PRÁCTICA 04:
INTRODUCCIÓN A LA ESPECTROFOTOMETRÍA
I. OBJETIVOS
II. FUNDAMENTOS
Se denomina Análisis Colorimétrico al conjunto de métodos de análisis cuantitativos que
se fundamentan en la medición de la intensidad de la luz transmitida a través de una
solución coloreada, ya sea que se trate de sustancias naturalmente coloreadas ò que se
han hecho de tal calidad mediante reacciones químicas adecuadas.
Cuando una haz de luz (luz incidente, Io) atraviesa una solución, una parte de la radiación
queda absorbida por las moléculas del soluto coloreado, sufriendo una reducción de su
intensidad (Luz transmitida, I), proporcional a la capacidad de absorción de dichas
moléculas.
Casi todas las sustancias en solución tienen la capacidad de absorber en forma selectiva
determinadas radiaciones luminosas unas más que otras dejándolas pasar. La longitud de
onda en la que las moléculas de dicha sustancia absorbe con mayor intensidad la luz, se
denomina “longitud de máxima absorción” o “lambda máximo”.
Si consideramos que cada molécula absorbe una determinada cantidad de luz, la
intensidad de la luz transmitida por una solución disminuirá en relación con el aumento del
número de moléculas que se interpongan entre la fuente luminosa y el observador. Este
número varía de acuerdo con la concentración del soluto y el espesor del recipiente que
contiene la solución, estos factores están considerados en la “Ley de Lambert y Beer”,
que rige los principios de la Espectrofotometría y cuyas formas de expresión son:
Donde:
Io = Intensidad de la luz incidente.
I = Intensidad de la luz transmitida.
E = Coeficiente de extinción molar, valor constante dependiendo de la naturaleza de la
Sustancia y de la longitud de onda
I = Espesor del recipiente en cm.
C = Concentración de la solución.
A = D.O. = Absorbancia (A) aumenta conforme disminuye la Transmitancia (T) y la
relación entre ambas es logarítmica.
CALCULO DE LA CONCENTRACIÓN DE UNA SOLUCION PROBLEMA:
Para calcular la concentración de una solución problema con el empleo de un
Espectrofotómetro, existen dos formas:
- Método de la curva standard o curva de calibración.
- Factor de calibración.
a) CURVA STANDARD.- Este método consiste en utilizar varios estándares de
concentraciones conocidas y progresivas para luego construir un gráfico en un sistema de
coordenadas en el que se colocan las lecturas en las ordenadas (Eje Y) y las
concentraciones en las abscisas (Eje X). En la recta obtenida (Función lineal), se puede
extrapolar la absorbancia o densidad óptica de la muestra problema, hallando la
concentración de la misma en el eje de las abscisas.
b) FACTOR DE CALIBRACIÓN.- (Fc), El factor de calibración es un término que se
relaciona con la concentración de una sustancia con su absorbancia, es decir la
intensidad que absorbe una sustancia de concentración conocida (Standard o Patrón).
Así tenemos:
Fc = [ Standard ] / A
Donde:
Fc = factor de calibración.
A = absorbancia del tubo standard.
[Standard] = concentración del standard.
Con el factor de calibración se puede fácilmente determinar la concentración de una
muestra desconocida o problema (MP), conociendo su absorbancia.
Si la muestra problema y el standard son procesados de la misma manera (diluciones) se
podrá usar directamente la siguiente fórmula:
[ MP ] = A. Fc
Si la muestra problema sufre diluciones previas se encontrará el factor de dilución (Fd)
que es matemáticamente la inversa de la dilución (dil) y esta a su vez es:
Dil = Vol / Vol o
Donde:
Vol = Volumen de la muestra problema tomada para hacer la dilución.
Vol o = Volumen total.
Para este segundo caso cuando se quiere saber la concentración de una muestra
problema se procederá usando la siguiente fórmula:
[ MP ] = A. Fc. dil
Donde:
A = Absorbancia de la muestra problema.
Fc = Factor de calibración.
Dil = Factor de dilución.
[MP] = Concentración de la muestra.
III. MATERIALES
Bicromato de Potasio 80 %.
espectrofotómetro
H2O destilada
Gradillas
Tubos De Ensayo
Pipeta 2 Ml
Pipeta 5 Ml
Beacker 250 Ml
Propipeta
Fiolas
Picetas
Tubo
Gradillas
[Link]
Preparar la siguiente batería de tubos:
Solución stock: Bicromato de Potasio 80 mg%.
Calcular la concentración en mg% de bicromato de K en cada uno de los tubos Standard
(I-II-II-IV).
Leer las absorbancia de los cuatro tubos a 350 nm de longitud de onda ( )גen el
espectrofotómetro contra el H2O destilada (Abs. H2O=0).
2. Con los datos obtenidos construir en un papel milimetrado la gráfica de absorbancia en
el eje de las Ordenadas vs concentración de bicromato de K en el eje de las Abscisas.
3. Una vez obtenida la curva de calibración, medir la absorbancia de la muestra problema
(Problema X).
4. Obtener el factor de calibración (Fc) promedio con las soluciones standard y sus
Absorbancia utilizadas para construir las curvas de calibración ajustadas.
5. Calcular la concentración de la muestra problema por los siguientes métodos:
A.- Gráficamente extrapolando su absorbancia en la curva de calibración.
B.- Usando Factor de Calibración, multiplicando su absorbancia por el factor de
calibración del standard.
