UNIVERSIDAD NACIONAL DE CÓRDOBA
COLEGIO NACIONAL DE MONSERRAT
TECNICATURA SUPERIOR EN BROMATOLOGIA
Cátedra de Análisis de alimentos I
TRABAJO PRÁCTICO Nº 1
TEMA 4:
Cromatografía líquida de alta presión
“HPLC”
Profesor López, Jorge.
Curso 3A
Alumnos:
Forray, Cindy
Clarissa
Gambarte, Nicolás
Guzmán, Milagros.
Paz, Camila
Córdoba, 14 de mayo de 2018
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Tabla de Contenidos
Introducción 1
Fundamentos y principios 2
Tipos de HPLC 2
Cromatografía de Reparto 2
Cromatografía de fase enlazada 3
Cromatografía de adsorción 3
Cromatografía de intercambio iónico 3
Cromatografía de exclusión por tamaño 3
Intrumentación 3
Características de la técnica HPLC 9
Aplicaciones de HPLC 9
Conclusiones 11
Lista de referencias 12
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Introducción
La cromatografía moderna se inició a partir de un experimento desarrollado en 1906, por Mikhail
Tswett, con el fin de separar los colorantes que componen a las plantas. El mismo consistió en
aplicar una muestra y un eluyente por el extremo de una columna abierta, alimentada por
gravedad, y que contenía una fase estacionaria; logrando que las sustancias más afines al
solvente salieran de la columna más rápidamente que las menos afines. Esta técnica se usa
ampliamente en química preparativa y en bioquímica para separar los diferentes componentes de
una mezcla compleja.
Inicialmente, la cromatografía de líquidos se realizaba en columnas de vidrio con diámetros de 1
a 5 cm y longitudes de 50 a 500cm. Para asegurar unos caudales razonables, el diámetro de las
partículas de la fase estacionaria sólida por lo general era de 150 a 200 µm. Incluso así los
caudales eran bajos y en consecuencia, los tiempos de separación eran largos -a menudo varias
horas-. Los intentos iniciales para acelerar el procedimiento clásico mediante la aplicación de
vacío o por bombeo no resultaron efectivos y el resultado era una menor eficacia.
En las primeras etapas del desarrollo de la cromatografía de líquidos, los científicos se dieron
cuenta que podían conseguir grandes aumentos en la eficacia de las columnas disminuyendo el
tamaño de las partículas de los rellenos. Sin embargo, no fue sino a finales de los años sesenta
cuando se desarrolló la tecnología adecuada para producir y utilizar rellenos de tamaño de
partícula del orden de los 3 o 10 µm. Esta tecnología requiere una instrumentación sofisticada,
que contrasta con las simples columnas de vidrio de la cromatografía de líquidos clásica. Para
distinguir estos procedimientos más nuevos de los métodos básicos, que todavía se utilizan con
fines preparativos, se emplea la denominación de HPLC (High Performance Liquid
Chromatography) o CLAR (Cromatografía Líquida de Alta Resolución)
En el presente trabajo práctico se realiza un estudio de la técnica de HPLC, de su campo de
aplicación y su importancia en la industria de alimentos.
Fundamentos y principios
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La cromatografía de líquidos de alta resolución es una técnica que permite separar, aislar
e identificar los analitos de una mezcla de compuestos químicos, utilizando una fase móvil
líquida que fluye a través de una columna, la cual contiene a la fase estacionaria.
Los componentes individuales de la muestra y la fase móvil se desplazan por la columna
forzados por una alta presión suministrada por una bomba. De esta forma, la separación
cromatográfica de la muestra es el resultado de las interacciones específicas entre las moléculas
de la muestra en ambas fases, móvil y estacionaria.
La utilización de presión, incrementa la velocidad lineal de los compuestos dentro de la columna
y reduce así su difusión, mejorando la resolución de la cromatografía.
Tipos de HPLC
La cromatografía HPLC incluye diferentes métodos, por lo que puede clasificarse de acuerdo al
tipo de equilibrio involucrado, mismo que es gobernado por el tipo de fase estacionaria utilizada.
(Ver Tabla 1).
Tabla 1. Tipos de cromatografía líquida HPLC.
Método específico Fase estacionaria Tipo de equilibrio
Reparto - Partición Líquido adsorbido sobre un sólido Distribución entre líquidos
inmiscibles
Líquido fase enlazada Especies orgánicas (líquido) Distribución entre un líquido y una
enlazadas a una superficie sólida superficie enlazada
Adsorción Sólido Adsorción
Intercambio iónico Resina de intercambio iónico Intercambio iónico
Exclusión por tamaño Líquido en los intersticios de un Distribución/exclusión
sólido polimérico
Nota: Adaptado de Skoog D. A. y Leary J. J. (2004).
Cromatografía de Reparto
Utiliza una fase estacionaria líquida que forma una fina película sobre la superficie de un
material inerte sólido, que sólo actúa de soporte, y generalmente está compuesto por sílice. La
migración se produce entonces, por distribución debido a diferencia s de solubilidad. Según las
diferencias en las distintas polaridades de sus fases, se divide en:
● En fase normal: En este caso la fase estacionaria es polar (trietilenglicol, agua) y la móvil
apolar (hexano, éter). El componente menos polar es el primero que se detecta.
● En fase reversa: Su fase estacionaria en apolar (usualmente hidrocarburo) y la fase móvil
polar (mezclas de disolventes polares miscibles). El componente más polar es el primero
que se detecta.
Cromatografía de fase enlazada
La fase estacionaria es generalmente un polímero de tipo líquido inmovilizado sobre un sólido
inerte mediante enlaces covalentes.
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Al igual que la cromatografía de reparto, la separación se debe a equilibrios de distribución de
los solutos entre las fases controlados por las diferentes solubilidades entre ellas. La diferencia
entre ambas radica en la forma que se retiene la fase estacionaria sobre las partículas soporte del
relleno; en la cromatografía de reparto, la fase estacionaria líquida se retiene sobre la superficie
del soporte por adsorción física y en ésta se une químicamente.
Cromatografía de adsorción
Es la forma clásica de cromatografía de líquidos adoptada a principios de este siglo, y en la
actualidad se ha convertido en un método importante de HPLC.
La fase estacionaria es sólida. La separación se logra por las diferencias en solubilidad (en fase
móvil) y de retención por adsorción (en fase estacionaria) de la mezcla de solutos.
Cromatografía de intercambio iónico
Está relacionada con los métodos modernos y eficaces para la separación y determinación de
iones que se basan en el uso de las resinas de intercambio iónico.
En este tipo de HPLC, tanto la fase estacionaria como fase móvil son de naturaleza iónica. Los
iones de la fase estacionaria son de carga opuesta a los del eluyente y están unidos a la fase
estacionaria sólida, que de ordinario es una resina. De ésta forma, las fases compiten por los
solutos los cuales son atraídos por fuerzas electrostáticas.
La limitación es que el soluto sea iónico (un anión o un catión). Se trata de una técnica muy útil
para separar iones inorgánicos, proteínas, etc.
Cromatografía de exclusión por tamaño
Es una técnica que se aplica particularmente a especies de alto peso molecular.
Este tipo de cromatografía separa los solutos en función de su tamaño molecular. La fase
estacionaria en este caso es un material poroso, con un tamaño de poros controlados, que permite
la entrada de ciertas moléculas de manera selectiva, dejando fuera otras de mayor tamaño.
El principal inconveniente es que se trata de un método de baja resolución. No obstante, es muy
útil para la separación de proteínas y otras moléculas de alto peso molecular.
Instrumentación
Los principales fabricantes de instrumentación para HPLC son Waters, Agilent, Shimadzu, y
Hewlett Packard. Todos los instrumentos de HPLC pueden funcionar con distintos detectores y
programas.
Como consecuencia de estas elevadas presiones, el equipo necesario para la HPLC tiende a ser
más sofisticado y caro que el que se utiliza en otros tipos de cromatografía. La Figura 1 muestra
un esquema de los componentes fundamentales de un cromatógrafo de líquidos de alta
resolución típico.
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Figura 1. Esquema de un aparato de HPLC. Por Perkin-Elmer Corporation citado en Skoog. D. A. y Leary J. J.
(2004)
Componentes básicos:
1. Reservorios de la fase móvil
Un aparto moderno de HPLC se equipa con uno o más recipientes de vidrio, cada uno de los
cuales contiene unos 500 mL de un disolvente.
Las propiedades comunes a los diversos disolventes que se emplean son:
▪ Alta pureza (calidad HPLC),
▪ Inactividad frente a la fase estacionaria,
▪ Baja viscosidad,
▪ Compatibles con la muestra,
▪ Compatibilidad con el sistema de detección,
▪ Precio razonable.
Los recipientes a menudo se equipan con un sistema de desgasificación para eliminar los gases
disueltos que interfieren formando burbujas en los sistemas de detección. Puede consistir en un
sistema de bombeo por vacío, un sistema de destilación, dispositivos para calentar y agitar los
disolventes o con frecuencia estos sistemas también contienen un dispositivo para la filtración
del polvo y de las partículas sólidas en suspensión de los disolventes.
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No es necesario que los desgasificadores y los filtros sean partes integrantes de HPLC. Por
ejemplo, una forma conveniente de tratar los disolventes antes de introducirlos en el recipiente,
consiste en filtrarlos mediante el vacío a través de un filtro de poro muy pequeño.
2. Sistemas de bombeo
Los requisitos para un sistema de bombeo en HPLC son rigurosos e incluyen:
▪ Debe ser capaz de generar altas presiones, estables, por encima de los 5000 psi (400 atm)
▪ Mantener un flujo libre de pulsos,
▪ Permitir cambios de disolvente de modo simple y rápido.
▪ Componentes inertes y resistentes a la corrosión.
Se utilizan tres tipos de bombas: bombas recíprocas, bombas de jeringa o de
desplazamiento y bombas neumáticas o de presión constante.
Las más empleadas son las bombas recíprocas: Consisten en una pequeña cámara en la que el
disolvente es impulsado por el movimiento de vaivén de un pistón accionado por un motor (ver
Figura 2). La entrada y salida del disolvente se regula mediante dos válvulas anti retorno que se
abren y cierran alternativamente, permitiendo el paso de fluido en un solo sentido.
Figura 2. Bomba recíproca de HPLC. Enrique Castaños (2015)
3. Sistema de programación y control de caudal
Como una parte de sus sistemas de bombeo, muchos instrumentos comerciales se
equipan con válvulas de alimentación que permiten controlar de manera programada la velocidad
de flujo de cada disolvente en cada instante.
La elución puede realizarse de dos maneras:
a) Elución isocrática: Cuando se emplea un único disolvente o una mezcla de disolventes de
composición constante.
b) Elución con gradiente: En este caso se utilizan dos (y a veces más) disolventes con una
polaridad significativamente distinta. Una vez comienza la elución, se varía la relación de
los disolventes se forma programada, a veces continuamente y a veces mediante una serie
de etapas escalonadas, con el fin de modificar la polaridad de la fase móvil y disminuir el
tiempo de separación.
La Figura 3 ilustra la ventaja de una elución con gradiente en la separación de una mezcla de
clorobencenos. Obsérvese que la elución con gradiente acorta notablemente el tiempo de
separación sin sacrificar la resolución de los primeros picos.
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Figura 3. Mejora de la eficiencia de la separación mediante la elución con gradiente . La curva b) corresponde a la
elución isocrática con metanol/agua 50:50 (v/v). La curva a) muestra la elución con gradiente, que se inicia con una
mezcla 40:60 de los dos disolventes y se va aumentando la concentración de metanol un 8%/min. Skoog D. A. y
Leary J. J. (2004)
4. Sistemas de inyección
Antes de inyectar la muestra en el equipo, hay que tenerla en estado líquido o en solución, y
tener en claro que sea compatible tanto con la fase móvil como con la fase estacionaria. Se
pueden inyectar cantidades que varían entre 1 µl a 500 µL; generalmente se inyectan entre 5 µl y
10 µl. Las cantidades inyectadas varían dependiendo de la sensibilidad y el rango dinámico del
detector.
La inyección de la muestra debe hacerse a la entrada de la columna en un breve periodo de
tiempo para perturbar lo menos posible el régimen de circulación de la fase móvil. Se lleva a
cabo en dos etapas, la primera se realiza a presión atmosférica y consiste en cargar la muestra
con la ayuda de una jeringa. En la segunda etapa, se gira la válvula para hacer pasar el eluyente
hacia la columna.
En cromatografía de líquidos el método más ampliamente utilizado para la introducción de la
muestra utiliza bucle de muestra (Figura 4). Estos dispositivos están normalmente integrados en
el equipo cromatográfico y hay bucles intercambiables que permiten la elección de los tamaños
de muestra.
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Figura 4. Bucle de muestra para cromatografía de líquidos. Antonio Díaz (2017).
5. Columnas analíticas
Las columnas para cromatografía de líquidos se construyen de ordinario con tubo de acero
inoxidable de diámetro interno uniforme, aunque en algunas ocasiones se encuentran construidas
de vidrio y materiales poliméricos.
La mayoría de ellas tienen una longitud entre 5 y 30 cm y se pueden alargar, si es necesario,
acoplando dos o más columnas. El diámetro interno es a menudo de 4 a 10 mm y los tamaños de
las partículas de los rellenos más comunes son 3.5 y 10 µm.
Cientos de columnas empaquetadas que difieren en tamaño y relleno se comercializan por
distintos fabricantes y su coste oscila a partir de los 600 USD. Recientemente, se han comenzado
a fabricar columnas de alta resolución más rápidas, con menores dimensiones que las anteriores
que presentan la ventaja del mínimo consumo de disolvente, cuya propiedad es de considerable
importancia puesto que los disolventes de alta pureza que se requieren en cromatografía de
líquidos son muy caros.
Pre columnas: Las columnas son delicadas y caras por lo que en muchas ocasiones, para
aumentar la vida de la columna analítica, se coloca delante una pre columna que elimina los
contaminantes, la materia en suspensión y aquellos componentes que se unen de manera
irreversible a la fase estacionaria, de manera que cuando está muy contaminada, se vacía y se
rellena de nuevo o se reemplaza por otra nueva. La composición del relleno de la pre columna es
debe ser semejante al de la columna analítica; sin embargo, el tamaño de la partícula es por lo
común mayor para minimizar la caída de presión.
Relleno de la columna: El relleno empleado en las columnas de HPLC debe ser químicamente
inerte, mecánicamente resistente y poseer un tamaño de partícula bien definido.
En cromatografía de líquidos se han utilizado dos tipos básicos de relleno, pelicular y
de partícula porosa.
a. Pelicular: Consiste en bolas de vidrio o de polímero, no porosas y esféricas en cuyas
superficies se deposita una capa delgada y porosa de sílice, alúmina o una resina de
intercambio iónico. Para algunas aplicaciones se aplica un recubrimiento adicional,
constituida por una fase estacionaria líquida que se mantiene fija por adsorción. Las bolas
también se pueden tratar químicamente para obtener una capa superficial orgánica. Por lo
general, los rellenos peliculares se utilizan ampliamente en las pre columnas y no en las
columnas analíticas.
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b. De partícula porosa: Están formados por micropartículas porosas habitualmente de sílice
muy puro, que son permeables al disolvente y presentan una elevada área superficial.
También se emplean rellenos de alúmina (u otros óxidos metálicos), grafito poroso o
materiales poliméricos (como estireno-divinilbenceno).
El relleno puede actuar como mero soporte de una fase estacionaria líquida o, convenientemente
tratado, puede intervenir directamente en el proceso de separación.
Termostatos: Calentando las columnas cromatográficas, de ordinario, se disminuye la viscosidad
del disolvente, reduciéndose así la presión requerida o permitiendo un mayor caudal. En
ocasiones, al aumentar la temperatura se acortan los tiempos de retención y mejora la resolución,
porque aumenta la velocidad de difusión de los solutos. Sin embargo, se puede degradar la fase
estacionaria y reducir la vida de la columna si no se controla. Usando unos pocos grados por
encima de la temperatura ambiente se mejora la reproductibilidad de los tiempos de retención y
la precisión del análisis cuantitativo.
En muchas aplicaciones no se necesita un control estricto de la temperatura, y las columnas
trabajan a temperatura ambiente. La mayoría de los instrumentos comerciales llevan actualmente
hornos para las columnas que controlan la temperatura de la columna a las décimas de grado,
desde la temperatura ambiente hasta 150 °C.
6. Detector
El rol más importante del detector de HPLC es monitorear los solutos a medida que eluyen.
Genera una señal eléctrica, proporcional al nivel de alguna propiedad de la fase móvil o de
solutos. Las características necesarias de un buen detector de HPLC son:
▪ Sensibilidad,
▪ Linealidad,
▪ Confiabilidad,
▪ Fácil de usar,
▪ Bajo volumen muerto.
Los detectores en cromatografía de líquidos son de dos tipos básicos:
a) Los detectores basados en una propiedad de la disolución responden a una propiedad de
la fase móvil (disolución) que se modifica por la presencia de los analitos: Detector
índice de refracción, electroquímicos, de dispersión de luz, etc.
b) Los detectores basados en una propiedad del soluto responden a alguna de las
propiedades del soluto que no son propias de la fase móvil: Detector de absorbancia en
UV, de absorbancia en IR, de fluorescencia, etc.
Características de la técnica HPLC
✓ Versatilidad. La HPLC es capaz de separar macromoléculas y especies iónicas,
productos naturales lábiles, materiales poliméricos y una gran variedad de otros grupos
poli funcionales de alto peso molecular. Además, no está limitada por la volatilidad o la
estabilidad térmica de la muestra.
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✓ Selectividad. Con una fase móvil líquida interactiva, otro parámetro que se encuentra
disponible para la selectividad, en adición a una fase estacionaria activa.
✓ Reducción de impacto ambiental. La cromatografía HPLC usa grande volúmenes de
disolvente. Se pueden reducir los residuos usando:
o Columnas más cortas y partículas de menor tamaño
o Columnas más estrechas: pasar de diámetro 4.6 mm a 3.0 mm o 2.0 mm
o En separaciones isocráticas, usar un recuperador electrónico, que dirija el eluato a
un depósito de reciclado cuando no sale un pico.
✓ Alto costo. (A partir de 5000 USD los más básicos) El HPLC es un método caro para el
análisis de muestras, pero por otra parte es sumamente efectivo.
✓ Reproducibilidad. (siempre que utilicen las mismas condiciones de corrida se obtendrán
los mismos resultados).
✓ Sensibilidad. en la cromatografía en columna de vidrio se utilizaban grandes cantidades
de solvente, lo que diluía la muestra, disminuyendo la sensibilidad del método.
✓ Automatización. Excelente para la cuantificación debido a los detectores on-line que
utiliza.
✓ Rapidez.
Aplicaciones de HPLC
La HPLC permite estas separaciones e identificaciones de sustancias o grupos de sustancias en
un tiempo corto, tanto cualitativa como cuantitativamente. Como condición, es imprescindible
que la muestra sea soluble en un disolvente, al ser la fase móvil un líquido. Es especialmente
adecuada para compuestos poco volátiles, termolábiles e iónicos.
Algunas aplicaciones incluyen sustancias tan diversas como aminoácidos, proteínas, ácidos
nucleicos, hidrocarburos, carbohidratos, fármacos, terpenos, plaguicidas, antibióticos, esteroides,
especies organometálicas y una gran variedad de sustancias inorgánicas.
Ejemplos:
❖ Detección y cuantificación de cafeína y teobromina (Detección UV): que son
alcaloides muy importantes en el café, té y el cacao, especialmente por su acción
estimulante. El contenido de estos compuestos se utiliza para evaluar su calidad.
❖ Determinación de azúcares (Detección IR): La analítica de carbohidratos no resulta
fácil pues presenta acumulación de grupos funcionales iguales, los grupos hidroxilo, y
además posee gran número de esteroisómeros. Tras una dilución los azúcares se separan
cromatográficamente por medio de HPLC en una fase amínica.
❖ Determinación cuantitativa de polisacáridos: como el almidón, las dextrinas, los
dextranos, el glucógeno, la inulina, la celulosa, las hemicelulosas, las pectinas, así como
sustancias mucilaginosas de algas marinas y las gomas vegetales.
❖ Detección de ciclamato en jugos de fruta.
❖ Separación de ésteres de ácidos grasos: por fase inversa y con argentización de
columnas (Silicato de Al con Ag).
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❖ Separación de Triglicéridos por la longitud de la cadena y el grado de
insaturación: por fase inversa y detector de dispersión luminosa, para el estudio de
aceites y grasas adulteradas.
❖ Determinación del contenido de Vit A y sus precursores: (y β caroteno) en margarina
y aceites de hígado por fase inversa.
❖ Determinación del contenido en Vit D: en leche en polvo y cereales por fase normal.
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Conclusiones
La técnica de HPLC utiliza elevadas presiones para incrementar la velocidad de separación de
los analitos, reduciendo su difusión y mejorando la resolución de la cromatografía. Como
consecuencia de estas elevadas presiones, el equipo necesario para la HPLC tiende a ser más
sofisticado y caro que el que se utiliza en otros tipos de cromatografía.
El alto costo de la técnica también se ve influenciado por el costo de los disolventes de alta
pureza; las columnas de alta resolución más rápidas y con menores dimensiones, presentan esta
ventaja del mínimo consumo de disolvente, y menor cantidad de muestra requerida.
Los distintos procedimientos que utiliza la cromatografía de líquidos tienden a ser
complementarios en cuanto a sus campos de aplicación, por lo cual es el método más moderno
para realización de cromatografías y recientemente es una de las técnicas más utilizada en la
industria Química y de alimentos, ya que ofrece la posibilidad de identificar y cuantificar sus
componentes mediante el uso de sustancias patrón.
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Lista de referencias
Antonio Díaz, (2017). HPLC. Recuperado de: [Link]
76217622?qid=9888abd7-2ad6-49d0-a711-bf7555129ed6&v=&b=&from_search=7
Enrique Castaños (2015). Instrumentación en HPLC. Recuperado
de: [Link]
Harris, D. C. (2004). Análisis químico cuantitativo. (2 a ed.) Barcelona, España: Editorial Reverté
S. A.
Skoog, D. A. y Leary J. (1994). Análisis instrumental. (4 a ed.) D. F., México: McGraw-Hill.
