CORTÁZAR T.M., HERNÁNDEZ J., ECHEVERRY M.C., CAMACHO M.

Biomédica 2006;26(Supl.1):26-37 Biomédica 2006;26(Supl.1):26-37

ARTÍCULO ORIGINAL

Papel de la vacuola parasitófora de

macrófagos de ratón infectados por Leishmania amazonensis
en la adquisición de moléculas
Tania M. Cortázar 1,2, Joselín Hernández 1,2, María Clara Echeverry 1,3, Marcela Camacho 1,2
1
Laboratorio de Biofísica, Centro Internacional de Física, Universidad Nacional de Colombia, Bogotá, D.C.,
Colombia
2
Departamento de Biología, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia, Bogotá, D.C., Colombia.
3
Laboratorio de Parasitología, Departamento de Salud Pública, Facultad de Medicina, Universidad Nacional
de Colombia, Bogotá, D.C., Colombia.
Introducción. Leishmania son parásitos intracelulares de macrófagos, confinados en
compartimentos denominados vacuolas parasitóforas. La permeabilidad de este compartimento
depende de su interacción con el tráfico vesicular y transportadores presentes en su membrana.
Objetivo. En este trabajo se estudió la permeabilidad de la membrana de la vacuola parasitófora
en la línea celular J774.A1 infectada con Leishmania amazonensis, in situ y en compartimentos
aislados.
Materiales y métodos. El aislamiento de vacuolas parasitóforas se hizo por gradiente de
densidad. La permeabilidad de la membrana de estas se valoró por distribución de sondas
fluorescentes y electrofisiología. Para establecer indirectamente el transporte de protones se
usó naranja de acridina. La presencia de transportadores ABC sensibles a probenecid se
estableció con amarillo lucifer y calceína. Por primera vez con la técnica de patch-clamp se
registraron corrientes en la membrana de este compartimento aislado.
Resultados. La vacuola parasitófora colorea de rojo con naranja de acridina indicando un pH
ácido. Concentra amarillo lucifer a través de un transportador sensible a probenecid, pero
excluye la sonda calceína. Vacuolas aisladas se marcan de rojo con naranja de acridina y
concentran amarillo lucifer a través de un transportador sensible a probenecid. Estas vacuolas
excluyeron calceína y presentaron en su membrana una corriente iónica que se activa a
diferencias de potencial cercanas a 60 mV, con una conductancia de 46 ± 3 pS.
Conclusiones. Se pueden aislar vacuolas parasitóforas con propiedades de permeabilidad
que preservan mecanismos de transporte similares a los encontrados in situ. Se registra por
primera vez la presencia de una corriente iónica poco selectiva en la membrana de este
compartimiento.
Palabras clave: Leishmania, membranas intracelulares, permeabilidad, proteínas de transporte
de anión, transporte iónico, canales iónicos.
Role of the parasitophorous vacuole of murine macrophages infected with Leishmania
amazonensis in molecule acquisition
Introduction. Leishmania are intracellular parasites of macrophages, confined into compartments
known as parasitophorous vacuoles. The permeability of this compartment depends on its
interaction with the endocytic pathway and transport proteins present on its membrane.
Objective. The membrane permeability of the parasitophorous vacuole was studied in J774.A1-
macrophage like cells infected with Leishmania amazonensis , in situ and on isolated
compartments.
Materials and methods. The parasitophorous vacuoles were isolated by density gradients.
Fluorescent probe distribution and electrophysiological recordings were used to determine
parasitophorous vacuole membrane permeability. Proton transport was evaluated indirectly by
acridine orange staining. Probenecid sensitive ABC transporters were detected using the
fluorescent probes lucifer yellow and calcein. For the first time ion currents were recorded on
the membrane of isolated parasitophorous vacuoles using the patch clamp technique.

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Biomédica 2006;26(Supl.1):26-37 PERMEABILIDAD DE LA VACUOLA PARASITÓFORA DE LEISHMANIA

Results. The parasitophorous vacuole stains red with acridine orange indicating an acidic
compartment. It concentrates lucifer yellow by means of a probenecid sensitive transporter but
excludes calcein. Isolated vacuoles stained red with acridine orange and concentrated lucifer
yellow by means of a probenecid sensitive transporter. These vacuoles excluded calcein and
showed an ion current in their membrane which is activated at potentials close to 60 mV with a
mean conductance of 46 ± 3 pS.
Conclusions. Isolated parasitophorous vacuoles with permeability properties preserving
transport mechanisms similar to those found in situ can be purified. A poorly selective ion
current on the parasitophorous vacuole membrane is reported for the first time.
Key words: Leishmania, intracellular membranes, permeability, anion transporter proteins,
ion transport, ion channels.

Leishmania spp. son parásitos intracelulares su luz en donde el transporte de protones está a
obligatorios. Después de entrar al hospedero cargo de una ATPasa vacuolar (4) y por la
mamífero, el parásito es fagocitado por expresión de transportadores aniónicos de la
macrófagos y, posteriormente, confinado a un superfamilia de transportadores ABC (3,5).
compartimiento denominado vacuola parasitófora
En este estudio se indaga el papel de la mem-
que se caracteriza por ser ácido y rico en
brana de la vacuola parasitófora que contiene
hidrolasas (1). Asumimos que para su super-
Leishmania amazonensis en el transporte de
vivencia el parásito depende de la interacción de
moléculas entre el citoplasma de la célula
las tres membranas concéntricas presentes: la
hospedera y la luz de la vacuola parasitófora. Se
membrana plasmática del macrófago, la
confirma evidencia previa que indica acumulación
membrana de la vacuola parasitófora y su mem-
de protones y expresión de transportadores ABC.
brana plasmática.
Se reporta un protocolo para el aislamiento de la
La permeabilidad de la vacuola parasitófora de vacuola parasitófora que permite mantener las
Leishmania está determinada por la capacidad de propiedades de permeabilidad estudiadas en
este compartimiento de interactuar con la vía compartimientos in situ, y se presentan, por
endocítica y la expresión de transportadores en primera vez, registros electrofisiológicos sobre la
su membrana. La membrana de la vacuola membrana de este compartimiento que muestran
parasitófora se fusiona con vesículas provenientes una corriente iónica poco selectiva.
de la ruta endocítica desde la membrana
Materiales y métodos
plasmática y moléculas que entran por endocitosis
de fase líquida, como el dextrán, o por endocitosis Parásitos
mediada por receptores, como la albúmina, se Se cultivaron promastigotes de L. amazonensis
sitúan con Leishmania (2). Además, la membrana (FLA/BR/67/PH8), gentilmente donados por Nancy
de la vacuola parasitófora se fusiona por la ruta Gore Saravia, CIDEIM, Cali, Colombia, a 24ºC en
mediada por receptores de manosa-6-fosfato (2) medio Schneider (Sigma) con suplemento de suero
y la de la autofagia (3). La evidencia de la expresión fetal bovino al 10%. Los parásitos se cultivaron
de los transportadores en la membrana de la hasta alcanzar su fase estacionaria (107) y se
vacuola parasitófora está dada por el pH ácido de concentraron para la infección o se diluyeron para
mantener el cultivo.
Correspondencia:
Marcela Camacho, Laboratorio de Biofísica, Centro
Célula huésped
Internacional de Física, Edificio de Programas Especiales La línea de macrófagos peritoneales de ratón
“Manuel Ancízar”, Ciudad Universitaria, apartado aéreo 4948,
Bogotá, D.C., Colombia. J774.A1 ( EECACC Nº 91051511) se mantuvo en
Telefax: (571) 368 1517, 369 0487 y 571 4286; fax: (571) monocapa al 80% de confluencia en cajas de
368 1335. cultivo de 25 cm2 en medio de cultivo RPMI 1640
mcamacho@[Link] y mmcamachon@[Link] (Sigma) con suplemento de suero fetal bovino al
Recibido: 28/07/05; aceptado: 10/02/06 10% (Hyclone) a 37ºC y 5% de CO2.

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CORTÁZAR T.M., HERNÁNDEZ J., ECHEVERRY M.C., CAMACHO M. Biomédica 2006;26(Supl.1):26-37

Infección y fagocitosis de una jeringa con aguja calibre 27G en un tubo

Falcon de 15 ml y sobre hielo durante 10 minutos.
Se expusieron las células J774.A1 a
El procedimiento se controló por microscopía de
promastigotes de L. amazonensis en fase
luz hasta lograr el 90% de lisis celular.
estacionaria o a partículas de látex de 3 µm de
diámetro, en una proporción de 1 a 10 y se Para remover células intactas y núcleos del
mantuvieron a 35°C y 5% de CO2 por 4 horas (6). homogenizado, la suspensión se diluyó a 10 ml
El excedente de parásitos o partículas de látex en solución tamponada de lisis y se centrifugó a
se removió por lavado con RPMI. Posteriormente, 50g por 10 minutos a 4°C. El sobrenadante se
los cultivos se mantuvieron a 35°C y 5% de CO2 llevó a un gradiente discontinuo de sacarosa (8).
hasta por 5 días después de la infección. Con este tipo de gradiente no fue posible separar
Aislamiento de vacuolas parasitóforas compartimentos que preservaran las caracterís-
de L. amazonensis ticas de las vacuolas parasitóforas. Por lo tanto,
se modificó así: un colchón inferior de 60% de
En este estudio se partió de 5x106 macrófagos, sacarosa, más colchones de 1 ml de Percoll
con porcentajes de infección a las 48 horas de (partículas coloidales de sílica cubiertas con
75,5±0,8% para aislar vacuolas parasitóforas (7). polivinilpirrolidona) en concentraciones variables
Este tiempo de infección se eligió por el volumen en una solución (en mM) de 145 de NaCl, 5 de
de la vacuola parasitófora y el comportamiento KCl y 10 de HEPES. Este gradiente se centrifugó
durante la purificación. Tiempos menores de a 3.500g por 25 minutos a 4°C (7).
infección mostraban vacuolas parasitóforas de
menor tamaño pero mayor variabilidad lo que Las fracciones recolectadas se visualizaron por
dificultaba la separación en una fracción y, luego microscopía de luz y aquéllas en las que se
de las 72 horas después de la infección, los ubicaron vacuolas que contenían parásitos, se
compartimientos aislados eran muy frágiles. lavaron en una solución (en mM) 145 NaCl, 5 KCl,
10 HEPES y 2 MgCl2, pH 7,34 (KOH 1N)-310
Para el aislamiento se siguió un procedimiento mOsm y se concentraron por centrifugación a
modificado a partir del descrito por Chakraborty 2.000g por 10 minutos. El sedimento con 0,5-1x103
et al. (8). En éste se combina un choque osmótico compartimientos aislados se resuspendió
en una solución hipotónica con ruptura mecánica suavemente en diferentes soluciones dependiendo
de la membrana plasmática del macrófago. Una del experimento que se iba a realizar.
vez que se lisan las células, el homogenizado se
separa en gradientes de densidad (8). Microscopía de los compartimentos aislados
A las 48 horas después de la infección, se Para determinar la naturaleza del compartimiento
removieron mecánicamente las células infectadas aislado se realizaron inicialmente observaciones
con L. amazonensis de la caja de cultivo en 2,5 morfológicas con microscopía de luz siguiendo
ml de medio de lisis, compuesto por 20mM los criterios descritos por Lang para vacuolas
HEPES, 0,5mM EGTA, 0,25M sacarosa, 0,1% parasitóforas de Leishmania (9): espacio
gelatina (Sigma G-9382), pH 7, más una mezcla delimitado por una membrana, con un diámetro
de inhibidores de proteasas, así: ácido entre 10 y 20 µm, con parásitos en su interior,
etilendiamino tetraacético, sal de sodio (EDTA) generalmente, polarizados hacia la membrana del
0,5mM; etilen glicol bis(2-aminoetiléter)-N,N,N´,N´- compartimiento.
ácido tetracético (EGTA) 0,5mM, trans- Una aproximación al pH de los compartimentos y
epoxisuccinil-L-leucilamido-(4-guanidino)-butano la detección de ácidos nucleicos parasitarios en
(E-64) 2 µM, N-α-p-tosil-L-lisina clorometilcetona su interior se hizo mediante la sonda
HCl (TLCK) 0,2µM, leupeptina 0,1mM y pepstatin metacromática naranja de acridina en
0,1µM. concentraciones entre 4 y 8 µM incubando los
Una vez en el medio de lisis, las células infectadas compartimentos aislados en los diferentes
fueron sometidas a ruptura mecánica por medio gradientes, durante 15 minutos en la oscuridad.

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Simultáneamente, se incubaron células infectadas 5 minutos. La fluorescencia se evidenció usando

en las mismas condiciones. La marcación de los un juego de filtros de 480 nm/520 nm; se realizaron
compartimentos vesiculares purificados en cada observaciones a los 5, 10, 30 y 60 minutos
uno de los gradientes se visualizó en microscopio después de la carga.
de fluorescencia con un juego de filtros 480 nm/
Carga de sondas fluorescentes
520 nm.
en vacuolas parasitóforas aisladas
Actividad enzimática en los compartimentos
Las vacuolas parasitóforas aisladas en una
aislados
solución (en mM) de 140 K glutamato, 2 KCl, 5
La actividad de β-glucoronidasa, enzima EGTA-K, 0,5 CaCl2, 4 MgCl2, 10 HEPES-K, 3 ATP-
lisosómica, se determinó mediante la incubación Na2, 0,5 GTP-Na (pH 7,34, 300mOsm), para
de los productos aislados de los diferentes mantener condiciones iónicas similares a las del
gradientes, en 0,1M de acetato de sodio, pH 4,4 citoplasma, se cargaron con naranja de acridina
y 0,25% Tritón X-100, y usando como sustrato para verificar el pH, y con amarillo lucifer para
1mM de 4-metillimbreliferil-2-acetamido-2-deoxi-β- verificar su viabilidad (3). Así mismo, se cargaron
D-glucopitanósido. La reacción se determinó por con calceína (25µM), se incubaron con la sonda
espectrofotometría a 448 nm. durante 5 minutos a 35°C y 5% CO2, y se lavaron
Carga de sondas fluorescentes dentro del una vez.
citoplasma de células J774.1 Calceína sal de potasio (622,5 da). Las células
Se expusieron células J744.A1 (control, expuestas se inyectaron con 25µM de esta sonda disuelta
a partículas de látex o infectadas) adheridas a en una solución cuya composición era (en mM)
laminillas de vidrio por 24 horas a dos sondas de 145 NaCl, 5 KCL, 1 CaCl2, 2 MgCl2, 10 HEPES-
aniónicas fluorescentes de diferente tamaño como Na, 5 glucosa, pH 7,2, 300 mOsm, mediante
se describe a continuación. Antes de las micropipetas hechas de capilares de hematocrito
observaciones, bajo microscopía de luz en un no heparinizados (Fisher Scientific No. 02-668-6)
microscopio invertido Zeiss IM-35, las células se cuyas resistencias variaron entre 3-5MΩ y usando
lavaron tres veces con medio RPMI. La adquisición la configuración de célula entera de la técnica de
de imágenes se llevó a cabo con una videocámara electrofisiología patch clamp (10). En otras
CCD modelo IC-100 acoplada al microscopio y palabras, antes de perforar la membrana de la
con el programa AIW 2.2. También se tomaron vacuola parasitófora se obtuvo un sello de alta
fotografías con cámara fotográfica Canon EOS resistencia entre la membrana de la vacuola
3000 QD. parasitófora y la micropipeta de vidrio. Una vez
alcanzada una resistencia superior a 1GΩ, se
Amarillo lucifer (521 da). Las células se expusieron aplicó presión negativa sobre la membrana hasta
a esta sonda, la cual absorbe a 427 nm y emite a lograr la ruptura controlada de ésta, al tiempo que
535 nm (Sigma), a una concentración de 0,5 mg/ se obtenía registro visual en fluorescencia con la
ml, más ATP 5mM y ácido plurónico 5µM en RPMI, cámara digital y el programa Axon Imaging Work-
durante 5 minutos. La marcación fluorescente se bench 2.2.
detectó usando un juego de filtros de 480 nm/520
nm; se realizaron observaciones a los 5, 10, 30 y Registros electrofisiológicos
60 minutos después de la carga. También se Las técnicas de electrofisiología se usan para la
realizó la carga de amarillo lucifer en las mismas detección de las propiedades eléctricas de la
condiciones y en presencia de 5mM de membrana tales como potenciales de membrana
probenecid, un inhibidor de transportadores ABC. y corrientes iónicas. El montaje para el registro
Calceína/AM (995 da). Las células se expusieron de estas propiedades constó de un amplificador
a esta sonda, la cual absorbe a 494 nm y emite a Axopatch 1-C (Axon Instruments, Foster City, CA).
517 nm (Molecular probes, Eugene, Oregon), a Los pulsos de voltaje generados y las corrientes
una concentración de 25-40µM en RPMI durante obtenidas, se digitalizaron con una interfase

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análogo-digital, Digidata 1200 (Axon Instruments, Las micropipetas de registro se hicieron con
Foster City, CA). Las señales se filtraron y capilares de borosilicato cuyas resistencias
almacenaron en una computadora compatible con variaron entre 3 y 5 MΩ en una solución (en mM)
IBM. de 145 NaCl, 5 KCl, 1 CaCl2, 10 HEPES, 15
EGTA, tratando de conseguir condiciones electro-
Para la generación de los potenciales y la
químicamente simétricas y potenciales de
obtención de los registros, se utilizó el paquete
reversión cercanos a 0 para los iones más
de programa electrofisiológico Pclamp6. Utilizando
importantes. Los registros se analizaron con el
la configuración de vacuola adherida similar a la
programa Pclamp6 ( Axon Instruments ) y se
de célula adherida de la técnica de patch clamp
graficaron con el programa Origin 7SR (OriginLag
(10), se hicieron registros en vacuolas
Corporation, Northampton, MA, USA).
parasitóforas aisladas suspendidas en una
solución (en mM) de 145 NaCl, 5 KCl, 1 CaCl2, 10 Resultados
HEPES. En esta configuración se acerca la punta
Permeabilidad de la vacuola parasitófora a
de una micropipeta de vidrio a la membrana de la
los protones
vacuola parasitófora y ejerciendo presión negativa
se genera un sello de alta resistencia (>1GΩ). De La estructura de la sonda naranja de acridina hace
esta manera, se pueden registrar los canales que esta pueda pasar fácilmente a través de las
iónicos presentes en la porción de membrana que membranas. Por lo tanto, permea la membrana
queda en la luz de la micropipeta. del macrófago y al entrar en el núcleo se intercala

Figura 1. Permeabilidad a protones medida por distribución de la sonda fluorescente naranja de acridina. Células J774.A1
control, luego de fagocitosis de partículas de látex, infectadas por Leishmania amazonensis, o vacuolas parasitóforas
aisladas, se cargaron con naranja de acridina a una concentración de 4-8 µg/ml y se observaron por microscopía de
fluorescencia. A. Macrófago control, microscopía de luz. B. Macrófago control, después de la carga de la sonda. C.
Macrófagos luego de la fagocitosis de partículas de látex, microscopia de luz. D. Macrófagos luego de la fagocitosis de
partículas de látex, después de la carga de la sonda. E. Macrófagos infectados por L. amazonensis 48 horas después de
la infección, microscopia de luz. F. Macrófagos infectados por L. amazonensis 48 horas después de la infección, después
de la carga de la sonda. G. Vacuola parasitófora aislada, microscopía de luz. H. Vacuola parasitófora después de la carga
de la sonda. Los datos son experimentos representativos de 10.
Barra en A-F: 8 µm; en G-H: 5 µm; vp: vacuola parasitófora; flechas: parásitos. Nótese que la coloración verde es la
marcación de ácidos nucleicos y la roja indica compartimientos con pH ácido.

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entre los ácidos nucleicos emitiendo una látex o fueron infectados por Leishmania se
fluorescencia verde. Sin embargo, al pasar a pueden identificar por la presencia de partículas
compartimientos ricos en H+ como la vacuola (figura 1C) o vacuolas de gran volumen con
parasitófora, adquiere carga neta positiva, su parásitos de tamaño similar a las partículas de
movilidad disminuye y su espectro de emisión látex en su interior. Las partículas de látex y Leish-
cambia emitiendo en el rango del rojo. Esta mania se ubican en compartimentos, fagosomas
marcación, indirectamente, sugiere la presencia (figura 1D) y vacuolas parasitóforas (figuras 1E-
de mecanismos que median el transporte de 1H), respectivamente, cuyo pH es ácido lo que
protones y generan un gradiente de este ion con se evidencia por la coloración roja obtenida luego
respecto al citoplasma del macrófago. de la marcación con naranja de acridina.
En la figura 1 se observa un macrófago control Permeabilidad mediada por transportadores en
(figura 1A) en donde la coloración verde la membrana de la vacuola parasitófora
corresponde al núcleo y el punteado rojo a Se cargaron células J744.A1 control, expuestas
compartimentos de la vía endocítica cuyo pH es a partículas de látex o infectadas con L.
ácido (figura 1B). Los macrófagos que fagocitaron amazonensis, con las sondas amarillo lucifer y

Figura 2. Permeabilidad de la vacuola parasitófora a través de trasportadores ABC determinada por distribución de la sonda
fluorescente amarillo lucifer. Células J774.A1 control (A-C), vacuolas parasitóforas aisladas (D-F), células infectadas por L.
amazonensis (G-L) o luego de fagocitosis de partículas de látex (M-R), se cargaron con amarillo lucifer a una concentración
de 0,5 mg/ml y se observaron por microscopía de fluorescencia. A. Macrófago control, microscopía de luz. B. Macrófago
control, 5 minutos y C. Macrófago control, 20 minutos después de la carga de la sonda. D. Vacuolas parasitóforas aisladas,
microscopía de luz. E. Vacuolas parasitóforas, 15 minutos después de la carga y F. Vacuolas parasitóforas, 15 minutos
después de la carga de la sonda en presencia de 5µM de probenecid. G. Macrófagos infectados por L. amazonensis, 48
horas después de la infección, microscopía de luz. H. Macrófagos infectados por L. amazonensis, 48 horas después de la
infección, 10 minutos después de la carga de la sonda. I. Macrófagos infectados por L. amazonensis, 48 horas después de
la infección, microscopía de luz. J. Macrófagos infectados por L. amazonensis, 48 horas después de la infección, 30
minutos después de la carga. K. Macrófagos infectados por L. amazonensis, 48 horas después de la infección, microscopía
de luz y L. 30 minutos después de la carga de la sonda en presencia de 5µM de probenecid. M. Macrófago luego de la
fagocitosis de partículas de látex, microscopia de luz. N. Macrófagos luego de fagocitosis de partículas de látex, 10 minutos
después de la carga. O. Macrófago luego de la fagocitosis de partículas de látex, microscopia de luz. P. Macrófago luego
de la fagocitosis de partículas de látex, 30 minutos después de la carga. Q. Macrófago luego de la fagocitosis de partículas
de látex, microscopía de luz. R. Macrófago luego de la fagocitosis de partículas de látex, 30 minutos después de la carga
en presencia de de 5µM de probenecid. Los datos son experimentos representativos de 10 experimentos.
Barra: en D-F, 5 µm y 8 µm para las demás imágenes; vp: vacuola parasitófora; flechas: parásitos.

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CORTÁZAR T.M., HERNÁNDEZ J., ECHEVERRY M.C., CAMACHO M. Biomédica 2006;26(Supl.1):26-37

calceína. Se tuvo en cuenta la distribución de la infectadas, a los 10 minutos después de la carga,

sonda en el citoplasma y, en el caso de el amarillo lucifer se observó en el citoplasma y
macrófagos que fagocitaron látex o fueron en el núcleo, pero fue excluida de la vacuola
infectados, se observó la concentración o parasitófora (figuras 2G, 2H). Después de 30
exclusión de las sondas en la luz del fagosoma o minutos de la carga, la sonda se encontró en las
de la vacuola parasitófora, respectivamente. vacuolas parasitóforas y en pequeñas vesículas
citoplasmáticas pero no en el citoplasma (figuras
La sonda amarillo lucifer no atraviesa la mem-
2I, 2J).
brana celular; por ello fue necesario cargarla
permeabilizando la membrana plasmática del El inhibidor probenecid bloqueó la transferencia
macrófago con ATP (11). En los macrófagos con- de amarillo lucifer a la luz de la vacuola
trol (figura 2A), se observó el amarillo lucifer parasitófora (figuras 2F, 2K, 2L). La distribución
distribuido de manera uniforme por todo el de amarillo lucifer en fagosomas de partículas de
citoplasma a los 5 minutos después de la carga látex fue similar a los controles (figuras 2M-2P).
(figura 2B). Luego, entre los 10 y los 45 minutos La concentración de la sonda en el fagosoma se
después de la carga, la sonda se concentró en puede atribuir a un transportador ABC porque la
compartimientos citoplasmáticos o fue liberada presencia de probenecid, un inhibidor de este
al medio extracelular (figura 2C). grupo de moléculas, evita esta distribución (figuras
2Q, 2R).
La permeabilidad de la vacuola parasitófora de
Leishmania (figuras 2D, 2E, 2F) no presentó Por encontrarse en su forma acetoximetil éster,
diferencias con el patrón observado en los la calceína/AM permea fácilmente las membranas
macrófagos control, aunque fue un proceso celulares interactuando con los lípidos de la
relativamente más lento. En las células membrana. En este estado, la sonda no es

Figura 3. Permeabilidad de la vacuola parasitófora a través de trasportadores ABC determinada por distribución de la sonda
fluorescente calceína. Células J774.A1 control, luego de fagocitosis de partículas de látex, infectadas por L. amazonensis,
o vacuolas parasitóforas aisladas se cargaron con calceína a una concentración de 25µM y se observaron por microscopía
de fluorescencia. A. Macrófago control, microscopía de luz. B. Macrófago control, después de la carga de la sonda. C.
Macrófagos luego de la fagocitosis de partículas de látex, microscopia de luz. D. Macrófagos luego de fagocitosis de
partículas de látex después de la carga de la sonda. E. Macrófagos infectados por L. amazonensis 48 horas después de la
infección, microscopia de luz. F. Macrófagos infectados por L. amazonensis 48 horas postinfección, después de la carga
de la sonda. G. e I. Vacuolas parasitóforas aisladas, microscopía de luz. H. Vacuolas parasitóforas aisladas, después de
la carga de la sonda. J. Vacuolas parasitóforas aisladas, después de la inyección de la sonda con pipeta de vidrio. Los datos
son experimentos representativos de 10 experimentos.
Barra en A-F: 8 µm, en G-H, 5 µm y en I y J 6 µm; vp: vacuola parasitófora; flechas: parásitos

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Biomédica 2006;26(Supl.1):26-37 PERMEABILIDAD DE LA VACUOLA PARASITÓFORA DE LEISHMANIA

Figura 4. Permeabilidad de la VP mediada por corrientes iónicas.

VP aisladas fueron registradas con la técnica de patch-clamp en configuración de VP-adherida. A. Curva de corriente
contra tiempo de un registro obtenido luego de la aplicación de una rampa de voltaje desde 60 hasta -60 mV desde un
potencial de sostenimiento de 0 mV. B. Curva IV de donde se observa potencial de reversión de 1,6 mV. Los datos son
experimentos representativos de 7 VP registradas. El potencial de reversión se relaciona con el potencial de equilibrio de
los iones que pasan a través de la corriente detectada.

fluorescente; una vez ingresa en el citoplasma, separadas, las vacuolas parasitóforas se

los grupos éster son cortados por esterasas y la identificaron por su tamaño, apariencia de la
sonda pasa a su forma fluorescente. Por este membrana y presencia de amastigotes. Se definió
mecanismo la calceína puede ser usada para como vacuolas parasitóforas a toda estructura con
determinar la viabilidad celular. diámetro alrededor de 10 µm y con parásitos en
En los macrófagos control (figura 3A), entre los 5 su interior, adosados a la membrana del
y los 60 minutos después de la carga, la calceína compartimento.
se distribuye por todo el citoplasma de manera Debido a que las vacuolas parasitóforas aisladas
uniforme y no es liberada al medio exterior (figura con esta metodología presentaban morfología
3B). En las células que fagocitaron látex (figura anormal y alteraciones de las propiedades de
3C), la sonda se observó por todo el citoplasma, permeabilidad de su membrana que atribuimos al
pero fue excluida del fagosoma (figura 3D). De la efecto osmolar ejercido por la sacarosa, se
misma manera, en macrófagos infectados (figura sustituyó parte de la sacarosa por un gradiente
3E), las vacuolas parasitóforas excluyeron por discontinuo de Percoll, así: un colchón inferior de
completo la sonda en todos los tiempos después 60% de sacarosa y colchones de 1 ml de Percoll
de la infección (figuras 3F, 3G, 3H), lo cual sugiere que variaron de la siguiente manera: 40-30-15. Las
que no existe ningún mecanismo de transporte vacuolas parasitóforas aisladas se encontraron
de calceína hacia el exterior del macrófago, la en la interfase entre los colchones de 10% y 20%
luz del fagosoma o de la vacuola parasitófora. de Percoll, fracciones en las cuales se acumuló
Permeabilidad de la el 41% (22% y 19%, respectivamente) de la
vacuola parasitófora aislada actividad de β-glucoronidasa. Los datos
reportados a continuación se hicieron en vacuolas
El aislamiento de vacuolas parasitóforas se
parasitóforas aisladas utilizando el gradiente de
llevó a cabo siguiendo el método recomendado
Percoll de 40-20-10%.
por Chakraborty et al. (8) y usado por Schaible et
al. (3), para Leishmania mexicana. La separación La vacuola parasitófora in situ, colorea de rojo
se siguió por microscopía de luz y enriquecimiento con la sonda naranja de acridina lo cual indica la
de la actividad de la enzima β-glucoronidasa, presencia de un pH ácido. Este gradiente de pH
un marcador lisosómico. En las fracciones se mantiene aún después del aislamiento de

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CORTÁZAR T.M., HERNÁNDEZ J., ECHEVERRY M.C., CAMACHO M. Biomédica 2006;26(Supl.1):26-37

vacuolas parasitóforas (figura 1H) lo que sugiere los datos presentados corresponden a vacuolas
que la membrana de la vacuola parasitófora no parasitóforas en configuración de vacuola
presenta alteraciones importantes de permeabilidad parasitófora adherida, en las que se registran las
que lo disipen. En la figura 1H la marcación verde corrientes a través de los canales iónicos
en el cuadrante inferior izquierdo de la vacuola presentes en la zona de la membrana en donde
parasitófora indica la marcación de ácidos se ubica la pipeta de registro, y provenientes de 7
nucleicos y sugiere la presencia de Leishmania. vacuolas parasitóforas.
Como se describió para las vacuola parasitófora
Las vacuolas parasitóforas se estimularon con
in situ, el amarillo lucifer se concentró en la vacuola
rampas de potencial desde 60 hasta -60 mV que
parasitófora (figura 2E) y este proceso fue mediado
se usan para detectar todas las corrientes iónicas
por un transportador ABC ya que la presencia del
presentes. Las corrientes observadas se
inhibidor probenecid evitó el transporte de la sonda
favorecen a diferencias de potencial de 55±1,5
la luz de la vacuola parasitófora (figura 2F). La
mV (figura 4A) en la que se observa una deflexión
presencia del gradiente de protones y el transporte
que corresponde a la apertura y cierre de la
de amarillo lucifer sugiere, además, que las
corriente registrada. El promedio de corriente
vacuolas parasitóforas aisladas son capaces de
cuando se observaron aperturas fue de 2,5±0,3
mantener procesos dependientes de la hidrólisis
pA (n=20) y la conductancia calculada fue de 46±3
de ATP.
pS (n=20). La curva IV que relaciona la corriente
El transporte de la sonda calceína también fue con el voltaje que la activa, muestra que el
restringido por vacuolas parasitóforas aisladas potencial de reversión, potencial al cual la corriente
(figura 3H) y la exclusión no es debida a neta es igual a 0 y que al relacionarse con el
alteraciones en la capacidad de emisión de la potencial de equilibrio para los iones presentes
sonda en un compartimento ácido, ya que es indica cuál es el ión que permea, es cercano a 0
posible visualizarla luego de su inyección directa lo que sugiere poca selectividad (figura 4B).
(figuras 3I, 3J).
Discusión
Detección de corrientes iónicas en
La vacuola parasitófora que contiene a Leishma-
vacuolas parasitóforas aisladas
nia parece satisfacer los requerimientos
Las técnicas electrofisiológicas se usan para la nutricionales del parásito y soporta su crecimiento
caracterización de las propiedades eléctricas de y replicación. Los datos obtenidos durante el
la membrana. El uso de esta técnica en presente estudio sugieren que las vacuolas
membranas de compartimientos intracelulares es parasitóforas de Leishmania amazonensis pueden
escaso. Los estudios aquí reportados se hicieron transportar iones desde el citosol de la célula
sobre grupos de vacuolas parasitóforas hospedera.
provenientes de aislamientos en los que se había
El secuestro de la sonda amarillo lucifer (521 da)
hecho verificación de la presencia del parásito por
en la luz de la vacuola parasitófora de L. mexicana
observación en microscopía y en los que las
se ha atribuido a la presencia de transportadores
marcaciones con naranja de acridina y amarillo
de aniones de la familia de glicoproteínas
lucifer eran satisfactorios.
transportadoras ABC en la membrana de dicho
Usando la técnica de patch clamp (10) en la organelo (2,3) y confirmada en las vacuolas
configuración de vacuola parasitófora adherida y parasitóforas de L. amazonensis en el presente
en soluciones con concentraciones iónicas estudio (figuras 2F, 2L). Representantes de la fa-
simétricas se lograron sellos de alta resistencia milia de transportadores ABC o Pgp son capaces
(>1 GΩ). Estos sellos fueron de difícil obtención de transportar un rango de sustratos heterogéneo.
por las dificultades para inmovilizar las vacuolas Se ha descrito el transporte de carboxifluoresceína
parasitóforas y la fragilidad de este comparti- (376 da) hacia el interior de vacuolas citosólicas y
mento. No se lograron registros en la configuración hacia el medio extracelular en macrófagos
de vacuola parasitófora completa. Por lo tanto, peritoneales de ratón, y atribuido a la presencia

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Biomédica 2006;26(Supl.1):26-37 PERMEABILIDAD DE LA VACUOLA PARASITÓFORA DE LEISHMANIA

de transportadores ABC sensibles a probenecid, pero se ha observado que fura-2 marca otros
incluidos en la membrana celular y vacuolar (12). compartimentos endosómicos (6,19,20).
Este tipo de transportadores expresados en la La vacuola parasitófora de Chlamydia trachomatis
membrana de macrófagos de ratón pueden excluye la calceína (21) y en fibroblastos
secretar antibióticos como penicilina G (546 da) y infectados con Toxoplasma gondii, los péptidos
norfloxacina (320 da) (13,14) y su inhibición y las moléculas de más de 1.900 da no cruzan la
disminuye la producción de IL-12, y la regulación membrana de la vacuola parasitófora (22). Esto
de moléculas MHC II (15). Se encuentran, nos permite especular que los fagosomas de
además, en células tumorales humanas (16) y en partículas de látex y las vacuolas parasitóforas
Leishmania (17), están implicados en el transporte de L. amazonensis no interactúan con algunos
de aniones orgánicos como urato y p-aminohipurato compartimentos endosómicos excluyendo en este
(16) y en el transporte de tioles y metales (17). proceso la expresión de trasportadores aniónicos
como los que concentran fluo y fura-2.
Muchas moléculas sintetizadas por los
macrófagos son empacadas en vesículas y Los estudios presentados en vacuolas
liberadas luego de la fusión de éstas con la mem- parasitóforas aisladas confirman los hallazgos in
brana plasmática. Transportadores como los aquí situ y la evidencia previa (2,3). Sin embargo, este
reportados podrían estar mediando la transferencia es el primer estudio en el que se presenta
de moléculas aniónicas, cuyos pesos moleculares evidencia microscópica de luz de vacuolas
oscilan entre 350 y 600 da, de cuya vía secretora parasitóforas aisladas demostrando algunas de
no se conoce nada. Entre estas moléculas sus propiedades de permeabilidad, aunque Kima
aniónicas se encuentran leucotrienos y y Dunn (23) muestran la ultraestructura de
prostaglandinas que juegan un papel importante vacuolas parasitóforas purificadas usando el
en las respuestas inmune e inflamatoria, glutatión, marcador calnexín. Sugerimos que las
bilirrubina y lactato producido durante la glucólisis modificaciones hechas en el proceso de
(18). Los transportadores de aniones podrían purificación de este compartimento, es decir, el
funcionar como sistema de concentración de reemplazo por un gradiente de Percoll, mejoran el
pequeños productos orgánicos, péptidos y toxinas, aislamiento de las vacuolas parasitóforas.
para ser exportados de la célula vía exocitosis.
Este estudio, además, reporta por primera vez
La exclusión de una molécula del tamaño de la datos electrofisiológicos obtenidos de vacuolas
calceína de fagosomas de partículas de látex y parasitóforas aisladas. Estudios previos con esta
de vacuolas parasitóforas de L. amazonensis se técnica en eritrocitos infectados con Plasmodium
observó por primera vez en el presente estudio. falciparum (24), registran una conductancia a
En el citoplasma, la calceína/AM se convierte en aniones, aunque no queda claro si los registros
un derivado polianiónico de la fluoresceína, el cual se obtuvieron de la membrana del eritrocito o de
emite fluorescencia al perder sus grupos éster por la vacuola parasitófora que contiene Plasmodium.
la acción de esterasas inespecíficas. La pérdida A pesar de esto, existe evidencia que argumenta
de los grupos éster hace que la molécula pierda a favor de cambios en la permeabilidad del
movilidad a través de membranas, quedando eritrocito por modificación de canales iónicos
atrapada en el citosol. Podría ser concentrada en constitutivos de su membrana (25,26) y por
la luz de los fagosomas y vacuolas parasitóforas, expresión de transportadores de origen parasitario
pero los trasportadores presentes (figuras 2J, 2P, (26,27).
3D, 3F) no permiten su paso, probablemente, por
La conductancia calculada a partir de la corriente
el tamaño.
registrada en la membrana de la vacuola
Así mismo, las sondas fluorescentes fluo-3 (781 parasitófora aislada (figura 4) podría ser el
da) y fura-2 (832 y 880 da) no se equilibran entre resultado de la expresión de un transportador ABC,
el citoplasma y la vacuola parasitófora de canales iónicos del retículo endoplasmático del
macrófagos infectados con L. amazonensis (19), macrófago o porinas. La presencia de trans-

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portadores ABC ha sido documentada en Agradecimientos

compartimentos de la vía endocítica de
Agradecemos a las entidades que financiaron este
macrófagos control e infectados y en la membrana
trabajo, al Departamento de Biología de la
de la vacuola parasitófora (2,3) (figuras 2F, 2L,
Facultad de Ciencias de la Universidad Nacional
2R). La evidencia reciente que sugiere que la
de Colombia, sede Bogotá, y al Centro
membrana del retículo endoplasmático (28) es
Internacional de Física de Bogotá, Colombia.
incorporada para la formación de fagosomas, abre
la posibilidad que los canales de calcio Conflicto de intereses
dependientes de ligando y voltaje, presentes en
Los autores de este manuscrito garantizamos que
la membrana de este compartimento (18), puedan
no tenemos conflicto de intereses.
estar asociados con la membrana de la vacuola
parasitófora. Financiación
En cuanto a la presencia de porinas se sabe que Este trabajo fue financiado por: Colciencias,
los protozoarios Trypanosoma cruzi y Entamoeba proyecto: 2228-04-12899, Programa Nacional de
histolytica (29,30), expresan proteínas con Ciencia y Tecnología de la Salud; División de
características similares a estas moléculas. Más Investigaciones, proyecto: 903835, Universidad
aún, los promastigotes de L. amazonensis Nacional de Colombia; Joselín Hernández recibió
contienen una hemolisina capaz de causar lisis apoyo de la DINAIN (División Nacional de
coloidosmótica de eritrocitos, y extractos de este Investigaciones, Universidad Nacional de
parásito que contienen esta actividad reaccionan Colombia), programa apoyo a estudiantes:
con anticuerpos contra perforina y C9 mostrando DI00C352.
que Leishmania también sintetiza porinas. Noronha Referencias
et al. sugieren que esta porina estaría mediando
la salida de Leishmania del macrófago (31). 1. Antoine JC, Prina E, Jouanne C, Bongrand P.
Parasitophorous vacuoles of Leishmania amazonensis-
Nuestros hallazgos electrofisiológicos no nos infected macrophages maintain an acidic pH. Infect
Immun 1990;58:779-87.
permiten determinar el tipo de molécula que gen-
era la corriente registrada y su significado 2. Russell DG, Xu S, Chakraborty P. Intracellular
fisiológico. Sin embargo, la expresión de porinas trafficking and the parasitophorous vacuole of
Leishmania mexicana-infected macrophages. J Cell Sci
puede ser un mecanismo de entrada de iones y 1992;103:1193-210.
nutrientes a través de la membrana de la vacuola
3. Schaible UE, Schlesinger PH, Steinberg TH, Man-
parasitófora como se ha sugerido para otros gel WF, Kobayashi T, Russell DG. Parasitophorous
parásitos (22,24), parte del proceso de salida del vacuoles of Leishmania mexicana acquire
parásito (32) o servir en la exclusión de péptidos macromolecules from the host cell cytosol via two
del parásito limitando así presentación de independent routes. J Cell Sci 1999;112:681-93.
antígeno. 4. Sturgill-Koszycki S, Schlesinger PH, Chakraborty
P, Haddix PL, Collins HL, Fok AK et al . Lack of
Los estudios futuros incluyen la caracterización acidification in Mycobacterium phagosomes produced
electrofisiológica de la corriente descrita en la by exclusion of the vesicular proton-ATPase. Science
membrana de la vacuola parasitófora, la 1994;263:678-81.
determinación de su origen y su función. Los 5. Lipman BJ, Silverstein SC, Steinberg TH. Organic
trabajos de los mecanismos de adquisición de anion transport in macrophage membrane vesicles. J
Biol Chem 1990;265:2142-7.
moléculas por la vacuola parasitófora contribuirán
al entendimiento de la nutrición, la supervivencia 6. Cortázar T. Estudios de permeabilidad del fagosoma
y el desarrollo del parásito en infecciones in vitro que contiene al protozoario Leishmania amazonensis
(trabajo de grado). Bogotá: Universidad Nacional de
e in vivo. Más aún, la investigación del transporte Colombia; 2000.
de fármacos a través de la vacuola parasitófora
7. Hernández J. Permeabilidad de membrana del
que contiene a Leishmania podría ser de gran compartimiento que contiene a Leishmania mexicana
valor, por ser este compartimento un sitio blanco amazonensis en macrófagos J774.1 (trabajo de grado).
para la quimioterapia. Bogotá: Universidad Nacional de Colombia; 2001.

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Biomédica 2006;26(Supl.1):26-37 PERMEABILIDAD DE LA VACUOLA PARASITÓFORA DE LEISHMANIA

8. Chakraborty P, Sturgill-Koszycki S, Russell DG. en macrófagos murinos infectados por Leishmania

Isolation and characterization of pathogen-containing amazonensis (tesis). Bogotá: Universidad Nacional de
phagosomes. Methods Cell Biol 1994;45:261-76. Colombia; 1995.
9. Lang T, Hellio R, Kaye PM, Antoine JC. Leishmania 20. Di Virgilio F, Steinberg TH, Silverstein SC. Inhibition
donovani-infected macrophages: characterization of of Fura-2 sequestration and secretion with organic anion
the parasitophorous vacuole and potential role of this transport blockers. Cell Calcium 1990;11:57-62.
organelle in antigen presentation. J Cell Sci
21. Heinzen RA, Hackstadt T. The Chlamydia trachomatis
1994;107:2137-50.
parasitophorous vacuolar membrane is not passively
10. Hamill OP, Marty A, Neher E, Sakmann B, Sigworth permeable to low-molecular-weight compounds. Infect
FJ. Improved patch-clamp techniques for high-resolu- Immun 1997;65:1088-94.
tion current recording from cells and cell-free mem-
brane patches. Pflugers Arch 1981;391:85-100. 22. Schwab JC, Beckers C, Joiner KA. The
parasitophorous vacuole membrane surrounding
11. Steinberg TH, Newman AS, Swanson JA, intracellular Toxoplasma gondii functions as a molecular
Silberstein SC. ATP4- permeabilizes the plasma mem- sieve. Proc Natl Acad Sci USA 1994;91:509-13.
brane of mouse macrophages to fluorescent dyes. J
Biol Chem 1987;262:8884-8. 23. Kima PE, Dunn W. Exploiting calnexin expression on
phagosomes to isolate Leishmania parasitophorous
12. Steinberg TH, Newman AS, Swanson JA, vacuoles. Microb Pathog 2005;38:139-45.
Silverstein SC. Macrophages possess probenecid-
inhibitable organic anion transporters that remove fluo- 24. Desai SA, Krogstad DJ, McCleskey E. A nutrient-
rescent dyes from the cytoplasmic matrix. J Cell Biol permeable channel on the intraerythrocytic malaria
1987;105:2695-702. parasite. Nature 1993;362:643-6.

13. Cao CX, Silverstein SC, Neu HC, Steinberg TH. 25. Huber SM, Duranton C, Henke G, van De Sand C,
J774 macrophages secrete antibiotics via organic an- Heussler V, Shumilina E et al. Plasmodium induces
ion transporters. J Infect Dis 1992;165:322-8. swelling-activated ClC-2 anion channels in the host
erythrocyte. J Biol Chem 2004;279:41444-52.
14. Cao C, Steinberg TH, Neu HC, Cohen D, Horwitz
SB, Hickman S et al. Probenecid-resistant J774 cell 26. Ginsburg H, Stein WD. How many functional transport
expression of enhanced organic anion transport by a pathways does Plasmodium falciparum induce in the
mechanism distinct from multidrug resistance. Infect membrane of its host erythrocyte? Trends Parasitol
Agents Dis 1993; 2:193-200. 2005;21:118-21.

15. Hasko G, Deitch EA, Nemeth ZH, Kuhel DG, Szabo 27. Staines HM, Powell T, Thomas SL, Ellory JC. Plas-
C. Inhibitors of ATP-binding cassette transporters modium falciparum-induced channels. Int J Parasitol
suppress interleukin-12 p40 production and major 2004;34:665-73.
histocompatibility complex II up-regulation in 28. Gagnon E, Duclos S, Rondeau C, Chevet E,
macrophages. J Pharmacol Exp Ther 2002,301:103-10. Cameron PH, Steele-Mortimer O et al. Endoplasmic
16. Efferth T, Lohrke H, Volm M. Reciprocal correlation reticulum-mediated phagocytosis is a mechanism of
between expression of P-glycoprotein and entry into macrophages. Cell 2002;110:119-31.
accumulation of rhodamine 123 in human tumors. 29. Andrews NW. The acid-active hemolysin of Trypano-
Anticancer Res 1989;9:1633-7. soma cruzi. Exp Parasitol 1990;71:241-4.
17. Légaré D, Richard D, Mukhopadhyay R, Stierhof 30. Leippe M, Muller-Eberhard HJ. The pore-forming
YD, Rosen BP, Haimeur A et al. The Leishmania ATP- peptide of Entamoeba histolytica, the protozoan para-
binding cassette protein PGPA is a intracellular metal- site causing human amoebiasis. Toxicology 1994;87:5-
thiol transporter ATPase. J Biol Chem 2001;276:26301- 18.
7.
31. Noronha FS, Ramalho-Pinto FJ, Horta MF. Identifi-
18. Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, cation of a putative pore-forming hemolysin active at
Walter P. Membrane transport of proteins of small acid pH in Leishmania amazonensis. Braz J Med Biol
molecules and the electrical properties of membranes. Res 1994;27:477-82.
En: Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K,
Walter P, editors. Molecular biology of the cell. Fourth 32. Almeida-Campos FR, Horta MF. Proteolytic activa-
edition. New York: Garland Sience; 2002. p.615-57. tion of leishporin: evidence that Leishmania
amazonensis and Leishmania guyanensis have dis-
19. Montes M. Estudio de conductancias iónicas y tinct inactive forms. Mol Biochem Parasitol 2000;111:363-
determinación de la concentración intracelular de calcio 75.

37