 340: 123-168.
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century. Clin Microbiol Rev. 2011; 24: 247-280.
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CUESTIONARIO Nº3
1. En la estructura química de Azul de metileno señale cómo se da su
disociación y en que ion reside el calor.
El azul de metileno posee una masa molecular de 373,9 g/mol, lo que
corresponde a clorhidrato de azul de metileno con tres grupos de agua como
lo muestra su fórmula química C16H18N3SCl.3H2O. El carácter catiónico de
su molécula se debe a las cargas positivas del nitrógeno que esta posee
como se observa en la imagen.1
Sumado a esto, el azul de metileno pertenece a un grupo de colorantes
conocido como fotosensibilizador, ya que a la luz visible (en el rango de 585-
670 nm) excita la estructura de fenotiazina a un estado de radical libre o
triplete. Adicionalmente, este colorante en solución en estado triplete pasa a
electrones oxígeno diatómico permitiendo la formación de radicales
superóxidos, una molécula biológicamente dañina capaz de oxidar ADN,
polisacáridos y lípidos directamente o por generación secundaria de otros
radicales.1
2. En el área de control de calidad en qué casos podría utilizar la tinción
simple y la diferencial. Fundamente su respuesta
El control de calidad de los métodos tintoriales es importante, ya que así se
asegura que la preparación de la muestra haya sido adecuada, por lo que se
recomienda realizar al mismo tiempo de la evaluación de la muestra clínica,
la tinción de un agente infeccioso ya identificado mediante esa tinción, el cual
funcionará como un control positivo.
En la tinción simple pueden teñir positivamente ciertos componentes como
las proteínas.
En la tinción diferencial consisten en la aplicación de dos colorantes que
contrastan en su intensidad o color y un paso intermedio que provoca una
respuesta diferente entre microorganismos distintos o entre determinadas
células dentro de una población. La diferenciación puede ser provocada por
un agente químico o físico, permitiendo observar dos tipos de respuestas
diferentes a la tinción en una misma muestra.
3. Señale 3 precauciones que el analista debe tener en cuenta para hacer
el frotis de muestras: viscosas o grumosas
4. ¿Se pueden cambiar los colorantes inicial y de contraste en la tinción
gram? Fundamente su respuesta
Los microorganismos que se tiñen débilmente de Gram negativos con la
tinción de Gram-Hucker, como ciertos anaerobios, Legionella sp,
Campylobacter sp y Brucella sp, pueden teñirse mucho mejor si se usa la
modificación que realizó Kopeloff a la tinción de Gram-Hucker, denominada
tinción de Gram-Kopeloff.
Esta técnica cambia el colorante de safranina por fucsina básica. Con esta
modificación es posible colorear eficazmente a los microorganismos antes
mencionados.
Las levaduras también se distinguen con esta coloración. Ellas toman el
cristal violeta, es decir, se tiñen de Gram positivo. Por otra parte, se pueden
distinguir bacilos Gram positivos formadores de esporas, en el que se
observa un espacio claro dentro del bacilo, donde se formó la endospora,
aunque las esporas no se tiñen bien. Para teñir esporas se usa otras técnicas
como Shaeffer-Fulton. Cabe destacar que esta tinción no sirve para colorear
todo tipo de bacterias, es decir, existen casos en el que la tinción no
funciona.5
5. Indique que tinciones podría utilizar para observar hongos
Tinciones simples
● Safranina: útil para el estudio de cultivos y productos biológicos
líquidos. Los elementos fúngicos se tiñen de color rojo intenso y el
resto del campo toma un tono incoloro o rosa pálido.
● Azul de algodón: es útil para realizar el examen directo de cultivos, ya
que es una técnica rápida que permite visualizar perfectamente las
estructuras fúngicas.
● Anaranjado de acridina: se utiliza para la detección de hongos y
bacterias en muestras clínicas. El pigmento se intercala en el ácido
nucleico con PH neutro las bacterias, los hongos y el material celular
se tiñen de naranja rojizo; con PH ácido las bacterias y los hongos se
mantienen de color naranja rojizo pero el material de fondo se tiñe de
amarillo verdoso.
● Tinción de azul de algodón de lactofenol: La tinción de azul
algodón de lactofenol no es considerada una tinción diferencial, sin
embargo, posee características tintoriales que permiten observar cada
uno de los componentes fúngicos y apreciar fácilmente las estructuras
para una adecuada identificación. El fenol inactiva las enzimas líticas
de la célula e impide que ésta se rompa; de igual forma, destruye la
flora acompañante e inactiva a la célula, quitándole el grado de
patogenicidad; además, actúa como mordiente cuando se usa en
combinación con colorantes.
El ácido láctico preserva las estructuras fúngicas al provocar un
cambio de gradiente osmótico con relación al interior fúngico, lo que
genera una película protectora. El azul de algodón es un colorante
ácido, que tiñe el citoplasma y la quitina presente en las células
fúngicas, mientras que el glicerol mantiene húmeda la preparación.
Una vez preparado el colorante, se debe colocar la muestra
microbiológica en un portaobjetos por medio de una impronta (proceso
en el cual se coloca una impresión de la muestra sobre una estructura
utilizando una cinta adhesiva transparente).6
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Meléndez N, Navarro M. Evaluación de la degradación de azul
de metileno mediante la técnica de oxidación de aire húmedo
con peróxido de hidrógeno empleando óxidos mixtos de Mn, Cu
y/o Fe como catalizador para el tratamiento de aguas residuales
provenientes del laboratorio de microbiología de la Pontificia
Universidad Javeriana [Ingeniero químico]. Fundación
Universidad de América Facultad de Ingenierías; 2019.
2. Vázquez C. Martín A. Técnicas básicas de Microbiología
Observación de bacterias Reduca (Biología). Serie
Microbiología. 2010 3 (5): 15-38
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microbiología Investigación en Discapacidad 2014 3(1): 10- 18
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5. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W.
(2004). Diagnóstico Microbiológico. (5ta ed.). Argentina,
Editorial Panamericana S.A.
6. López L., Hernández M., Colín C., Ortega S., Cerón G.,
Franco Las tinciones básicas en el laboratorio de microbiología.
Investigación en Discapacidad. 2014; 3 (1):10-18.
