CROMATOGRAFIA

INTEGRANTES:
NICOL MEZA ESPITIA
ROSMAN RAMOS
ALEXANDRA PEREZ ROBLES

FERNANDO MENDOZA CORVIS

FACULTAD DE INGENIERIA
INGENIERIA DE ALIMENTOS
UNIVERSIDAD DE CORDOBA
SEDE BERASTEGUI
IV- SEMESTRE
2020
 CROMATOGRAFÍA
El origen histórico de la cromatografía
El término cromatografía fue empleado, por primera vez, por el científico
ruso Mijaíl Tsvet. Y lo hizo en el año 1906, pese a que llevaba realizando técnicas
de cromatografía desde 1903.
Tsvet logró separar una mezcla de pigmentos de plantas, o clorofilas, en una
columna de carbonato de calcio. Años más tarde aplicó la cromatografía a un
extracto de yema de huevo en una columna de inulina.
Debido a que Tsvet divulgó sus investigaciones en el idioma ruso, haciendo uso de
una revista de divulgación con poco alcance, no fue hasta los años 30 cuando otros
investigadores tuvieron acceso a sus avances y pudieron retomar el desarrollo de la
cromatografía.
A partir de ese momento, y durante los años siguientes, las técnicas de
cromatografía comenzaron a desarrollarse. Las mejoras de las técnicas ya existentes
y el desarrollo de nuevas técnicas fue continuo:
1931 – Redescubrimiento de la Cromatografía por Kuhn y Lederer.
1941 – Cromatografía de reparto por Martin y Synge.
1944 – Cromatografía de papel por Gordon, Consden y Martin.
1947 – La Comisión de Energía Atómica, de los Estados Unidos, dio a conocer
información sobre el uso de la cromatografía de intercambio iónico para la
separación de productos de fisión nuclear.
1952 – Cromatografía de gas-líquido por Martin y James.
1956 – Cromatografía de capa fina por Stahl.
A partir de 1956 – Gracias a los avances de las nuevas técnicas comienza a
desarrollarse la teoría de la separación cromatográfica.
1959 – Cromatografía de filtración en gel por Porath y Flodin.
1960 – Comienza el desarrollo del HPLC.
1962 – Se utiliza por primera vez la Cromatografía de Fluídos Supercríticos.
Definición Cromatografía
La cromatografía es un método físico de separación para la caracterización de
mezclas complejas cuyo objetivo es separar los distintos componentes, la cual tiene
aplicación en todas las ramas de la ciencia; en el principio de retención selectiva,
cuyo objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla, permitiendo
identificar y determinar las cantidades de dichos componentes. Diferencias sutiles en
el coeficiente de partición de los compuestos dan como resultado una retención
diferencial sobre la fase estacionaria y, por tanto, una separación efectiva en función
de los tiempos de retención de cada componente de la mezcla.

La cromatografía puede cumplir dos funciones básicas que se excluyen mutuamente:

 Separar los componentes de la mezcla, para obtenerlos más puros y que

puedan ser usados posteriormente (etapa final de muchas síntesis).

 Medir la proporción de los componentes de la mezcla (finalidad analítica). En

este caso, las cantidades de material empleadas suelen ser muy pequeñas.
Otras definiciones (en la web): cromatograma, cromatografiar, cromatógrafo, fase
ligada, fase inmovilizada, eluir, efluente, muestra, componentes de la muestra,
soluto, disolvente, zona.
Otros términos: columna, lecho cromatográfico, empaquetamiento.
TIPOS DE CROMATOGRAFÍA
Existen diferentes criterios de clasificación de la cromatografía:
 Por la naturaleza de sus fases:
 Cromatografía líquido - líquido
 Cromatografía gas - líquido
 Cromatografía líquido -. sólido
 Cromatografía gas – sólido
 Atendiendo al proceso químico-físico que va a protagonizar el proceso de
separación: siendo este el criterio más coherente de clasificación:
 Cromatografía de Adsorción (líquido - sólido o cromatografía de fases
normales).
 Cromatografía de Reparto (o líquido - líquido), se basa en las características
de solubilidad relativa de los solutos entre la fase móvil y una fase
 estacionaria de un líquido no polar. La fase líquida se impregna a un soporte
inerte de sílice o, en el caso de cromatografía de fase invertida, se une
químicamente.
 Cromatografía de Intercambio iónico.
 Cromatografía de Exclusión.
 Con base en la naturaleza del soporte en el que se aloja la fase estacionaria:
 Cromatografía plana:
 Cromatografía en papel
 Cromatografía en capa fina (TLC)
 Cromatografía en columna:
 Cromatografía de gases (GC)
 Cromatografía líquida (LC)
 cromatografía líquido - líquido
 cromatografía sólido – líquido
CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA
Todas las cromatografías denominadas en columna se caracterizan por tener una
fase estacionaria que se encuentra dentro de una columna de vidrio de 5 a 30 mm de
diámetro por la que se hace pasar una fase móvil líquida o gaseosa que estará en
permanente movimiento. Según la afinidad de las moléculas por la fase móvil o la
estacionaria, éstas se separarán.
Después de cada cromatografía se puede obtener información del cromatograma
tanto cualitativa (para identificar los distintos compuestos de la mezcla) como
cuantitativa (para poder obtener la cantidad y composición de las sustancias
separadas).
Las fases estacionarias pueden ser de materiales muy distintos, existen derivados de
dextranos (sefadex), derivados de agarosa, poliacrilamida, esferas de vidrio, sílice,
etc.
Existen distintos tipos de cromatografía en columna:
 Cromatografía de intercambio iónico: se basa en la afinidad de los iones en
solución por los sitios de polaridad opuesta que se encuentran en la fase
estacionaria.
 Cromatografía de exclusión: Se basa en la habilidad de materiales de
porosidad controlada para separar los componentes de una mezcla de acuerdo
al tamaño y forma de las moléculas.
 Cromatografía de afinidad: se fundamenta en la especificidad de algunas
macromoléculas biológicas. Éstas se unen específicamente a la fase
estacionaria y para separar dicha macromolécula, bastará con variar el pH una
vez que la columna este limpia y sólo se encuentre de interés.
 Cromatografía de adsorción: se basa principalmente en las diferencias en la
afinidad relativa de los compuestos por el sólido utilizado como fase
estacionaria. Las separaciones obtenidas se determinan casi exclusivamente
por interacciones polares, siendo la fase estacionaria más polar que la fase
móvil.
 Cromatografía de partición: la fase estacionaria es un líquido soportado en un
sólido inerte. Otra vez, la fase móvil puede ser un líquido (cromatografía de
partición líquido-líquido) o un gas (cromatografía de partición gas-líquido,
GLC). La cromatografía en papel es un tipo de cromatografía de partición en
la cual la fase estacionaria es una capa de agua adsorbida en una hoja de
papel. La cromatografía de gases (GC) y de alta resolución (HPLC) son
técnicas de partición ampliamente empleadas.
 Cromatografía de fase reversa: el mecanismo de separación depende de
interacciones hidrofóbicas entre las moléculas de soluto en la fase móvil y el
ligando hidrofóbico inmovilizado en la fase estacionaria. La naturaleza actual
de las interacciones de unión hidrofóbica asume que la interacción de unión
es el resultado de un efecto entrópico favorable. Las condiciones iniciales de
unión de la fase móvil usadas en la cromatografía de fase reversa son acuosas
lo cual indica un grado alto de estructuras de agua organizadas alrededor de
las moléculas de soluto y el ligando inmovilizado. A medida que el soluto se
 une al ligando hidrofóbico inmovilizado disminuye el área hidrofóbica
expuesta hacia el disolvente. Así, el grado de organización de la estructura de
agua disminuye con un favorable aumento de entropía en el sistema.
CROMATOGRAFÍA PLANA
La mayoría de los principios que se aplican para la cromatografía en columna se
aplican también a la cromatografía en superficie plana.
 Cromatografía en capa fina (TLC)
Para la cromatografía en capa fina (TLC), la fase estacionaria es una capa de
partículas de unos milímetros de espesor, fijadas sobre un soporte sólido
generalmente de aluminio, plástico o vidrio. Después de aplicar el analito cerca
de la parte inferior de la placa seca, el disolvente empieza a producir la
separación.
La ventaja principal de la TLC es que se analizan simultáneamente la muestra y
el patrón, mientras que en la cromatografía en columna las muestras se analizan
individualmente. Además, las muestras que son difíciles de separar, se pueden
resolver utilizando dos disolventes diferentes por desarrollo de la placa en
direcciones perpendiculares.
Otra ventaja es que, si los componentes no se pierden en los vapores que rodean
la placa, todos estarán en algún lugar de la misma, mientras que en la
cromatografía en columna algunos componentes no eluyen y se pierden. Y a esto
se suma que la placa de TLC se usa una sola vez, por lo que se pueden utilizar
condiciones severas de separación.
La mancha en una placa de TLC se caracteriza por la distancia que recorre con
relación a la distancia recorrida por la fase móvil. El grado de retención en
cromatografía plana de superficie se expresa como el factor de retardación, o
índice de retención

El “frente” del disolvente es el límite alcanzado por la fase móvil, en éste se

mide la distancia en que se ha desplazado éste. El valor de Rf depende de las
mismas condiciones experimentales que el valor de K de la cromatografía en
columna: la composición de la fase móvil, el tipo de fase estacionaria, la
temperatura y el tipo de compuestos separados.
También se puede definir el coeficiente de distribución, K, en términos de la
concentración del soluto en la fase móvil, Cm, y en la fase estacionaria,

La detección y localización de las manchas en la placa de TLC se hace

observando los cambios en la fluorescencia, o absorción en el U.V., de un
indicador que se incorporó a la fase estacionaria. Toda la placa fluoresce bajo luz
UV cuando no hay solutos presentes. Los lugares en los que reside el soluto
aparecen como manchas oscuras. También podemos observar el color de los
compuestos después de reaccionar con reactivos específicos para grupos o
metales, rociados sobre la placa, como la fluores camina para aminas.
Existen instrumentos para determinar directamente la fluorescencia y/o color de
las manchas en la placa. Los instrumentos deben ser capaces de cuantificar la
medida sobre el área total de la mancha.
Cromatografía en papel
En este caso, el soporte y fase estacionaria es papel. El papel que normalmente se
utiliza es de celulosa. La celulosa es muy polar en el agua y se vuelve
electronegativa. El papel tiene propiedades de intercambio iónico débiles, así
como de adsorción.
La mayoría de las propiedades varían de papel a papel, lo que provoca
variaciones en el Rf. Actualmente existen papeles modificados con resinas
cambiadores de iones, alúmina, etc. El aparato que se usa consta de un soporte
para el papel, un recipiente para el disolvente y una cámara hermética para
desarrollar el cromatograma. La cámara hermética es necesaria para evitar la
evaporación de los disolventes volátiles debido a la gran superficie del papel
expuesta. Antes de sumergir el papel en el disolvente de elución se aplica la
muestra en forma de punto diminuto con cualquier objeto que pueda transferir un
pequeño volumen.
El papel debe estar en equilibrio con los vapores del disolvente antes de empezar
el desarrollo. La cromatografía en papel se ha aplicado con buen éxito a
problemas de química orgánica e inorgánica y de bioquímica.
Cromatografía de exclusión
También se llama de exclusión molecular. Estrictamente, se basa en diferencias de
tamaño, forma o carga entre las moléculas de los distintos componentes de la
muestra, pero lo más habitual es aprovechar las diferencias de forma y tamaño. En
este caso, se la llama también cromatografía de exclusión por tamaño, de filtración
en gel, de permeación en gel o de tamiz molecular.
Las moléculas más pequeñas pueden penetrar en los poros de las partículas que
forman el gel (fase estacionaria, relleno de la columna), por lo que tienen mayor
recorrido y se retarda su avance por la columna. Las moléculas de tamaño superior
al de los poros sólo circulan por el exterior de las partículas (se dice que son
excluidas), por lo que avanzan más rápido y eluyen antes.
CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO
La separación en la cromatografía de intercambio iónico depende la adsorción
reversible de moléculas de soluto cargadas, a una resina con grupos iónicos de carga
opuesta. El mecanismo de separación se basa en un equilibrio de intercambio iónico.
Muchos de los experimentos de intercambio iónico se llevan a cabo en cinco etapas.
La primera etapa es un equilibrio en el cual el intercambiador iónico se encuentra en
las condiciones apropiadas de pH y fuerza iónica, lo que permitirá la unión de las
moléculas de soluto. En este estado inicial, los grupos que se intercambiarán están
asociados con sus respectivos contra-iones (usualmente aniones o cationes simples,
como cloruro o sodio).
En una segunda etapa se encuentra la aplicación de la muestra y su adsorción, en la
cual las moléculas del soluto llevan a cabo el apropiado desplazamiento de carga de
los contra-iones y se unen reversiblemente al gel. Las substancias que no se unen
son eluídas de la cama del intercambiador usando el buffer inicial.
En la tercera etapa, se lleva a cabo la desorción de la muestra cambiando las
condiciones de elusión, al desfavorecer la formación del enlace iónico de las
moléculas de la muestra y la cama del intercambiador. Esto normalmente se logra
aumentando la fuerza iónica del buffer de elusión o cambiando su pH.
En las cuarta y quinta etapas corresponden a la remoción de sustancia no eluídas
bajo las condiciones experimentales previas y regresar al equilibrio de las
condiciones iniciales para la siguiente purificación.
Cromatografía de gases
La cromatografía de gases, según la fuente que consultemos, estará mencionada
como técnica cromatográfica aparte, como técnica cromatográfica dentro de la
cromatografía de reparto o como técnica cromatográfica especial. Sin ir más lejos,
en el cuadro adjuntado más arriba, está mencionada fuera de las cinco técnicas de
cromatografía según los métodos de separación.
La fase móvil de esta técnica, como su propio nombre indica, es un gas. Resulta útil
para la separación de analitos gaseosos o volátiles que no pierden sus características
físico-químicas cuando adquieren su condición gaseosa.
Un cromatógrafo de gases está compuesto por:
Inyector.
Eluyente.
Caudalímetro de burbujas.
Columna cromatográfica.
Detector: Detector de ionización de argón, detector de ionización de llama, detector
de conductividad térmica… etc. Existen hasta 25 detectores diferentes utilizables en
un cromatógrafo de gases.
Dentro de las utilidades de la cromatografía de gases encontramos el análisis de
moléculas orgánicas, ácidos o bases libres, fármacos o ácidos orgánicos en plasma
sanguíneo.
CROMATOGRAFÍA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC)
Fundamentos y principios básicos
El proceso cromatográfico puede ser considerado como: un conjunto de fuerzas que
compiten de manera selectiva por un compuesto (analito o soluto) para, por una
parte, fijarlo al relleno de la columna o fase estacionaria, o llevarlo disuelto en los
líquidos que fluyen a través de la columna o fase móvil. Los distintos tipos de
fuerzas entre fase estacionaria y solutos definen los distintos tipos de cromatografía.
En la cromatografía de reparto se utilizan fases estacionarias polares (sílice,
alúmina, hidroxiapatito) y fases móviles apolares (ciclohexano, isooctano,
tetracloruro de carbono, etc.), aplicándose a la separación de solutos apolares. El
origen de la retención es, por tanto, la interacción de los grupos polares de los
analitos con los grupos polares de la superficie del relleno.
En la de partición la fase estacionaria es líquida, es necesario ligarla o embeberla
sobre partículas inertes (generalmente de sílice) para que permanezca fija en la
columna. Hoy en día los grupos funcionales se fijan mediante enlace químico a
las partículas de relleno, lo que permite a la fase estacionaria resistir las altas
presiones aplicadas en HPLC.
Hay dos posibilidades en la cromatografía de partición: cromatografía en fase
normal (cuando la fase estacionaria es polar, por ejemplo, si contiene grupos
ciano, diol, amino o dimetilamino) y cromatografía en fase inversa (cuando la
fase estacionaria es apolar, por ejemplo, con grupos C8 ó C18). La cromatografía
de partición en fase inversa es la más utilizada de todas las técnicas HPLC, pues
las fases móviles polares permiten separar una amplia variedad de compuestos de
interés bioquímico, farmacológico o químico. En fase inversa la retención está
basada en una atracción primaria entre la fase estacionaria y la región no polar
del analito. El orden de elución es de hidrofílico a hidrofóbico, de polar a no
polar. Para aumentar la retención de un compuesto, es necesario aumentar la
polaridad de la fase móvil. La fase estacionaria más común es C18. Las fases
móviles más comunes son; acetonitrilo, metanol, tetrahidrofurano, etc. con agua
como componente de la fase móvil.
La cromatografía de exclusión molecular separa los solutos en función de su
tamaño molecular. El principal inconveniente es que se trata de un método de
baja resolución. No obstante, es muy útil para la separación de proteínas y otras
moléculas de alto peso molecular. Es importante que no haya interacción entre la
fase estacionaria y la muestra.
Las reglas básicas en HPLC son cuatro:
1. Fase móvil y estacionaria han de ser de polaridad opuesta.
2. Todos los solutos han de ser solubles en la fase móvil (es decir, polaridad
similar).
3. Todo soluto que entra en la columna ha de salir de ella (propagación).
4. Y, a ser posible, con los distintos solutos separados (migración diferencial).
La elución de los componentes de una muestra comprende el lavado de una parte
de la muestra disuelta en la fase móvil a través de una columna de fase
estacionaria por agregado de disolvente fresco. La porción de muestra se
introduce por la parte superior de la columna (tiempo t0), los componentes se
distribuyen por sí mismos entre las dos fases según la naturaleza química de
éstos con respecto a las fases móvil y estacionaria. Adiciones posteriores del
disolvente llevan a las moléculas de soluto hacia abajo en la columna, hasta que
salen de ella en un tiempo determinado (tx).
La velocidad a la cual un soluto migra depende de la fracción de tiempo que ha
necesitado para salir de la columna, tiempo que es detectado por un detector.
Esta velocidad será pequeña para solutos fuertemente retenidos por la fase
estacionaria, y será grande para solutos que tengan mayor afinidad por la fase
móvil.
El detector se coloca en el extremo final de la columna, y la señal se transforma
en una gráfica en función del tiempo denominada cromatograma. El
cromatograma discurre horizontalmente paralelo a la escala de tiempos (línea de
base), zona que informa de las condiciones generales del sistema en ausencia de
solutos. Luego se observa un brusco incremento sobre la línea base, seguido de
un descenso más o menos simétrico que enlaza con la continuación de la misma
(pico cromatográfico).
Idealmente el pico tiene apenas anchura: es estrecho, casi una línea vertical. Pero
muchas veces presenta una anchura apreciable, tomando el aspecto habitual de
una gaussiana. También se presenta una primera banda peculiar ascendente-
descendente (frente del disolvente o frente de inyección), no siempre observable,
y que suele hacerse coincidir con el tiempo muerto del sistema o tiempo
necesario para que un fluido sin retención atraviese físicamente la columna,
tubos, etc. del sistema.
Las moléculas de un mismo soluto, pese a hallarse sometido a las mismas
fuerzas, no eluyen todas al mismo tiempo, sino obedeciendo a un modelo
gaussiano.
Los picos sobre el eje de los tiempos se emplean para identificar tanto cualitativa
(posición en el eje) como cuantitativamente (área bajo los picos) los
componentes de la muestra.
La cromatografía cuantitativa se basa en una comparación de la altura o del
área del pico de un analito con el de uno o más estándares. Ambos parámetros

varían linealmente con la concentración. La cromatografía cualitativa se basa en

la comparación de la posición de los picos (tiempos determinados de retención)
con cromatogramas estándares.
La efectividad de la columna cromatográfica para la separación de solutos
depende de las velocidades relativas a las cuales las especies son eluídas. La
eficiencia máxima para la cromatografía líquida ocurre a muy bajas velocidades
de flujo. Se puede incrementar la eficiencia de la columna si se disminuye el
tamaño de la partícula del empaque de la columna, se reduce la viscosidad de la
fase móvil o se incrementa la temperatura.
En una primera etapa, la cromatografía de líquidos se llevaba a cabo en columnas
de vidrio con diámetros de 1-5 cm y longitudes de 50-500 cm, cuyas partículas
de la fase estacionaria no superaban las 150-200 µm de diámetro a fin de
asegurar unos caudales razonables. Incluso así, los tiempos de separación eran
largos, podían llevar varias horas.
La cromatografía líquida de alta eficacia o HPLC (High Performance
Liquid Chromatography) es el método más sofisticado y moderno de la
cromatografía líquida, que utiliza partículas de fase estacionaria para el interior
de la columna con diámetros muy pequeños para aumentar la eficiencia, en torno
a 3-10 µm. Así, se ha conseguido reducir el tamaño de la columna a 10-30 cm de
largo y 4-10 mm de diámetro en la HPLC, y el tiempo necesario para la
separación.
Aplicaciones
La HPLC permite muy buenas separaciones e identificaciones de sustancias o
grupos de sustancias en un tiempo corto, tanto cualitativa como
cuantitativamente. Como condición, es imprescindible que la muestra sea soluble
en un disolvente, al ser la fase móvil un líquido.
Es especialmente adecuada para compuestos poco volátiles , termolábiles e
iónicos. Algunas aplicaciones incluyen sustancias tan diversas como
aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos, hidrocarburos, carbohidratos,
fármacos, terpenos, plaguicidas, antibióticos, esteroides, especies
organometálicas y una gran variedad de sustancias inorgánicas.
Ejemplos de utilización de HPLC:
- Detección y cuantificación de cafeína y teobromina que son alcaloides muy
importantes en el café, té y el cacao, especialmente por su acción estimulante. El
contenido de estos compuestos se utiliza para evaluar su calidad. (Detección UV)
- Determinación de azúcares. La analítica de carbohidratos no resulta fácil pues
presenta acumulación de grupos funcionales iguales, los grupos hidroxilo, y
además posee gran número de esteroisómeros. Tras una dilución los azúcares se
separan cromatográficamente por medio de HPLC en una fase amínica.
(Detección IR)
- Determinación cuantitativa de polisacáridos como el almidón, las dextrinas, los
dextranos, el glucógeno, la inulina, la celulosa, las hemicelulosas, las pectinas,
así como sustancias mucilaginosas de algas marinas y las gomas vegetales.
- Detección de ciclomato en jugos de fruta.
 - Separación de ésteres de ácidos grasos por fase inversa y con argentización de
columnas (Silicato de Al con Ag).
- Separación de Triglicéridos por la longitud de la cadena y el grado de
insaturación por fase inversa y detector de dispersión luminosa, para el estudio
de aceites y grasas adulteradas.
- Determinación del contenido de Vit A y sus precursores (y β caroteno) en
margarina y aceites de hígado por fase inversa.
- Determinación del contenido en Vit D en leche en polvo y cereales por fase
normal.
técnicas y un pequeño resumen (esto en el mejor de los casos), dichas técnicas no
serán tratadas en esta entrada.