UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA

FACULTAD DE CIENCIAS

ESCUELA DE BIOTECNOLOGÍA

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TEMA:

MÉTODO DE REDUCCIÓN DE AZUL DE METILENO

CURSO:

Bioquímica II

ESTUDIANTES:

Eche Polo Franklin

Torres Venegas Astrid
Vergara Murga Daly
Zambrano Prada Thirsa

PRESENTADO A:

[Link]. Gladis melgarejo Velásquez

NUEVO CHIMBOTE 2019

I. INTRODUCCION:
La complejidad bioquímica de la leche en su composición y su elevada actividad de
agua la convierte en uno de los alimentos naturales donde proliferan fácilmente los
microorganismos y bien se podría catalogar como medio universal de cultivo. Los
microorganismos en la leche tienen varias orientaciones. Unos son beneficiosos por
las transformaciones que producen y otros perjudiciales y su control presenta
aspectos sanitarios y comerciales, el primero se refiere al riesgo que el alimento
puede suponer para la salud del consumidor cuando es portador de microorganismos
patógenos o de sus toxinas y el segundo a las características de conservación de la
misma que viene determinada por la presencia de un mayor o menor número de flora
saprofita, está en elevadas concentraciones puede producir defectos y disminución de
las propiedades nutritivas y organolépticas del producto.
Existen grupos de microorganismos (M.O) que son tomados como indicadores en la
industria láctea, pues su presencia permitirá comprobar el cumplimiento de la
aplicación de las buenas prácticas higiénicas. Los M.O indicadores son: Bacterias
aerobias mesófilas y coliformes fecales y totales.
Las enzimas son proteínas altamente especializadas que funcionan como
catalizadores biológicos de las reacciones celulares. Existen seis clases principales de
enzimas de acuerdo al tipo de reacción catalizada; una de estas clase de las
oxidorreductasas.
Como se sabe, los organismos obtienen su energía a través de reacciones de óxido
reducción catalizadas por las oxidorreductasas y su capacidad de realizar una
determinada reacción depende del potencial redox (Eh).existen microorganismos que
pueden desarrollarse en ambientes pobres o ricos en oxígenos ,la presencia de
mayores o menores concentraciones de oxígeno en un alimento indicaran si este es
un medio oxidante o no, o lo que es lo mismo si posee valores altos o bajos de Eh,
respectivamente de acuerdo con esto los microorganismos se clasifican en:
o Aerobios estrictos, crecen en presencia de oxigeno: Eh:+350 a 500mv
o Anaerobios estrictos, crecen en ausencia de oxigeno: Eh:-150mv
o Aerobios facultativos, crecen en presencia o ausencia de oxigeno: Eh:-150 a
+350mv
 la determinación de los potenciales de óxido reducción en alimentos se realiza con
electrodos apropiados y también se usan sustancias que se van a colorear o decolorar
a diferentes valores de Eh.
El potencial de oxido-reducción (Eh) de la leche fresca es de +0.35 a +0.40 voltios
(350 a 450mv), el cual se debe principalmente al contenido de oxígeno disuelto en el
producto .si por cualquier causa ese oxigeno es separado, el Eh disminuye. Esto
ocurre cuando el microorganismo es muy elevado, el consumo de oxigeno será
mayor y por consiguiente el PH caerá rápidamente; si, por el contrario, el número de
microorganismos es pequeño, el Eh disminuirá lentamente.
El principio anterior encuentra aplicación en la determinación de la calidad sanitaria
de la leche, utilizando como indicador de óxido-reducción al azul de metileno este se
presenta de color azul en forma oxidada y es incoloro en su forma reducida
(leucobase).en solución acuosa de Ph 7.0 su oxidación es completa a Eh +0.075
voltios y su reducción es completa a Eh -0.015 voltios.
En la presente practica se usara un método indirecto, el método de reducción de
colorante, usando azul de metileno, un indicador de óxido reducción, con la finalidad
de estimar en forma aproximada la carga microbiana en leche, el ensayo se denomina
Prueba de la Reductasa, una prueba rápida que se usa para inspeccionar leche tratada
o no por el color y destinada a los consumidores. el fundamento radica en que por la
actividad microbiana sus nutrientes van a ser oxidados y otras sustancias entre ellas
el indicador, van a ser reducidas por acción enzimática.

II. OBJETIVOS:

 Verificar la actividad de una enzima de óxido reducción.

 Estimar el número de microorganismos presentes en un alimento mediante la
prueba de la reductasa.

III. EQUIPOS,MATERIALES Y REACTIVOS:

EQUIPOS:
 Balanza analítica
 Baño maría
 MATERIALES:
 50 ml de leche fresca
 Solución diluida de azul de metileno
 Agua destilada
 Termómetro
 Tubo 16x150 mm
 Pipetas de 10 ml y 1 ml

IV. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL:

1. Mezclar cuidadosamente la muestra por inversión y coloca 10 ml de ella en
un tubo, cuidando que los lados internos no se mojen de leche.
2. Añade 1 ml de la solución de azul de metileno sin dejar que la pipeta contacte
con la leche ni con la parte mojada del tubo.
3. Tapar asépticamente el tubo con tapón de goma, inviértalo 2 veces de tal
manera que toda la columna de aire se eleve por encima de la leche.
4. Después de 5 minutos colocar el tubo en el baño de agua a 37.5 ± 0.5°C,
cuide que el agua se mantenga por encima del nivel de la leche en el tubo y
que el interior del baño sea oscuro.
5. Prepara 2 tubos control, uno (1) que contenga 1 ml de agua corriente y 10 ml
de leche, y otro (2) que contenga 10 ml de leche y 1 ml del indicador. Ambos
tubos de control tienen que introducirse en agua hirviente por lo menos 3
minutos.

DETEMINACIONES QUIMICA
 ACIDEZ: En un vaso de capacidad adecuada conveniente colocar 20
ml de leche, agregar 3 gotas de fenolftaleína y valorar con NaOH
0.1N hasta obtener una coloración ligeramente rosada.

ALTERACIONES

 1° REACCION: En un tubo de ensayo colocar 10 ml de leche y

enseguida calentar.
 2° REACCION: En un tubo de ensayo colocar 5 ml de leche más 5 ml
de alcohol de 70°C y agitar.
  3° REACCION: En un tubo de ensayo colocar 3 ml de leche más 3 ml
de solución alcohólica de alizarina al 0.2% en alcohol de 68°.

ALTERACIONES
 En un tubo de ensayo de 2 ml de la leche, calentar a ebullición, dejar
enfriar y agregar gotas de lugol.

V. RESULTADOS Y DISCUSIONES
Tiempo de reducción de azul de metileno en las muestras de leche

MUESTRA TIEMPO CALIFICACION

1 30 min a 3h Aceptable
2 30 min a 3h Aceptable

Tabla internacional del Test de Reducción del Azul de Metileno relacionado con los
recuentos de bacterias/ml

TRAM (minutos) N° Bacterias/ml

˂30 minutos 20 – 30 millones
30 min – 2 horas 4 – 20 millones
2 – 6 horas 0.5 – 4 millones
>6 horas ˂500.000

La presencia de microorganismos en la leche y por su acción reductora, se produce

una modificación del color del azul de metileno, pasando de color azul intenso a azul
claro, pudiendo desaparece totalmente de acurdo a la carga microbiana presente. Una
leche con un contenido bajo en microorganismos, no modifica el tinte azul del
colorante o tarda mucho tiempo en modificarlo.

OBSERVACION DE CARACTERES ORGANOLEPTICOS:

 COLOR: Se observó que la leche era blanco amarillento, pudiendo

presentarse ligeramente azulado.
 SABOR: Ligeramente dulce y un poco grasosa.
 OLOR: Agradable.
 ASPECTO: Uniforme
DETEMINACIONES QUIMICA
 1 ml de NaOH 0.1 N 0.009 gr Ácido Láctico
4 ml de NaOH 0.1 N gastado Y gr Ácido Láctico

Y = 0.036

0.036 gr Ácido Láctico 20 ml de Leche

Z 100 ml

Z = 0.18%

 La muestra de la leche muestra una acidez de 0.18%, por lo cual se

encuentra entre los rangos de acidez de una leche normal.

ALTERACIONES

 1° REACCION: La muestra de leche siguió uniforme por lo que no es leche

acida.
 2° REACCION: La leche se escurre por las paredes del tubo sin dejar grumos
por lo que indica que es leche normal.
 3° REACCION: Se dio un color rosado bajo, lo cual presenta una leche fresca o
normal.

ALTERACIONES
 No hubo cambio, por lo que indica que no hay presencia de materias amiláceas,
sin embargo después de añadirle maní este cambio a una coloración azul.

VI. CONCLUSIONES:
 A lo largo de este objeto de aprendizaje se ha descrito el método para la
realización de la prueba de la decoloración del colorante azul de metileno o
prueba de la reductasa bacteriana. Esta prueba resulta muy útil a la hora en la
industria láctea puesto que la velocidad a la que se produce el cambio de color
del indicador azul de metileno es directamente proporcional al número de
gérmenes presentes. De esta manera se puede determinar de manera indirecta la
calidad higiénica de la leche.
  La calidad higiénica de la leche ocupa en estos momentos una gran prioridad,
para las industrias lácticas, es por eso los productores deben de producir su
producto con el más riguroso cuidado
 La utilización del TRAM, tiempo de reducción del Azul de metileno, es un
método practico de los tantos existentes y que nos facilitan para analizar la
calidad microbiológica de nuestra leche
 Mediante nuestra práctica realizada para lograr una coloración demoro más de
1h a 2h; para virar del color azul al blanco, lo cual esto nos da a conocer que
nuestra leche analizada está dentro del rango permitido y lo cual si está apto para
el consumo humano
 Logramos determinar una cantidad aproximada de microorganismos existente en
nuestra leche, lo cual nos permite garantizar que nuestro producto está apto para
el consumo humano.

VII. CUESTIONARIO:
 ¿Qué es el potencial redox?
Se piensa que el potencial redox es un importante factor selectivo en todos los
ambientes, incluidos los alimentos, que probablemente influye en los tipos de
microorganismos presentes y en su metabolismo. El potencial redox indica
las relaciones de oxígeno de los microorganismos vivos y puede ser utilizado
para especificar el ambiente en que un microorganismo es capaz de generar
energía y sintetizar nuevas células sin recurrir al oxígeno molecular: los
microorganismos aerobios requieren valores redox positivos y los anaerobios
negativos. Cada tipo de microorganismo sólo puede vivir en un estrecho
rango de valores redox

 ¿Qué correlación existe entre el número de microorganismos en una

muestra alimenticia y el tiempo de reducción del azul de metileno?
El principio de la prueba de reducción con azul de metileno se basa en que el
potencial de óxido reducción (Eh) de la leche fresca aireada es de +0.35 a
+0.40 voltios, el cual se debe principalmente al contenido de O2 disuelto en
el producto. Si por cualquier causa ese O2 es separado, el Eh disminuye. Esto
ocurre cuando los microorganismos crecen en la leche y consumen el O2. Si
 el número de microorganismos es muy elevado, el consumo de O2 será
mayor y por consiguiente el Eh caerá rápidamente; si por el contrario, el
número de microorganismos es pequeño, el Eh disminuirá lentamente

 ¿Una muestra de carne tendrá los mismos valores de Eh en toda su

masa?
Una muestra de carne no tiene igual Eh en toda su masa ya que esta puede
tener particularidades donde se centre mayor cantidad de microorganismos,
es decir que existen partes de la masa cárnica que puedes estar más afectadas
que las otras.

 Señale dos muestras alimenticias en las que se puede aplicar la prueba de

la reductasa.
Puede ser usado para otros alimentos como por ejemplo jugos de frutas y
variedades, en los que se encuentran los jugos de soya, piña y otros, sobre
todo alimentos líquidos en los que también se podría observar el viraje de
color del azul de metileno u otro colorante a usar.

 ¿Qué razones hacen difícil la determinación de Eh en un alimento?

Debe tenerse en cuenta que existen factores que pueden afectar el tiempo de
reducción, entre ellos el tipo de microorganismo, el número de leucocitos, el
periodo de exposición a la luz, la cantidad de O2 disuelto y la tendencia de la
leche a elevar los microorganismos hacia la superficie a medida que se va
separando la crema en el tubo de prueba. Es así como ciertos
microorganismos (Lactococcus lactis) son más activos en su capacidad
reductora que otros, mientras que existen algunas especies que son muy poco
activas en este sentido (Streptococcus agalactiae, Bacillus subtilis,
microorganismos termodúricos). Por otra parte, a medida que aumenta el
número de leucocitos en la leche y su exposición a la luz natural o artificial,
el tiempo de reducción tiende a reducirse, mientras que la agitación y la
tendencia de la crema a ascender (arrastrando los microorganismos) son
factores que tienden a retardar el tiempo de reducción.
VIII. ANEXOS

Fig, N°01: La muestra después Fig, N°02: Determinación de

de 1 hora acidez de la muestra

Fig, N°03: La muestra Fig, N°04: La muestra con

calentándose materias amilaceas

IX. BIBLIOGRAFIA
 FRAZIER. W. 1992. Microbiología de los Alimentos. 4ta edición. Editorial Acribia.
Zaragoza HARRIGAN, W. 1992. Métodos de Laboratorio en Microbiología de los
alimentos y productos. Lácteos. 3ra Edición. Editorial Acribia. Zaragoza
 JAY. J.1994. Microbiología Moderna de los Alimentos. 2da Edición. Editorial Acribia.
Zaragoza
 MORENO M., M.; M. T., SILVA G. y CALDERON M., W. (2006). Guía de Prácticas:
Microbiología General. Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo Facultad de Ciencias
Biológicas. Lambayeque
 DAVILA FERNANDEZ, N. y HERNANDEZ GARCIA, J. M. (2006). Métodos de ensayos
rápidos de detección de microorganismos en la leche.