DETERMINACIÓN DE AMINOÁCIDOS TERMINALES CON GRUPOS ALFA
AMINO LIBRES. MÉTODO DE SANGER.
Avilez Colin Angélica del Carmen 3IV01 Sección I
Morales López Nahui Ollin
Introducción
Esquema.
Objetivos. (anexo 1)
Resultados.
Identificar el aminoácido, alfa-amino terminal de las
cadenas de la molécula de hemoglobina Rf= distancia muestra / distancia frente de solvente
mediante el método de Sanger.
Muestra dm dfs Rf
Interpretación DNP-phe 19 29.8 0.63
DNP-Ala 18.5 27.2 0.61
Análisis de la técnica DNP- Val 21.1 28.6 0.68
1) Dinitrofenilación del aminoácido N-terminal DNFB 15.51 30.5 0.50
de la proteína. Punto m 10.2 30.4 0.33
Por naturaleza, las proteínas son polipéptidos con Discusiones.
carga neutra. Al adicionar bicarbonato de sodio, un
ambiente ácido, protona los grupos R ionizables. Cuando un polipéptido reacciona con el 2,4-
dinitrofluoro benceno, el grupo NH2 -terminal (y el
En condiciones alcalinas usando la base débil la grupo ε-amino de cualquier lisina presente en el
proteína se desprotona y es cuando puede enlace peptídico) forma un derivado 2,4-
reaccionar con el reactivo de Sanger DNFB. dinitrofenilo del polipéptido de color amarillo
Añadiendo HCl 3N se detiene la dinitrofenilación. intenso. La hidrolisis subsecuente del péptido con
2) Eliminación del DNFB que no reaccionó HCl 6N hidroliza todos los enlaces peptídicos, por
lo que el derivado amarillo del residuo NH2 -terminal
Al realizar las primeras extracciones con éter
puede separarse por cromatografía en papel de los
saturado con solución acuosa de FeSO 4 retiramos
aminoácidos libres. Posteriormente se compara
los restos de DNFB que no reaccionaron con los
con derivados conocidos de los aminoácidos y, con
aminoácidos.
ello, se identifica.
3) Hidrólisis de la DNP-proteína
Conclusiones.
Anadir HCl 6N para realizar la hidrolisis; romper los - El aminoácido de la hemoglobina es DNP
enlaces peptídicos que no se disociaron. Valina.
Posteriormente se añade agua para poder separar - La cromatografía en papel identificó a la
a.a. hidrofílicos. valina como grupo principal al ser más
Se realiza la segunda extracción con éter para eluyente.
obtener loss dinitrofenil derivados la fase etérea, ya - La manera de romper los enlaces en las
que estos son hidrófobos. proteínas tiene que suceder en condiciones
4) Identificación del residuo N-terminal por extremas.
cromatografía en papel.
- Los aminoácidos dinitrofenilados en la
Finalmente se calientan los extractos etéreos para cadena lateral tienen carácter polar.
provocar la evaporación, quedando así solamente
el derivado dinitrofenilado de la hemoglobina.
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3c_secuencia_proteinas.pdf
Anexo 1. Esquema a escala 1:2 de Cromatograma.
3IV01 SECCION: I Avilez Colin Angélica del Carmen
Morales López Nahui Ollin
DNFB
DNP Phe DNP Ala DNP Val Problema
