Universidad Privada del Valle
Facultad Tecnología
Ingeniería en Industrias Alimentarias
Campus Tiquipaya
METODO DE LOWRY
1. INTRODUCCION: La determinación cuantitativa de la concentración de proteínas
es una de las pruebas que más frecuentemente deben hacerse en el laboratorio.
Primitivamente, la cantidad de proteínas se evaluaba midiendo la cantidad total de
nitrógeno proteico, y teniendo en cuenta que este elemento representa
aproximadamente el 16% del peso de una proteína. Este era un método largo y
laborioso y con poca sensibilidad. La aparición de métodos calorimétricos ha
permitido solventar estos dos inconvenientes.
2. FUNDAMENTO:
El ensayo de proteínas de Lowry es un ensayo bioquímico para la determinación del
nivel total de proteínas en una disolución. La concentración total de proteínas se
detecta por la diferencia de color con una disolución de muestra, que es medida
utilizando técnicas de colorimetría.
La cuantificación de proteínas de manera precisa es esencial para todos los
experimentos relacionados a proteínas en una multitud de temas de investigación.
Se han desarrollado diferentes métodos para cuantificar proteínas totales, o alguna
en particular en un ensayo dado. Los métodos de cuantificación de proteínas totales
incluyen métodos tradicionales tales como la medición de la absorbancia a 280 nm,
los ensayos de Bradford y ácido bicinconínico, así como métodos alternativos como
el de Lowry o ensayos novedosos desarrollados por los proveedores comerciales.
Los proveedores comerciales típicamente proveen un kit bien diseñado y
conveniente para cada tipo de ensayo. Los métodos para cuantificar proteínas
individuales incluyen el ELISA, el Western blot y, más recientemente, la
espectrometría de masas, entre otros.
El ensayo de Lowry, propuesto por Oliver H. Lowry en 1951, se basa en dos
reacciones químicas. La primera reacción es la reducción de los iones de cobre en
condiciones alcalinas, los cual forma un complejo con los enlaces peptídicos
(reacción de Biuret). La segunda es la reducción del reactivo de Folin-Ciocalteu por
el complejo cobre-enlace peptídico, el cual causa un cambio en el color de la
solución a azulado con una absorción en el rango de 650 a 750 nm. La cantidad de
proteína en la muestra puede ser estimada utilizando una curva de calibración con
una solución de una proteína estándar seleccionada, tal como la ASB.
Ventajas del método de Lowry
Muy sensible. El rango es de 0,1 a 1 mg/mL.
Menos afectado por la turbidez de la muestra.
Más específico que la mayoría de los otros métodos.
Relativamente simple.
Se puede completar en 1 a 1,5 h.
Desventajas del método de Lowry
El color varía con diferentes proteínas (más que el método de Biuret).
El color no es estrictamente proporcional a la concentración de proteínas.
La sacarosa, lípidos, buffers fosfato, monosacáridos y hexoaminas interfieren con la
reacción.
Las altas concentraciones de azúcares reductores, sulfato de amonio y compuestos
con sulfidrilo interfieren con la reacción.
3. PROCEDIMIENTO
Fundamento de la práctica.
El método de Lowry es el más apropiado para concentraciones de proteínas entre
0.01–1.0 mg/mL y se basa en la reacción del Cu+, producido por la oxidación de los
enlaces peptídicos, con el Reactivo de Folin-Ciocalteu (una mezcla de Ácido
fosfotúngstico y ácido fosfomolíbdico en la reacción de Folin–Ciocalteu).
Reactivo de Folin-Ciocalteu: característica de grupos -OH reductores que, junto con
los complejos cuproprotéicos de la reacción del biuret, reducen el reactivo de Folin,
el cual vira a color azul oscuro. El espectro de absorción del reactivo de Folin
reducido presenta un máximo de absorción a 700nm y su intensidad es proporcional
a la de proteínas que existe en la muestra.
PROTOCOLO EXPERIMENTAL
Solución Standard de seroalbumina bovina (1 mg/ml).
Muestra problema, de concentración desconocida.
Reactivo de Lowry, compuesto por tres soluciones que se mezclan en el
momento de su utilización, y que son las siguientes:
A: Carbonato sódico al 2% en NaOH 0.1 M
B: Sulfato cúprico al 1%
C: Tartrato sódico-potásico al 2% En el momento de su uso se mezclan
50ml de A con 0.5 ml de B y 0.5 ml de C.
Reactivo de fenoles de Folin-Ciocalteau. Este reactivo viene preparado comercialmente y
se debe mantener en refrigeración. Para su uso se diluye inmediatamente antes en la
relación de 1 parte de reactivo por 2 de agua destilada.
USO DEL ESPECTROFOTOMETRO
1. Seleccionar la longitud de onda adecuada y comprobar si la fuente de iluminación y el
fototubo corresponden a la misma.
2. Encender el aparato al menos 30 minutos antes de su uso para obtener una perfecta
estabilización de su línea de base.
3. Ajustar el aparato a transmitancia cero: con el receptáculo de muestras vacío y la tapa del
mismo cerrado, girar el botón izquierdo del aparato hasta hacer coincidir la aguja con el
punto cero de la escala de transmitancia.
4. Ajustar el aparato a transmitancia 100%: Se introduce el blanco (en su tubo adecuado) en
el receptáculo de muestras, habiendo cuidado de la limpieza y de la transparencia del tubo.
Se baja la tapa del receptáculo y mediante el botón derecho se lleva la aguja hasta coincidir
con el 100% de transmitancia. A continuación, se saca este tubo y se comprueba que la
aguja se coloca exactamente frente al cero.
5. Medir cada una de las muestras:
(a) medir en la escala de absorbancia, ya que según la ley de Beer-Lambert la
concentración es proporcional a la absorbancia, pero como esta escala es logarítmica, para
valores altos de absorbancia, las mediciones se hacen imprecisas; (b) o bien medir las
transmitancia, cuya escala es lineal, y convertirlas después a absorbancia mediante la
relación.
A=e×b×c
A = log (100/T)
Una vez obtenidas las absorbancias, encontrar la relación entre absorbancia y
concentración de proteínas.
4. APLICACIÓN EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA:
Se utiliza para la determinación de proteínas en los alimentos y de esta manera
formar tablas nutricionales y determinar procedimientos adecuados para aquellos
alimentos con altas diapositivas.
5. BIBLIOGRAFIA
[Link]
[Link]
%C3%8DNAS_INTRODUCCION
[Link]
