UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMANN
Facultad de Ciencias
Escuela Académica Profesional de Biología-Microbiología
PRINCIPIOS DE LA ESPECTROFOTOMETRÍA
BIOFÍSICA
PRESENTADO POR:
JEAN SEBASTIAN MANDAMIENTO PONCE
DOCENTE:
GIUSEPPY EDISON CALIZAYA MAMANI
TACNA – PERÚ
2018
ÍNDICE
INTRODUCCIÓN…………………………………………………………………
OBJETIVOS……………………………………………………………………….
CAPÍTULO I
ORIGEN DE LA ESPECTROFOTOMETRÍA
1. HISTORIA…………………………………………………………………….
2. PRINCIPIOS DE ESPECTROFOTOMETRÍA……………………………….
3. FUNCIONAMIENTO…………………………………………………………
4. TIPOS DE ESPECTROFOMETRÍA…………………………………………..
CAPÍTULO II
APLICACIONES ANALÍTICAS
5. ABSORBANCIA……………………………………………………………..
6. TRANSMITANCIA…………………………………………………………..
CONCLUSIONES……………………………………………………………….
BIBLIOGRAFÍA………………………………………………………………...
INTRODUCCIÓN
La presente investigación monográfica: “Principios de la espectrofotometría”, trata de
un método utilizado para medir cuanta luz absorbe una sustancia química, midiendo la
intensidad de la luz cuando un haz luminoso pasa a través de la solución muestra,
basándose en la Ley de Beer-Lambert. Esta medición también puede usarse para medir
la cantidad de un producto químico conocido como sustancia.
La espectrofotometría utiliza el espectrofotómetro lo cual es un instrumento que permite
comparar la radiación absorbida o transmitida por una solución que contiene una
cantidad desconocida de soluto, y una que contiene una cantidad conocida de la misma
sustancia, permitiendo así un mejor uso y control del espectrofotómetro.
El trabajo se organiza de la siguiente manera: El capítulo I: se ocupa del origen de la
espectrofotometría. Esta parte consta de los principios, funcionamiento y tipos de
espectrofotometría en diversas áreas estudiadas. Finalmente, el Capítulo II: que
corresponde a las aplicaciones analíticas de la espectrofotometría, lo cual hace
referencia al efecto que se puede medir que puede ser: la absorbancia y transmitancia.
Sirvieron de fuentes de consulta los textos, revistas y páginas web, para el presente
trabajo monográfico.
OBJETIVOS
Objetivo general:
Obtener mayor conocimiento respecto al tema de la espectrofotometría.
CAPÍTULO I
ORIGEN DE LA ESPECTROFOTOMETRÍA
1. HISTORIA
La espectrofotometría surgió con el estudio de la interacción entre la radiación y la
materia como función de la longitud de onda (λ). En un principio se refería al uso de la
luz visible dispersada según su longitud de onda, por ejemplo por un prisma. Más tarde
el concepto se amplió enormemente para comprender cualquier medida en función de la
longitud de onda o de la frecuencia. Por tanto, la espectrofotometría puede referirse a
interacciones con partículas de radiación o a una respuesta a un campo alternante o
frecuencia variante (ν). Una extensión adicional del alcance de la definición añadió la
energía (E) como variable, al establecerse la relación E=hν para los fotones. Un gráfico
de la respuesta como función de la longitud de onda (o más comúnmente la frecuencia)
se conoce como espectro.
2. PRINCIPIOS DE LA ESPECTROFOTOMETRÍA
En la espectrofotometría se aprovecha la absorción de radiación electromagnética
en la zona del ultravioleta y visible del espectro. La muestra absorbe parte de la
radiación incidente en este espectro y promueve la transición del analito hacia un estado
excitado, transmitiendo un haz de menor energía radiante. En esta técnica se mide la
cantidad de luz absorbida como función de la longitud de onda utilizada. La absorción
de las radiaciones ultravioletas, visibles e infrarrojas depende de la estructura de las
moléculas, y es característica de cada sustancia química.
La espectrofotometría ultravioleta-visible utiliza ases de radiación del espectro
electromagnético, en el rango UV de 180 a 380 nm, y en el de la luz visible de 380 a
780 nm, por lo que es de gran utilidad para caracterizar los materiales en la región
ultravioleta y visible del espectro.
Ley de Beer
La de Beer Ley de Beer declara que la cantidad de luz absorbida por un cuerpo depende
de la concentración en la solución. Por ejemplo, en un vaso de vidrio tenemos agua con
azúcar diluida y en otro tenemos un vaso con la misma cantidad de agua pero con más
azúcar diluida. El detector es una celda fotoeléctrica, y la solución de azúcar es la que se
mide en su concentración. Según la ley de Beer, si hiciéramos que un rayo de luz
atravesara el primer vaso, la cantidad de luz que saldría del otro lado seria mayor que si
repitiéramos esto en el segundo; ya que en el segundo, las ondas electromagnéticas
chocan contra un mayor número de átomos o/y moléculas y son absorbidos por estos.
Ley de Lambert
Se dice que la cantidad de luz absorbida por un objeto depende de la distancia recorrida
por la luz. Por ejemplo, retomando el ejemplo de los vasos, pero ahora, pensemos que
ambos tiene la misma cantidad de agua y la misma concentración de azúcar, pero, el
segundo tiene un diámetro mayor que el otro.
Según la ley de Lambert, si hiciéramos que un rayo de luz atravesara el primer vaso, la
cantidad de luz que saldría del otro lado seria mayor que si repitiéramos esto en el
segundo; ya que en el segundo, las ondas electromagnéticas chocan contra un mayor
número de átomos o/y moléculas y son absorbidos por estos; de la misma forma que se
explicó en la ley de Beer.
Ley de Bouguer-Beer-Lambert
Una ley muy importante es la ley de Bouguer-Beer-Lambert (también conocida como
ley Lambert Bouguer y Beer) la cual es solo una combinación de las citadas
anteriormente.
3. FUNCIONAMIENTO
El funcionamiento de un espectrofotómetro básicamente consiste en iluminar la
muestra con luz blanca y calcular la cantidad de luz que refleja dicha muestra en una
serie de intervalos de longitudes de onda. El instrumento se calibra con una muestra o
loseta blanca cuya reflectancia en cada segmento de longitudes de onda se conoce en
comparación con una superficie de reflexión difusa perfecta.
La reflectancia de una muestra se expresa como una fracción entre 0 y 1, o como un
porcentaje entre 0 y 100. Es importante darse cuenta de que los valores de reflectancia
obtenidos son valores relativos y, para muestras no fluorescentes, son independientes de
la calidad y cantidad de la luz usada para iluminar la muestra. Así, aunque los factores
de reflectancia se midan usando una fuente de luz concreta, es perfectamente correcto
calcular los valores colorimétricos para cualquier iluminante conocido.
4. TIPOS DE ESPECTROFOTOMETRÍA
Espectrofotometría de absorción
Es una técnica en la cual la energía de un haz de luz se mide antes y después de la
interacción con una muestra. Cuando se realiza con láser de diodo ajustable, se la
conoce como espectroscopia de absorción con láser de diodo ajustable. También se
combina a menudo con una técnica de modulación, como la espectrometría de
modulación de longitud de onda, y de vez en cuando con la espectrometría de
modulación de frecuencia a fin de reducir el ruido en el sistema.
Espectrometría de fluorescencia
La espectrometría de fluorescencia usa fotones de energía más elevada para excitar
una muestra, que emitirá entonces fotones de inferior energía.
Esta técnica se ha hecho popular en aplicaciones bioquímicas y médicas, y puede ser
usada con microscopía confocal, transferencia de energía entre partículas fluorescentes,
y visualización de la vida media de fluorescencia.
Espectrometría de rayos x
Cuando los rayos X con suficiente frecuencia (energía) interaccionan con una
sustancia, los electrones de las capas interiores del átomo se excitan a orbitales vacíos
externos, o bien son eliminados completamente, ionizándose el átomo. El "agujero" de
la capa interior se llena entonces con electrones de los orbitales externos. La energía
disponible en este proceso de excitación se emite como radiación (fluorescencia) o
quitará otros electrones menos enlazados del átomo (efecto Auger). La absorción o
frecuencias de emisión (energías) son características de cada átomo específico. Además,
para un átomo específico se producen pequeñas variaciones de frecuencia (energía) que
son características del enlace químico. Con un aparato apropiado pueden medirse estas
frecuencias de rayos X características o energías de electrones Auger. La absorción de
rayos X y la espectroscopia de emisión se usan en química y ciencias de los materiales
para determinar la composición elemental y el enlace químico.
La cristalografía de rayos X es un proceso de dispersión. Los materiales cristalinos
dispersan rayos X en ángulos bien definidos. Si la longitud de onda de los rayos X
incidentes es conocida, se pueden calcular las distancias entre planos de átomos dentro
del cristal. Las intensidades de los rayos X dispersados dan información sobre las
posiciones atómicas y permiten calcular la organización de los átomos dentro de la
estructura cristalina.
Espectrometría visible
Muchos átomos emiten o absorben la luz visible. A fin de obtener un espectro lineal
fino, los átomos deben estar en fase gaseosa. Esto significa que la sustancia tiene que
ser vaporizada. El espectro se estudia en absorción o emisión. La espectroscopia de
absorción visible a menudo se combina con la de absorción ultravioleta (espectroscopia
UV/Vis). Aunque esta forma pueda ser poco común al ser el ojo humano un indicador
similar, todavía se muestra útil para distinguir colores.
Espectrometría ultravioleta
Todos los átomos absorben en la región ultravioleta (UV) ya que estos fotones son
bastante energéticos para excitar a los electrones externos. Si la frecuencia es lo bastante
alta, se produce la fotoionización. La espectrometría UV también se usa para la
cuantificación de proteínas y concentración de ADN, así como para la proporción de
proteínas y ADN en una solución. En las proteínas se encuentran generalmente varios
aminoácidos, como el triptófano, que absorben la luz en el rango de 280nm. El ADN
absorbe la luz en el rango de 260nm. Por esta razón, la proporción de absorbancia
260/280nm es un buen indicador general de la pureza relativa de una solución en
términos de estas dos macromoléculas. También pueden hacerse estimaciones
razonables de la concentración de ADN o proteínas aplicando la ley de Beer.
Espectrometría infrarroja
La espectrometría infrarroja ofrece la posibilidad de medir tipos diferentes de
vibraciones en los enlaces atómicos a frecuencias diferentes. En química orgánica, el
análisis de los espectros de absorción infrarroja indica qué tipo de enlaces están
presentes en la muestra.
CAPÍTULO II
APLICACIONES ANALÍTICAS
5. ABSORBANCIA (Abs)
Representado la cantidad de luz que es absorbida por la muestra. Es el logaritmo en base
diez del recíproco de la transmitancia, en el que el disolvente puro es el materia de
referencia.
Absorbancia = -log (T) = -log ( P ⁄ Po )
Donde:
T = Transmitancia.
P = Intensidad de la luz transmitida.
P0 = Intensidad de la luz incidente.
Esto permite que diferentes espectrofotómetros con diferentes fuentes de luz produzcan
lecturas de absorción independientes de la potencia de la fuente de luz.
6. TRANSMITANCIA (T)
Representa el porcentaje de luz que pasa a través de la muestra. Es la relación entre la
intensidad de radiación transmitida por la muestra y la intensidad de radiación que
incide sobre la muestra, medidos ambos en la misma posición del espectro y con la
misma rendija. Se supone que el haz de radiación es paralela y que incide sobre las
superficies planas y paralelas de la muestra formando ángulos rectos para evitar el
fenómeno de distracción que podría desviar el haz el detector resultando en mediciones
equivocadas o erróneas.
Transmitancia = P / P0
Donde:
T = Transmitancia.
P = Intensidad de la luz transmitida.
P0 = Intensidad de la luz incidente.
CONCLUSIONES
Llegado al final de la monografía, es preciso establecer las conclusiones que permitan
dejar en claro el tema tratado.
- Un espectrofotómetro tiene distintos usos, entre ellos se tiene para el análisis
cuantitativo en diversas áreas como es el caso de la química, física, biología,
bioquímica, materiales e ingeniería química, aplicaciones clínicas, industriales, etc.
BIBLIOGRAFÍA
Colectivo de Autores. Manual de Física nuclear, La Habana 1978.
«Espectrofotometría». El Espectrofotómetro. 24 de diciembre de 2016. Consultado el 9
de mayo de 2017.
[Link]
Laboratorio
[Link]
