Sulfobacterias en Fluidos Geotérmicos: Estudio Preliminar en el Área Geotermal de Larderello

Giorgio Culivicchi, Alessandro Lenzi *, Bruno Tarquini, Silvia Mariani

Enel GEM Producción geotérmica,

Laboratorio Larderello UNIT, Piazza Leopolda 1 - 65044 (PI) ITALIA

Palabras clave: Larderello, Italia, bacterias, reducción de H2S

ABSTRACTO

Las condiciones químicas y físicas de la energía geotérmica

Las aguas de las plantas pueden permitir el desarrollo de sulfobacterias Involucrados en el ciclo
biológico del azufre. En este estudio informamos. Los resultados preliminares obtenidos en la
investigación y clasificación de bacterias en desarrollo en torre de enfriamiento. En nuestro
estudio primero desarrollamos la identificación Técnicas y luego identificó el hábitat adecuado
para Proliferación de sulfobacterias. Varias familias de Las sulfobacterias se han identificado en
diferentes ambientes químicos y entre todos los Sulfolobus han sido identificados. La
identificación se ha extendido a aguas termales naturales en la zona de Larderello.

1. INTRODUCCIÓN

Los ciclos biológicos naturales son un conjunto de transformaciones realizadas en

microorganismos para transformar los elementos químicos en compuestos capaces de sostener la
vida del propio organismo. Tenemos los ciclos biológicos de nitrógeno, carbono, fósforo y azufre.
las condiciones físico-químicas de la energía geotérmica plantas pueden permitir el desarrollo de
la vida microbiana implicada en el ciclo de azufre. En este estudio hemos verificado la presencia de
sulfobacterias en torres de enfriamiento y comparadas con las presentes en fumarolas naturales
en la zona de Larderello. las centrales eléctricas de la zona de Larderello son energía presente en
el producto químico endógeno transportador de vapor elementos presentes en el fluido primario
o generados por equilibrio químico con las rocas en el embalse. Vapor es después de la
transformación de energía y algunos los elementos químicos se disuelven en él. La búsqueda de
sulfobacterias en las torres de enfriamiento ha sido realizado extensivamente en este estudio y
ampliado a respiraderos y fumarolas. El objetivo del estudio fue también evaluar los orígenes de
las sulfobacterias, ya sea in situ proliferación o incluso primaria del propio vapor. El punto de
partida de la investigación ha sido centrándose en dos géneros de bacterias:

Género Thiobacillus como ya se ha identificado en algunos

Aguas 1

Género Sulfolobus con vías metabólicas adecuadas para producción de ácido sulfúrico sin
generación de azufre y consiguiente taponamiento de las membranas en las que Microbia se
cultivan2. Como resultado principal de la investigación se encuentra la técnicas de identificación
para verificar y discriminar Microbic en los sistemas investigados. La clave para realizar una
herramienta de identificación rápida y el método de hibridación in situ que ha demostrado ser un
buena alternativa a los métodos de cultivo clásico.
2. EL THIOBACILLUS Y SOLFOLOBUS

Las bacterias (del griego baktérion, "palo") son un grupo grande de microorganismos unicelulares
sin un núcleo separado (Procariota) reproduciéndose por división celular. Las bacterias son anchas
untado. Pueden estar presentes en aguas marinas, lagos, suelos, alimentos, aire y también se han
descubierto en hábitat extremo como aguas termales oceánicas. Se conocen aproximadamente
1600 tipos de bacterias. Son clasificados por la forma, por la presencia de oxígeno en su habitat y
por sus propiedades bioquímicas.

2.1 El género de Thiobacillus

El género Thiobacillus incluye Gram-negativos, aeróbicos, organismos en forma de bastón que

prefieren temperaturas 20-30 ° C (hasta 50 ° C) y pH = 2-8, aunque algunas especies también
puede proliferar por debajo de pH = 2. Estos organismos son bacterias quimio-lito-autotroforas y
puede oxidar compuestos inorgánicos, esencialmente H2S para tomar energía para la síntesis de
compuestos orgánicos. Por definición, las bacterias lito-tróficas utilizan Compuestos (H2, NH4 +,
NO2-, H2S, S) como fuente de energía y también se dice chomotrófico si la producción de energía
es por reacciones de oxidación. Además, los organismos autótrofos utilizan CO2 como fuente de
carbono. Por esta definición el Thiobacillus es una bacteria quimio-lito-autotrófica. Para este
organismo la fuente de energía es sulfuro de hidrógeno.

Que se oxidó a azufre coloidal:

2H2S+ O2 → 2S (colloid) + 2H2O [1]

En la torre de enfriamiento, el espontáneo no microbiano se observa también la oxidación del

sulfuro de hidrógeno. En este caso las condiciones de pH pueden cambiar las tasas de reacción y
en general los dos procesos están presentes al mismo tiempo azufre. La oxidación puede avanzar
hasta el ácido sulfúrico con un segundo

Etapa química u oxidación microbiana:

2S+3O2+2H2O → 2H2SO4 [2]

Las especies de Thiobacillus se han dividido en tres grupos de Kelly y Harrison 3 como se indica en
la tabla 1:
Table 1

Grupo principal Especies

Neutrófilos obligatoriamente, Thiobacillus thioparus,
Quimiolitototrófico [Link],
[Link],
[Link],
[Link]
Neutrófilo facultativo Thiobacillus novellus,
Chemolithotroph [Link],
[Link],
[Link],
[Link],
[Link],
[Link]
Acidophyl Thiobacillus ferroxidans,
 [Link],
[Link],
[Link],
Se ha demostrado que los miembros del género Acidiphilium
Están presentes con algunos acidófilos en la naturaleza y en
Vitro (Harrison4 1984

2.1 El género Sulfolobus

El género Sulfolobus forma parte de Archaebacteria o Archaea incluyendo bacterias Gram-

negativas que son típicas de hábitat (es decir, temperaturas del agua por encima de 100ºC). Se
conocen dos especies de Sulfolobus: el Sulfolobus Solfataricus y el Sulfolobus acidocaldarius.

Características del género Sulfolobus:

• Células esféricas altamente lobadas con diámetros comprendidos entre 0,8 y 2 μm.

• Celdas no móviles

• Facotado autotrófico, puede usar Azufre elemental como fuente de energía, así como extractos
de algas y ribosa.

• Estrictamente aeróbico

• Temperatura óptima para el crecimiento: 70-80 ° C (máx. 85 ° C, min 55 ° C)

• Alcance óptimo del pH para el crecimiento: 2,0-3,0 (en algunos casos puede crecer también a pH
= 0,9)

• Colonias: lisas, con brillo y no pigmentadas

Estas bacterias, a menos que Thiobacillus, pueden producir directamente ácido sulfúrico a partir
de sulfuro de hidrógeno, sin producción de azufre coloidal que puede generar taponamiento y
segregación de barro de azufre en torres.

3. MATERIALES Y MÉTODOS

En esta sección damos una descripción sintética de los métodos utilizados para el muestreo,
identificación morfológica y la identificación del género por hibridación in situ.

3.1 Muestreo

Se ha muestreado un conjunto de especímenes de diversos hábitats en condiciones estériles. Las

muestras han sido almacenadas en botellas y se analizaron después del muestreo. Las muestras
son descritas abajo:

• Muestra 1: agua y lodo de la cuenca de la torre de una central eléctrica en la zona de Larderello
(codificada Camp1A + F) 

• Muestra 2: agua y lodo de la torre de refrigeración de

Planta de energía en el área de Larderello (codificado Camp2A) 

• Muestra 3: agua verdosa y lodos del Lago salidas de corriente (codificadas Camp3A + F verde)

• Muestra4: agua oscura y lodos del Lago salidas de corriente (codificadas Camp4A + F nera)

• [Link]ña 5: agua caliente en la corriente principal desde el

Lago Flujo de ventilación (codificado Camp5A)

• Muestra 6: agua y espuma de la cuenca de la torre de una planta de energía en el área de

Radicondoli (codificada Camp6Ra)

• Muestra 7: agua de la cuenca de la torre de enfriamiento de una planta de Larderello (codificada

18/10) 

• Muestra 8: agua de la cuenca de la torre de enfriamiento de una planta de Larderello (codificada

22/11)

• Muestra 9: agua y lodo de fumarolas alrededor de la zona Lago

3.2 Identificación morfológica mediante SEM microscopía

Se ha realizado un cribado morfológico cualitativo sobre las muestras con el fin de verificar la
forma y dimensiones características de los microorganismos bajo investigación. Nosotros hacemos
informe del protocolo para la preparación y observación de muestras.

• Muestreo por pipetas Pasteur de botellas estériles conteniendo los especímenes recogidos

• Filtración en policarbonato de porosidad de 25 mm, 0,4 μm filtros

• Secado del filtro

• Montaje del filtro en porta-muestras de microscopio (talón)

• Metalización por revestimientos de oro

• La observación y la identificación cualitativa por análisis dimensional

3.3 Hibridación in situ (FISH: fluorescencia in situ Hibridación)

Todas las muestras han sido probadas por hibridación in situ técnica y observada por microscopía
de fluorescencia. Los métodos de cultura clásica siguen siendo ampliamente utilizados para
caracterizan especímenes bacterianos, además estudios de ecología basados en el muestreo
extensivo en el hábitat natural son los mejores realizado utilizando técnicas de biología molecular
como In Situ Hibridación. Brock5 (1987) ha introducido este experimental en estudios de ecología
con el fin de identificar poblaciones específicas de bacterias que método reproducible para evaluar
la distribución y las especies aisladas directamente en el hábitat natural.

La técnica se basa en el uso de oligonucleotídicos sondas (típicamente 20 bases) marcadas con

fluoróforos y complementarios a los ribosómicos característicos y específicos RNA presente en el
grupo taxonómico bajo investigación. Gene de arranque "bibliotecas" disponibles en bancos de
datos gen las sondas oligonucleotídicas específicas se diseñan como las para genes que codifican
secuencias de ARNr 16S y 23S (16S y 23S son los coeficientes de sedimentación para el gradiente
de densidad técnicas de separación por ultracentrifugación). En todas las bacterias hay un gran
número de ribosomas citoplasma. Cada ribosoma tiene sedimentación total coeficiente con valor
70S y está compuesto de dos subunidades llamado 50S y 30S. En los ribosomas 70S tres ARN se
pueden encontrar moléculas: la primera en 16S en la subunidad 30S. La segunda y tercera
moléculas, denominadas 23S y 5S están en la subunidad 50S. Las sondas de hibridación pueden
unirse al rRNA 16S y 23S y de acuerdo con la secuencia en la sonda se pueden identificar grupos
específicos de bacterias. En el cuadro 2 se presentan las características específicas y sondas
utilizadas en este estudio.
Eub 16S 338 Fluo Sonda bacteriana universal
Archaea 23S 915 Cy3 Sonda específica para el Grupo
Archaea
β 23S 1027 Fluo Sonda específica para el Grupo
Β-Proteobacteria
γ 23S 1027 Cy3 Sonda específica para el
Grupo γ-Proteobacteria
En el cuadro 2 las siglas codifican respectivamente:

1. el nombre del Grupo

2. el fragmento de ARNr al que está unida la sonda

3. el número del nucleótido terminal de la sonda con la secuencia de E. coli como referencia

4. Los fluoróforos presentes en la sonda: Cy3 emite en verde, Fluo es un compuesto emisor rojo.
Cada sonda está diseñada para las regiones más variables de secuencias genéticas para ser
altamente específicas.

3.3.1 Preparación de la muestra para Hybridaion in situ

En el siguiente párrafo reportamos el protocolo que para realizar la hibridación in situ de muestras
con algunas recomendaciones de la experiencia de laboratorio

1. Concentración de la muestra por centrifugación

2. La fijación de la muestra mediante una reacción formaldeídica al 4% (muestra a la relación de

solución de fijación 1: 1) en tubos de ensayo para una hora bajo refrigeración.

3. Ejemplo de centrifugación para eliminar la solución de fijación y suspensión con agua

desionizada.

4. Repita la operación arriba

5. Ejemplo de centrifugación para eliminar la solución de fijación y suspensión con etanol al 30%

6. Repita la operación arriba

7. Ejemplo de centrifugación para eliminar la solución de fijación y suspensión con etanol al 50%

8. Ejemplo de centrifugación para eliminar la solución de fijación y suspensión con etanol al 70%

9. Ejemplo de centrifugación para eliminar la solución de fijación y suspensión con etanol al 90%
10. Ejemplo de centrifugación para eliminar la fijación solución y suspensión con etanol puro

Observación derivada de este estudio específico: una buena preparación de la muestra requiere
una eliminación precisa del precipitar la suspensión. A 10 min. Permanencia en reposo con
muestras refrigeradas entre cada centrifugación sugerido para obtener los mejores resultados.

Preparación de la muestra de microscopía

11. Concentración de muestras en lentes microscópicas

12. Evaporación de etanol en el horno tratamientos de soluciones de hibridación

13. Preparación de la "solución de hibridación":

a. 180 μl de NaCl 5 M segundo. 20 μl TRIS / HCl pH = 8 tampón . Agua destilada hasta 1ml

14. Preparación de la "mezcla de hibridación" mezclando 800 μl de "solución de hibridación" más

100 μl de sonda de rRNA específica + otros 100 \ mu l del segundo sonda de ARNr específica (si es
necesario)

15. Deposición de la mezcla de hibridación en el vidrio de microscopio y protección con tapa de

vidrio.

16. Digestión en cámara húmeda a 44 ° C durante 2-3 horas.

Solución de lavado

17. Solución de lavado: a. 1 ml de TRIS / HCl 1 M a pH = 8 segundo. 9000 \ mu l de NaCl 5M H2O

hasta 50 ml

18. Transferir la solución de lavado en placas Falcon y calentar durante 30 min a 46 ° C

19. Retire las gafas de cubierta por la solución de lavado

20. Colocar los vasos en placas de halcón e incubar 15 min a 46 ° C

21. Lave los vasos tres veces durante 5 min con agua destilada agua

22. Gafas secas y remontaje de las gafas glicerol y antifade

23. Observación bajo microscopía de fluorescencia.

4. RESULTADOS

En el siguiente párrafo se presentan los resultados obtenidos las muestras sometidas a

investigación por una exploración morfológica por microscopía de SEM y por el método de
hibridación in situ.
4.1 Análisis morfológico preliminar por SEM

(Microscopía electrónica de barrido)

El análisis de muestras por microscopía electrónica ha determinar la presencia de posibles

agregados bacterianos partículas coloidales de azufre. Existen dos tipos de bacterias. Un primer
tipo en forma de barra típico del género Thiobacillus (Figura 1) y un segundo esferoidal típico del
Sulfolobus Género (fig.2).

Figura 1: bacterias en forma de barra del tipo Thiobacillus 1

Figura 2: bacterias en forma de esfera del tipo Sulfolobus

Figura 3: Muestra 1. La flecha indica un grupo de Eubb 338 Fluo bacterias híbridas en rojo. Las
bacterias son uniformemente fluorescentes, ya que los ribosomas están presentes en el
citoplasma entero. Ampliación 63X

Algunas muestras han sido positivas también Γ-proteobacterias. Esto indica que la bacteria
Thiobacillus están presentes ya que el género contiene específicamente Γ-proteobacterias.

Figura 4: Muestra 6. La flecha indica un grupo de bacterias híbridas con sonda γ1027Cy3. Maceria
son fluorescente en verde. Ampliación 63X
Figura 5: Muestra 7. bacterias hibridadas con β1027Fluo sonda que emite fluorescencia roja.
Ampliación 63X

En estas muestras, una alta concentración de especies bacterianas ha detectado dando respuesta
positiva para todos los 4 tipos de sondas de hibridación utilizadas.

Figura 6: Muestra 3. Bacterias hibridadas con Eub338Fluo. Ampliación 63X

Un resultado importante es la respuesta positiva a la ArcheaCy3 sonda específica para

arqueobacterias. Entre Archeobacteria tenemos las bacterias termófilas. Es decir género de
Sulfolobus capaz de proliferar a temperaturas Hasta 100 ° C.
Figura 7: Muestra 5. Las bacterias hibridadas con el Archaea915Cy3 sonda. Tenga en cuenta que
estas bacterias son menores que los anteriores y esto de acuerdo con la hipótesis de la presencia
de Sulfolobales. Aumento63X

La abundancia de formas bacterianas también es presencia de respuesta positiva a las sondas para
β y γ proteobacterias.

Figura 8: Muestra 4. Bacterias hibridadas con el sonda γ1027Cy3. Ampliación 63X

Archeobacteria también se han observado en el barro presente en fumarolas. La observación

morfológica y la respuesta a sondas de hibridación de Archeobacteria sugieren la presencia de las
bacterias del género Sulfolobus.
Figura 9: Muestra 9. Bacterias hibridadas con el Archaea915Cy3 sonda. Ampliación 63X

En la tabla 3 se presenta un resumen sintético de la hibridación resultados.

Respuesta de Respuesta de Respuesta de Respuesta de

sonda sonda sonda sonda
Muestra Eub-Fluo Archaea-Cy3 -Cy3 -Fluo
Enfriamiento POSITIVO SIN RESPUESTA POSITIVO POSITIVO
Cuenca de la
torre
Salidas de vapor POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO
Fumarolas POSITIVO POSITIVO SIN RESPUESTA SIN RESPUESTA

4. CONCLUSIONES

En la tabla 4 tenemos una matriz de reanudación de los resultados obtenidos para este cribado
preliminar en microorganismos variedades en los fluidos geotérmicos del área de Larderello. Como
podemos tanto el género de Thiobacillus como el de Solfolobus han sido observado en las aguas
de la torre de refrigeración, así respiraderos En todos los casos en que se han observado bacterias
en centrales eléctricas no hay tratamientos químicos donde correr a menos que se observen en
obras anteriores y este fenómeno muestra que un hábitat natural "sano" se crea en este sistemas.

En nuestra opinión otro resultado notable es la aplicación de técnicas de hibridación in situ a

muestras geotérmicas apertura de una nueva oportunidad para la rápida y muy específica
identificación de las familias microbianas que colonizan sistemas geotérmicos.

Muestra -bacteria γ-bacteria Eubacteria Archeobacteria

Enfriamiento PRESENTE PRESENTE PRESENTE PRESENTE

Cuenca de la
torre
(superficial
Aguas)
Enfriamiento PRESENTE PRESENTE PRESENTE PRESENTE
Cuenca de la
torre
(Espumas)
Respiraderos de PRESENTE PRESENTE PRESENTE PRESENTE
corriente
(humedad)
Respiraderos de PRESENTE PRESENTE PRESENTE PRESENTE
corriente
(barro)
Fumaroles AUSENTE AUSENTE PRESENTE PRESENTE
(humedad)