UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA
CENTRO UNIVERSITARIO DE OCCIDENTE
DIVISION DE CIENCIA Y TECNOLOGIA
LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA AGRICOLA
LABORATORIO No. 5
ANALISIS MICROBIOLOGICO DE LA LECHE
1. INTRODUCCION
La leche cruda proviene de vacas, búfalos, ovejas y cabras, aunque el volumen
más grande proviene de las vacas. La leche es alta en proteínas y carbohidratos
(lactosa), utilizados por muchos microorganismos para crecer. En la leche cruda,
los microorganismos provienen del interior de las ubres, las superficies del cuerpo
del animal, del alimentador, el aire, el agua y el equipo que se usa para ordeñar y
almacenar la leche. Los tipos predominantes provenientes de una ubre sana son
Micrococcus, Streptococcus y Corynebacterium. Por lo general, la leche cruda
contiene <103 microorganismos/mL. Si una vaca presenta mastitis, puede excretar
Streptococcus agalactiae, Staphylococcus aureus, Pseudomonas y coliformes en
números relativamente altos. Además, es posible que las glándulas mamarias
puedan infectarse con microorganismos provenientes de la sangre del animal.
Entre estos se encuentran Mycobacterium tuberculosis (variedad hominis y
variedad bovis) causantes de tuberculosis en el hombre; también pueden hallarse
Brucella abortus y Brucella melitensis causantes de brucelosis en el hombre y que
provocan abortos en las vacas. En los contaminantes provenientes de los
animales, el alimentador, el suelo y el agua, predominan bacterias de ácido láctico,
coliformes, Micrococcus, Staphylococcus, Enterococcus, Bacillus y esporas de
Clostridium. Patógenos como Salmonella, Listeria monocytogenes, Yersinia
enterocolitica y Campylobacter jejuni también provienen de estas fuentes. El
equipo puede ser una fuente principal de bacilos gram negativos como
Pseudomonas, Alcaligenes y Flavobacterium, además de Micrococcus y
Enterococcus. Durante el almacenamiento en refrigeración antes de la
pasteurización, sólo pueden crecer microorganismos psicrófilicos en la leche
cruda. Éstos incluyen Pseudomonas, Flavobacterium, Alcaligenes y algunos
coliformes y Bacillussp. Los microorganismos presentes en la leche pasteurizada
son los que sobreviven a la pasteurización de la leche cruda (p.ej. Los
termorresistentes como Micrococus, algunos Enterococcus, como E. faecalis,
Streptococcus, algunos Lactobacillus como L. viridescens y esporas de Bacillus y
Clostridium) y los contaminantes que entran después del calentamiento y antes del
empacado (que pueden ser coliformes, Pseudomonas, Alcaligenes y
Flavobacterium.
DETERMINACIÓN DE LA CALIDAD BACTERIOLÓGICA DE LA LECHE.
MÉTODOS DIRECTOS: Existen numerosos y diversos métodos para apreciar la
calidad bacteriológica de la leche. Los más precisos y significativos son aquellos
que permiten la enumeración de los microorganismos; pero también son los más
delicados y más largos. El análisis bacteriológico de la leche exige, en principio, el
recuento de la población total y de los grupos microbianos más importantes,
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especialmente desde el punto de vista higiénico (bacterias patógenas, coliformes,
esporuladas, termorresistentes, etc.).
Entre los métodos directos más utilizados se encuentran:
Recuento en placa. Las muestras de leche se diluyen para sembrar las placas
utilizando un medio de gelosa como cultivo; tras una incubación de 2 a 3 días a 30
°C, se cuentan las UFC.
Recuento directo al microscopio. El método de Breed, es el más utilizado. Con una
pipeta capilar o un asa calibrada se extiende 0.01 mL de leche de manera
uniforme sobre un portaobjetos en un área de 1 cm2; se seca al aire y se
desengrasa con xilol, a continuación se fija con alcohol y se tiñe con azul de
metileno a l0.3% y se realiza el conteo en al menos 10 campos del microscopio.
Conocida la superficie del campo puede calcularse el número medio de bacterias
por mililitro de leche. Este método tiene la ventaja de ser rápido, sin embargo, no
puede emplearse satisfactoriamente con leche de contenido bacteriano bajo.
Prueba de coliformes. Se utiliza esta prueba después de la pasteurización con la
finalidad de descubrir contaminaciones posteriores. Se realiza en medios
selectivos como el agar bilis rojo violeta o agar lactosado desoxicolato usando la
técnica de placa vertida. Después de la incubación, los coliformes muestran
colonias de color rojo oscuro de 5 o más milímetros de diámetro. También puede
realizarse en medios líquidos por el método del N.M.P.
MÉTODOS INDIRECTOS
Pruebas basadas en la reducción de colorantes. El tiempo de decoloración de un
colorante indicador de la oxidorreducción da una medida del grado de
contaminación de la leche, ya que existe una relación entre el desarrollo
microbiano y el descenso del potencial redox. En la actualidad se utilizan con
frecuencia dos pruebas, la prueba del azul del metileno (o prueba de la reductasa)
y la prueba de la resazurina.
Prueba de reducción del azul de metileno. El tiempo en horas que tarda en pasar
el azul de metileno de su forma oxidada (azul) a la incolora (reducida) bajo
condiciones controladas es inversamente proporcional a la calidad sanitaria de la
leche, y aunque no es posible establecer con exactitud el número de
microorganismos, es factible clasificar el producto dentro de ciertos grados
aceptables o no aceptables. La incubación se hace en tubos estériles a 37 °C con
10 mL de leche y 1 mL de colorante. A intervalos regulares se observa el color de
la mezcla, pudiéndose así definir diferentes categorías de leche.
Clase de Leche Tiempo de Reducción
I Leche de excelente calidad Más de 8h
I Leche de buena calidad 6a8h
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II Leche regular De 2 a 6h.
III Leche de mala calidad De 20 min. a 2h.
IV Leche de muy mala calidad Menos de 20min.
Prueba de la fosfatasa alcalina (Prueba de Aschaffen burgy Muellen). La fosfatasa
es una enzima normalmente presente en la leche cruda y progresivamente
inactivada por calentamiento a temperaturas superiores a 60°C. Se ha demostrado
que esta enzima es más difícil de destruir que la mayoría de los organismos
patogénicos termo-resistentes que pudieran estar presentes en la leche, como por
ejemplo el bacilo tuberculoso. La prueba es de gran utilidad para decidir si la leche
ha sido o no pasteurizada, si la leche pasteurizada se ha mezclado con leche
cruda, o incluso si la pasteurización ha sido deficiente. Este método se basa en la
hidrólisis del fenil-fosfato, que en presencia de la fosfatasa de la leche libera fenol;
éste se determina colorimétricamente haciéndolo reaccionar con 2,6-dibromo-
quinonclorimida (B.Q.C.) obteniéndose un color azul, cuya intensidad se mide con
el espectrofotómetro. Sin embargo, hay que tener en cuenta que esta enzima se
inactiva conla pasteurización lenta o LTLT (Low Temperature 62 °C, Long Time 30
min) y no así con el tratamiento de pasteurización rápida o HTST (High
Temperature 72 °C ShortTime 15s). Otras pruebas que se realizan como control
microbiológico de la leche son:
1.Aislamiento de psicrofilos.
2.Aislamiento de bacterias termorresistentes.
3.Aislamiento de bacterias patógenas.
4.Prueba de sedimento y recuento leucocitario.
Cabe mencionar que el papel del Q.F.B. en este ámbito puede considerarse desde
dos aspectos diferentes:
1. El realizar control microbiológico como tal al realizarla pasteurización de la leche
y llevar a cabo pruebas como la reducción de azul de metileno y conteo de
coliformes; y
2. El utilizar las pruebas bioquímicas para llevar a cabo la identificación de
microorganismos, como es el caso de la leche tornasol y el agar leche.
2. OBJETIVOS
Valorar la importancia de las pruebas realizadas para el control
microbiológico de la leche como verificación del proceso de pasteurización.
3. Material y reactivos
Material
•Pipetas estériles 1 y 10mL.
•Asa bacteriológica
•Termómetro
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•2 tubos estériles de18X150
•1 caja de Petriestéril
•3 tubos de leche tornasol
•1 caja de agar leche
•Medio agar bilis rojo violeta estéril fundido
Material biológico
CEPAS
•Escherichia coli
•Bacillus cereus
•Proteus vulgaris
•Staphylococcus aureus
•Klebsiella pneumoiae •Pseudomonas aeruginosa
•Enterococcus faecalis
MUESTRA
•Muestra de leche cruda
Reactivos
•Colorante azul de metileno
Equipo
•Incubadora
Servicios
•Electricidad
•Agua
•Gas
4. Procedimiento
I.PASTEURIZACIÓN DE LA LECHE CRUDA.
1.Colocar 10mL de leche cruda en un tubo estéril de 18X150 con tapón
previamente etiquetado con la letra P(pasteurizado).
2.Pasteurizar la leche por cualquiera de los dos métodos disponibles LTLT ó
HTST.
3.Realizar la prueba de reducción de azul de metileno como control.
II.REDUCCIÓN DEL AZUL DE METILENO.
1.Colocar 10mL de leche cruda en un tubo estéril de18X150 con tapón
previamente etiquetado con las letras NP (No pasteurizado).
2.Agregar a ambos tubos (PyNP)1mL de la solución de azul de metileno y mezclar
homogéneamente. Comenzar a contar el tiempo de reducción. Nota: Mantener los
tubos al abrigo de la luz.
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3.Incubar a 37°C, observar su color frecuentemente durante la primera media
hora, posteriormente puede observarse el color de los tubos a intervalo de 1 hora,
sin agitarlos.
4.Una muestra se considera reducida cuando presenta 4/5 partes decoloradas.
(En los procedimientos I y II se deben reportar la calidad de la leche pasteurizada
(P) y no pasteurizada (NP) determinando el tiempo necesario para reducir el azul
de metileno en cada muestra de leche. Considerando que una muestra de leche
se considera reducida cuando presenta 4/5 partes decoloradas.)
III.REACCIONES MICROBIOLÓGICAS EN LECHE TORNASOL (LITMUSMILK).
1.Inocular un tubo de leche tornasol con 1 mL de leche cruda.
2.Inocular otro tubo de leche tornasol con una asada de E.coli.
3.Realizar lo mismo con la cepa de P. vulgaris (S. aureus, K. pneumoniae,P.
aeruginosa, E. faecalis y/o Bacillus cereus).
4.Incubar a 37 °C por 24-48h.
5.Reportar las reacciones que se presentaron con la muestra de leche y con las
cepas utilizadas. (En esta parte del procedimiento III se deben reportar las
reacciones microbiológicas en leche tornasol para cada una de las muestras de
leche y las reacciones en las cepas bacterianas utilizadas como controles.)
IV.SEMBRADO EN PLACAS DE AGAR BASE LECHE.
1.Tomar con el asa bacteriológica una muestra de leche cruda y sembrar por
estría simple en la mitad de la placa de agar leche.
2.Sembrar en la otra mitad de la placa una asada de Bacillus cereus.
3.Observar el proceso de proteólisis.
V.DETERMINACIÓN DE COLIFORMES.
1.En una caja de Petri estéril, colocar una alícuota de 1.0 mL de leche.
2.Adicionar el medio bilis rojo violeta fundido y enfriado a una temperatura de 45-
50°C, mezclar suavemente.
3.Permitir que el medio solidifique y adicionar 4 mL más del medio fundido y
enfriado a una temperatura de 45-50°C.
4.Permitir que el medio solidifique e incubar a 37 °C por 24-48h.
5.Examinar las colonias de color rojo a purpura, de 0.5 mm de diámetro (o más
grande) rodeadas de un halo con precipitado de ácidos biliares. (Por último en el
procedimiento IV y V se debe indicar si se presenta el proceso de proteólisis en la
placa de agar leche para el microorganismo de Bacillus cereus y para la muestra
de leche no pasteurizada (NP Indicar la presencia de organismos coliformes
determinando colonias características en el medio bilis rojo violeta; y reportar
número de colonias características en el medio por 1 mL de leche.)
5. CUESTIONARIO
1. ¿Qué es la pasteurización y cuántos tipos de ésta existen?
2. Explique: ¿por qué la leche recién ordeñada de una vaca no enferma tiene
poder bacteriostático?
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3. ¿Qué enfermedades se pueden adquirir por consumir leche contaminada?;
y ¿cuáles son los agentes etiológicos?
4. Indique: ¿qué bacterias no patógenas se pueden entrar en la leche?
5. Indique la reacción química de la enzima fosfatasa.
6. ¿En qué consiste la prueba de sedimento y recuento leucocitario?
7. ¿Qué ventajas presenta el método de Breed sobre el recuento en placa?
8. Mencione el fundamento y las reacciones que se pueden presentar en el
medio de leche tornasol.
9. Escriba la reacción química con fórmulas desarrolladas de la reducción del
azul de metileno.
10. ¿Cuál es la composición nutrimental de la leche de vaca?
