Practica de Laboratorio No.

Análisis Instrumental laboratorio

Integrantes:

 Aguilar Chancusig Cisne Mishell

 Pinargote Ortega Tania Katiuska

Fecha:

Quito, viernes 22 de abril del 2020

Cromatografía en papel y cromatografía en columna

Resumen

En la clase de laboratorio de análisis instrumental se identificó y se realizó virtualmente el

método de cromatografía en papel, comprendiendo la importancia por medio de la
separación de los pigmentos de plantas junto con dos solventes diferentes, para observar la
diferencia del Factor de retención del procedimiento.
Se realizó la práctica de cromatografía en columna donde como objetivo se determinó la
separación de compuestos en mezcla ya que primero deben extraerse para luego purificarse,
esta separación implica la aplicación de principios químicos y técnicas para poder separar
compuestos específicos de mezclas ya que estas pueden ser homogéneas y heterogéneas
dependiendo del disolvente y de los solutos. Se realizó la separación realizando la
simulación de la práctica separando dos tipos de colores verde ya que la clorofila posee ese
pigmento y morado ya que el compuesto químico donde absorbe la radiación visible esta
entre 380 nm (Violeta) en el cual se considera un pigmento.  utilizando la acetona tomando
dos muestras y separándola utilizando el simulador realizando la práctica virtualmente.
 
Introducción

La cromatografía en papel

La cromatografía en papel es un proceso muy utilizado en los laboratorios para realizar

análisis cualitativos ya que pese a no ser una técnica potente no requiere de ningún tipo de
equipamiento.[ CITATION Uni07 \l 3082 ]

La cromatografía en papel es una técnica simple que tiene buena capacidad de resolución y
se aplica en la separación e identificación de compuestos muy polares o polifuncionales
como ácidos orgánicos, antibióticos hidrosolubles, hidratos de carbono, aminoácidos y
pigmentos vegetales, entre otros, se clasifica como cromatografía líquido-líquido por
partición, la separación de los componentes de una muestra, en la cromatografía
líquido/líquido en papel, se relaciona con las diferentes solubilidades relativas de estos,
entre las fases móvil y estacionaria.

Los componentes menos solubles en la fase estacionaria tienen una migración más rápida a
lo largo del papel, mientras que los más solubles en la fase estacionaria serán
selectivamente retenidos, teniendo una migración más lenta.[ CITATION Adr19 \l 3082 ]

Coeficiente de retención (Rf)

Este coeficiente, es una constante para cada sustancia siempre que la determinación se
realice en las mismas condiciones operativas en cuanto a tipo de papel, temperatura, tiempo
de corrida, solventes usados, volumen y concentración de las sustancias aplicadas.

En la práctica la distancia recorrida por una sustancia, en un tiempo determinado, se mide

desde el punto de aplicación de esta hasta el centro de la mancha producida por ella, luego
de su revelado; la distancia recorrida por el frente del solvente se mide desde la línea de
partida hasta la mayor distancia hasta la cual se observe húmedo el papel. Los Rf de las
diversas sustancias toman valores entre 0 y 1; se encuentran tabulados en la bibliografía
específica y pueden ser usados, como se mencionó anteriormente, para la identificación de
los componentes de una muestra, en tanto se trate de sistemas cromatográficos idénticos.

Fuente de la imagen: Amrita Vishwa Vidyapeetham & CDAC Mumbai.

La cromatografía en columna
Es quizás el método más general, utilizado para la separación, a la vez que, para la
purificación, de diferentes compuestos orgánicos que se encuentren en estado sólido o
líquido.

En este tipo de cromatografía, la fase estacionaria utilizada, es decir, el absorbente, se

coloca en el interior de una columna de vidrio, la cual finaliza con una llave para controlar
el paso de sustancias al exterior de la columna. La fase estacionaria se impregna con el
eluyente o fase móvil. Seguidamente la mezcla orgánica que nos interesa separar la
depositamos por la parte superior de la fase estacionaria, y así la fase móvil podrá ir
atravesando el sistema.

Los compuestos que se encuentran disueltos en la fase móvil, poco a poco saldrán de la
columna cromatográfica, y se recogen en fracciones. Las fracciones menos polares, que son
por lo general las que se retienen poco o nada en el absorbente, serán las primeras en salir
de la columna. En cambio, las sustancias más polares, quedan retenidas por más tiempo en
el absorbente, y a menudo es necesario el uso de diferentes disolventes con la finalidad de
incrementar su polaridad para que sean arrastradas por estos. El tiempo que se necesita para
hacer fluir un compuesto por la columna, se conoce con el nombre de tiempo de retención.
Este tiempo varía, siendo característico de cada compuesto en unas condiciones
cromatografías determinadas, que varían según el absorbente usado, el disolvente, la
presión, el diámetro que tenga la columna utilizada, etc. El absorbente mayormente
utilizado para las cromatografías en columna, es el gel de sílice.[ CITATION Men11 \l
12298 ]
Objetivos

 Separar y estudiar los pigmentos vegetales mediante cromatografía en papel.

 Determinar la cromatografía en columna y aplicarla para la separación de
compuestos en mezcla.

Metodología

Cromatografía en papel
Materiales Reactivos

Cámara cromatográfica Hojas de espinaca

Mortero Solvente Ether acetona

Tijeras Acetona

Lápiz
Capilar

Espátula

Regla

Tiras de papel filtro

Vidrios de reloj

Hilo

Grapadora

La cromatografía en columna

Materiales  Hojas secas de espinaca

 Mortero  Matraz

 Embudo  Espátula

 Columna de vidrio cilíndrica  Algodón

  Soporte  Vaso de precipitación

Reactivos:  Hexano con acetona.

 Sulfato de sodio anhidro   Gel de sílice

Procedimiento:

Cromatografía en papel

Cuando el solvente Tome algunas hojas de

espinaca verde recién Con unas tije
sube
cortadas. las hojas de
aproximadamente 3/4
en trozos pe
de la tira, retire la tira
deja que ca
con cuidado y deje
Podemos observar morte
que se seque.
que, a medida que el
solvente se mueve a
través del papel,
extiende los diferentes
pigmentos de la
mezcla a varias
distancias.

Deje la cámara
cromatográfica intacta
durante algún tiempo.

El punto de carga debe Procedimiento

permanecer
aproximadamente 1
cm por encima del de laboratorio
nivel de solvente.
real
Con un hilo, cuelgue la
tira de papel de filtro
en la cámara
cromatográfica.

Doblar un extremo de
la tira de papel de
filtro y engraparlo.

Coloque un
Tome la cámara
extracto de
cromatográfica y
Permita que la gota se en el medio
vierta solvente de éter
seque y repita hasta con la ayud
acetona en ella.
colocar cuatro o cinco tubo ca
gotas en el papel.
 Puede seleccionar el
tipo de extracto de
hoja utilizando la lista
desplegable Ahora, seleccione el
Para repetir el "Seleccionar el tipo de disolvente
experimento, haga clic extracto de pigmento utilizando la lista
en el botón vegetal". desplegable
"Restablecer". "Seleccionar el
disolvente".

Ahora seleccione la
banda de pigmento
Haga clic en el botón
apropiada de la lista
"Inicio" para
desplegable
comenzar el
"Seleccionar el
experimento.
pigmento
identificado".

Verifique el valor de
Procedimiento Podemos observar
Rf calculado que
coincida con los
valores predefinidos
de simulador que los diferentes
pigmentos se mueve
a través del papel de
filtro a varias
en el gráfico.
distancias.

Seleccione la casilla de
Haga clic en el tubo de
verificación "mostrar
ensayo para medir el
gráfico" que muestra
valor R_f. Aparece una
un gráfico de valores
información sobre
predefinidos de
herramientas para
diferentes pigmentos
de hoja. Seleccione la casilla de Seleccione la casilla de identificar la banda.
verificación "mostrar verificación "mostrar
escala" para medir la escala" para medir la
distancia recorrida por distancia recorrida por
el pigmento y el el pigmento y el
solvente. solvente.

La cromatografía en columna
 Se deben pesar 10 gramos de hojas
secas de espinaca. (Todos los tallos y
venas deben retirarse de las hojas
antes de pesarlas).

Las hojas de espinaca se trituran y se

muelen usando un mortero y una
Filtrar el sulfato de sodio del extracto mano de mortero y se convierten en
crudo usando un embudo. una pasta fina agregando 10 ml
(50:50) de mezcla de hexano con
acetona.

Agregue 2-3 espátulas de sulfato de El filtrado de la pasta bien triturada

sodio anhidro para eliminar los se debe transferir a un matraz cónico
restos de agua que puedan estar a través de un embudo que se tapa
presentes en el extracto crudo. con un pequeño trozo de algodón.

Adsorción del filtrado crudo al gel de sílice

Embalaje de la columna para cromatografía

 Añadir aproximadamente 3 g de gel de
sílice (para cromatografía en columna de
malla 60-120) al extracto crudo.

Vierta 100 ml de hexano en el vaso de

lienta suavemente la mezcla usando un
precipitados y revuelva bien usando una
secador de pelo hasta que el gel de sílice
varilla de vidrio para hacer una
fluya libremente.
suspensión de la sílice.

Tome 25 g de gel de sílice fresco (para

cromatografía en columna de malla 60- Tome una columna de vidrio cilíndrica y
120) en un vaso de precipitados de 250 conecte un pequeño trozo de algodón.
ml.

Monte la columna en el soporte.

 Verter la lechada en la columna.

Transfiera el material bruto

adsorbido a la capa de disolvente
Eliminación de solvente:
sobre el gel de sílice en la columna
empaquetada.

A medida que avanza la elución con Continúe llenando la columna con

acetona, los pigmentos verdes hexano y eluya hasta que el β-
comienzan a moverse hacia abajo de caroteno de color amarillo
la columna. descienda por la columna.

Después de recoger el pigmento

amarillo, llene la columna con
acetona.

[ CITATION AMR20 \l 3082 ]

Resultados

Cromatografía en papel

Práctica de cromatografía en      
papel
    Rf  
Analito Planta Ether cetona Isopropanol
alcohol
Caroteno Espinaca 0,95 0,94
Xantofila Espinaca 0,71 0,89
Clorofila a Espinaca 0,65 0,46
Clorofila b Espinaca 0,45 0,22
Antocianina Espinaca NA NA
Caroteno Maple in 0,95 0,94
spring/summer
Xantofila Maple in 0,71 0,89
spring/summer
Clorofila a Maple in 0,65 0,46
spring/summer
 Clorofila b Maple in 0,45 0,22
spring/summer
Antocianina Maple in NA NA
spring/summer
Caroteno Maple ni 0,94 0,88
autumnal/winter
Xantofila Maple ni NA NA
autumnal/winter
Clorofila a Maple ni NA NA
autumnal/winter
Clorofila b Maple ni NA NA
autumnal/winter
Antocianina Maple ni 0,65 0,6
autumnal/winter
Caroteno Fall foliage 0,92 0,9
Xantofila Fall foliage 0,75 0,83
Clorofila a Fall foliage NA NA
Clorofila b Fall foliage NA NA
Antocianina Fall foliage NA NA

Tabla 1.1 Se observan los valores de RF con los diferentes pigmentos de plantas con los
dos tipos de solvente

Cromatografía en columna

Los pigmentos amarillos y verdes recogidos de la columna se concentran luego eliminando

los solventes usando un evaporador rotativo.

Los pigmentos que quedan en el matraz de fondo redondo después de la evaporación

rotatoria se transfieren a las gafas con una espátula.

Cálculos:
Cromatografía en papel
Los valores de RF fueron calculados en el procedimiento de simulación que se observa en
la Tabla 1.1, por lo tanto no se realizaron cálculos
Cromatografía en columna
No hay cálculos en esta práctica
Discusión de Resultados

Cromatografía en papel
Dependiendo del tipo de pigmento, se determina el tipo de banda por cada color, donde, la
banda superior de pigmentos de color amarillo anaranjado en la separación corresponde al
caroteno. La banda amarillenta que aparece debajo indica las xantofilas. La tercera banda
verde oscuro arriba representa la clorofila a. La banda verde amarillenta más baja es la de
clorofila b.
Para la diferencia de valores del RF según la bibliografía del Manual de laboratorio de
fisiología vegetal, la cromatografía en papel permite a un extracto alcohólico, reconocer la
presencia de los pigmentos amarillentos y verdes, con respecto la solubilidad en solventes
con diferentes contenidos de agua, se tratarán de separar los pigmentos, la molécula intacta
al saponificarla en los solventes éter y alcohol en el caso de la práctica realizada, los dos
grupos carboxilo de la clorofila permite su disolución en agua.[ CITATION Lud64 \l 3082 ]
No todas las moléculas de un mismo soluto fluyen de igual forma en el mismo instante de
tiempo, es decir, no presentan un comportamiento ideal. Este comportamiento no ideal se
debe a tres factores:
1. difusión en remolino
Se debe a los distintos caminos que toman las moléculas del soluto al
atravesar la fase estacionaria. Aquellas partículas de soluto que atraviesen
canales más amplios viajarán más rápido con la fase móvil, y aquellas que
vayan por canales más estrechos viajarán más lentamente.
2. difusión longitudinal.
DIFUSIÓN EN REMOLINO
Se debe a los distintos caminos que toman las moléculas del soluto al
atravesar la fase estacionaria. Aquellas partículas de soluto que atraviesen
canales más amplios viajarán más rápido con la fase móvil, y aquellas que
vayan por canales más estrechos viajarán más lentamente.
3. Resistencia a la transferencia de materia
Se debe a que, al pasar la fase móvil por un canal entre las partículas de la
fase estacionaria, no todas las moléculas del soluto se transfieren a igual
velocidad entre la fase móvil y la fase estacionaria en cada plato teórico
[ CITATION ULP20 \l 3082 ]

Cromatografía en columna
Al realizar la práctica respectiva de la cromatografía de columna se obtuvieron resultados
acerca de la separación y los pigmentes existentes de la muestra donde se obtuvieron
pigmentos verdes y morados separados en distintos matraces ya que el pigmento morado se
da el compuesto químico donde absorbe la radiación visible ya que esta entre 380 nm y se
tiñe de ese color Violeta y el color verde ya que la clorofila presenta ese color.
Conclusiones

Cromatografía en papel
Por medio de la práctica virtual, se logró comprender la importancia de la cromatografía en
papel, en donde se logró separar y estudiar varios pigmentos vegetales mediante dos
solventes diferentes, entendiendo la comparación de los valores de RF que se dieron en la
práctica, pudimos observar cómo los diferentes colorantes vegetales de las plantas y se
separaron, y con ello nos permitió identificar los distintos componentes de cada uno de los
pigmentos vegetales.

Cromatografía en columna
Después de realizar la práctica virtual se concluye que la cromatografía de columna tiende a
separar los distintos componentes de una mezcla, permitiendo identificar y determinar las
cantidades de dichos componentes. Se pudo determinar que las sustancias pueden estar
unidas en un factor que mediante la cromatografía de las reacciones pueden separarse.

PREGUNTAS
Cromatografía en papel
Autoevaluación

1) El valor R_f se calcula como

 R_f del compuesto = (Distancia recorrida por el solvente) / (Distancia recorrida por
el compuesto)
 R_f del compuesto = (Distancia recorrida por solvente) / (Distancia recorrida por
soluto)
 R_f del compuesto = (Distancia recorrida por el compuesto) / (Distancia recorrida
por el solvente)
 R_f de compuesto = (Distancia recorrida por compuesto) / (Distancia recorrida por
soluto)

2) ¿Cuáles son los cuatro pigmentos primarios en las hojas de una planta?

 Clorofila a, clorofila d, xantofilas y carotenoides

 Clorofila a, clorofila d, cloroplasto y carotenoides
 Clorofila a, clorofila c, cloroplasto y carotenoides
 Clorofila a, clorofila b, xantofilas y carotenoides
3) ¿Qué es la cromatografía?

 Una técnica utilizada para separar moléculas en función de las diferencias de

tamaño, forma, masa, carga, solubilidad y propiedades de adsorción.
 Una técnica simple utilizada para separar soluciones de diferente concentración.
 Una técnica simple utilizada para separar el solvente de la solución.
 Una técnica utilizada para separar moléculas en base al color.

4) El término cromatografía se deriva del griego. Croma significa ___________ y

Graphe significa_________.

 Croma = Solución y Graphe = Colores

 Croma = color y Graphe = escritura
 Croma = escritura y Graphe = color
 Croma = pigmentos y Graphe = escritura

5) ¿Cuál es el color de la clorofila a?

 Amarillo
 Verde amarillento
 Verde oscuro
 Naranja
6) ¿Cómo se pueden identificar los diferentes compuestos en una mezcla en
cromatografía de papel?

 Usando el valor Rf.

 Utilizando concentración de solvente.
 Utilizando concentración de soluto.
 Usando longitudes de onda de luz visible.

7) A continuación se detallan los pasos en la preparación de un montaje temporal de

una cáscara manchada de la hoja. i) Moler las hojas de espinaca con el mortero y la
maja. ii) Cuando el solvente se eleve aproximadamente 3/4 del camino hacia arriba,
retire la tira con cuidado y déjela secar. iii) Usando un hilo, cuelgue la tira de papel de
filtro en la cámara cromatográfica que contiene solvente de éter acetona. iv) Coloque
una gota del extracto de pigmento en el medio de la tira de papel de filtro. ¿Cuál de
las siguientes es la secuencia correcta de pasos?

 i, iv, iii, ii
 i, iii, iv, ii
 i, ii, iii, iv
 iv, iii, ii, i

Cromatografía en columna

Autoevaluación (Self Evaluation)

1) El ion metálico presente en la clorofila es:

a) Mn + 2
b) Hg + 2
c) Mg + 2
d) Ninguna de las anteriores

2) ¿Qué compuesto se forma cuando la clorofila pierde su ion metálico?

a) Plastoquinona
b) Feofitina
c) Fotoquinona
d) Filofina

3) El color amarillo pálido de la mantequilla se debe a la presencia del pigmento

_____ no metabolizado que la vaca ha consumido de las plantas verdes.

a) Betacaroteno
b) Clorofila b
c) Clorofila a
d) Melanina

4) ¿Qué grupo de pigmentos incluyen clorofila b, betacaroteno y xantofilas?

a) Pigmentos primarios
b) Pigmentos secundarios
 c) Pigmentos terciarios
d) Pigmentos accesorios

Bibliografía

Corzo, A. (2019). Técnicas de Análisis en Química Orgánica - CROMATOGRAFÍA. Retrieved from

[Link]

Mendez, A. (2011). Cromatografía en columna. La Guía Química. Retrieved from

[Link]

Universidad Nacional Autónoma de México. (2007). Técnicas Cromatográficas. Retrieved from

[Link]

AMRITA. (2020) Isolation of Plant Pigments by Column Chromatography.. Obtenido de

[Link]

ANEXOS
La cromatografía en papel
Procedimiento
Preguntas

La cromatografía en columna

Procedimiento
Preguntas