ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE ALIMENTOS (POLLO BROASTER)
Alejandro Muñoz Barragán , Bryan Andrés Reina Villamarin , Deysi Lorena Benítez Tupaz,
Stephany Palechor Chicangana, David Alexander Calapsu.
Universidad del Cauca; amunozb@[Link], brandresrein@[Link],
deysiben@[Link], stephanypac@[Link], dacalapsu@[Link]
Resumen--. Esta práctica tiene como finalidad analizar la calidad microbiológica de
alimentos, mediante la caracterización microbiológica de hongos y bacterias a partir de
una muestra de Pollo Broaster procedente de un restaurante ubicado en el barrio la
paz. Esto nos permite identificar la presencia de mesófilos, (mohos y levaduras),
coliformes totales, coliformes fecales y Escherichia coli.
Palabras clave—mohos,levadura,mesófilos,coliformes(totales, fecales y [Link] , equipos,
materiales, características.
nutrientes básicos y es una buena fuente
de vitaminas, particularmente del grupo
Introducción
Análisis microbiológico
B. La glucosa es el carbohidrato
fermentable. El cloranfenicol es el agente
Los análisis microbiológicos consisten en
selectivo que inhibe la flora bacteriana
una inspección de alimentos o
acompañante, lo que resulta en una
sustancias por medio de pruebas que
mejor recuperación de las células
permiten detectar si se presentan o no
fúngicas lesionadas. El agar es el agente
microorganismos patógenos.
solidificante al interior de esta
En la actualidad se utilizan diferentes
metodología.
medios de cultivos sintéticos los cuales
le aportan nutrientes a los PCA
microorganismos con el fin promover su Se utiliza para la enumeración de
crecimiento y desarrollo, dos de los bacterias en agua, aguas residuales,
medios de cultivo que se utilizan para el alimentos y productos lácteos en un
crecimiento de hongos y bacterias son entorno de laboratorio. PCA no está
YGC y PCA. destinado a ser utilizado en el
diagnóstico de enfermedades u otras
YGC condiciones en humanos. Este método
no contiene suplementos selectivos y es
El agar YGC (extracto de levadura,
relativamente rico en nutrientes, por lo
glucosa, cloramfenicol). Es un medio
que es ideal para la enumeración de
utilizado para el aislamiento selectivo y la
organismos viables, ya sea siguiendo un
enumeración de hongos y levaduras. El
método de vertido en placa o un método
extracto de levadura proporciona
1
de placa de superficie que se puede
acoplar con un plato en espiral. Mesófilos
Un mesófilo es un organismo que crece
En un análisis microbiológico de mejor a temperatura moderada, ni
alimentos se debe identificar la presencia demasiado caliente ni demasiado frío,
de diferentes microorganismos con un rango de crecimiento óptimo de
indicadores de contaminación para así 37 a 39 ° C. El término se aplica
determinar la calidad, entre ellos se principalmente a microorganismos. Los
encuentran: organismos que prefieren ambientes
extremos se conocen como extremófilos.
E. coli Los mesófilos tienen diversas
Las bacterias coliformes se definen como clasificaciones, que pertenecen a dos
bacterias Gram negativas no formadoras dominios: bacterias, arqueas, y al reino
de esporas y móviles o inmóviles que hongos del dominio Eucarya. Los
pueden fermentar la lactosa con la mesófilos que pertenecen al dominio
producción de ácido y gas cuando se Bacteria pueden ser gram positivos o
incuban a 35–37 ° C. Debido a la gram negativos. Los requerimientos de
capacidad limitada de ciertas bacterias oxígeno para los mesófilos pueden ser
coliformes para fermentar la lactosa, la aeróbicos o anaeróbicos. Hay tres
definición ha cambiado a bacterias que formas básicas de mesófilos: coccus,
contienen la enzima B-galactosidasa. bacilo y espiral. (Delgado et al, 2015).
(ReNaLOA, 2014) Son un indicador de Los hábitats de los mesófilos pueden
uso común de la calidad sanitaria de los incluir queso y yogur. A menudo se
alimentos y el agua. Los coliformes se incluyen durante la fermentación de la
pueden encontrar en el ambiente cerveza y la elaboración del vino. Como
acuático, en el suelo y en la vegetación; la temperatura normal del cuerpo
están universalmente presentes en humano es de 37 ° C, la mayoría de los
grandes cantidades en las heces de patógenos humanos son mesófilos, al
animales de sangre caliente. Si bien los igual que la mayoría de los organismos
coliformes en sí mismos no son que comprenden el microbioma humano.
normalmente causas de enfermedades (ReNaLOA, 2014).
graves, son fáciles de cultivar y su
presencia se utiliza para indicar que Mohos
pueden estar presentes otros
organismos patógenos de origen fecal. Los mohos son hongos microscópicos
Dichos patógenos incluyen bacterias, que viven en la materia vegetal o animal.
virus o protozoos que causan El moho crece a partir de pequeñas
enfermedades y muchos parásitos esporas que flotan en el aire. Cuando
multicelulares. Los procedimientos de algunas de estas esporas caen sobre un
coliformes se realizan en condiciones pedazo de comida húmeda, se
aeróbicas o anaeróbicas. (Prado, 2019) convierten en moho. El moho alimentario
2
se alimenta a sí mismo produciendo alimentaria. Esto se debe principalmente
químicos que hacen que la comida se a que estas especies pueden crecer en
descomponga y comience a pudrirse. A presencia de altas concentraciones de
medida que el pan se pudre, el moho sacarosa, etanol, ácido acético, ácido
crece. (Lindner & Torromé, 1995) Hay sórbico, ácido benzoico y dióxido de
miles de diferentes tipos de moho. Un azufre, lo que representa algunos de los
moho que crece en los limones parece métodos de conservación de alimentos
un polvo verde azulado. Un moho que comúnmente utilizados (Orberá, 2005).
crece en las fresas es una pelusa de
color blanco grisáceo. Al principio, un
moho común que crece en el pan parece Materiales y Metodología
una pelusa blanca de algodón. Si
observa ese moho durante unos días, se La muestra “Pollo Broaster” fue obtenida
volverá negro. Los pequeños puntos de un restaurante ubicado en el barrio La
negros son sus esporas, que pueden Paz en la ciudad de Popayán , las
crecer para producir más moho. instalaciones de almacenamiento y
exhibición del restaurante constaban de
Levaduras una vitrina abierta que daba
directamente a la calle, por la cual hay
Las levaduras pueden crecer en una alta densidad de tráfico
alimentos con un pH bajo (5.0 o menos) automovilístico, la manipulación era de
y en presencia de azúcares, ácidos medio instrumental (pinza) pero sin
orgánicos y otras fuentes de carbono medio de barrera física entre el alimento
fácilmente metabolizables. Durante su y el manipulador (guantes y tapabocas)
crecimiento, las levaduras metabolizan su método de empaquetamiento fue el
algunos componentes alimenticios y de una bolsa plástica que se encontraba
producen productos finales metabólicos. afuera de la vitrina expuesta en mayor
Esto hace que cambien las propiedades medida a la contaminación circundante
físicas, químicas y sensibles de un del medio.
alimento, y el alimento se echa a perder. Para la correcta determinación de
El crecimiento de la levadura en los organismos se realizaron varios
productos alimenticios a menudo se experimentos paralelos cada uno con la
observa en sus superficies, como en los finalidad de la determinación de la
quesos o carnes, o por la fermentación presencia de diferentes
de azúcares en bebidas, como jugos, y microorganismos, esta metodología fue
productos semi líquidos, como jarabes y la misma, realizado en paralelo para
mermeladas. (Lindner & Torromé, 1995) Mesófilos (PCA), levaduras y hongos
La levadura del género (PDA) y una metodología diferente
Zygosaccharomyces ha tenido una larga también simultáneamente para
historia como levaduras en Coliformes (EMB).
descomposición dentro de la industria
3
Para el desarrollo de esta práctica se 6. Luego se prepararon 9 tubos de
realizará la caracterización de Mesófilos, ensayo con 9 mL de caldo bilis verde
mohos, levaduras y coliformes (totales, brillante con campana de Durham
fecales y E. coli) mediante un análisis para inocular 1 mL de la muestra de
microbiológico en una muestra de los tubos positivos. Se llevaron a
alimento (pollo Broaster). incubación por 72 h a 37 °C.
7. Después de este intervalo de tiempo,
Como primera medida es necesario los tubos con las muestras fueron
hacer uso del autoclavado de los extraídos y se procedió a realizar
materiales a utilizar, para eliminar el una inoculación 1mL en cajas de
contaminante presente en los materiales Petri con agar EMB como base.
y medios de cultivos, que garantice un 8. Se llevaron a incubación por 48 h a
mejor resultado. 37 °C, y se registra el color
resultante en las cajas, pues si
presenta un color verde brillante es
Caracterización de coliformes correcto afirmar la presencia positiva
1. Se agregan 10 g de la muestra “Pollo de E. coli.
broaster”, en un Erlenmeyer con 90
mL de agua destilada y se realiza Mesófilos, mohos y levaduras
agitación durante 3 a 5 minutos. A. En 2 Erlenmeyer de 500 ml, se
2. Después se procede a realizar una añade 500 ml de agua destilada a
dilución seriada en dos tubos de cada uno,
ensayo con 9 mL de agua destilada, 1. Se pesa el medio de cultivo sólido de
añadiendo 1 mL de muestra. YGC (20 gr) Y (11,75 gr) PDA para
3. Una vez terminado eso, se deben agregar en los dos Erlenmeyer de
preparar 9 tubos de ensayo con 9 mL 500 ml, seguidamente este es
de caldo bilis verde brillante en la llevado a ebullición,
campana de Durham y adicionar 1 2. Se lavan 8 cajas de Petri, se secan y
mL de la muestra con concentración se cubren con papel kraft
10^-1, respectivamente en cada 3 3. Posteriormente se realiza el proceso
tubos con caldo bilis. de esterilización en la autoclave
4. Se rotulan los tubos y se llevan a durante 35 minutos a los materiales y
incubación a 37 °C, con una revisión medios preparados.
sistemática cada 48 h. 4. Transcurrido el tiempo se procede a
5. Una vez transcurrido el tiempo, se desalojar los materiales esterilizados
sacaron los tubos de la incubadora y y se colocan en el horno (DIES),
se seleccionaron los tubos que den hasta el momento de ser utilizados.
positivos a través de la presentación 5. El Erlenmeyer con PDA se mantuvo
de turbidez y burbujas de gas. a temperatura ambiente, en la
campana. Luego se procede a verter
4
en cada una de las cajas de Petri
aproximadamente 20 ml de solución
agar.
6. Se empaca y se introduce en la
incubadora a 25°C durante 8 días.
7. Transcurridos ocho días se llevó la
muestra de interés, esta fue de tipo
sólida “Pollo Broaster”.
8. Pesar 10 gramos de esta muestra
para realizar las diluciones
respectivas Img 1. Proceso de dilución.
9. Iniciar el proceso de siembra (B).
B. En este paso se preparó el siguiente 6. Con agitación de 1 min entre
montaje e instrumental para le las diluciones.
procesos de siembra: 7. Dentro de campana de
1. En un Erlenmeyer de 100 ml se extracción, se procede
añaden 90 ml de agua destilada después a la siembra de 0,1 ml
2. En 4 tubos de ensayo se adicionan 9 en cajas de Petri.
ml de agua destilada en cada uno 8. Finalmente se empaca y es
3. La disolución de la cantidad de llevado a la incubadora a 25 °C
muestra seleccionada se llevó a por 8 días con un seguimiento
cabo de la siguiente manera: sistemático cada 24 horas.
Disolución en el Erlenmeyer (100 ml) 9. De manera que, una vez
el cual contenía 90 ml de agua concluida el seguimiento se
destilada, en el cual se agrega los 10 reporta la lectura de
g de la muestra a trabajar resultados, dando una
4. Realizar agitación a dicha solución descripción macroscópica, un
por un tiempo estimado de 3 min. conteo de microorganismos, al
5. Se tomó un 1mL y fue vertido en igual que las unidades
tubos de ensayo rotulados con formadoras de colonias por
concentraciones 10^-1, 10^-2, 10^-3, mililitros (UFC/ml) para cada
10^-4, 10^-5; como indica la imagen caja de Petri utilizada dentro
1. de la práctica.
5
RESULTADOS
Mohos y levaduras
No se registró crecimiento de mohos en
ninguna caja de Petri, pero si hubo
presencia de 4 UFC en la caja de (10^-5)
el cual se determinó como levadura.
Img 4. Dilución 10−3
Img 2. Dilución 10−1
Img 5. Dilución 10−4
Img 3. Dilución 10−2
Img 6. Dilución 10−5
6
Mesófilos
La formación de colonias depende de la
concentración, es decir que a mayor
dilución es mayor las UFC como se
identifica en el siguiente cuadro 1:
Cuadro 1. Conteo de colonias por caja
Caj Colonia
Disolucion a Colonia
de s
es Pet s
ri
Img 8. Dilución 10−2
10-1 1 > 300 0
10-2 2 > 300 0
10-3 3 > 300 0
201000
10-4 4 201
0
10-5 5 6 0
Img 9. Dilución 10−3
Img 7. Dilución 10−1 Img 10. Dilución 10−4
7
Cuadro 2. Prueba de coliformes
Dilución Burbuja o Número de
turbidez tubos
10-1 Positivo 3
10-2 Positivo 1
10-3 Positivo 1
Img 11. Dilución 10−5
Coliformes
Se utilizó caldo bilis porque es un medio
selectivo, ya que contienen bilis y verde
brillante los cuales inhiben el crecimiento
de bacterias gram negativas y gram
Img 12. Positivo para [Link]
positivas a excepción de coliformes (se
aprecia mejor este tipo de Con las pruebas que resultan positivas,
microorganismos). Este caldo permite se realiza un duplicado, es decir nuevas
identificar la presencia de coliformes
diluciones para identificar el crecimiento
debido a la turbidez de la solución y
fermentación de la lactosa, la cual de coliformes como se muestra en el
genera gas y se almacena en el tubo cuadro 3:
Durham.
Cuadro 3. Conteo de colonias por caja
Los tubos que dieron positivo para la
prueba de coliformes se observa en el Dilución Burbuja o Número de
turbidez tubos
siguiente cuadro:
10-2 Positivo 3
10-3 Positivo 1
8
Img 13. Positivo para coliformes totales
10-4 Positivo 1
Siembra en agar EMB
ANÁLISIS DE RESULTADOS
El agar EMB es un medio selectivo y
Los mesófilos al ser exitosos en medios
diferencial el cual favorece el crecimiento de
abundantes de oxígeno y con un rango
las enterobacterias (bacterias gran
de temperaturas entre 20 °C y 45 °C son
negativas), como la bacteria ([Link]), y
el microorganismo con un mayor éxito
presentan un color característico verde
reproductivo en estas circunstancias
metálico en el medio por su rápida
específicas, y son lógicos los resultados
fermentación de lactosa. Al realizar la
que al disminuir la concentración en las
siembra se obtiene los siguientes resultados
diluciones seriadas el conteo de
como se identifica en el cuadro 4:
mesófilos será menor a causa que la
Cuadro 4. Resultado de conteo de
cantidad de muestra es menor en la
colonias por caja
solución de cada tubo de ensayo, pues la
Caja de cantidad de mesófilos presente es
Dilución Colonias UFC/ml
Petri directamente proporcional a la cantidad
de muestra pues depende del medio
10-2 1 170 1700000
para prosperar además de la cantidad de
10-2 2 129 1290000
espacio de la muestra sobre la cual se
-2
10 3 0 0 desarrolla. Dándose así demasiados
UFC en las concentraciones mayores
(10^-1, 10^-2, 10^-3), y un conteo menor
en las concentraciones menores (10^-4,
10^-5) a causa de la relación explicada
previamente. Los datos evidencian la
presencia de mesófilos pero no son
concluyentes para emitir un juicio sobre
la salubridad del alimento pues al no
haberse podido hacerse un conteo
efectivo en los primeros 4 tubos no
9
podemos compararlos con la literatura, la anterior se concluye que hubo algunos
cual expresa que el máximo recuento de errores experimentales, humanos, es
aerobios mesófilos/g es de 10^7 decir se contamino la muestra en la
UFC/cm2 (Mossel et al, 2003). ejecución del procedimiento. Por ello no
Se observa que existe un diferencial de se logró comparar con la literatura.
UFC entre los organismos, a causa de la La E. coli se puede distinguir de la
misma naturaleza de los mayoría de los otros coliformes por su
microorganismos o del mismo medio capacidad de fermentar la lactosa a 44 °
donde se han reproducido (Audisio, C en la prueba de coliformes fecales, y
2016). Por el cuál se debe evaluar el por su crecimiento y reacción de color en
almacenamiento, su manipulación y el ciertos tipos de medios de cultivo.
proceso de cocción de los alimentos, Cuando se cultiva en una placa de
pues los 4 microorganismos analizados eosina azul de metileno (EMB), un
para ser presente de manera efectiva en resultado positivo para E. coli son las
un alimento no sobrevivirán al proceso colonias de color verde metálico en un
de cocción al que se somete el pollo medio púrpura oscuro. Escherichia coli
broaster, de modo que el nivel de tiene un período de incubación de 12 a
propagación será bajo, generando así 72 horas con una temperatura óptima de
que la contaminación este presente ya crecimiento de 37 ° C. (Prado, 2019) A
en los procesos de manipulación y diferencia del grupo de coliformes
almacenaje del alimento ya preparado generales, E. coli son casi
listo para el consumo humano. exclusivamente de origen fecal y, por lo
(Ministerio De Sanidad, Servicios tanto, su presencia es una confirmación
Sociales E Igualdad, 2016). efectiva de la contaminación fecal.
Además los resultados que se obtuvieron (Krumperman, 1983)
de mohos y levaduras, se determinó que Para la [Link], estas burbujas de gas y la
en el procedimiento no hubo crecimiento turbidez en los tubos de ensayo son el
de UFC en las concentraciones mayores producto de la fermentación, pues la
(10^-1, 10^-2, 10^-3 y 10^-4), pero si un ecuación general de la fermentación es:
conteo de 4 levaduras UFC en la
concentración menor (10^-5), por lo
10
Glucosa → 2 Etanol+CO 2 se registraron 1290000 UFC/ml, la última
caja de petri no presento [Link] ya que no
Pero el mecanismo de detección es
se observó el color verde metalico. La
respecto a la fermentación de lactosa,
presencia de esta bacteria pudo haberse
entonces como lo muestra la figura 1.
contraído después de haber freído el
pollo ya que los microorganismos no
resisten temperaturas muy elevadas. Las
malas prácticas de manufactura o no
llevar una asepsia adecuada pudo haber
sido un factor importante para la
contaminación del alimento, ya que el
personal no usaba la indumentaria
Figura 1. Proceso de fermentación
láctica correcta de higiene (gorro, tapabocas,
guantes y uniforme adecuado) además
Es entendible que este gas es dióxido de
de no limpiar los utensilios que utilizan
carbono y esta turbidez es presentada
para manipular el pollo, el paso de
por compuestos orgánicos en
vehículos, el lugar donde se encontraba
suspensión en la solución a causa de su
almacenado el pollo pudieron haber sido
no completa solubilidad, el cual
otros indicadores de contaminación.
demuestra la presencia de
Según las NTC los alimentos de
microrganismos fermentadores de la
consumo humano no deben de contener
lactosa, y como estos ya fueron
bacterias como (E. coli).
sometidos a la prueba previa en los
tubos de ensayo, se puede dar una doble
Conclusiones
confirmación de la presencia de [Link] en
la muestra “Pollo Broaster” (Stoeckel et
La manipulación de alimentos
al, 2004).
debe contar con mejores controles
Las pruebas para la bacteria (E. coli) de higiene pues microrganismos
dieron positivo alcanzando su máximo como (E. coli) pueden proliferar.
Esto implica que la calidad y
valor en la caja de petri 1 donde se
seguridad del alimento disminuya.
registraron 1700000 UFC/ml, La muestra de alimento analizada
seguidamente de la caja de petri 2 donde (Pollo Broaster) no es apta para el
11
consumo humano debido a la contamination of foods. Appl.
presencia de microorganismos Environ. Microbiol., 46(1), 165-
patógenos (E. coli) los cuales 170.
pueden ocasionar enfermedades y Lindner, E., & Torromé, A. (1995).
efectos negativos al organismo. Toxicología de los alimentos (No.
84-200-0776-5. 01-A1 LU. AL-
Para saber si este alimento TxAl.). Zaragoza: Acribia.
incumple con las normas de Ministerio De Sanidad, Servicios
salubridad en lo referente a la Sociales E Igualdad (2016)
cantidad de UFC/CM^2 se Parámetros De Seguridad
requieren estudios posteriores con Alimentaria Para La Carne Y
concentraciones intermedias y Productos Cárnicos Destinados A
cajas más grandes para una La Unión Económica De Eurasia,
mayor facilidad en el conteo, pues Dirección General De Salud
realizar una extrapolación con tan Pública , Calidad E Innovación,
solo 2 puntos (10^-4 y 10^-5) no Subdirección General De Sanidad
es confiable pues una gran Exterior
cantidad de funciones de Mossel. D, et al (2003).
cualquier naturaleza puede pasar Microbiología de los Alimentos. 2ª
por 2 puntos cualquieras. ed, Acribia, Zaragoza, p 493, 510,
636
Stoeckel, D. M., Mathes, M. V.,
Referencias Hyer, K. E., Hagedorn, C., Kator,
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Audisio M (2016) Manual de (2004). Comparison of seven
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Manabí-Ecuador. Revista de MICROBIOLOGIA DE LA CARNE
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identify high-risk sources of fecal
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sobre los alimentos. Revista
Cubana de Salud Pública, 30(3),
0-0.
13
