ISBN 978-987-688-124-1
Manual de
microbiología
general
UniR o
editora
María Reynoso, Carina Magnoli,
Germán Barros y Mirta Demo
e-bo k
Manual de microbiología general /
María M. Reynoso ... [et.al.]. - 1a ed. - Río Cuarto : UniRío Editora, 2015.
E-Book. - (Pasatextos)
ISBN 978-987-688-124-1
1. Microbiología. 2. Agronomía. I. Reynoso, María M.
CDD 660.62
Fecha de catalogación: 26/05/2015
Manual de Microbiología General
María M. Reynoso, Carina E. Magnoli, Germán G. Barros y Mirta S. Demo.
2015 © María M. Reynoso, Carina E. Magnoli, Germán G. Barros y Mirta S. Demo.
© UniRío editora. Universidad Nacional de Río Cuarto
Ruta Nacional 36 km 601 – (X5804) Río Cuarto – Argentina
Tel.: 54 (358) 467 6309 – Fax.: 54 (358) 468 0280
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Primera edición: Junio de 2015
ISBN 978-987-688-124-1
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Uni. Tres primeras letras de “Universidad”. Uso popular muy nuestro; la Uni.
Universidad del latín “universitas” (personas dedicadas al ocio del saber),
se contextualiza para nosotros en nuestro anclaje territorial y en la concepción de
conocimientos y saberes construidos y compartidos socialmente.
El río. Celeste y Naranja. El agua y la arena de nuestro Río Cuarto
en constante confluencia y devenir.
La gota. El acento y el impacto visual: agua en un movimiento
de vuelo libre de un “nosotros”.
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Secretario Académico: Claudio Asaad
Directora: Elena Berruti
Equipo: José Luis Ammann, Daila Prado, Maximiliano Brito y Daniel Ferniot
Microbiología I (2159) VII
PRESENTACIÓN
La Microbiología, es una ciencia relativamente nueva con respecto a otras ramas de la
Biología. Aunque se pueden encontrar raíces más profundas, la ciencia de la microbiología no
se desarrolló realmente hasta el siglo XIX. El estudio de los microorganismos se inició a partir
de que Antonie van Leewenhoek en 1670 diseñó el microscopio y observó por primera vez a
las bacterias mientras analizaba infusiones de pimienta, y que a partir de los estudios de Luis
Pasteur en 1876, se logró el mayor desarrollo y reconocimiento de los microorganismos como
protagonistas de una gran diversidad de procesos.
Aunque durante mucho tiempo estos organismos causaron graves problemas de
enfermedades en plantas, animales y humanos también es cierto que desde la antigüedad
algunas especies microbianas han sido utilizadas en procesos de producción de alimentos
fermentados como quesos, vino, pan y cerveza, entre otros y actualmente se ha reconocido
su importancia en diversas áreas de investigación básica, en la industria alimentaria,
ambiental y farmacéutica.
El objetivo general de la asignatura Microbiología I es que el estudiante se inicie en el
conocimiento de la biología básica de los microorganismos (beneficiosas y perjudiciales), en
sus características morfológicas, fisiológicas, nutricionales y genéticas, proporcionando un
panorama global de la importancia de los mismos en la vida del hombre y en las
modificaciones que ocurren en la naturaleza en base a sus actividades como saprófitos,
parásitos o simbiontes. Asimismo, se pretende que el estudiante adquiera las habilidades
necesarias para su manipulación en el laboratorio.
El manual está dividido en ocho capítulo, contiene 7 teóricos prácticos, 6 prácticas de
laboratorios y una guía de preguntas teóricas, diseñados para que el estudiante se familiarice
gradualmente con los contenidos de la asignatura. El orden de presentación, corresponde al
programa de la asignatura Microbiología I (código 2159), que forma parte del plan de estudio
de la carrera Microbiología impartida en la Universidad Nacional de Río Cuarto.
Debido a que este manual está dirigido a estudiantes que iniciarán su experiencia en el manejo
de los microorganismos, consideramos de gran importancia incluir al principio del mismo una
serie de recomendaciones relacionadas con las reglas generales del laboratorio y los
principales procedimientos que el estudiante deberá aprender, para que manipule en forma
adecuada a los microorganismos y garantizar tanto su seguridad como la de sus compañeros.
En cada tema, se presentan los contenidos teóricos consultados a partir de una amplia
bibliografía, cuyas citas se sugieren al final de cada uno. Los trabajos teóricos prácticos
incluyen situaciones problemáticas, que el estudiante deberá resolver consultando el material
bibliográfico sugerido u otro que considere apropiado. Las prácticas de laboratorio, contienen
los objetivos, se indican los materiales necesarios y procedimientos a realizarse en forma de
instrucciones numeradas que se complementan con figuras y esquemas. Posteriormente, en
cada práctica se proponen formas de presentación de los resultados en cuadros, para que el
estudiante recopile sus observaciones.
Consideramos que este manual puede ser de gran ayuda para los profesores y estudiantes
en el curso de Microbiología I y otros que se imparten en la UNRC, está elaborado de acuerdo
a la infraestructura de los laboratorios y a la programación de la asignatura, con sesiones de
10 horas por semana, incluyendo teóricos y prácticos.
Microbiología I (2159) VIII
ÍNDICE
CAPÍTULO I.
Normas de bioseguridad para el laboratorio de microbiología 1
Introducción 1
Clasificación de los microorganismos por grupos de riesgo 1
Cámaras de bioseguridad 2
Niveles de bioseguridad de laboratorios 3
Manejo de los desechos infecciosos 4
Recomendaciones para el estudiante 5
Bibliografía 5
Teórico Práctico 1. Seguridad en microbiología 6
CAPÍTULO II.
Fundamentos de microscopía, montaje y coloraciones de muestras 7
Introducción 7
Microscopio óptico o de luz 7
Microscopios electrónicos 10
Preparación de muestras para microscopía óptica 11
Tinciones comúnmente usadas en microbiología 13
Coloración de azul de metileno 13
Coloración de Gram 13
Coloración de Zielhl-Neelsen 14
Coloración de endosporas 15
Coloración de cápsula bacteriana 16
Coloración de flagelos 16
Bibliografía 17
Teórico Práctico 2. Microscopía y Coloraciones 18
Laboratorio 1. Microscopia y Coloraciones 19
CAPÍTULO III.
Esterilización y preparación de medios de cultivo 21
Introducción 21
Esterilización 22
Métodos físicos 23
Métodos mecánicos 28
Métodos químicos 29
Preparación de medios de cultivo 30
Bibliografía 32
Teórico Práctico 3. Esterilización y preparación de medios de cultivo 34
Laboratorio 2. Esterilización y preparación de medios de cultivo 35
CAPITULO IV.
Métodos de siembra y cultivo de microorganismos 39
Introducción 39
Cultivos en medios sólidos 41
Cultivos en medios líquidos 43
Influencia del medio ambiente físico 43
Introducción 43
Temperatura 44
Acidez y alcalinidad (pH) 45
Oxígeno 45
Disponibilidad de agua 47
Radiaciones no Ionizantes 48
Microbiología I (2159) IX
Bibliografía 49
Teórico Práctico 4. Métodos de siembra y cultivo de microorganismos. Influencia 50
del ambiente físico sobre el crecimiento microbiano
Laboratorio 3. Métodos de siembra y cultivo de microorganismos. Influencia del 51
ambiente físico sobre el crecimiento microbiano
CAPÍTULO V.
METODOS DE RECUENTO DE POBLACIONES MICROBIANAS 53
Introducción 53
Estimación del crecimiento microbiano 53
Estimación de la masa celular 53
Determinación del peso húmedo 53
Determinación del peso seco 53
Métodos turbidimétricos 53
Otros métodos 54
Estimación del número de células 54
Recuento total de células al microscopio 54
Método del Número Más Probable (NMP) 55
Recuento de viables en placa 56
Determinación de la proporción células viables/ células totales 58
Recuento sobre filtros de nitrocelulosa 58
Otros métodos 58
Bibliografía 58
Teórico Práctico 5. Métodos de recuento de poblaciones microbianas 59
Laboratorio 4. Métodos de recuento de poblaciones microbianas 61
CAPÍTULO VI.
INFLUENCIA DEL MEDIO AMBIENTE FÍSICO Y QUÍMICO 63
Introducción 63
Determinación de la potencia de un desinfectante 63
Clasificación de las sustancias químicas de acuerdo a su toxicidad selectiva 64
Criterios considerados para el uso adecuado de desinfectantes y antisépticos 65
Desinfectantes y antisépticos de uso común en la práctica 65
Bibliografía 66
Teórico Práctico 6. Influencia del medio ambiente físico y químico 67
Laboratorio 5. Influencia del medio ambiente físico y químico 69
CAPÍTULO VII.
MÉTODOS DE IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS 72
Introducción 72
Clasificación de los métodos de identificación microbiana 72
Métodos basados en características fenotípicas 73
Métodos basados en criterios morfológicos 73
Métodos basados en tinción diferencial 73
Métodos basados en pruebas bioquímicas 73
Métodos basados en ensayos serológicos 85
Métodos basados en tipificación con fagos 85
Métodos basados en características genotípicas 85
Sondas de ácidos nucleicos 86
Marcadores basados en la técnica de amplificación por reacción en cadena de la 87
polimerasa (PCR)
Bibliografía 89
Teórico Práctico 7. Métodos de identificación de microorganismos 90
Laboratorio 6. Métodos de identificación de microorganismos 91
Microbiología I (2159) X
CAPÍTULO VIII.
PREGUNTAS TEÓRICAS 93
Estructura y función de la célula bacteriana 93
Nutrición microbiana 93
Metabolismo microbiano 94
Crecimiento microbiano 94
Influencia del ambiente físico y capacidad de supervivencia y crecimiento en
condiciones ambientales extremas 95
Influencia del ambiente químico 95
Reproducción viral 96
Genética microbiana 96
Respuesta de los microorganismos al ambiente biótico y abiótico 97
Microbiología I (2159) 1
CAPÍTULO I. NORMAS DE BIOSEGURIDAD PARA EL LABORATORIO
DE MICROBIOLOGÍA
1. Introducción
El trabajo en el laboratorio de Microbiología debe ser considerado de alto riesgo
para todo el personal de laboratorio debido al manejo de muestras
potencialmente contaminadas con patógenos microbianos y de cultivos de microorganismos
obtenidos a partir de dichas muestras. La exposición del personal de laboratorio a este riesgo
debe ser minimizada y controlada mediante un plan de bioseguridad. Los riesgos biológicos
infecciosos más comunes en el laboratorio de microbiología incluyen cultivos de
microorganismos (bacterias, micobacterias, hongos, virus y parásitos) en altas
concentraciones, muestras clínicas de origen humano o animal conteniendo agentes
infecciosos y otros riesgos como toxinas, alergenos, productos recombinantes, etc.
Es importante considerar que existen cuatro elementos necesarios para que se inicie una
infección: un huésped susceptible, un agente infeccioso, la concentración de dicho
agente infeccioso (dosis infectante) y una ruta de transmisión. Esta última es la única
que puede ser controlada por medio de normas de bioseguridad y por lo tanto es indispensable
brindarle especial atención a las rutas más comunes de transmisión: oral, respiratoria,
percutánea y contacto directo con la piel y/o las mucosas.
Toda muestra clínica, fluidos corporales, tejidos y cultivos microbianos, deben ser
considerados como infecciosos para el personal de laboratorio y deben ser manipulados bajo
determinadas medidas de contención, las cuales incluyen adecuadas prácticas
microbiológicas, la utilización de barreras físicas, un adecuado diseño de laboratorio y
cámaras de bioseguridad. El uso de vacunas seguras y eficaces (si están disponibles) puede
proporcionar un mecanismo adicional para la reducción de las infecciones ocupacionales.
El establecimiento de los programas de bioseguridad en el laboratorio de microbiología es
responsabilidad de los administradores del mismo. Sin embargo, es importante tener claro
que no es posible crear un ambiente de laboratorio saludable y seguro sin que cada una de
las personas que trabajan en él no asuma su cuota de responsabilidad hacia la seguridad en
el laboratorio.
2. Clasificación de los microorganismos por grupos de riesgo
El concepto de grupo de riesgo fue desarrollado como una manera de clasificar los diferentes
tipos de microorganismos (bacterias, virus, hongos, parásitos) dependiendo del grado de
virulencia para el ser humano, animales y plantas. Se han definido cuatro grupos de riesgo
de microorganismos, cuyas características se indican a continuación:
Microbiología I (2159) 2
•En este grupo se incluyen microorganismos que durante mucho
tiempo han sido estudiados y/o cultivados bajo diversas
Grupo de circunstancias y se ha demostrado, con base al conocimiento
científico actual, que no representan ningún riesgo para la salud
riesgo 1 humana y para su medio ambiente, aunque algunos de estos
microorganismos podrían representar algún riesgo para niños o
para adultos inmunosupresos. Ejemplo: Bacillus subtilis
•En este grupo se incluyen microorganismos de moderado riesgo
potencial para el personal de laboratorio y que usualmente están
Grupo de asociados con enfermedad en seres humanos. Ejemplos: Vibrio
cholerae, Salmonella spp., Shigella spp., Staphylococcus spp.,
riesgo 2 Haemophilus spp., cepas patógenas de Escherichia coli, Candida
albicans, Cryptococcus neoformans, Aspergillus flavus, Aspergillus
fumigatus.
•En este grupo se incluyen microorganismos altamente infecciosos y
Grupo de que pueden causar graves enfermedades sistémicas en seres
riesgo 3 humanos. Ejemplos: Mycobacterium tuberculosis, todas las
especies de Brucella.
•En este grupo se incluyen microorganismos exóticos, altamente
infecciosos, causantes de enfermedades mortales en el ser humano
Grupo de para los cuales no existe un tratamiento efectivo. Ejemplo: virus
riesgo 4 Ebola, virus Hanta; virus Junín y Mapucho.
3. Cámaras de bioseguridad
Las cámaras de bioseguridad son utilizadas para reducir la contaminación y minimizar la
exposición del personal de laboratorio a los agentes microbianos. Todos aquellos
procedimientos que generen aerosoles o que involucren la manipulación de patógenos
microbianos que puedan causar infección por inhalación deben ser llevados a cabo en cámaras
de bioseguridad. Las cámaras de bioseguridad de clase II son recomendadas para laboratorios
de niveles de bioseguridad 2 y 3. La protección del personal está dada por el movimiento del
aire del cuarto hacia la abertura frontal de la cámara, de manera que la seguridad del personal
estará comprometida si el flujo de aire es distorsionado por otras corrientes de aire en el
laboratorio. Por tal motivo, las cámaras de bioseguridad deben ser colocadas en lugares
distantes de las puertas, pasillos o sitios en el laboratorio donde exista mucha actividad.
Al igual que en otros procedimientos, el personal de laboratorio que use la cámara de
bioseguridad debe ser apropiadamente entrenado. Se debe utilizar guardapolvos de manga
larga y guantes (en el caso que sea necesario) para proteger las manos y los antebrazos de
una posible contaminación. La superficie de trabajo debe ser descontaminada antes de
introducir el material de trabajo. Todos los materiales y el equipo a utilizar deben estar
colocados en su lugar antes de que se inicie el trabajo. En las cámaras de bioseguridad clase
II no se debe colocar absolutamente nada sobre las rejillas de salida del flujo de aire.
La organización de la superficie de trabajo es importante. Los materiales contaminados deben
ser separados de los materiales limpios y/o estériles de manera que los primeros no pasen
sobre los segundos, se debe tomar en todo momento en cuenta la técnica aséptica y el
material contaminado se debe descartar desinfectado y tapado.
Microbiología I (2159) 3
Las cámaras de bioseguridad clase II utilizan un flujo de aire no turbulento denominado flujo
laminar que evita tanto el escape de material infeccioso de la cámara como el ingreso de este
del cuarto hacia el interior de la misma.
La operación y el mantenimiento de las cámaras de bioseguridad clase II deben incluir el dejar
funcionando el sistema de flujo laminar permanentemente, aun cuando no se esté utilizando
la cámara, la aplicación de luz ultravioleta en el interior de la cámara, la desinfección rutinaria
de la superficie de trabajo con desinfectantes apropiados y el cambio anual de los prefiltros
del sistema.
4. Niveles de bioseguridad
Nivel de bioseguridad 1
En el nivel de bioseguridad 1 los microorganismos que pueden ser manipulados están bien
definidos y caracterizados por tener una muy baja o ninguna virulencia para personas adultas
saludables y pertenecen al grupo de riesgo 1. El acceso a este laboratorio debe ser limitado
o restringido y las puertas y ventanas deben permanecer cerradas, el mobiliario debe ser fácil
de lavar y desinfectar y tienen que estar disponibles lavamanos con jabón, desinfectante y
toallas de papel. Todos los desechos generados que implican algún riesgo biológico deben ser
autoclavados o incinerados.
Los procedimientos operativos deben estar incluidos en las guías de bioseguridad en el
laboratorio, deben estar claramente detalladas por escrito y accesibles en todo momento para
el personal de laboratorio. Se debe proporcionar un entrenamiento inicial en prácticas
microbiológicas, en las guías de bioseguridad y en los procedimientos para el control de las
infecciones a cada uno de los nuevos empleados, estudiantes y visitantes.
Nivel de bioseguridad 2
En laboratorios del nivel de bioseguridad 2 es donde se efectúa la mayor parte del trabajo
rutinario del laboratorio de microbiología, incluyendo el manejo de muestras clínicas de
diversa índole y la manipulación de cultivos de microorganismos.
En este laboratorio debe estar disponible un autoclave para esterilizar todos los desechos
infecciosos. Los procedimientos que involucren la generación de aerosoles deben ser
efectuados en una cámara de bioseguridad clase II. Se deben utilizar guantes, anteojos
protectores y barbijos cuando se manipulan muestras clínicas, cultivos microbianos o material
contaminado.
Se debe limitar al máximo el uso de agujas y jeringas y extremar los cuidados para minimizar
el riesgo de una autoinoculación y de generación de aerosoles. Todos los derrames de material
infecciosos y accidentes deben ser inmediatamente reportados al responsable del laboratorio.
El responsable del laboratorio, con el apoyo de los responsables de los diferentes laboratorios
a su cargo, es el responsable directo de establecer y/o aprobar todas las políticas y los
procedimientos para la operación segura del laboratorio.
Nivel de bioseguridad 3
Los microorganismos que deben ser trabajados en el nivel de bioseguridad 3 son altamente
infecciosos, pueden causar graves infecciones sistémicas en seres humanos
inmunocompetentes e incluyen a Mycobacterium tuberculosis, Bacillus anthracis, Coxiella
burnetii y todas las especies de Brucella.
Todas las actividades de laboratorio, incluyendo el manejo de muestras clínicas y de cultivos
microbianos, deben ser realizadas en cámaras de bioseguridad clase II o utilizando
combinaciones de protección personal y contención física. El laboratorio debe estar
