DUPLICACIÓN DEL ADN
CARACTERÍSTICAS DE LA DUPLICACIÓN DEL ADN
Aunque los principios generales de la duplicación o replicación del ADN son sencillos
y pueden considerarse como consecuencia directa de su estructura, el proceso
requiere una maquinaria compleja que contiene una gran cantidad de enzimas y
proteínas que actúan en conjunto.
Fig. 12.9 - La duplicación del ADN se produce previo desenrollamiento de las dos
cadenas de la doble hélice, usando cada una como molde para sintetizar las nuevas
cadenas.
1. MÚLTIPLES PUNTOS DE ORIGEN
Los cromosomas eucariontes tienen una gran cantidad de ADN, el cual se halla
contenido en dos moléculas lineales, una para cada cromátide. Si estas moléculas se
replicasen a partir de un sitio único de origen, la etapa “S” de la Interfase sería
extremadamente larga. Las células eucariontes resuelven este problema disponiendo
de múltiples sitios de origen de la replicación en cada cromosoma. En ellos, el ADN
presenta secuencias especiales de nucleótidos. Además todos los orígenes tienen en
común secuencias conservadas de aproximadamente doce pares de nucleótidos,
llamados ARS (autonomus replication secuence).
Fig. 12.10 - La replicación siempre comienza en los sitios de origen en cada
cromosoma. En ellos el ADN presenta secuencias especiales de nucleótidos
2. DESENROLLAMIENTO DE LAS CADENAS DE ADN
En cada cromosoma, las dos cadenas del ADN se encuentran arrolladas una a la otra
como los hilos de una soga. Si tratamos de separarlas, la soga debe apretarse más en
las vueltas restantes o girar. Algo similar ocurre en el ADN, cuando las cadenas
complementarias se separan para iniciar la duplicación. En ese momento aumenta la
tensión torsional en el sector no duplicado de la doble hélice.
Fig. 12. 11 - Separación progresiva de las dos cadenas de ADN a nivel de la horquilla
de replicación y su posible consecuencia biológica.
El desenrollamiento es realizado por las enzimas ADN-helicasas, las cuales recorren
la hélice desenrollando las hebras del ADN a medida que avanzan. Una vez
separadas, las cadenas se combinan con las proteínas SSB, llamadas también
proteínas desestabilizadoras, que evitan el autoapareamiento entre las bases
complementarias libremente expuestas.
Fig. 12.12 - Cadenas adelantada y retrasada del ADN durante la replicación. La
helicasa separa a las dos cadenas del ADN y las proteínas SSB evitan
autoapareamientos entre las bases complementarias libremente expuestas en la
cadena atrasada.
A medida que la enzima helicasa abre la doble hélice, dos enzimas
complementarias: la topoisomerasa I y la topoisomerasa II o girasa, van
disminuyendo la tensión torsional acumulada por el superenrollamiento en el sector
no replicado de la doble hélice.
La topoisomerasa I primero corta una de las cadenas del ADN, luego la cadena
cortada gira una vuelta en torno a su propio eje y finalmente vuelve a unir los
extremos cortados.
La topoisomerasa II corta las dos cadenas, las cuales luego de girar una vuelta
alrededor del eje de la doble hélice, restablecen sus uniones.
Ambas enzimas utilizan energía del ATP y se comportan como nucleasas (cortando
las cadenas de ADN) y luego como ligasas (restableciendo las uniones fosfodiéster).
Las topoisomerasas I y II se diferencian no sólo porque la primera corta una de las
cadenas y la segunda corta las dos, sino también porque la topoisomerasa I realiza
desenrollamientos de corto alcance y la girasa abarca una extensión de ADN bastante
mayor.
Fig. 12.12 - Efecto hipotético de la topoisomerasa II para evitar el superenrollamiento que se
produce en el ADN como consecuencia de la separación progresiva de sus cadenas.
3. LA DUPLICACIÓN DEL ADN ES BIDIRECCIONAL
Al abrirse la doble hélice se forma una “burbuja” de replicación, cuyo tamaño
aumenta a medida que avanza la separación de las dos cadenas del ADN, fenómeno
que se produce en ambos extremos de la burbuja en forma simultánea. Se establece
de este modo, en cada uno de los extremos, una estructura en forma de Y, a la que
llamamos horquilla de replicación, cuyos brazos representan a las cadenas ya
separadas de ADN y el tronco la doble hélice en vías de separación. Así cada burbuja
tiene dos horquillas de replicación que a partir de un punto de origen común
avanzan en direcciones opuestas. Las horquillas desaparecen cuando se van
integrando a las burbujas contiguas. Las horquillas que recorren los telómeros
desaparecen cuando se separa el último par de nucleótidos.
El segmento de ADN que se sintetiza a partir de un origen de replicación (con sus dos
horquillas), lo llamamos replicón. De este modo la replicación del ADN termina
cuando se ensamblan los sucesivos replicones. Esto permite que el ADN se sintetice
en un tiempo bastante breve para el ciclo de vida de una célula.
Fig. 12. 14 - Esquema que muestra dos replicones contiguos y los puntos donde se
origina la replicación (flechas). Puede observarse el carácter bidireccional de la
replicación y los sectores donde el ADN se sintetiza en forma continua y discontinua.
4. LA SÍNTESIS DE ADN ES DISCONTINUA
Una de las características de las ADN-polimerasas es que sólo pueden actuar en
dirección 5’ 3’, por agregado de nucleótidos en el extremo 3’ de las cadenas
nuevas. Como vimos, a medida que se separan las cadenas progenitoras en la
horquilla de replicación, una presenta sus nucleótidos en dirección 5’ 3’ y la otra
en dirección 3’ 5’. De manera que la primera al ser copiada debería formar una
cadena hija en sentido 3’ 5’, algo que las polimerasas no pueden hacer.
Las células solucionan esta situación utilizando estrategias distintas en la
construcción de cada una de las nuevas cadenas. La cadena hija que se formó en
dirección 5' 3’ se construye en forma continua mediante el agregado de
nucleótidos en el extremo 3’ a medida que avanza la horquilla de replicación. En
cambio la otra cadena hija es sintetizada de manera discontinua, en pequeños
tramos, llamados fragmentos de Okazaki, los cuales se unen entre sí a medida que se
sintetizan, por acción de la enzima ADN-ligasa.
Por lo expuesto, podemos decir que la síntesis del ADN es un proceso bidireccional,
no sólo porque se produce en dos direcciones divergentes a partir de una misma
burbuja de replicación, sino también porque las cadenas de la doble hélice son
sintetizadas en direcciones opuestas.
Fig. 12. 15 - Replicación semiconservativa del ADN.
5. MODELO SEMICONSERVATIVO
Como las nuevas hélices de ADN están formadas por una cadena original
(preexistente) que sirvió de molde y una cadena nueva (recién sintetizada) decimos
que el mecanismo de replicación es semiconservativo.
INICIO DE LA SÍNTESIS DE ADN
Para iniciar la síntesis de las cadenas complementarias se requiere además del ADN
molde un cebador o primer, que consiste en una pequeña cadena de ARN de unos
diez nucleótidos de largo. La síntesis del cebador es catalizada por una enzima
llamada ARN-primasa y el cebador queda unido al ADN temporariamente.
Una vezsintetizado el cebador la síntesis continúa si la ADN-polimerasa tiene
disponibles suficientes desoxirribonucleótidos trifosfatados (dATP, dGTP, dCCP y
dTTP). Éstos se agregan en la cadena nueva de acuerdo a la secuencia de nucleótidos
de la cadena que sirve de molde.
Gran parte de la energía requerida durante la replicación la aportan los
desoxirribonucleótidos trifosfatados, que hidrolizan los últimos dos grupos fosfato
(liberando energía) cuando se unen entre sí.
Iniciada la síntesis de ADN a partir del cebador, la ADN-polimerasa a (alfa) es
reemplazado por la ADN-polimerasa e (epsilon), enzima de alta procesividad (más
rápida), que elonga la hebra continua, mientras que la ADN-polimerasa d (delta) se
encarga de elongar los fragmentos de Okazaki de la hebra discontínua.
Las ADN-polimerasa e (epsilon) y d (delta) catalizan la síntesis de las cadenas nuevas
agregando nucleótidos en el extremo 3’ de las hebras en formación. Mientras tanto
los cebadores de la cadena rezagada son removidos por la actividad nucleasa
reparadora de la ADN-polimerasa d (delta) y su lugar es reemplazado por un
fragmento de ADN equivalente. Como vimos la cadena continua requiere un solo
cebador que se forma a comienzo de la replicación, en cambio la cadena discontinua
necesita muchos cebadores, uno para cada fragmento de Okazaki. Cabe señalar que
las ADN-polimerasas d (delta) y e (epsilon) son sostenidas por un anillo proteico
llamado PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) mientras realiza el deslizamiento
por la cadena de ADN. Está asociación entre polimerasas y PCNA hace posible el
aumento en la velocidad de síntesis. Al inicio, la síntesis es lenta debido a que el
complejo ADN polimerasa a (alfa)-primasa no se asocia al anillo de PCNA.
Fig. 12.16 - Doble hélice de ADN desenrrollándose. Cada cadena servirá de molde
para la síntesis de cadenas nuevas
Fig. 12.17 - La energía para el proceso de replicación la proveen los mismos
desoxirribonucleótidos trifosfatados, con la hidrólisis de los últimos dos grupos
fosfato-
Fig. 12. 18 - Unión del aro de PCNA a la ADN polimerasa
Los fragmentos de Okazaki alcanzan una longitud de 200 nucleótidos. Una vez
completa la síntesis de un fragmento ambas enzimas se liberan y vuelven juntas
hacia el ángulo de la horquilla de replicación, dejando atrás los 200 nucleótidos del
segmento que acaban de sintetizar y otros tantos del ADN molde que se usará para
copiar el próximo fragmento de Okazaki.
Como ocurre con la polimerasa d en movimiento, la ADN-polimerasa a no se
desprende del ADN debido a que se le asocia un aro de PCNA. Luego el cebador es
hidrolizado por una nucleasa, la que se encarga también de reparar errores (segundo
sistema de reparación) y los huecos son rellenados con desoxirribonucleótidos por
la ADN-polimerasa b (beta). Finalmente los fragmentos de Okazaki son unidos por la
ADN-ligasa.
La discontinuidad de la síntesis hace que la hebra mal orientada crezca más
lentamente que la otra, que lo hace en forma continua, por esta razón se les asignó
el nombre de cadena rezagada y cadena adelantada respectivamente.
Replicación de la heterocromatina
La heterocromatina por estar muy compactada se replica tardíamente durante la fase
“S” del ciclo celular.
Síntesis de histonas
Hemos señalado que el ADN se replica en forma semiconservativa, es decir que las
cadenas de la doble hélice progenitora, al separarse para su replicación, se
comparten por igual en ambos cromosomas hijos. En cambio no se sabe como se
segregan las histonas. Es posible que al cabo de la replicación sean heredadas
totalmente por uno de los cromosomas hijos, en este caso el otro cromosoma hijo
debe procurarse de la totalidad de histonas nuevas.
En su mayor parte las histonas se sintetizan durante la fase “S” de la interfase y se
incorporan al cromosoma apenas es duplicado el ADN
Replicación en Procariontes
Muchas de las características esenciales de la duplicación del ADN son universales,
aunque existen algunas diferencias entre procariontes y eucariontes debido a que su
material genético está organizado de manera distinta.
En las bacterias casi todo el ADN se encuentra formando una cadena circular, en
cambio en los eucariontes cada cromosoma no duplicado contiene una cadena lineal
asociada a una gran cantidad de proteínas y algo de ARN.
En procariontes al existir un único punto de origen se forma sólo un ojal de
replicación. Aquí actúan tres ADN-polimerasas:
ADN-polimerasa I, es la que elimina el cebador y reemplaza los ribonucleótidos de
éste por desoxirribonucleótidos, rellenando los huecos dejados por la ADN-polimerasa
II. Adiciona 10 nucleótidos/seg.
ADN-polimerasa II, tiene actividad de nucleasa, es decir que retira nucleótidos de la
cadena de ADN en los sitios donde se produjeron errores o desemparejamientos.
ADN-polimerasa III, es la enzima responsable de alargar las cadenas en el proceso de
replicación. Adiciona 500 nucleótidos/seg.
Fig. 12.19 - Mecanismo de replicación del ADN en células procariontes
Fig. 12.20 - Mecanismo de replicación en procariotas
Cuadro 12.1 - MÚLTIPLES FUNCIONES DE LAS ADN-POLIMERASA EN E. COLI
· Síntesis de ADN en sentido 5’ 3’
· Exonucleasa en sentido 3’ 5’
Poli. I y Poli. III
· Corrección de errores, removiendo nucleótidos en sentido
5’ 3’
Poli. I · Exonucleasa en sentido 5’ 3’
Cuadro 12.2 - PRINCIPALES ENZIMAS QUE ACTUAN EN LA REPLICACIÓN
Enzimas Reacciones que catalizan
Elimina el cebador, reemplazando los
ADN-polimerasa I (procariontes) ribonucleótidos por desoxirribonucleótidos.
Rellena los huecos del ADN.
ADN-polimerasa II (procariontes) Nucleasa, corrige errores.
Principal enzima de la replicación. Sintetiza
ADN-polimerasa III (procariontes) la cadena nueva a partir del cebador.
Realiza corrección de pruebas.
La primasa del complejo sintetiza un
Complejo ADN-polimerasa a-primasa "primer" de ARN y a partir de dicho
(eucariontes) primer, la polimerasa a del complejo inicia
la síntesis de ADN.
Polimerización de desoxirribonucleótidos de
ADN-polimerasa e (eucariontes)
la cadena adelantada.
Polimerización de desoxirribonucleótidos de
ADN-polimerasa d (eucariontes)
la cadena rezagada.
ADN-polimerasa b, q, l Reparación del ADN.
Duplicación y reparación del ADN
ADN-polimerasa g (eucariontes) mitocondrial.
Rompen los puentes de hidrógeno,
Helicasas
separando las cadenas del ADN.
Primasas Sintetizan el primer o cebador.
Se extienden sobre las hebras del ADN
Proteínas SSB evitando autoapareamientos entre las bases
libremente expuestas
Topoisomerasas I y II Corrigen el superenrollamiento
