Recuento de Staphylococcus aureus en medio Baird Parker

I. INTRODUCCIÓN

Staphylococcus aureus es una especie bacteriana integrada por cocos (de 0,8-1,0 mm de
diámetro) Gram positivos que se dividen en más de un plano, por lo que se agrupan
irregularmente en racimos. Son inmóviles y no forman esporas. Anaerobios facultativos y
catalasa positivos.

Algunas cepas de S. aureus son patógenas para el hombre. Puede producir infecciones
generalizadas además de lo que se conoce como intoxicación estafilocócica. Ésta es una
intoxicación alimentaria resultados del consumo de alimentos en los que S. aureus se ha
multiplicado y producido enterotoxina.

La dosis infectiva es alta ya que es necesario un número de al menos 10 6 UFC/g para

producir cantidad suficiente de enterotoxina para producir la enfermedad en el
consumidor.

Es común referirse a las cepas de estafilococos coagulasa positivas y DNAsa termoestable

positivas como potencialmente productores de enterotoxinas, aunque no todas las cepas
con estas propiedades las producen realmente, sino sólo un porcentaje de ella, variable
con su origen.

Dado que es un microorganismo presente en la flora normal de los animales de sangre

caliente (más del 50 % de las personas son portadoras de [Link] en fosas nasales,
garganta, manos, pelo, etc.) y se trata de una especie muy sensible a la acción del calor y
de los desinfectantes, su presencia en determinados niveles en los alimentos indica higiene
defectuosa por mala manipulación. Si, además, los [Link] aislados son cepas
enterotoxigénicas, suponen un riesgo para la salud.

Puede ocurrir que no se detecte S. aureus en un alimento, que el número detectado sea
pequeño y que, sin embargo, exista cantidad detectable suficiente de enterotoxina
estafilocócica. En este caso, los microorganismos que originaron la toxina han ido
descendiendo en número e, incluso, desapareciendo, mientras que la toxina, por su mayor
resistencia, permanece en el alimento.

El cloruro de litio y el telurito potásico que forman parte del medio inhiben el desarrollo
de la flora competitiva; el piruvato sódico y la glicocola o glicina favorecen el crecimiento
de los estafilococos. La yema de huevo es el sustrato para detectar la producción de
lecitinasa y la actividad de la lipasa

El cloruro de litio y el telurito de potasio actúan como agentes selectivos. La yema de

huevo es el sustrato para detectar la producción de lecitinasa y la actividad de la lipasa .
Los estafilococos producen colonias de color gris oscuro a negro debido a la reducción
del telurito de potasio a teluro de potasio; Los estafilococos que producen lecitinasa
descomponen la yema de huevo y causan zonas claras alrededor de las colonias
respectivas. Se puede formar una zona opaca de precipitación debido a la actividad de la
lipasa ([Link] ).

El medio de cultivo es opaco, debido a que se le incorpora emulsión de yema de huevo.

S. aureus sintetiza una lipasa que, al actuar sobre la lipoproteina de la yema de huevo,
produce un aclaramiento alrededor de las colonias. Alrededor de las colonias se forma
también una zona opaca como consecuencia de la formación de un precipitado de sales de
calcio y magnesio, insoluble en ácidos grasos. Esta zona opaca se hace más visible a partir
de las 24 horas de incubación.

El aclaramiento del medio que rodea a las colonias junto con el color negro brillante de
las mismas, son las características típicas más visibles de las colonias típicas.

Las colonias que no presentan ese color negro brillante o que no tienen alrededor un halo
claro de lipolisis son consideradas atípicas y desechadas.

OBJETIVO

• Confirmar la presencia de este microorganismo como agente causal de

intoxicaciones.
• Determinar si un alimento o ingrediente de los mismos, es fuente potencial de este
microorganismo enterotoxigénico.
• Demostrar la contaminación postproceso, la cual es usualmente debida a contacto
humano o con superficies inadecuadamente sanitizadas.
 II. MATERIAL Y MÉTODOS

2.1. MATERIAL BIOLÓGICO

Muestra: alimento líquido o sólido

MEDIOS DE CULTIVO:

• Agar Baird Parker a

• Caldo infusión cerebro corazón (BHI) b
• Agar DNA
• Agua peptonada al 0,1% (diluyente)
• Plasma citratado de conejo, desecado y titulado

MATERIAL DE LABORATORIO

 Tubos de dilución 16x150mm y 10x100mm

 Pipetas 10ml
 Placas de Petri
 Mechero de alcohol
 Estufa
 Gradillas
 Azas microbiológicas calibradas

III. PROCEDIMIENTO

• Para ello, pesar 10 gramos de muestra y mezclar con 90 mL de agua de triptona

al 0,1% y homogeneizar durante 1 a 3 minutos. El tiempo varía según el tipo
de alimento.
• A partir de la primera dilución (10-1 ó 1/10), se preparan diluciones hasta 10-4
• Partiendo de las diluciones decimales, sembrar 0,1 ml por duplicado, en placas
Baird Parker, mediante extensión en superficie.
• Incubar a 37ºC durante 30 y 48 ± 2 horas.
• Después de la incubación, examinar las placas que presentan entre 20 y 200
UFC/ml, para ver la presencia de colonias sospechosas de S. aureus

IV. RESULTADOS

Las colonias típicas de Staphylococcus aureus sobre agar Baird-Parker son redondas, de
bordes lisos, convexas, de 2-3 mm de diámetro, húmedas, brillantes, negras, con un borde
blanco fino, rodeadas de una zona opaca y de un halo claro de 2-5 mm.
 PRUEBA DE LA COAGULASA
OBJETIVO:
• Determinar la presencia de la enzima coagulasa en Staphylococcus aureus
• Diferenciar especie entre S aureus coagulasa (+) y S epidermidis coagulasa (-).
PROCEDIMIENTO:
1. Sembrar las colonias seleccionadas en Caldo Infusión Cerebro Corazón caldo BHI e
incubar los tubos a 37°C durante 20 a 24 horas.
2. Adicionar 0.1 ml del cultivo a tubos de 10x100 que contengan 0.3 ml de plasma de
conejo e incubar a 37°C.
3. Examinar después de 4 horas de incubación, si el plasma ha perdido su fluidez o se
encuentra un coagulo más o menos grande. Si la reacción es negativa, incubar los
tubos a temperatura de laboratorio y reexaminar luego de 24 horas.

PRUEBA DE LA ENZIMA TERMONUCLEASA.

Es una prueba auxiliar a la prueba de la coagulasa, no la sustituye. Se recomienda que las
reacciones 2+, sean confirmada por una prueba termonuclesas antes de considerar como S
aureus coagulasa (+)
PROCEDIMIENTO
1. Calentar 0.3 mL de la suspensión del microorganismo que creció en caldo infusión
cerebro corazón durante 15 minutos en baño de agua hirviendo.
2. Hacer orificios circulares en el agar DNAsa Test de 2 mm de diámetro por medio de
una varilla de hueca y retirar los trozos de agar por aspiración.
3. Colocar una gota de la suspensión bacteriana, con ayuda de una pipeta Pasteur
estéril. Es recomendable incluir testigos tanto positivos (S. aureus ATCC 6538),
como negativos (S. epidermidis ATCC 12228).
4. Incubar a 35 ± 2 °C, durante 4 a 24 h.
5. Después de incubar, adicionar el colorante azul de orto-toluidina 0.1M a los
orificios hechos en el agar DNA
6. La formación de un color rosa brillante extendido por lo menos un milímetro
alrededor del orificio, en donde se inoculó, indicará que el microorganismo posee la
enzima termonucleasa.
7. En el caso de no contar con orto toluidina, se puede utilizar HCl 1.0N como indicador.
De encontrarse esta enzima, se observa un halo transparente alrededor de la colonia,
seguido de un precipitado blanco.
V. ANEXOS

Staphylococcus aureus en agar Baird Parker.

CÁLCULOS Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS
Para determinar el número de S. aureus enterotoxigénico presentes en 1.0 g de alimento se
deben de considerar:
Ejemplo: Al analizar una de alimento de acuerdo con esta metodología, se encontró que la
caja Petri representativa estadísticamente, contenía 70 UFC sospechosas de S. aureus (negras,
brillantes con halo y precipitado blanco). Éstas se localizaban en la caja Petri sembrada con
la dilución 10-3 (0.001g/mL), como en este método se inoculan 0.1 mL el factor que hay que
aplicar es 10-4 (0.0001g) para este caso.
De estas 5 colonias analizadas, solamente 2 resultaron positivas para las pruebas de la enzima
coagulasa y de la enzima termonucleasa.
Para conocer ¿Cuántas UFC/g de S. aureus toxigénico, se encuentran en este alimento?
¿Se puede consumir el alimento?, el razonamiento es el siguiente:
a) determinar el porcentaje de colonias de S. aureus toxigénico.
Cinco colonias representan el 100% de UFC muestreadas, dos colonias positivas,
¿A qué porcentaje corresponden?, expresado en forma aritmética es:
5 UFC 100%
2 UFC X
X= 40%
El total de colonias sospechosas es 70 X 104 UFC/g puesto que se encontraron 70UFC en la
caja sembrada con 0.1 mL de dilución 10-3:
70 UFC 0.0001 g (10-4g)
X 1g
X= 700,000 UFC/g de alimento.
De las 700,000 UFC/g de alimento, solamente el 40% son toxigénicas (tomando en cuenta
el primer cálculo) entonces ¿cuántas UFC toxigénicas por gramo se encuentran en este
alimento?
700,000 UFC/g 100%
X 40%
X=280,000 UFC/g
Tomando en cuenta solamente 2 dígitos y potencias de 10, la forma correcta de expresar el
resultado es: Staphylococcus aureus enterotoxigénico= 28X104 UFC/g
 Fig. 1. Resultados de prueba de la coagulasa

Fig. 2. Distintos tipos de resultados de prueba de la coagulasa

 Fig. 3. DNasa agar para Staphylococcus (+ = halo)
A S. aureus, B S. epidermidis, C S. saprophyticus

VI. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

BRYAN, A., h: C.A BRYAN y C.G. BRYAN. 1984. Bacteriología. Principios Y

prácticas. Edit Continental. México.
PELCZAR, M., J. E. D. REID y E.C.S. CHAN. 1991 Microbiología. 4ta. Ed. Edit. Mac
Graw- Hill. España.
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Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnóstico
Microbiológico. 5ta ed. Editorial Panamericana S.A. Argentina.
Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Diagnóstico Microbiológico de Bailey & Scott.
12 ed. Editorial Panamericana S.A. Argentina.
Mac Faddin J. (2003). Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de
importancia clínica. 3era ed. Editorial Panamericana. Buenos Aires. Argentina.
NOM-115-SSA1-1994. Bienes y servicios. Método para la determinación de
Staphylococcus aureus en alimentos.