Instituto Tecnológico Superior de Calkiní en el Estado de Campeche
temas
“2.1 Incremento de la solubilidad”
2.1.1 Incremento de la solubilidad
2.2 capacidad de espumado
2.2.1 capacidad de espumado
2.3 formación de geles
2.3.1 formacionde genes
2.4 incremento de digestión
2.4.1 modificación del perfil de aminoácidos (reacción de la plasteina)
Alumnos:
Diego Gpe. Ac Ac 5632
Francisco Germán Ac Moo 5923
Yahaira Gpe. Ake Dzul 5891
Abraham Balam Beberaje 5617
Cristopher Ivan Balam Ku 5614
Luis Alejandro Colli Ku 5648
Carrera: Ingeniería Bioquímica
Asignatura: Enzimología Aplicada
Docente: MCIB. Nubia Noemi Cob Calan
Ciclo escolar 2019-2020P
Introducción
En los últimos años han cambiado las tendencias de producción de alimentos. Estos cambios van
desde la sustitución de ingredientes para el mejoramiento y eficiencia de procesos tecnológicos hasta
el diseño de productos realmente novedosos. Las características de algunos alimentos nuevos los
hacen más accesibles a los consumidores; otros, se han desarrollado para nutrir a personas con
necesidades especiales. Son ejemplos de la nueva tecnología de producción de alimentos basada en
ingredientes ideales, las fórmulas infantiles hipoalergénicas, las bebidas fortificadas para adultos y
los nutracéuticos.
Seleccionar la fuente de proteína
La elección de la procedencia de la proteína debe basarse en criterios tales
como:
a) la facilidad de obtener cantidades suficientes del tejido del que se aísla la
proteína
b) la cantidad de la proteína de interés en el tejido y
c) cualquier propiedad peculiar de la proteína de interés, que ayudará en su
estabilización y su aislamiento.
Definir las Propiedades de la Proteína de
Interés • La información es útil para detectar la proteína a través de SDS-
Masa Molecular PAGE, también es importante cuando seleccionamos un método
de filtración en gel.
Punto • El conocer el valor del pI puede ser utilizado con diferentes
propósitos: precipitación isoeléctrica, selección de columna de
Isoeléctrico intercambio iónico, pH de trabajo.
• Afectada por temperatura, pH, fuerza iónica. Esto debe ser
Solubilidad considerado para evitar la agregación y precipitación de la proteína.
También útil para separación.
• Hidrofobicidad e hidrofilicidad de la muestra, para elegir una
Polaridad columna de interacción hidrofóbica.
• Ligandos útiles para separar la proteína por cromatografía de
Unión Específica afinidad.
• En términos de actividad, agregación y composición de
Estabilidad subunidades. Las características físicas y químicas de la proteína
son importantes a lo largo del proceso.
Técnicas de purificación/separación de acuerdo a las
propiedades de las proteínas
Características Procedimiento
1. Salting in
Solubilidad 2. Salting out
1. Cromatografia de intercambio
Carga iónica iónico
2. Electroforesis
1. Cromatografía de adsorción
Polaridad 2. Cromatografía en papel
3. Cromatografía en fase reversa
4. Cromatografía interacción
hidrófoba
1. Dialisis y ultrafiltración
Tamaño molecular 2. Electroforesis en gel
3. Cromatografía de filtración en gel
4. Ultracentrifugación
1. Cromatografía de afinidad
Especificidad de unión
Fases de la Purificación
1. Fase I o fase de captura, el objetivo es aislar, concentrar y
estabilizar la proteína de interés. Se deben de eliminar los
contaminantes críticos que comprometan la estabilidad de
la proteína. (Homogenización, centrifugación)
2. Fase II o fase intermedia, el objetivo es eliminar la mayoría
de las impurezas como otras proteínas, ácidos nucléicos,
endotoxinas y virus. (Precipitación selectiva)
3. Fase III o fase de perfeccionamiento, la mayoría de las
impurezas ya han sido removidas excepto aquellas que
están muy relacionadas con la proteína de interés y que se
encuentran en cantidades muy pequeñas. El objetivo es
logar la mayor pureza posible. (Métodos cromatográficos)
FASE I.
Métodos de
baja resolución Homogenización, filtración,
centrifugación
FASE II. Precipitación con sales, solventes,
temperatura o pH
Métodos de
baja resolución
Métodos cromatográficos:
filtración en gel, intercambio iónico,
FASE III. Métodos afinidad
de alta
resolución Métodos electroforéticos:
electroforesis no desnaturalizante,
desnaturalizante
Ruptura de la Célula
¿Qué Propiedad de la Proteína es Importante?
ESTABILIDAD
Las proteínas se desnaturalizan fácilmente a temperaturas elevadas, aunque
algunas se pueden desnaturalizar a 25°C. La purificación de las proteínas debe
llevarse a cabo a 0°C o temperaturas cercanas.
MÉTODOS
•Suaves:
Lisis celular (choque osmótico)
Digestión enzimática (lisozima)
Lisis química (detergentes)
Homogenización manual
Molienda
Menos agresivos, previenen desnaturalización de la proteína, pero no
aseguran su liberación celular.
Ruptura de la Célula
¿Qué Propiedad de la Proteína es
Importante? ESTABILIDAD
MÉTODOS
•Moderados:
Homogenización con cuchillas
Molienda abrasiva
Congelamiento
•Vigorosos:
Ultrasonicación
Homogenizador Manton-Gaulin
Prensa francesa
Reducen viscosidad del extracto, pero pueden inactivar proteínas.
Buffer de Lisis
Debe mantener las condiciones apropiadas para mantener e incluso mejorar la
estabilidad de la proteína.
pH Fuerza Iónica Aditivos
Mantener un pH en el Mantener una Son componentes que
cual la proteína es concentración de sales previenen la degradación
estable y se previene la adecuada para reducir las y mejoran la estabilidad.
precipitación isoeléctrica. pérdidas por Se deben agregar solo si
precipitación es necesario.
Aditivos
Fraccionamiento Celular: Centrifugación
Diferencial
• Eliminar contaminantes o clarificar la muestra
• Separación de los componentes con base en las diferencias en densidad,
tamaño y forma. Como resultado, el efecto de la gravedad para cada proteína
es diferente.
• Partículas más grandes y pesadas migran más rápido.
Homogenización del tejido
Centrifugación Diferencial
Baja
Baja velocidad decentrifugación
velocidad de centrifugación
(1 000
(1 000g,g,10’)
10’)
Sobrenadante sujeto a velocidad de centrifugación
media
(20 000 g, 20’)
Sobrenadante sujeto a velocidad de centrifugación
alta
Tejido homogenado (80 000 g, 1 h)
Sobrenadante sujeto
a velocidad de
centrifugación
muy alta
(150 000 g, 3 h)
Pellet, contiene
células completas,
núcleos, membranas
plasmáticas
Pellet, contiene
mitocondrias,
lisosomas,
peroxisomas
Sobrenadante
contiene proteínas
solubles
Pellet, contiene microsomas
(fragmentos de RE), vesículas
pequeñas
Pellet, contiene ribosomas, macromoléculas
grandes
Remover contaminantes y/o concentrar
la muestra
Después de romper las células y estabilizar las proteínas, el
siguiente paso es concentrar. Se pueden utilizar diferentes
métodos:
Ultrafiltración
Precipitación selectiva
Precipitación selectiva
¿Qué propiedad de la
proteína es importante?
SOLUBILIDAD
• Debido a que la proteína contiene varios grupos cargados, la solubilidad es
sensible a la temperatura, el pH, la fuerza iónica.
• Si afectamos alguna de éstos factores podemos disminuir o incrementar la
solubilidad de la proteína.
• El método más comúnmente empleado es la precipitación por salado con
(NH4)2SO4.
Sin embargo, también hay otros métodos
Precipitación con solventes orgánicos.
Precipitación isoeléctrica.
Precipitación térmica.
Precipitación
¿Qué propiedad de la proteína es
importante? SOLUBILIDAD
Log (S/S’)
Fuerza Iónica
Precipitación por salado
Solubilidad
Capa de
Hidratación Salting in
Salting out
Concentración de sal
Precipitación por
salado
Salting in: La solubilidad de una proteína, a una
concentración baja de iones, aumenta a medida que se
incrementa la concentración de la sal.
Salting out: Las interacciones proteína-proteína se hacen
más fuertes que las interacciones proteína-disolvente y la
proteína precipita.
La concentración de sales requerida para alcanzar el efecto
de salting out varía de acuerdo a las características de la
proteína
Precipitación por salado
2.2.- Capacidad de
espumado
2.2.1.- Capacidad de espumado
¿Qué sería si encontrásemos bizcochos duros, crema batida
aguada y una cerveza sin su característica espuma? Tal vez
dejarían de ser consumidos a pesar de su buen sabor. Es por eso
la importancia de las propiedades funcionales de las proteínas que
mejoran el aspecto y textura de los alimentos. Dentro de ellas
tenemos a la propiedad espumante, la cual consiste en la
formación de una fase acuosa continua y una fase gaseosa
dispersa.
Las espumas siguen 3 pasos principales para formarse. Primero, la proteína globular soluble
se difunde por la interface gas/agua, concentrándose y reduciendo la tensión superficial.
Segundo, las proteínas se desdoblan en la interface orientando su lado polar hacia las
moléculas de agua; lo cual resulta en una orientación de la molécula proteica hacia el lado
hidrofílico e hidrofóbico. Por último, los polipéptidos interactúan para formar una película
delgada con una posible desnaturalización parcial y coagulación.
La propiedad espumante de una proteína se refiere a su habilidad de formar una película delgada y resistente en una
interface líquido-gas, de manera que grandes cantidades de burbujas de gas puedan ser incorporadas y estabilizadas.
La capacidad espumante de una proteína se refiere a la cantidad de área interfacial que puede ser creada por la
proteína y puede ser expresado como el volumen de espuma estable (overrun) o el poder espumante (FP). La proteína
debe migrar a la interfase, adsorberse y reorganizarse.
Donde: VA = Volumen de la espuma
VL = Volumen del líquido inicial
Factores que afectan la estabilidad de la espuma
En general muchas propiedades espumantes se ven afectados principalmente
por la concentración de proteína que contenga el alimento. A mayor
concentración de proteína más rígida será la espuma, esto se debe a la
formación de pequeñas burbujas y a la alta viscosidad de la fase acuosa.
Existen, además, otros factores que se deben tener en cuenta para mantener la espuma en un alimento, estos
son: el pH, la presencia de sales, la presencia de azúcares y la presencia de lípidos.
En el caso del pH, las espumas muestran estabilidad cerca a un pH isoeléctrico, ya
que la carencia de interacciones de repulsión favorecen las interacciones proteína-
proteína y por lo tanto la formación de una película viscosa en la interface.
El efecto de la adición de sales en las propiedades espumantes dependen del tipo de
sal y las características de solubilidad de la proteína en la solución salina. La
capacidad espumante y la estabilidad de la mayoría de proteínas globulares, como
albúmina de huevo, gluten, entre otras, incrementan con el incremento de la
concentración de NaCl.
Efecto de la adición de azúcares. La adición de sacarosa (en su mayoría) a soluciones
proteicas, usualmente causa que la espuma sea más estable, debido a un incremento
en la viscosidad de la fase, la cual reduce la velocidad de drenado del fluido de las
micelas. Por otro lado, la capacidad espumante disminuye, esto es porque la proteína
es menos capaz de desdoblarse y se adsorbida en la interface.
Efecto de la adición de lípidos. Debido a que los lípidos (especialmente fosfolípidos) son más
activos en la superficie que las proteínas, los lípidos se adsorben mejor en la interface gas-agua e
inhibe la adsorción de las proteínas durante la formación de la espuma.
2.3 Formación de geles
Los geles formados a partir de proteínas globulares, tras su calentamiento y
desnaturalización son ejemplos de dispersiones agregadas. El plegamiento
térmico de las proteínas conduce a una liberación de las cadenas laterales
aminoacídicas, que podrán participar así en interacciones intermoleculares. La
asociación subsecuente ocurre con formación de pequeños agregados esféricos,
que aparecen en cadenas cuyas interacciones dan lugar a la red del gel.
¿Que necesitamos para formar el gel?
Para que este tipo de agregación desordenada conduzca a la formación de un gel,
se necesitan concentraciones proteicas relativamente altas (5-10%). También la
velocidad e agregación debe ser menor que la de plegamiento, porque en caso
contrario, en el entorno del punto isoeléctrico por ejemplo, se formarían geles
groseros poco estructurados.
Desnaturalización
El grado de desnaturalización necesario para que comience la agregación parece
depender de la proteína. Puesto que lo que se liberan durante la
desnaturalización parcial son sobre todo grupos hidrófobos, predominan las
interacciones hidrófobas intermoleculares, de ahí el carácter termoplástico
(termoirreversible) de este tipo de geles, en contraposición con los geles
termorreversibles por puentes de Hidrogeno
¿Podemos mejorar la formación de un
gel?
La capacidad de formación de un gel se mejora mediante la adición de sal: el
incremento moderado de la fuerza iónica aumenta la interacción entre las
moléculas cargadas o los agregados moleculares por protección de carga, sin que
se llegue a la precipitación.
Usos de los geles
La gelificación tiene un papel fundamental en la preparación de numerosos
alimentos, como productos lácteos, geles de gelatina, proteínas vegetales
texturadas, geles proteicos de soja, pastas de panadería. También se aplica para
la mejora de la absorción de agua, el espesado, y para estabilizar emulsiones y
espumas.
2.4 incremento de digestibilidad
2.4.1 modificación del perfil de aminoácido (
reacción de plasteína)
La tecnología de los alimentos aprovechan las propiedades vinculadas alas
estructuras de las proteínas para realizar muchas operaciones relacionadas
con la fabricación de los productos alimenticios
La eficiencia de estas operaciones de las diversas funciones ejercidas por las
proteínas de acuerdo con su composición aminoacidicas
En los momentos actuales existen una permanente exigencia en tono alas
propiedades requeridas
En este campo de las modificaciones proteicas caben señalar tres metas o fines
a conseguir desde el punto de vista de la preparación
A) bloqueo de las reacciones de degradación: como pueden ser evitar que se
produzca la reacción maillard
B) mejora de las propiedades fisicoquímicas: como las repercuten en la
solubilidad en la capacidad de emulsion en la estabilización de espumas o en
la textura de los alimentos
C) mejora del valor nutritivo: como puede ser, simplemente, el incremento
de su digestibilidad o, de modos mas complejos, en el enriquecimientos en
algunos cmponentes.
Reaccion de la plasteina
Creación enzimática de uniones peptídicas a partir de hidrolizados
Formación de polipéptidos con un peso molecular alrededor de 3000 Da
Mejorar el valor biológico de las proteínas
Reaccion de plasteina
Conclusión
Lograr estabilidad en las enzimas resulta de interés tanto para el ámbito
comercial como para el campo científico. En este documento, revisamos cómo la
evolución dirigida ha contribuido al desarrollo de enzimas estables y a una nueva
visión con respecto a los principios de estabilidad de las proteínas. Se describen
numerosos ejemplos recientes. Estos ejemplos muestran que la evolución dirigida
es una estrategia efectiva para obtener enzimas estables, particularmente
cuando se utiliza en conjunto con estrategias de ingeniería racionales o cuasi
racionales.
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