PRÁCTICA Nº1

OBSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS Y TÉCNICA DE COLORACIÓN

I. OBJETIVOS:
 Observar las diferentes forma de los microorganismos
 Conocer las técnicas de coloración (Tinciones)
 Aprender como se elabora la tinción de Gram y Ziehl-Neelsen

II. INTRODUCCIÓN
Una de las características más importantes de los microorganismos es su tamaño
minúsculo que los hace imperceptibles a simple vista y aunado a su transparencia, obliga
utilizar (además del microscopio) técnica especiales para observar y estudiar su
morfología y algunas de sus estructuras.
La morfología de los microorganismos puede examinarse de dos formas: Observando
microorganismos vivos sin colorear (en fresco) y observando células muertas teñidas con
colorantes.
El examen en fresco de los microorganismos permite conocer algunas de sus
características (morfología, tamaño, movimiento, etc). Sin embargo, las microorganismos
vivos son casi incoloros y no se pueden visualizar fácilmente al microscopio óptico normal
cuando se encuentran suspendidos en agua, de ahí que se utilicen colorantes para
incrementar su contraste con el entorno que los rodea y de esta forma hacerlos visibles.
Los colorantes son compuestos aromáticos solubles en agua (generalmente en forma de
sales), que contienen un ión orgánico coloreado y otro ión inorgánico.
Pueden dividirse en dos grupos: Ácidos y básicos.
El colorante es ácido si la porción coloreada tiene carga negativa, es decir, si tiene un
anión coloreado, siendo en este caso repelido por estructuras de la célula que presenten
la misma carga, como es el caso de la superficie bacteriana. El colorante se denomina
básico si la porción coloreada es el catión, cargado positivamente y con afinidad por
estructuras de la célula con carga negativa, como es la superficie celular.
Las bacterias toman mejor los colorantes básicos, como son el cristal violeta, el azul de
metil eno y la safranina. La eosina es un colorante de tipo ácido, así como la nigrosina.

1. EXAMEN EN FRESCO
Para la observación de microorganismos sin teñir se pueden utilizar dos tipos de
preparaciones:
Montaje húmedo y montaje en gota pendiente.
 Montaje húmedo: En este caso, se deposita una gota de la muestra tomada con asa
de siembra previamente flameada, en un portaobjetos y colocar sobre la misma un
cubreobjetos presionando suavemente.
 Montaje en gota pendiente: En este segundo caso, depositar una gota de la muestra
en el centro de un cubreobjetos limpio y colocarlo invertido sobre el pocillo de un
portaobjetos excavado, de manera que la gota no se mueva ni tome contacto con los
lados o el fondo de la depresión.
 Utilizar el microscopio con el objetivo de 40 aumentos, disminuyendo la cantidad de luz
incidente sobre la muestra con ayuda del diafragma o bajando el condensador. Un
exceso de luz dificultará la observación de los microorganismos, ya que poseen el
mismo índice de refracción que el medio circundante (el vidrio del portaobjetos y el
líquido en el que se encuentran suspendidos).
Si se utiliza el objetivo de inmersión se debe colocar una gota de aceite de inmersión
sobre el cubreobjetos.
Para reducir la evaporación de la muestra con el calor desprendido por el foco luminoso
y que los microorganismos pierdan su movilidad, debe realizarse la operación
rápidamente o bien sellar losbordes del cubreobjetos con parafina.
2. TINCIÓN DE LOS MICROORGANISMOS
Existen distintos tipos de tinción:
 Tinción simple: Aquella en la que sólo se utiliza un
colorante, que generalmente tiñe a los
microorganismos. Este tipo de tinción se denomina
directa. Si el colorante proporciona una coloración al
fondo, sin alterar el aspecto de las células, que
permanecen sin teñir, la tinción se denomina
negativa.
La tinción simple permite observar morfología
celular, tamaño y agrupación de los
microorganismos.
 Tinción diferencial: Es aquella que emplea
secuencialmente dos colorantes que permiten
distinguir tipos de microorganismos en función de
diferencias en su estructura y composición química.
La tinción de Gram y la ácido-alcohol-resistente,
basadas en las propiedades de la pared celular
bacteriana, son las más utilizadas.
 Tinción estructural: Se utiliza para identificar y
estudiar determinadas estructuras que pueden estar
presentes en los microorganismos. En las tinciones estructurales se colorea únicamente
una parte de la célu la.
Se utilizan este tipo de tinciones para poner en evidencia la presencia de cápsulas,
endosporas, flagelos o inclusiones (almidón, polifosfato, etc.).

3. PREPARACIONES FIJADAS Y COLOREADAS

En la mayoría de los casos, los pasos a seguir son los que se indican a continuación:

 Realizar una extensión con el asa de siembra esterilizada : para ello se toma
una pequeña gota de cada uno de los cultivos y se extiende en un portaobjetos limpio.
Si el cultivo procede de un medio sólido, se coloca una gota de agua en el portaobjetos
y se mezcla con una pequeña porción de la muestra hasta formar una suspensión
homogénea, extendiéndola con el fin de obtener una fina película. Posteriormente, se
deja secar al aire o en la parte alta de la llama del mechero, pero no se debe eliminar el
líquido calentando el portaobjetos a la llama porque pueden distorsionarse las células.

 Fijar la muestra: La fijación tiene como finalidad coagular el protoplasma de las

células y hacer que se adhieran al portaobjetos, siendo el calor el método más utilizado
para la fijación, aunque pueden utilizarse otros agentes, como el alcohol (metanol) u
otros compuestos químicos. La fijación con calor se recomienda cuando se trabaja con
 muestras de un cultivo sólido; en muestras obtenidas de un cultivo líquido es mejor
hacer la fijación con metanol ya que se retienen en el portaobjetos un mayor número de
células. Es necesario que la extensión se haya secado antes de proceder a la fijación,
por ello se debe esperar hasta que el líquido de la misma se evapore. La fijación por
calor se lleva a cabo pasando varias veces la preparación seca a través de la llama de
un mechero, con la extensión hacia arriba. El calor desnaturaliza las proteínas y suele
matar al microorganismo. Es importante no excederse en este proceso, para evitar que
las bacterias se deformen o se rompan, siendo suficiente que el portaobjetos se note
caliente sobre el dorso de la mano, pero no demasiado.

 Realizar la tinción: Para ello es necesario cubrir la preparación con abundante

colorante y dejarlo actuar durante algún tiempo.

 Pasado ese tiempo: Lavar con agua las preparaciones teñidas para eliminar el
exceso de colorante, dejando caer con suavidad el agua sobre un extremo del
portaobjetos, que se mantendrá inclinado durante este proceso. No se debe dirigir el
agua con demasiada fuerza sobre la preparación para no arrastrar la muestra.

 Eliminar el exceso de agua: Del portaobjetos golpeándolo ligeramente con

cuidado por el canto. Permitir que se seque la preparación, bien utilizando un papel
secante, sin frotar o bien dejándola secar al aire, aunque lleva más tiempo.
 Examinar la preparación al microscopio: con el objetivo de inmersión (100x),
colocando, previamente, una gota de aceite de inmersión sobre la preparación.

III. PARTE EXPERIMENTAL:

1. MATERIALES:
 Microscopio
 Láminas portaobjetos
 Cubreobjetos
 Solución fisiológica
 Azul de metileno
 Safranina
 Aceite de inmersión
 Agua destilada
 Cristal violeta
 Alcohol 90º
 Yodo en cristales yoduro de potasio
 Acetona
 Fucsina básica
 Fenol
 Etanol
 Ac. Clorhídrico cc
 Cultivo de microorganismos en medio sólido y líquido

2. PROCEDIMIENTO Y RESULTADOS

 Para el examen en fresco es necesario:……………………………………………………

……………………………………. ……………….; Se flamea el asa de siembra, luego se
toma muestra y se coloca la muestra líquida 1 a 2 gotas en un portaobjetos y luego se
tapa con un cubreobjetos, finalmente se observa en el microscópico con objetivo de 40X

Fla
me ad
o

Portaobjeto Observa
Se observa:………………………………………………………………………………….
................................................................................................................................................
......................................................................................................................................

 Para realizar una tinción simple es necesario:…..…………………………………………

……………………………………. …………………………………………………………..; Se
coloca la muestra en un portaobjetos, se prepara extensiones de los distintos
microorganismos y se dejar secar al aire y proceder a su fijación.
Realizar la tinción cubriendo la preparación con abundante colorante y dejarlo actuar
durante algún tiempo (para la fuchsina fenicada bastan de 15 a 30 segundos, para el
cristal violeta es suficiente de 30 a 45 segundos, para la safranina de 1 a 2 minutos y para
el azul de metileno de 3 a 5 minutos).Luego se lava con agua las preparaciones teñidas y
Examinar la preparación al microscopio con el objetivo de inmersión.

Extensión Fijación Colorante Lavado Secado al aire Observa

Se observa:……………………………………………………………………………….....
................................................................................................................................................
......................................................................................................................................

 Para la preparación de la tinción de Gram el kit consta de:……………………………

…………………………………………………………………………………………………………
…………………………; Se procederá a teñir durante un minuto con la solución cristal
violeta, luego se lava el exceso de colorante con agua y se cubre la extensión con una
solución diluida de yodo (lugol), que actuará como mordiente, durante un minuto. Lavar
con agua el exceso de lugol.y decolorar con etanol de 90%, cubriendo la preparación y
dejando actuar durante 30 segundos luego lavar con agua abundante para eliminar el
resto del disolvente. Posteriormente se colorear con safranina durante un minuto
(coloración de contraste), se lavar con agua y dejar que la preparación se seque luego
examinar las preparaciones al microscopio, con aceite y usando el objetivo de inmersión.
Las bacterias Gram positivas aparecerán coloreadas de violeta, mientras que las Gram
negativas se observan de color rosa.

Se observa:……………………………………………………………………………………
................................................................................................................................................
......................................................................................................................................

 Para la preparación de la tinción de Ziehl Neelsen el kit consta de:……………………

…………………………………………………………………………………………………………
…………………………; Luego de hacer un frotis con la muestra de esputo y fijar la
preparación al calor, se coloca unas gotas de fucsina fenicada, luego se calienta
suavemente hasta que se desprenda vapor sin ebullición (hasta 3 veces), se lava, se
decolora, se vuelve a lavar, se añade el azul de metileno, se deja 1 minuto, se saca el
exceso de este último colorante se seca y finalmente se observa en el microscopio con
aceite y usando el objetivo de inmersión.

Se observa:……………………………………………………………………………………
................................................................................................................................................
......................................................................................................................................

IV. CUESTIONARIO:
 Dibuje la pared célular de las Gram(+) y Gram (-) y mencione que diferencias
existe entre estos dos grupos bacterianos.
 Explique el fundamento de la coloración Gram
 Explique el fundamento de la coloración Ziehl Neelsen
 PRÁCTICA Nº 2
TÉCNICAS DE TINCIONES ESTRUCTURALES
I. OBJETIVOS:
 Observar algunas estructuras como esporas, flagelos, cápsulas y corpúsculos
metacromáticos mediante la elaboración de coloraciones.
 Conocer las técnicas adecuadas para observar estructura bacterianas como :
Método de Wirtz Conklin (esporas), Método de Leifson (flagelos), Método de tinta
china (cápsula) y Método de Loeffer (corpúsculos metacromáticos).

II. INTRODUCCIÓN:
Las tinciones estructurales se utilizan para poner de manifiesto partes específicas de los
microorganismos que carecen del contraste necesario para poderse observar con el
microscopio óptico. Los procedimientos y colorantes utilizados permiten teñir
selectivamente una porción de la célula, como pueden ser endosporas, flagelos, cápsulas,
etc.

1. ESPORAS:
Ciertas especies bacterianas, en particular de los géneros
Bacillus y Clostridium, producen elementos de resistencia
denominados esporas o endoesporas debido a que se
forman dentro de la célula, a razón de una por célula. A
diferencia de la célula vegetativa que la produce, la espora
es muy resistente a condiciones adversas tales como alta
temperatura, baja humedad, radiaciones y agentes
químicos. Es una forma de vida latente que puede
permanecer largos períodos como tal y cuando desaparecen
las condiciones adversas puede germinar. También puede
inducirse esa germinación mediante, por ejemplo, un shock
térmico, es decir un calentamiento a 80ºC.
Las esporas son altamente impermeables a los colorantes, de manera que con las
técnicas de coloración comunes aparecerán como regiones sin teñir dentro de las células
coloreadas. Por lo tanto, para teñir las esporas específicamente, deben usarse métodos
de coloración especiales. Los datos importantes que se obtienen como resultado de esta
coloración son: Presencia o ausencia de esporas, Deformación o no del cuerpo celular y
Posición dentro del cuerpo celular. En base a la posición de la espora dentro de la célula
se las clasifica en: terminales, centrales y subterminales (posición intermedia).

Se fuerza la coloración mediante el calor, el colorante llegará a teñir las esporas. Debido a
la citada impermeabilidad de la pared de las esporas, durante el periodo de decoloración,
se decolorará toda la célula bacteriana excepto las esporas (se necesitan cultivos de al
menos 48 horas, para que el microorganismo haya tenido tiempo suficiente de formarlas).
La tinción más utilizada es de de Wirtz-conklin que es la que se llevara en práctica sin
embargo, existe otra tinción de esporas, el método de Moeller, que utiliza como reactivos:
solución acuosa de ácido crómico, fucsina fenicada de Ziehl-Neelsen, solución acuosa de
clorhidrato de anilina, azul de metileno y alcohol absoluto.

2. FLAGELOS:
Muchas bacterias son móviles y su capacidad para
moverse en forma independiente se debe generalmente
a la presencia de estructuras especiales, los flagelos.
Son apéndices largos, delgados, de forma helicoidal,
libres en un extremo y unidos a la célula por otro. Son
tan delgados que solo se pueden ver al microscopio
común luego de una coloración especial que hace uso
de un mordiente. Este promueve la fijación de las
moléculas de colorante al flagelo dando lugar a la
formación de un precipitado a lo largo del flagelo,
haciéndolo visible.
La célula bacteriana puede tener uno o más flagelos
dispuestos en distinta manera y en base a eso se clasifican en: polar (flagelo en un
extremo del cuerpo celular), anfitrica (flagelos en ambos extremos), lofotrica (penacho de
flagelos en un extremo) y peritrica (flagelos alrededor de toda la célula sin distribución).
Para su observación, se debe partir de cultivos jóvenes, de entre seis y doce horas. Se
prepara una suspensión del germen en agua destilada, mezclando suavemente hasta
obtener una suspensión lechosa. Si se sospecha que el germen es patógeno, se debe
utilizar agua formolada al 5-10%. Se deposita unas gotas de la suspensión en un extremo
del portaobjetos inclinado, de forma que las gotas se extiendan a lo largo del cristal (se
dejará secar al aire sin aplicar calor).
Para su observación existen métodos como el de Rhodes (Se cubre la extensión con el
mordiente de Rhodes durante 3-5 min, lavar cuidadosamente con agua destilada, mejor por
inmersión, cubrir con la solución de nitrato de plata amoniacal, calentándolo hasta casi ebullición y
dejándolo actuar de 3-5 min. Luego lavar con agua destilada y secar (se observa con objetivo de
inmersión, directamente o bajo un cubreobjetos). Los flagelos podrán observarse gracias al
precipitado de nitrato de plata que se deposita en torno suyo.); Tribondeau (Se fija el frotis con
alcohol y se cubre con la mezcla formada por 5 ml del mordiente de Tribondeau y 0,5 ml de cristal
violeta previamente sometida a ebullición. Se deja actuar durante 20 segundos. Se lava
rápidamente con agua, sin volcar previamente el colorante, se seca y se observa al microscopio
con objetivo de inmersión. Los flagelos se verán de color castaño .); y Leifson que se relizará
en práctica.

3. CÁPSULA:
Ciertas bacterias segregan en su superficie materiales gomosos compuestos por
polisacáridos, polipéptidos o complejos glucoproteicos. Cuando este material se dispone
de una manera compacta alrededor de la superficie celular se denomina cápsula. La
mejor forma de observarla es con tinción negativa, aunque existen técnicas especiales,
para la coloración específica de la cápsula.
Para el método de Hiss primero se realiza un frotis espeso de una mezcla de suspensión
bacteriana con solución fisiológica y suero sanguíneo, se seca a temperatura ambiente y
se fija al calor. Luego se Cubre la preparación con solución de cristal violeta al 1% y se
calienta con vapor fluyente durante un minuto. Lavar con solución de sulfato de cobre al
2%, secar y observar al
microscopio con objetivo de inmersión.(Las cápsulas se colorean de azul pálido y las
bacterias de color púrpura). El otro método es de la Tinta china que se realiza en la
práctica.
4. CORPÚSCULOS METACROMÁTICAS:
El número y el tipo de gránulos de almacenamiento
varía con el medio y el estado funcional de las células.
Los gránulos identificados por procedimientos e tinción
adecuados indican la acumulación de reservas de
alimentos, incluyendo polisacáridos, lípidos o
polifosfatos. El glucógeno es el principal material de
almacenamiento de las bacterias entéricas y
constituye el 40% del peso.
Algunas especies de Bacillus y Pseudomonas
acumulan un 30% o más de su peso seco en poli-
beta-hidroxibutirato. Los polímeros de alto peso
molecular como el polihexametafosfato conocidos
como gránulos metacromáticos o volutita se producen
en especies de Corynebacterium, Yersinia pestis y
especies de micobacteria. Estos gránulos de volutita se ven rojo rosáceo cuando se tiñen
con azul de metileno.

Las tinciones pueden realizarse mediante el método de Albert (Se fija el frotis al calor, se
cubre con el colorante de Albert, se deja actuar durante 15 minutos y se lava con agua destilada.
Se cubre la preparación con lugol durante un minuto, lavar con agua, secar a temperatura
ambiente y observar con objetivo de inmersión. Los corpúsculos metacromáticos se tiñen de color
azul oscuro.); el método de Ernst-Neisser (Fijar el frotis al calor, cubrir con azul acético y dejar
actuar durante 10 min, calentando hasta emisión de vapores los primeros minutos se lavar con
agua destilada y cubre con una solución de vesuvina durante un minuto, lavar, secar y observar
con objetivo de inmersión.) finalmente también se puede reconocer mediante el método de
Loeffler que se realizara en la práctica.

III. PARTE EXPERIMENTAL:

1. MATERIALES
 Microscopio
 Láminas portaobjetos
 Fucsina básica
 Alcohol 95º
 Acido Tánico
 Agua destilada
  Cloruro de sodio
 Cristal violeta
 Nigrosina o tinta china
 Safranina
 Verde de malaquita
 Azul de metileno

2. PROCEDIMIENTO Y RESULTADOS

 Para realizar el método de Wirtz-Conklin se utiliza:………..……………………………

…………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………….;Se procede a la extensión,
desecación y Fijación. Luego se dejar enfriar y se da la Coloración ( Cubrir la preparación
con verde malaquita al 5% en solución acuosa, manteniéndola a emisión de vapores
durante 5 min) para seguidamente lavar con abundante agua. La espora sigue teñida de
verde y la célula vegetativa pierde el colorante. El colorante de contraste es Safranina y
dejar actuar durante 1 min se lavar con agua, secar y observar al microscopio.

Se observa:……………………………………………………………………………………..
................................................................................................................................................
......................................................................................................................................

 Para realizar el método de Leifson se utiliza:…….………..……………………………

…………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………….;Se procede a la extensión,
desecación y Fijación. Luego se cubre la preparación con el colorante de Leifson y se deja
actuar durante unos 10 minutos. Se lava con agua, sin volcar el colorante, se seca y se
observa al microscopio con objetivo de inmersión.
Se observa:……………………………………………………………………………………..

 Para realizar el método de la Hiss se utiliza:….……….………..………………

…………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………….

Se observa:…………………………………………………………………………………….
................................................................................................................................................
......................................................................................................................................
 Para realizar el método de Albert se utiliza:……..….……….………..………………
…………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………
Se observa:…………………………………………………………………………………….
................................................................................................................................................
......................................................................................................................................

IV. CUESTIONARIO:
 Mencione 3 microorganismos (pos cada uno) que contengan flagelos, esporas,
cápsula y corpúsculos metacromáticos.
 Conceptualice que son gránulos de reserva
 Escriba 3 tipos de inclusiones y que funciones cumple
 Escriba los fundamento de todos los métodos de tención estructural