MICROBIOLOGÍA GENERAL 2020 - I
PRÁCTICA I: INTRODUCCIÓN AL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA
Objetivos:
Reconocer equipos, aparatos y materiales de laboratorio
Describir los procesos de esterilización por calor seco y calor húmedo
Acondicionar materiales para la esterilización
Describir la importancia de los medios de cultivo
Comprender la preparación de medios de cultivo
RECONOCIMIENTO DE EQUIPOS, APARATOS Y MATERIALES DE LABORATORIO
Los laboratorios de microbiología deben disponer de todo lo necesario para el correcto desarrollo de sus
actividades. Cada equipo debe contar con un procedimiento de manejo y el personal de laboratorio
debe estar debidamente capacitado en su uso.
AUTOCLAVE: Aparato en el que se logran temperaturas superiores a la temperatura de ebullición del
agua por medio de un aumento de presión. Funciona a 1,18 Kg/cm 2 por encima de la presión
atmosférica. En las condiciones de 121 °C y 15 lb/pulg2 por 15 minutos se logra la destrucción de toda
forma de vida, es decir se logra la esterilización mediante el vapor de agua. Fundamento: coagulación de
proteínas estructurales y enzimas bacterianas cesando así su función biológica.
MICROBIOLOGÍA GENERAL 2020 - I
HORNO: Es utilizado en operaciones que requieren calor intenso. La esterilización de materiales
mediante el calor seco se realiza a no menos de 170 °C (160 – 180 °C) por dos horas. Se esterilizan:
materiales de vidrio, porcelana y metal. Fundamento: Oxidación de proteínas.
ESTUFA DE INCUBACIÓN: Es un equipo cerrado que permite controlar la temperatura, humedad y otras
condiciones necesarias para lograr el crecimiento de microorganismos. La temperatura ajustable
típicamente va de 60-65 °C. Usualmente se usa a 37 °C para el crecimiento de bacterias, aunque se
puede utilizar a otras temperaturas dependiendo del microorganismo.
MICROBIOLOGÍA GENERAL 2020 - I
ASA DE SIEMBRA: Llamada también asa bacteriológica o de Kolle, consta generalmente de un mango a
base de platino, acero, aluminio con un filamento de nicrom, tungsteno o platino en forma de aro o
punta dependiendo de la finalidad de uso. Se emplea para transferir microorganismos de un medio de
cultivo a otro, para su adecuado desarrollo y aislamiento. También se usa para realizar un frotis
bacteriano. Para esterilizar el alambre, se pone éste en posición ligeramente vertical directamente a la
flama de un mechero Bunsen hasta que se torne rojo. Después se deja enfriar por unos 10 a 15
segundos.
PLACA PETRI: Es un recipiente circular de vidrio o plástico, de diferentes tamaños de acuerdo a su uso.
Consta de tapa y base. En microbiología se utiliza como el contenedor de un medio de cultivo sólido, el
cual servirá de nutriente para el crecimiento de un microorganismo.
MICROBIOLOGÍA GENERAL 2020 - I
ESTERILIZACIÓN
Proceso por el cual se elimina toda forma vegetativa o esporulada de microorganismos contenidos en un
objeto o sustancia. La esterilización se puede conseguir por agentes físicos, químicos o mecánicos, la
elección del método dependerá de la naturaleza del material a esterilizar.
Se esteriliza el material limpio que se usará en un procedimiento microbiológico. Pero también se
esteriliza material contaminado antes de su desecho. Éstos últimos necesitan tiempos más largos de
tratamiento, por ejemplo 121 °C por 30 minutos en autoclave.
Agente Sistema de Esterilización Método
Calor húmedo Autoclave
Calor seco Incineración y flameado
Horno
FISICO
Radiaciones Ionizantes (rayos γ, x)
No ionizantes (rayos UV, IR)
Frío Congelación
Gases Óxido de etileno (OE)
QUÍMICO Alternativos del OE
Líquidos Glutaraldehído, etc.
MECÁNICO Ondas Sonicación
ACONDICIONAMIENTO PREVIO A LA ESTERILIZACIÓN:
Material Contaminado: El material contaminado debe estar en un lugar apropiado, en recipientes
debidamente rotulados. Antes de la esterilización, deben estar en bolsas apropiadas y correctamente
cerradas. Es importante la recuperación de material reusable como placas Petri y la eliminación de
material desechable.
MICROBIOLOGÍA GENERAL 2020 - I
Material Limpio: Antes de someterse a la esterilización, cualquier material limpio debe lavarse y
enjuagarse minuciosamente. Una vez seco se necesita acondicionar para que se mantenga la condición
de estéril después del proceso y hasta el momento de usarse. Los materiales de vidrio como tubos y
matraces se tapan inicialmente con algodón o papel metálico, y luego se cubre con papel kraft. En caso
de pipetas, se introduce algodón a manera de filtro en el cuello de la pipeta y luego se envuelve toda la
pipeta en forma de espiral con papel kraft. Se debe recordar que los materiales de vidrio se esterilizan en
el horno.
Los medios de cultivo se colocan en matraces, frascos o tubos, dependiendo del uso o disponibilidad de
material, y se esterilizan generalmente en autoclave.
Si el laboratorio cuenta con cinta testigo, se corta un pedazo apropiado y se coloca sobre alguna parte
del material a esterilizar. Existen cintas para calor húmedo y calor seco.
Una vez que el material está preparado para colocarse en la autoclave u horno, tener cuidado de que los
materiales no estén muy apretados o con muchos espacios vacíos. Lo que se busca es que el agente
esterilizante pueda fluir libremente y así alcanzar de manera homogénea todos los puntos de la carga.
Reforzamiento (videos):
Links:
1. Acondicionamiento de materiales: https://www.youtube.com/watch?v=8zVts-5EHxo.
2. Acondicionamiento de pipetas: https://www.youtube.com/watch?v=Xk2jTk2a7Gw
3. How to use an autoclave: https://www.youtube.com/watch?v=0dlDf8HiiQw
MICROBIOLOGÍA GENERAL 2020 - I
PRÁCTICA 1 A
MATERIALES:
- Tubos delgados o similar (para simular pipetas de vidrio)
- Frascos de boca ancha de vidrio o plástico (simular matraces), viales o similares
- Algodón
- Ligas o un pedazo de pabilo
- Papel kraft o papel reciclado (tamaño A4) y tiras de papel de 3 cm de ancho por 30 cm de largo
PROCEDIMIENTO
Acondicionamiento de los materiales para su esterilización:
- Pipetas, viales y matraces: se hace tapones de algodón y luego se cubre con papel kraft.
- Placas Petri: Se apilan de dos o cuatro en forma invertida y luego se envuelven con papel kraft.
Todos los materiales deben ser rotulados correctamente: fecha de esterilización, volumen para pipetas.
MICROBIOLOGÍA GENERAL 2020 - I
PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO
Los medios de cultivo son mezclas de nutrientes que en concentraciones adecuadas y condiciones
óptimas de temperatura, humedad, tensión de oxígeno, pH, potencial redox u otros, favorecen el
crecimiento de microorganismos para su aislamiento e identificación a través de su morfología y
propiedades bioquímicas. Contienen básicamente fuentes de carbono, nitrógeno y energía, buffer,
agente gelificante (generalmente agar) y en algunos casos, factores de crecimiento, sustancias
inhibidoras e indicadores de pH.
Algunas bacterias pueden crecer satisfactoriamente en medios de cultivo con los nutrientes básicos pero
otros microorganismos necesitan medios especiales para su crecimiento y desarrollo.
Tener presente que el medio de cultivo a preparar debe: a) contener las sustancias necesarias para el
crecimiento del microorganismo que se desea estudiar y b) mantener su esterilidad hasta el momento de
su uso.
CLASIFICACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO
Algunos medios de cultivo pueden prepararse por ingredientes, otros se venden listos para ser usados,
pero la gran mayoría se pueden adquirir para ser reconstituidos y esterilizados. Se pueden clasificar:
A) POR SU ESTADO FÍSICO:
1. Medios líquidos o caldos: Aquello que contienen los nutrientes disueltos. Estos medios no
contienen agar ni otro agente gelificante. Para prepararlo: se pesa la cantidad suficiente del
caldo para el volumen deseado, se adiciona agua destilada y se agita hasta disolver. Se
verifica el pH, se coloca en el material necesario (tubo, matraz, etc.) y se lleva a autoclave.
2. Medios sólidos: Contienen nutrientes pero además un agente gelificante como el agar agar
que es un polisacárido complejo obtenido de algas rodofíceas de origen marino. Tiene la
ventaja que no es degradado enzimáticamente por los microorganismos a excepción del
algunos de ambientes marinos. Funde aproximadamente a 10 °C y permanece en estado
líquido mientras la temperatura no descienda por debajo de 45 °C.
Para prepararlo: se pesa la cantidad suficiente del medio de cultivo para el volumen
deseado, se adiciona agua destilada y se disuelve en calor. Se controla el pH. Se esteriliza en
autoclave.
3. Medios semisólidos: Semejantes a los medios sólidos, pero la concentración del agente
gelificante es menor, generalmente 2,5 g/L por lo que su consistencia es gelatinosa.
Para su preparación se puede utilizar el medio de cultivo comercial o se puede preparar el
caldo y añadirle agar agar (15 g/L). Se disuelve en calor, se controla el pH y se reparte en
tubos de ensayo. Se lleva a esterilizar en autoclave.
Para cualquier medio de cultivo, si se necesita ajustar el pH se utiliza NaOH 0,1 N o HCl 0,1 N.
MICROBIOLOGÍA GENERAL 2020 - I
B) POR SU COMPOSICIÓN:
1. Medios complejos: Contienen todos los nutrientes necesarios para el crecimiento de
muchos tipos de microorganismos pero no se conocen todos los componentes que forman
parte de ellos ni las concentraciones exactas de cada uno de ellos. Por ejemplo medios que
contienen extracto de carne o levadura.
2. Medios definidos: Contienen los distintos nutrientes en forma de productos químicos puros
y en concentraciones conocidas. Por ejemplo, MgSO4, HPO4H2, Na2PO4H, glucosa, etc.
C) POR SU UTILIZACIÓN:
1. Medios generales: En los que se pueden desarrollar una gran variedad de microorganismos.
2. Medios selectivos: Generalmente se usan cuando se requiere aislar un tipo de bacteria a
partir de una mezcla de diversos tipos. Entonces estos medios favorecen el crecimiento de
la bacteria de interés e inhiben el resto. Esto se puede lograr mediante el uso de sustancias
inhibidoras como colorantes, antibióticos, cierta concentración de algunas sales, etc.
3. Medios diferenciales: Permiten distinguir diferencias metabólicas de diversas especies o
géneros de bacterias o de ciertos grupos de las mismas. Para este fin se incorporan al medio
de cultivo alguna sustancia que puede ser metabolizada por las bacterias que son de interés.
Por ejemplo, muchas bacterias fermentan azúcares produciendo ácido, mientras que otras
no. Si se incorpora un azúcar como lactosa al medio de cultivo y además se agrega un
indicador ácido-base, se podrá saber si la bacteria fermenta debido al cambio de color que
ocurre al acidificarse el medio de cultivo.
MICROBIOLOGÍA GENERAL 2020 - I
Reforzamiento (videos):
Links:
1. Preparación de un medio de cultivo sólido: https://www.youtube.com/watch?v=YGoPu0cn9ms
MICROBIOLOGÍA GENERAL 2020 - I
PRÁCTICA 1 B
MATERIALES:
- Frascos de boca ancha de vidrio o plástico (simular matraces)o viales
- Envases de manti pequeña con tapa o latas de atún sin tapa limpias y secas (simular placas)
- Gelatina (10 g)
- Azúcar rubia (2 g)
- Cuchara sopera
- Agua
- Algodón, papel kraft, liga o un pedazo de lana o pabilo.
PROCEDIMIENTO
A. Preparación de un medio líquido:
1. Disolver media cucharada de azúcar en agua.
2. Colocar en vial, vaso pequeño o algún frasco que asemeje a un tubo de prueba.
3. Coloque tapón de algodón.
B. Preparación de un medio sólido:
1. Preparar aproximadamente media taza de gelatina. Aproximadamente es 1 ½ cucharadas
para media taza de agua.
2. Disolver bajo las condiciones necesarias.
3. Dispensar en los envases de manti o latas de atún. Tapar para evitar que caigan partículas
del ambiente.
C. Preparación de un medio semisólido:
De acuerdo a las experiencias anteriores prepare un medio semisólido.
Responda a las preguntas en clase del profesor.
MICROBIOLOGÍA GENERAL 2020 - I
CUESTIONARIO 1
1. ¿Qué precauciones se deben tener en cuenta para la esterilización en autoclave?
2. Indique método de esterilización y cómo se acondicionan (si fuera el caso) los siguientes:
a. Una solución de antibiótico
b. Mandiles
c. Hisopos
d. Pinzas y tijeras metálicas
3. ¿Cuál es el fundamento del funcionamiento de la cinta testigo? ¿Cuántos tipos de cinta testigo
existe en el mercado?
4. Complete los cuadros:
AGAR MANITOL SALADO
USO PRINCIPAL
FUNDAMENTO DE SU USO
TIPO DE MEDIO POR SU
COMPOSICIÓN
TIPO DE MEDIO POR SU
UTILIZACIÓN
DESCRIBA CÓMO SE PREPARA
200 ML. DEL MEDIO.
MÉTODO DE ESTERILIZACIÓN DEL
MEDIO DE CULTIVO
MICROBIOLOGÍA GENERAL 2020 - I
CALDO SELENITO - CISTINA
USO PRINCIPAL
FUNDAMENTO DE SU USO
TIPO DE MEDIO POR SU
COMPOSICIÓN
TIPO DE MEDIO POR SU
UTILIZACIÓN
DESCRIBA CÓMO SE PREPARA
200 ML. DEL MEDIO.
MÉTODO DE ESTERILIZACIÓN DEL
MEDIO DE CULTIVO
5. Para el aislamiento de Listeria monocytogenes se requiere incorporar un suplemento de
enriquecimiento al medio de cultivo. Conteste:
a. ¿Cuáles son los componentes de dicho suplemento?
b. ¿Cuál es la función de cada componente?
c. ¿Cómo se realiza la incorporación del suplemento?
