INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
INGENIERO BIOQUIMICO.
AISLAMIENTO DE DNA PLASMIDICO
NTRODUCCION:
El termino DNA recombinante significa la unión o recombinación de dos piezas de DNA de dos diferentes
especies. Esta técnica permite purificar un gen (clona) de una especie para insertarlo al DNA de otras especies,
donde se replica junto con el DNA del hospedero.
Los plásmidos, también llamados plasmodios, son moléculas de DNA extra cromosómico circular o lineal que se
replican y transcriben independientes del DNA cromosómico. Están presentes normalmente en bacterias, y en
algunas ocasiones en organismos eucariotas como las levaduras, aparecen en el citoplasma de las bacterias. Su
tamaño varía desde 1 a 250pb. El número de plásmidos puede variar, dependiendo de su tipo, desde una sola
copia hasta algunos cientos por célula. Determinan ciertos rasgos, que no son vitales, pero que de alguna
manera determinan la capacidad del organismo para adaptarse.
Estas moléculas de DNA portan solamente unos pocos genes que en cierto modo están ligados al cromosoma
bacteriano, de forma que se replican en números fijos, junto con los cromosomas. Las moléculas de DNA
plasmídico, adoptan una conformación tipo doble hélice al igual que el DNA de los cromosomas, aunque, por
definición, se encuentran fuera de los mismos. Se han encontrado plásmidos en casi todas las bacterias. A
diferencia del DNA cromosomal, los plásmidos no tienen proteínas asociadas.
OBJETIVOS:
Aislar DNA plasmídico bacteriano, comprobando dicho aislamiento mediante electroforesis en gel de agarosa.
DNA cromosomal
Plasmido relajado
Plasmido lineal
Plasmido súper enrollado
RNA
Imagen 1. Electroforesis en gel de agarosa. Separación de
las tres formas de plásmidos, revelado con luz UV.
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
INGENIERO BIOQUIMICO.
AISLAMIENTO DE DNA PLASMIDICO
Discusión:
Para la obtención de DNA plasmidico, este se realizó por medio de una célula anfitriona, de la cual se utilizó cepas
de Escherichia Coli, en esta se encuentra el plásmido más representativo pUC 19 que lleva un origen de
replicación y el gen de resistencia a la ampicilina. El cultivo de esta bacteria provino de una sola colonia, la cual fue
cultivada en medio Luria-ampicilina en fase logarítmica.
El DNA cromosomal, lo podemos encontrar en el precipitado, mientras que el DNA plasmidico se queda en el
sobrenadante junto con el RNA al realizarse la centrifugación durante 5 minutos a 13000 rpm. De inmediato el
sobrenadante (que contiene al plásmido) se le adiciono 500 μL de la solución IV, la cual contiene isopropanol, el
cual provoca la deshidratación del DNA, provocando su precipitación, en seguida se centrifugo por 5 minutos a
13000 rpm, una vez terminada la centrifugación se secó al aire el tubo eppendorf y se adiciono Tris-EDTA, como
el Tris le da un medio estable al DNA, mientras que el EDTA lo protege del ataque de las nucleasas.
Por otra parte, se pesó 1 g de agarosa y se suspendió en 100 mL de regulador TB 1X y se calentó hasta
licuefacción, enseguida se vertió la agarosa en el portageles de la cámara de la electroforesis, se colocó el peine
y se esperó hasta que solidificara. Se tomaron 5 μL del DNA plasmídico obtenido anteriormente y se colocaron en
un pozo para realizar posteriormente la electroforesis. El DNA plasmídico posee con una carga negativa, por lo
que migra al ánodo (carga positiva). El DNA plasmidico se puede encontrar en 3 formas diferentes: relajada, lineal
y súper. El gel de agarosa es una matriz que cuenta con pequeños espacios en donde las moléculas pueden ir
pasando a través del gel (como si fueran una especie de tela). Entre menor sea el tamaño de la molécula, tendrá
una menor dificultad para atravesar el gel, por lo tanto, va a recorrer más distancia. En este caso, la forma más
pequeña del DNA es la súper, lo que significa que migra con mayor rapidez que las otras dos formas. La siguiente
en migrar más rápido es la forma lineal, tiene una mayor superficie de contacto que la forma anterior, lo cual
dificulta un poco su paso a través de la agarosa. Seguida de esta forma, se encuentra la relajada, es la que tiene
mayor volumen, por lo que su migración es muy dificultada, aunque aun así puede migrar pero con una
dificultad mayor.
El RNA al ser un compuesto de bajo peso molecular, no tiene dificultad de migrar al ánodo, por lo que se observa
una gran concentración de él, en la parte inferior. Encambio el DNA cromosomal, su molécula es muy grande
para atravesar el gel, por lo que se observa que no migra casi nada. Para poder observar el corrimiento de estas
moléculas, se reveló con bromuro de etidio, este se intercala entre los ácidos nucleicos (bases) y sirve
como marcador, se observó con luz U.V. debido a que así los orbitales de los electrones sufren una
estimulación que provoca que se desacomoden y reacomoden, esto desprenden una energía luminosa, lo cual
nos permite observa al DNA.
Conclusiones:
Se logró aislar DNA plasmídico de Escherichia Coli, lo cual se comprobó por electroforesis en gel de agarosa donde
se pudieron identificar las tres formas en las que se encontraba en DNA plasmidico (super, lineal y relajada),
resultando la forma super la que predominó, al observar que fue la que migro con mayor rapidez al ánodo.
La migración del ADN plasmidico depende tanto de su carga como de su tamaño.
El gel de agarosa funciona como una especie de rejilla de colación, permitiendo el paso solo de moléculas muy
pequeñas para que se lleve a cabo el corrimiento.
Mientras menor sea la porosidad de el gel mayor será la resolución que dará en el revelado.
BIBLIOGRAFÍA:
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
INGENIERO BIOQUIMICO.
AISLAMIENTO DE DNA PLASMIDICO
E. Conn Eric, “Bioquímica fundamental”, Universidad de California, Editorial Limusa, 2001, México D.F.
Voet Donald, “Fundamentos de Bioquímica”, Editorial Médica Panamericana, 2ª Edición, 2007, Madrid,
España.
Preguntas extra:
¿Interfiere la estructura del DNA con el desplazamiento del mismo?
Si, debido a que mientras más enrollado se encuentra este pasara con mayor facilidad sobre el gel.
¿Qué diferencia hay entre un DNA bacteriano y un plásmido?
Los plásmidos, son moléculas circulares de ADN de doble cadena que constituyen una unidad de replicación
independiente del cromosoma. Por esto pueden encontrarse más de una copia del mismo plásmido dentro de la
célula bacteriana.
¿En qué formas puede estar el DNA?
- Circular relajado: Se halla desplegado sobre un único plano.
- Circular superenrollada: El contorno del círculo va girando sobre sí mismo de manera tal que adquiere profundidad.
- Lineal: Se suele representar con forma de escalera de caracol, siendo los lados de la escalera cadenas lineales de
nuceótidos unidos a nucleótidos del otro lado de la escalera por puentes de hidrogeno.
