RESUMEN

EXPERIMENTO HERSHEY Y CHASE

FUNCIONES INDEPENDIENTRES DE PROTEINAS VIRALES Y ACIDO NUCLEICO EN EL

CRECIEMIENTO BACTERIOFAGO

 En el experimento Hershey y Chase se utilizaron virus bacterianos llamados fagos para

demostrar que el ADN es el material genético.
 Hershey y Chase trabajan con fagos, que son virus que infectan bacterias. El fago que se
uso estaba compuesto por una molécula de ADN, rodeada por una cubierta proteica.
 En las bacterias virulentas S muertas había algo capaz de transformar a las bacterias R
inocuas, en bacterias virulentas S.
 Ese algo es llamado por Griffith “Factor Transformante”, tenía información para producir un
carácter heredable en las bacterias R, que era la presencia de la capsula (responsable de
la virulencia). Se trataba por lo tanto del material genético.
 Alfred Hershey y Marta Chase diseñaron un sistema para averiguar si la herencia era
comunicada por el DNA o las proteínas.
 Utilizaron técnicas de marcaje radioactivo para construir dos tipos de fagos distintos.

PRIMERA PARTE DEL EXPERIMENTO

 Una población de fagos creció en un medio que contenía 35 S.

 El 35 S marca a las proteínas que contienen residuos de aminoácidos Cys o Met y por
lo tanto, esta población contiene proteínas radioactivas y ya que el DNA no contiene S
se encuentra sin marca o no radioactivo.
 Se permitió que los fagos marcados infectaran la bacteria.
 Los fagos que se formaron en estas células no contienen radioactividad.

SEGUNDA PARTE DEL EXPERIMENTO

 La segunda población de virus creció en un medio que contenía 32 P.

 El 32 P marca los ácidos nucleícos, pero no a las proteínas de forma que esta población
contiene DNA radioactivo y proteínas no radioactivas o no marcadas.
 Cuando los fagos infectaron a la bacteria el DNA marcado por 32 P penetro en la célula y
se pudo encontrar ese DNA radioactivo en los fagos producidos posteriormente en la
bacteria infectada.
 De las observaciones al microscopio electrónico también sabían que durante la infección,
el virus ataca a la bacteria por sus colas que se fijan a un receptor específico de la
superficie celular y le inyectan el contenido de la cabeza (el DNA) en la bacteria para
multiplicarse utilizando su maquinaria metabólica.
 La cubierta proteica permanencia en el exterior.
 Agitaron los cultivos con una batidora para separar las partículas víricas de las cubiertas
bacterianas.
 Luego realizaron una centrifugación para separar los fagos de las bacterias de modo que
las bacterias más grandes y más pesadas quedan en el sedimento mientras que los fagos
se quedan en el sobrenadante.
 Encontraron que la radioactividad del 35 S de la cubierta proteica aparecía en el
sobrenadante mientras que la 32 P del DNA aparecía en el sedimento, a partir del cual
 aparecieron nuevas partículas víricas marcadas radiactivamente, lo que demostraba que el
ADN era el material genético y no la proteína.

FREDERICK GRIFFITH: LA TRANSFORMACIÓN BACTERIANA

En 1928, el bacteriólogo británico Frederick Griffith llevo a cabo una serie de experimentos con
ratones y bacterias streptococcus pneumonueae. Griffith o intentaba identificar el material genético,
sino en realidad trataba de desarrollar una vacuna contra la neumonía. En sus experimentos,
Griffith utilizo dos cepas de bacterias relacionadas, conocidas como R y S.

 Cepa R: cuando se cultivan en una caja petri, las bacterias R formaban colonias o grupos
de bacterias relacionadas que tenían bordes bien definidos y un aspecto rugoso ( de ahí la
abreviatura “R”). Las bacterias R no eran virulentas; es decir, al inyectarse en un raton no
causaban enfermedad
 Cepa S: Las bacterias S forman colonias redondas y lisas (la abreviatura “S” es por la
palabra “smooth” en ingles”). La apariencia lisa se debía a una envoltura de polisacárido, a
base de azucares, que producían las bacterias. Esta capa protegía a las bacterias S del
sistema inmunitario del raton, por lo que resultaban virulentas (capaces de causar
enfermedad). Los ratones a los que se les inyectaban bacterias S vivas desarrollaban
neumonía y morían.

Como parte de sus experimentos, Griffith inyecto bacterias S muertas por calor en ratones (es
decir, bacterias S que se calentaron a altas temperatura, lo que causo la muerte de las células).
Como era de esperarse, las bacterias S muertas por calor enfermaron a los ratones.

Sin embargo, los experimentos tomaron un giro inesperado cuando inocuas bacterias R se
combinaron con las inofensivas bacterias S muertas por calor y se inyectaron en un ratón. El ratón
no solo desarrollo neumonía y murió, sino que cuando Griffith tomo una muestra de sangre del
ratón muerto, se encontró bacterias S vivas. Griffith concluyo que las bacterias de la cepa R debían
haber tomado lo que el llamo “principio transformante” de las bacterias S muertas por calor, que les
permitió “transformarse” en bacterias con cobertura lisa y cobertura virulenta

AVERY, MCCARTY Y MACLEOD: LA IDENTIFICACIÓN DEL PRINCIPIO TRANSFORMANTE

En 1944, tres investigadores canadienses y estadounidenses, Oswald Avery, Maclyn McCarty y

Colin MacLeod, se propusieron identificar el "principio transformante" de Griffith.

Para ello, comenzaron con grandes cultivos de células S muertas por calor, y mediante una larga
serie de pasos bioquímicos (que se determinaron por cuidadosa experimentación), purificaron
progresivamente el principio transformante al lavar, separar o destruir enzimáticamente los otros
componentes celulares. Con este método, fueron capaces de obtener pequeñas cantidades de
 principio transformante altamente purificado, el cual podían luego analizar con otras pruebas para
determinar su identidad^22squared.

Varias líneas de evidencia les sugirieron a Avery y a sus colegas que el principio transformante
podría ser el ADN :

 La sustancia purificada dio un resultado negativo en las pruebas químicas conocidas para
detectar proteínas, pero un resultado fuertemente positivo en un examen químico conocido para
detectar ADN.

 La composición elemental del principio transformante purificado era muy semejante a la del
ADN en su proporción de nitrógeno y fósforo.

 Enzimas que degradan proteínas y ARN tenían poco efecto sobre el principio
transformante, pero las enzimas capaces de degradar ADN eliminaban la actividad transformante.

Todos estos resultados apuntaban hacia el ADN como el probable principio transformante. Sin
embargo, Avery fue cauteloso en la interpretación de sus resultados. Se dio cuenta de que era
posible que alguna sustancia contaminante presente en pequeñas cantidades, y no el ADN, fuera
el principio transformante real.

Debido a esta posibilidad, el debate sobre el papel del ADN continuó hasta 1952, cuando Alfred
Hershey y Martha Chase utilizaron un enfoque diferente para identificar concluyentemente al ADN
como el material genético.
 INFORME DE LA PRÁCTICA N° 2

EL DNA COMO MATERIAL GENETICO

CUESTIONARIO

1. ¿En qué consistió el experimento realizado por Griffith?

Como parte de sus experimentos, Griffith inyecto bacterias S muertas por calor en ratones
(es decir, bacterias S que se calentaron a altas temperatura, lo que causo la muerte de las
células). Como era de esperarse, las bacterias S muertas por calor enfermaron a los
ratones. Sin embargo, los experimentos tomaron un giro inesperado cuando inocuas
bacterias R se combinaron con las inofensivas bacterias S muertas por calor y se
inyectaron en un ratón. El ratón no solo desarrollo neumonía y murió, sino que cuando
Griffith tomo una muestra de sangre del ratón muerto, se encontró bacterias S vivas.
Griffith concluyo que las bacterias de la cepa R debían haber tomado lo que el llamo
“principio transformante” de las bacterias S muertas por calor, que les permitió
“transformarse” en bacterias con cobertura lisa y cobertura virulenta

2. ¿A qué denominó Griffith “principio transformante”.?

Como parte de sus experimentos, Griffith inyectó bacterias S muertas por calor en ratones
(es decir, bacterias S que se calentaron a altas temperaturas, lo que causó la muerte de
las células). Como era de esperarse, las bacterias S muertas por calor no enfermaron a los
ratones.
Sin embargo, los experimentos tomaron un giro inesperado cuando inocuas bacterias R se
combinaron con las inofensivas bacterias S muertas por calor y se inyectaron en un ratón.
El ratón no solo desarrolló pnenumonia y murió, sino que cuando Griffith tomó una muestra
de sangre del ratón muerto, ¡encontró que contenía bacterias S vivas. Griffith concluyó que
las bacterias de la cepa R debían haber tomado lo que él llamó "principio transformante" de
las bacterias S muertas por calor, que les permitió "transformarse" en bacterias con
cobertura lisa y volverse virulentas.

3. ¿En qué consistió el experimento de Avery y colaboradores para caracterizar el

principio transformante de Griffith?
En 1944, tres investigadores canadienses y estadounidenses, Oswald Avery, Maclyn McCarty y
Colin MacLeod, se propusieron identificar el "principio transformante" de Griffith.

Para ello, comenzaron con grandes cultivos de células S muertas por calor, y mediante una
larga serie de pasos bioquímicos (que se determinaron por cuidadosa experimentación),
purificaron progresivamente el principio transformante al lavar, separar o destruir
enzimáticamente los otros componentes celulares. Con este método, fueron capaces de
 obtener pequeñas cantidades de principio transformante altamente purificado, el cual podían
luego analizar con otras pruebas para determinar su identidad^22squared.

Varias líneas de evidencia les sugirieron a Avery y a sus colegas que el principio transformante
podría ser el ADN ^22squared:

 La sustancia purificada dio un resultado negativo en las pruebas químicas conocidas para
detectar proteínas, pero un resultado fuertemente positivo en un examen químico conocido para
detectar ADN.

 La composición elemental del principio transformante purificado era muy semejante a la del
ADN en su proporción de nitrógeno y fósforo.

 Enzimas que degradan proteínas y ARN tenían poco efecto sobre el principio
transformante, pero las enzimas capaces de degradar ADN eliminaban la actividad
transformante.

4. ¿A qué conclusión llegaron Avery y colaboradores después de realizar su experimento?

Todos estos resultados apuntaban hacia el ADN como el probable principio transformante. Sin
embargo, Avery fue cauteloso en la interpretación de sus resultados. Se dio cuenta de que era
posible que alguna sustancia contaminante presente en pequeñas cantidades, y no el ADN, fuera
el principio transformante real. Debido a esta posibilidad, el debate sobre el papel del ADN continuó
hasta 1952, cuando Alfred Hershey y Martha Chase utilizaron un enfoque diferente para identificar
concluyentemente al ADN como el material genético.

5. ¿En qué consistió el experimento realizado por Hershey y Chase para demostrar que el
DNA es el material genético?
 En el experimento Hershey y Chase se utilizaron virus bacterianos llamados fagos para
demostrar que el ADN es el material genético.
 Hershey y Chase trabajan con fagos, que son virus que infectan bacterias. El fago que se
uso estaba compuesto por una molécula de ADN, rodeada por una cubierta proteica.
 En las bacterias virulentas S muertas había algo capaz de transformar a las bacterias R
inocuas, en bacterias virulentas S.
 Ese algo es llamado por Griffith “Factor Transformante”, tenía información para producir un
carácter heredable en las bacterias R, que era la presencia de la capsula (responsable de
la virulencia). Se trataba por lo tanto del material genético.
 Alfred Hershey y Marta Chase diseñaron un sistema para averiguar si la herencia era
comunicada por el DNA o las proteínas.
 Utilizaron técnicas de marcaje radioactivo para construir dos tipos de fagos distintos.

5. Mencione algunas razones por las que Hershey y Chase utilizaron un bacteriófago para
llevar a cabo su experimento.
  En sus ahora legendarios experimentos, Hershey y Chase estudiaron bacteriófagos, virus
que atacan bacterias. Los fagos que utilizaban eran simples partículas compuestas de
proteína y ADN, con sus estructuras externas hechas de proteínas y el núcleo interno
compuesto por ADN.

 Hershey y Chase sabían que los fagos se unían a la superficie de una célula bacteriana
hospedera e inyectaban alguna sustancia (ya sea ADN o proteínas) en el hospedero. Esta
sustancia daba "instrucciones" que causaban que la bacteria hospedera comenzara a
producir montones y montones de fagos, es decir, este era el material genético del fago.
Antes del experimento, Hershey pensaba que el material genético resultaría ser proteína^4
7. ¿De qué manera Hershey y Chase comprobaron que las proteínas del fago T2 no pasan a
la progenie?
Como los virus de la progenie heredan los caracteres fenotípicos del virus primitivo, Alfred Hersher
y Matha Chase diseñaron un sistema para averiguar si la herencia era comunicada por el DNA o
por las proteínas. Utilizaron técnicas de marcaje radioactivo para construir dos tipos de fagos
distintos. Una población de fagos creció en un medio que contenía 35 S. El 35 S marca a las
proteínas que contienen residuos de Cys y Met y por lo tanto, esta población contiene proteínas
radioactivas y DNA no radioactivo, ya que el DNA no contiene S. La segunda población de virus
creció en un medio que contenía 32P. El 32P marca los acidos nucleicos, pero no a las proteínas,
de forma que esta población contiene DNA radioactivo y proteínas no radioactivas. Ambos tipos
de virus fueron utilizados por separado para infectar a las células de E. coli susceptibles

8. Después de haber analizado los artículos originales relacionados con los tres
experimentos más importantes en la dilucidación del material genético, ¿usted podría
concluir que el DNA es la única molécula que funciona como material genético en los
organismos vivos?. ¿Si o no?. Explique porque si o porqué no.
 INFORME DE LA PRACTICA N 3

RECUENTO DE CELULAS

OBJETIVOS

 Determinar el numero levadura a través de conteo celular, haciendo uso de un

hemocitometro de Neubauer.

MATERIALES Y REACTIVOS

 Suspensión de células de levadura

 Cámara de Neubauer
 Micro pipetas
 Puntas de micropipetas
 Pipeta pasteur
 Mini centrifuga
 Buffer fosfato de pH 7.4
 Hielo

RESULTADOS

  1 2 3 4 TOTAL
Primer Cuadrante 18 29 19 18 84
Segundo Cuadrante 19 17 14 25 75
Tercer Cuadrante 16 24 32 16 88
Cuarto Cuadrante 34 14 16 18 82
  TOTAL 329

DISCUSIÓN
Las cámaras de recuento se utilizan para determinar el número de partículas por unidad de
volumen de un líquido. Las partículas leucocitos, eritrocitos, trombocitos, bacterias, esporas,
polen etc. se cuentan visualmente con un microscopio (Karp,1996)
La cámara de Neubauer también llamada cámara cuenta-glóbulos o hemocito metro, es un
instrumento muy útil que permite contar células de distintos tamaños, tienen la apariencia de un
portaobjetos grueso, que en una cara tiene una placa muy delgada de metal, la cual se encuentra
grabada con un par de cuadriculas muy finas y de medidas definidas. Esta cámara cuenta también
con un par de muescas que permite colocar la muestra a analizar en dos compartimientos. Por
ultimo la cámara de neubauer se complementa con un cubreobjetos cuyo grosor es mayor ,
también que el de los cubreobjetos convencionales. La altura entre el portaobjeto y el cubreobjeto
se encuentra definida, asi como el area de la cuadricula en el portaobjetos, por lo tanto, es posible
calcular el volumen contenido en cada compartimiento de la cámara de Neubauer. De esta
manera, es posible conocer el volumen de muestra celular que se coloca en la cámara.

CUESTIONARIO

1. Calcule el número de células de levadura que hay en 10 ml de una suspensión, si en el

recuento encontramos 50 células por mm2.

25 ul ------------ 1 mm2 ------------- 50

10000ul----------- 1 mm2 -------------------- X

1000 x 1 x 50 = 25 x 1 x (X)

50 000 = 25 . X

2 000 = X

3. En base a los resultados obtenidos en la práctica realice los cálculos para preparar
500 l de una suspensión que contenga 1000 células por ml.

3. Además de la cámara de Neubauer para el recuento de células, diga que otros métodos se
pueden utilizar para determinar el número de células de una muestra problema.
 Citometria de flujo

4. Describa el procedimiento del método de la citometría de flujo para el conteo de células.

La citometría de flujo es un método analítico que permite la medición rápida de ciertas
características físicas y químicas de células o partículas suspendidas en líquido que producen una
señal de forma individual al interferir con una fuente de luz. Una de las características analíticas
más importantes de los citómetros de flujo es su capacidad de medir múltiples parámetros
celulares, como el tamaño, forma y complejidad y, por supuesto, cualquier componente celular o
función que pueda ser marcada con un fluorocromo. Las aplicaciones más relevantes de la
citometría de flujo en la práctica médica se relacionan con la hematología e inmunología clínicas,
midiendo parámetros como número y clasificación de células sanguíneas. Esta técnica es
empleada también en el conteo de subpoblaciones de linfocitos en pacientes con el virus de la
inmunodeficiencia humana, así como la caracterización de leucemias agudas y síndromes
linfoproliferativos crónicos, entre otros padecimientos. En los últimos 20 años, el análisis de
enfermedades pulmonares de origen inmunológico por citometría de flujo ha jugado un papel
importante en el entendimiento y diagnóstico de enfermedades como sarcoidosis, neumonía
eosinofílica o neumonitis por hipersensibilidad. Las aplicaciones de la citometría de flujo son
numerosas, lo cual ha permitido el empleo de estos instrumentos de manera amplia en los campos,
tanto de la investigación biológica como médica. Esta revisión brinda un panorama general de los
principios básicos de la citometría de flujo y la muestra como una herramienta reproducible y
aplicable a una gran variedad de campos médicos, así como su empleo en el campo de las
enfermedades pulmonares.

La citometría de flujo representa un método rápido objetivo y cuantitativo de análisis de células,

núcleos, cromosomas, mitocondrias u otras partículas en suspensión.

El principio en el que se basa esta tecnología es simple: hacer pasar células u otras partículas en
suspensión alineadas y de una en una por delante de un haz luminoso. La información producida
puede agruparse en dos tipos fundamentales: la generada por la dispersión de la luz y la
relacionada con la emisión de luz por los fluorocromos presentes en la célula o partícula al ser
excitados por el rayo luminoso. Las señales luminosas detectadas se transforman en impulsos
eléctricos que se amplifican y se convierten en señales digitales que son procesadas por una
computadora

BIBLIOGRAFIA

Karp G. Biologia Celular y Molecular (1996) McGraw-Hill Interamericana Mexico

 Orfao A, Ciudad J, López A, López-Berges MC, Vidriales B, Macedo A, et al.  La citometría de flujo
en el diagnóstico clínico. Servicio General de Citometría . Universidad de Salamanca, 1993.   

 Orfao A, González M, Ciudad J, López-Berges MC, López A, San Miguel JF, et al.  Aplicaciones de
la citometría de flujo en el diagnóstico hematológico . Biol Clin Hematol 1992;13:456-523.
 INFORME DE LA PRÁCTICA N° 4

VIABILIDAD CELULAR

OBJETIVO
Determinar la concentración de células (células/ml), el porcentaje de células vivas y
de células muertas, y el número total de células en una suspensión celular.

RESUMEN

Se determinó la concentración y viabilidad de una suspensión celular (linfoma de células B). El azul
tripán tiñe a las células que presentan daño en la membrana plasmática, fue utilizado para
diferenciar entre células viables y no viables / teñidas con azul tripán. Se preparó una disolución
1:2 con 10 μL del cultivo y azul de tripàn. Se usó la cámara de Neubauer para contar e inferir el
número de células viables, como concentración celular, expresadas en células por mililitro.

OBSERVACIONES

El conteo de las células observadas en los cuadrantes 1, 2, 3 y 4 de la cámara de Neubauer se

registró en la Tabla 1. Se observó células teñidas de azul / no viables (18) y células brillantes/
viables (295), de un total de 313 células contadas. En la figura 3 se observan las células
(brillantes /viables y teñidas de azul/ no viables) en el cuadrante tres de la cámara de Neubauer.

RESULTADOS

Célula Numero de Células en cada Cuadrado Total

Viable 85 59 78 73 295
No Viable 3 1 6 8 18

Viabilidad

295 295
Viabilidad %= = =0.94 x 100=94 %
295+ 18 313

295
Celulas | ml= =74
4

DISCUSIONES
Factores como la homogenización de y /o de la muestra o azul tripán, resuspensión de la muestra,
exactitud y presión de los volúmenes tomados por las micropipetas, y la destreza de la persona
para contar las células pueden afectan los resultados, por lo que son muy importantes estos
aspectos, para obtener resultados confiables. Se consideró que los factores anteriores fueron
controlados adecuadamente dentro de lo posible (calibración dudosa de las micropipetas) pero lo
resultados están dentro de un rango aceptable.
CONCLUSIONES

Mediante la tinción con azul tripán, fue posible la diferenciación entre células viables/ brillantes y
teñidas de azul / no viables, y así determinar el porcentaje de viabilidad celular. Con la cámara de
Neubauer fue posible inferir la concentración celular. Se encontró a partir de las células
proporcionadas un 94 % de viabilidad.

CUESTIONARIO
1. Cuál es el fundamento de la prueba de exclusión del azul de tripán?.
El azul de tripan es un colorante anionico grande de los colorantes aozicos. El azul de tripan se usa
tradicionalmente como componente en tinciones policromas como por ejemplo para la visualización
de tejido conjuntivo colágeno. El azul de tripan se usa también como colorante para tinciones
vitales
La prueba de exclusión del colorante se usa para determinar el número de células viables
presentes en una suspensión celular. Se basa en el principio de que las células vivas poseen
membranas celulares intactas que excluye ciertos colorantes, tales como azul de tripán, Eosina, o
bromuro de propidio, mientras que las células muertas no. En esta práctica, simplemente se
mezcla una suspensión celular con el colorante y luego se examina visualmente para determinar si
las células toman o excluyen el colorante. Según este protocolo, una célula viable tendrá un
citoplasma claro mientras que una célula no viable tendrá un citoplasma azul.
El azul de tripán es un colorante vital. La reactividad del azul de tripán se basa en el hecho de que
el cromóforo está cargado negativamente y no interacciona con la célula a menos que la
membrana esté dañada. Por ello, todas las células que excluyen el colorante son viables.
Debido a que el hemocitómetro tiene un volumen exacto por debajo del cubre-objetos, se puede
determinar la concentración (células/ ml) de células vivas y muertas en la cámara. La
concentración de la suspensión original de células será la misma que la de la cámara –excepto si
se realiza alguna dilución.
Las células muertas absorben el colorante, azul de tripán, y aparecen azules bajo el microscopio.
Las células vivas excluyen el azul de tripán, y aparecen incoloras. De este modo, se puede calcular
el porcentaje de células viables.

2. Qué problemas presenta el análisis de viabilidad celular utilizando la prueba de

exclusión del azul de tripán?

3. Investigue que otros métodos se pueden utilizar para determinar viabilidad celular.

Naphthalene Black

BIBLIOGRAFIA

Tecnicas y métodos de laboratorio clínico. Gaonzales de Buitrago J. 2004 Segunda edición.

Ediciones Masson. Barcelona, España. parte III, pag.278-279

2. Anatomia patológica. Steves A, Lowe J. 2001 segunda edición al español. Ediciones Harcourt,
Madrid España. Capitulo 15, enfermedades de los ganglios linfáticos, Pag 310-311.