CUANTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS
Elianeth Romero, José Cobo, Ketty Pérez Melendres & Luis Ángel Tamara Polo.
Universidad de Sucre
Programa de Biología
Microbiología General
INTRODUCCIÓN
La cuantificación de microorganismos por montaje de colonias, ha sido ampliamente
utilizada para determinar poblaciones microbianas viables en los alimentos y varios sustratos,
este procedimiento está basado en la presunción de que cada célula microbiana en una
muestra se formará a simple vista, con colonias separadas cuando son mezcladas con el agar
u otro medio sólido que permita su crecimiento. El método de contaje de colonias provee
una estimación del número de microorganismos viables en una muestra de acuerdo al medio
empleado y el tiempo y la temperatura de incubación. Las células microbianas a menudo se
encuentran como conjuntos o grupos de células, por cuanto, la muestra y las diluciones
homogeneizadas pueden uniformemente distribuir los conjuntos de bacterias, ya que estos
grupos no pueden ser disgregados completamente por ellos mismos. Cada colonia que
aparece en las cajas de Petri con agar como grupos de células libres deben ser referidas como
Unidades Formadoras de Colonias (UFC) [1].
El método utilizado con más frecuencia para la medición de poblaciones bacterianas es el
recuento en placa. Una ventaja importante de esta técnica es que mide el número de células
viables. Una desventaja es que se requiere bastante tiempo, por lo general 24 horas o más,
para que se formen colonias visibles. Esto puede plantear un grave problema en algunas
aplicaciones, como por ejemplo el control de calidad de la leche, cuando no es posible
mantener un lote determinado durante tanto tiempo. El recuento en placa se basa en la
suposición de que cada bacteria crece y se divide para producir una sola colonia. Esto no
siempre es cierto porque las bacterias con frecuencia crecen unidas en cadenas o como
grumos. Por consiguiente, a menudo una colonia no se produce como resultado de una única
bacteria sino de segmentos cortos de una cadena o dc un agregado bacteriano [2]. Este
método lleva consigo el hacer un banco de diluciones seriadas que no son más que un tipo
de diluciones sucesivas manteniendo constante el factor de dilución en cada paso [3].
El objetivo de la práctica fue el conocer el fundamento de las técnicas más utilizadas para la
cuantificación microbiana, de igual forma el establecer cuantificación de microorganismos a
partir de muestras, mediante el método de recuento en placa en superficie.
METODOLOGÍA
Los procesos llevados a cabo durante esta práctica se contemplan en el Diagrama 1.
Recuento en placa con siembra en superficie
Se marcaron 3 cajas de Petri con Se procedió a extender la muestra
el medio PCA 10-4, 10-5 y 10-6 sobre la superficie del agar con la
(Figura 2:B) ayuda de una espátula en forma de
L.
Después se marcaron los tubos
que contenían 9 mL del diluyente Se dejó en reposo durante 10
desde 10-1 hasta 10-6 véase minutos aproximadamente y luego
(Figura 2:A). se ubicaron las cajas en posición
invertida y se llevaron a la
incubadora a 37 °C durante 24
Se tomó 1 mL de leche y se añadió
horas. Al cabo de este tiempo se
al tubo 10-1 se agito por 10
procedió a revisar los resultados.
segundos.
Luego se pipeteó 1 mL tubo 10-1 al Se contaron las colonias de
tubo 10-2 y así sucesivamente hasta bacterias que se desarrollaron
llegar al tubo 10-6; utilizando sobre el agar y para calcular el
siempre una nueva pipeta para cada número de unidades formadoras de
tubo. colonia (UFC), se tomaron en
cuenta aquellas placas con 30-300
colonias.
Con la última pipeta se procedió a
tomar alícuotas de 0.1 mL de los
tubos 10-4, 10-5 y 10-6 y se vertió Las UFC se calcularon mediante la
esta cantidad sobre las placas de fórmula:
Petri en el orden inverso, es decir 𝑛𝑢𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎𝑠 𝑥 1
𝑈𝐹𝐶 =
desde 10-6 hasta 10-4. 𝑓𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖𝑜𝑛 𝑋 1 𝑚𝑙 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎
Diagrama 1. Proceso general utilizado durante la práctica.
RESULTADOS Y DISCUSION
Cálculos
• Factor de dilución: 1/10
• Fórmula para el cálculo de unidades formadoras de colonias:
UFC=número de colonias*1/factor de dilución*1/ml de muestra
1. Para la muestra 10-4 se reportaron 160 colonias, Remplazamos:
UFC=160*1/10-4*1ml=
160*105 UFC/ml ≈16000000
2. Para la muestra 10-5 se reportaron 400 colonias
UFC=400*1/10-5*1ml
400*106 UFC/ml ≈400000000
3. Para la muestra 10-6 se reportaron 85 colonias
UFC=86*1/10-6*1ml=
86*107 UFC/ml ≈860000000
Figura 1. Resultado del crecimiento bacteriano luego de 24 horas. Se observa cada una de
las colonias que germinaron en los tratamientos 10-4, 10-5 y 10-6. Además se resaltó con un
rotulador negreo la posición de estos para que el conteo fuera más fácil.
Figura 2. Instrumentos utilizados en la práctica. A: tubos de ensayo marcados desde 10-1
hasta 10-6 y B: Cajas de Petri con el medio PCA 10-4, 10-5 y 10-6.
Es importante considerar un número limitado de colonias pues de no ser así, éstas pueden
sobrepoblarse y dificultar el conteo de las mismas. El rango sugerido de conteo de acuerdo a
la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) es de 25-250 colonias, por otra parte
muchos microbiólogos prefieren placas con 30 a 300 colonias [2] [4].
De acuerdo a los resultados obtenidos las colonias sobrepasaban estos rangos, además debido
a la sobrepoblación, superposición de unas con otras o la unión de estas, no se podían
diferenciar bien las colonias, las que se contaron eran porque se encontraban individuales.
Cabe destacar que con una muestras de bacterias pobladas era muy difícil el conteo es por
ello que con un rotulador se calco la presencia de las colonias para que su conteo fuera más
fácil, véase figura 1.
Es muy probable que algunas de las colonia presentes en las muestras sean de agentes
contaminantes que pudieron haber germinado durante dicho proceso, esto a raíz de una mala
manipulación de los instrumentos utilizados. A demás durante la practica uno de los tubos de
ensayo que contenía la dilución 10-5 se rompió, aun con este accidente se terminó la práctica.
Es posible que la muestra se haya contaminado y por eso en los resultados se vea un número
exagerados de colonias que sobrepasan las 400. Otra posible explicación del porque hubo
tantas colonias en la muestra 10-5 se pudo haber debido a un descuido que termino en invertir
las muestras 10-5 en 10-4 y viceversa. Ya que si organizamos de manera los datos de mayor
a menor sin tener en cuenta el orden se observa mayor la proporción.
La leche al ser un producto lácteo es más propenso a la contaminación por micotoxinas o
cualquier agente que se encuentre en el ambiente, es por ello que su manipulación en el
laboratorio debe ser con extremo cuidado. Cuando se realiza el recuento en placa es
importante que crezca sólo un número limitado de colonias en la placa. Cuando hay
demasiadas colonias algunas células se encuentran apiñadas y no pueden desarrollarse; esta
situación es causa de inexactitudes en el recuento [5].
CONCLUSIONES
Los microorganismos suelen desarrollarse en condiciones ambientales y fisicoquímicas
óptimas que obedecen a su biología, esto debe tenerse en cuenta al momento de tomar una
muestra destinada a realizar conteo de microorganismos. La cuantificación de
microorganismos es un elemento crítico en los estudios de ecología microbiana y
microbiología clínica. No solo es importante conocer al responsable de un efecto benéfico o
identificar al microorganismo potencial de causar alguna infección severa, sino también es
importante saber el número de microorganismos implicados, para establecer si éstos serán
capaces de desarrollar una función benéfica o perjudicial.
CUESTIONARIO
1. Investigue el fundamento de técnicas existen para el conteo total de microorganismos.
Conteo en caja de petri
Método más usado para contar bacterias. Se prepara un caldo de cultivo, el cual
posteriormente se vierte en las placas de petri. Dependiendo del tipo de sembrado, puede que
la muestra se encuentre incorporada en el agar) o puede que la muestra se disperse sobre el
agar gelificado .Es de suponerse que cada célula o grupo de células presentes en la muestra
se reproducirá en sus múltiples alrededores para producir "colonias de células" separadas en
el agar. Cada colonia es llamada unidad formadora de colonias (UFC). Es importante
considerar un número limitado de colonias pues de no ser así, éstas pueden sobrepoblarse y
dificultar el conteo de las .El conteo se facilita utilizando un contador de colonias.
Conteo por filtración
En esta técnica se necesitan al menos 100 mL de agua que atraviesen una membrana delgada
de un filtro, con poros tan pequeños que no permitan el paso de bacterias, de esta forma éstas
son retenidas en la superficie del [Link] el filtro es transferido a una caja de
petri que cuenta con un caldo nutritivo, en la cual las colonias surgen de las bacterias en la
superficie del filtro. Las colonias bacterianas formadas por este método son distintivas
cuando ocupan un medio [Link] método es aplicado frecuentemente en la detección
y enumeración de bacterias coliformes, las cuales son indicadores de contaminación fecal en
la comida o en el agua.
Método del número más probable (NMP)
Es una técnica de estimación estadística basada en el hecho que a mayor número de bacterias
en una muestra, mayor será la dilución necesitada para reducir la densidad hasta el punto en
que ninguna bacteria se le permita crecer en la serie de tubos de dilución. Muestras
microbianas son añadidas a tubos con caldos de lactosa y la presencia o ausencia de gas
formado en la fermentación y da un estimado de número de células. Este método es más útil
cuando las bacterias que están siendo contados no crecerán en medios sólidos, como en el
caso de las bacterias nitrificantes quimioautótrofas.
Determinación directa por microscopio
Las células se pueden contar en un frote teñido, como es el caso del Método de Breed,
colocando en la preparación un volumen conocido de la suspensión de células sobre un área
conocida del portaobjetos. Después de haber fijado y teñido el frote, es posible contar con un
microscopio las bacterias.
Como no es práctico recorrer toda el área, se cuenta el número de células en unos cuantos
campos microscópicos seleccionados al azar. Si el diámetro del campo microscópico se mide
con micrómetro objetivo, se puede calcular fácilmente el área, entonces el número de campos
en 1 cm2 se multiplicará por el promedio del número de células por campo y después por
100 (si se vierte 0.01 mL) el resultado será igual al número de células por mililitro. Este
método es susceptible a muchas críticas debido a su falta de uniformidad al momento de
hacer el frote.
Método de turbidez
El instrumento usado para medir la turbiedad es un espectrofotómetro (colorímetro). En el
espectrofotómetro, un haz de luz es transmitido a través de la suspensión bacteriana a un
detector sensible a la luz. Mientras incremente el número de bacterias, menor será la luz
captada por el detector. Este cambio en la luz se registrará en la escala del instrumento como
el porcentaje de transmisión. También se registra una expresión logarítmica llamada
absorbancia (algunas veces nombrada densidad óptica), un valor derivado del porcentaje de
transmisión que puede ser reportado. Más de un millón de células por mililitro deben estar
presentes para que la primera señal de turbidez sea visible. Aproximadamente de 10 millones
a 100 millones de células por mililitro son necesitadas para hacer una suspensión
suficientemente turbia para leer en el espectrofotómetro. La turbidez no es útil para medir
contaminación en líquidos por la pequeña cantidad relativa de bacterias.
Determinación del peso seco en las células
Es el método más directo para las mediciones cuantitativas de la masa celular y
probablemente el más fácilmente realizable y reproducible, aunque se debe aplicar sólo en
suspensiones celulares muy densas y las células deben ser lavados muy bien para removerles
todo material extra. Se utiliza para bacterias filamentosas y mohos. En este proceso, el fungus
es removido del medio de crecimiento, filtrado para remover material extraño, drenado en un
secador y después es pesado [6] [7] [8].
2. ¿Qué técnicas existen para el conteo de microorganismos vivos y en que se basan?
•Contaje en Placa Standard: Consiste en el plaqueo de una muestra de volumen conocido del
alimento que se analiza. El resultado es función de una serie de factores como son el método
de muestreo, el tipo de microorganismo, el tipo de alimento y las características del medio
de cultivo. Cada bacteria viable formará una colonia, el plaqueo puede hacerse en una placa
normal o por medio de un plaqueador en espiral que va depositando concentraciones
progresivamente más diluidas de la muestra.
Contaje microscópico directo: Usando cámaras de cuenta, se coloca un volumen determinado
y se recuentan las bacterias.
Determinación del número más probable: Es una técnica de estimación estadística basada en
el hecho que, a mayor número de bacterias en una muestra, mayor será la dilución necesitada
para reducir la densidad hasta el punto en que ninguna bacteria se le permita crecer en la serie
de tubos de dilución. Muestras microbianas son añadidas a tubos con caldos de lactosa y la
presencia o ausencia de gas formado en la fermentación y da un estimado de número de
células.
Métodos basados en la reducción de colorantes por viables: Usando azul de metileno o
resazurina. Colorantes reducidos por las bacterias; al reducirse cambian de color y esto es
medible. Usado en medios líquidos [9] [10].
3. ¿Para qué se utilizan estas técnicas en la industria o en la clínica?
Para el conteo de microorganismos y para el aislamiento de estos, en la industria sirve para
la conservación de alimentos y en la clínica ayuda a detectar bacterias patógenas causantes
de enfermedades [11].
4. Investiga que métodos comerciales existen para el conteo de bacterias, hongos y
levaduras ¿cuál es su fundamento?
•Recuento de levaduras y mohos. Técnica de enumeración de las colonias a 25º C: Este
método se basa en la siembra en profundidad en un medio de cultivo selectivo determinado,
en dos placas de Petri, con una cantidad determinada de muestra si el producto a examinar es
líquido, o con una cantidad determinada de suspensión madre en el caso de otros productos.
En las mismas condiciones, siembra de las diluciones decimales obtenidas de la muestra o de
la suspensión madre. Incubación de las placas en aerobiosis a 25º C, durante 3, 4 ó 5 días.
Cálculo del número de levaduras y mohos por mililitro o por gramo de muestra a partir del
número de colonias obtenidas en las placas escogidas a los niveles de dilución que dan un
resultado significativo.
• La Placa 3M™ Petrifilm™ para Recuento Rápido de Mohos y Levaduras: Es un medio de
cultivo listo para usar que contiene nutrientes suplementados con antibióticos, un agente
gelificante soluble en agua fría y un indicador que facilita la enumeración de mohos y
levaduras. Las placas para recuento rápido de mohos y levaduras (RYM) 3M™ Petrifilm™
simplifican y aceleran el proceso de detección, ofreciendo resultados en solo 48 [Link]
obtener resultados más rápidos y menor uso de mano de obra, podrá contar con más tiempo
para supervisar el proceso, garantizando un control de proceso más estricto y una mayor
calidad del producto [12] [13].
BIBLIOGRAFÍA
[1] Ministerio de agricultura y ganadería MAG & Instituto interamericano para la
cooperación para la agricultura IICA (2001) Manual de Procedimientos Para El Control
Microbiológico de Alimentos. Asunción, Paraguay.
[2] Tortora, G. J., et al. (2007). Introducción a la microbiología, Médica Panamericana.
[3] [Link]. (2018). Diluciones seriadas | cuaderno de laboratorio. [online] Available
at: [Link] [Accessed 18 Mar.
2018].
[4] Food and Drug Administration (2003) “Bacteriological Analytical Manual”. 9thed.
Arlington, VA: AOAC.
[5] Camacho, A., [Link], [Link]ón, [Link], [Link] y [Link]ázquez. 2009. Técnicas
para el Análisis Microbiológico de Alimentos. 2ª ed. Facultad de Química, UNAM. México.
[6] Tortora, Gerard J (2004). Microbiology “An Introduction” (8va edición). Pearson
Prentice Hall.
[7] Pelczar, Michael J. (1982). Microbiology (2da edición). Mc Graw Hill.
[8] Pommerville, Jeffrey C. (2010). Alcamo’s fundamentals of Microbiology (4ta edición).
Jones and Bartlett Publishers.
[9] Cabral, Brandon., Gonzales, Lesly., Hernández, Nayeli., Jiménez, Fabiola., lagunas,
Itzel., lira, Vanessa., mata, Lizbet., Hernández, Alan. 2014. Dilución bacteriana. Centro de
bachillerato tecnológico industrial y de servicio. Disponible en:
[Link]
[10] Microbiología de alimentos. (2016), Análisis de los Microrganismos totales. [online]
Available at: [Link]
[11] Alonso, l & Poveda, J. (2008). Estudio comparativo en técnicas de recuento rápido en
el mercado y placas petrifilmTM y 3MTM para el análisis de alimentos. Pontificia
universidad Javeriana. Bogotá.
[12] [Link]. (2018). Placas 3M™ Petrifilm™ para Recuento Rápido de Mohos y
Levaduras. [online] Available at: [Link]
productos-3m/~/Placas-3M-Petrifilm-para-Recuento-R%C3%A1pido-de-Mohos-y-
Levaduras/?N=5002385+3293784883&rt=rud [Accessed 19 Mar.
[13] [Link]. (2018). Métodos de análisis microbiológico. [online] Available at:
[Link] [Accessed 19 Mar. 2018].
