Universidad Nacional Autónoma de México

FACULTAD DE QUÍMICA
Alumna: Ortega Becerril Ana Karen
Microbiología de Alimentos. Grupo 3
Profesora Martha Giles Gómez. Semestre 2016-2

Prueba Inmunológica comercial

ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)

Los ensayos inmunológicos son procedimientos en los cuales se utilizan anticuerpos como
reactivos enlazantes “específicos”. Y tienen aplicación universal para la determinación o
cuantificación de fármacos terapéuticos y no terapéuticos, diversas sustancias biológicas,
sustancias infecciosas o anticuerpos de respuesta del huésped en el suero, en la orina, en
el líquido cefalorraquídeo en saliva y en cualquier líquido biológico donde se encuentre la
sustancia a investigar.1

El radioinmunoensayo se desarrollada en 1959 por Yalow y Berson, fue el precursor de los

ensayos enmunoenzimáticos que fueron descritos originalmente en 1971 por Engvall y
Perlmann, y Van Wemen y Schuurs, sin embargo el uso de material radioactivo ha limitado
el uso del radioinmunoensayo, y a la vez ha popularizado el empleo del inmunoensayo
enzimático (EIA), del que hay dos técnicas principales: el ensayo inmunoabsorbente ligado
a enzimas y el ensayo inmunológico multiplicado por enzimas (EMIT). 2

Los inmunoensayos han sido usados por varias décadas en la detección y caracterización
de microorganismos y sus componentes en microbiología. El método más popular es el
ELISA. Su principal ventaja consiste en el corto período de tiempo que se necesita para
identificar al agente patógeno3, así como su fácil manejo, alta sensibilidad y especificidad.

La técnica de ELISA se basa en el uso de anticuerpos o antígenos marcados con una

enzima (generalmente la peroxidasa) para visualizar la reacción Ag-Ac. de forma que los
conjugados resultantes tengan tanto actividad inmunológica como enzimática. Al estar
uno de los componentes (antígeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado
sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reacción antígeno-anticuerpo quedará
inmovilizada y, por tanto, será fácilmente revelada mediante la adición de un substrato

1
Guzmán, Elizabeth V. “ V. Las pruebas de Elisa” [en línea]. En Gaceta Médica de México Suplemento No.3,
Año/Vol. 140 (2004). Tomado del sitio electrónico Medigrapic, Literatura Biomédica, pp. S48.
http://www.medigraphic.com/pdfs/gaceta/gm-2004/gms043o.pdf [Consultado: 2/Marzo/2016]
2
Ídem
3
Fundora, Hermes H; Yamila Puing; Sergio Chiroles; Andrea M. Rodríguez; Juan Gallardo; Yosaline Milián.
“Métodos inmunológicos utilizados en la identificación rápida de bacterias y protozoarios en aguas” [en
línea]. Artículo en revisión por Instituto Nacional de Nutrición e Higiene de los Alimentos: La Habana, Cuba
(2012). Tomado del sitio electrónico Biblioteca Virtual en Salud de Cuba,
http://bvs.sld.cu/revistas/hie/vol51_1_13/hie09113.htm [Consultado: 2/Marzo/2016]
especifico que al actuar la enzima producirá un color observable a simple vista o
cuantificable mediante el uso de un espectrofotómetro o un colorímetro.4
Esta técnica es utilizada tanto para la determinación de antígenos como de anticuerpos,
así como la detección de bacterias patogénicas como de toxinas en muestras ambientales,
con una sensibilidad 1-5 UFC/25 mL de muestra y una especificidad de 95 - 99 %, lo cual
ofrece resultados en tiempos más cortos que los métodos tradicionales.5

Fundamento de ELISA

Existen diversas variaciones al método de ELISA para detectar y cuantificar, el marcador

enzimático que se emplea en estos análisis se conjuga con un ligando, que puede ser un
antígeno, un anticuerpo específico para el antígeno de interés o un anticuerpo para el
anticuerpo primario. Casi todas las pruebas ELISA son ensayos en fase sólida en los cuales
se adsorbe un antígeno o un anticuerpo sobre un soporte sólido.
Algunos de los protocolos se basan en reacciones de enlace competitivo y otras en
reacciones de enlace no competitivo, pero en todas las pruebas ELISA se requiere de un
paso de separación para eliminar el conjugado enzimático libre antes de proceder a
determinar la cantidad de conjugado enzimático enlazado (lavados). Para lo cual se añade
sustrato enzimático y se mide la reacción catalítica entre la enzima y el sustrato (en
presencia de un cromógeno). Por sus características catalíticas las enzimas son
marcadores muy sensibles y versátiles. Una sola proteína enzimática puede transformar
en algunos minutos gran número de moléculas de sustrato en una cantidad igualmente
abundante de producto final, produciendo un cambio de color amplificado y que se
detecta con facilidad.6

Las técnicas de ELISA se realizan mediante la adición secuencial de todos los reactivos
necesarios separados por etapas de lavado. Cada una de las operaciones puede realizarse
manualmente con micropipetas o con equipamiento para la automatización de todas y
cada una de las etapas. Esta completa automatización se justifica por la necesidad de
procesar y analizar un gran número de muestras y necesitar una elevada repetitividad de
resultados7

Las variables que están implicados en este método son:

4
“Fundamento y tipos de ELISAs” [en línea] . En Grupo Cultek, S.L. (2006) pp. 1. Tomado del sitio electrónico
http://www.cultek.com/inf/otros/soluciones/Soluciones-ELISA-protocolos.pdf [Consultado: 2/Marzo/2016]
5
Fundora, Hermes H; Yamila Puing; Sergio Chiroles; Andrea M. Rodríguez; Juan Gallardo; Yosaline Milián.
“Métodos inmunológicos utilizados en la identificación rápida de bacterias y protozoarios en aguas” [en
línea]. Artículo en revisión por Instituto Nacional de Nutrición e Higiene de los Alimentos: La Habana, Cuba
(2012). Tomado del sitio electrónico Biblioteca Virtual en Salud de Cuba,
http://bvs.sld.cu/revistas/hie/vol51_1_13/hie09113.htm [Consultado: 2/Marzo/2016]
6
Guzmán, Elizabeth V. “ V. Las pruebas de Elisa” [en línea]. En Gaceta Médica de México Suplemento No.3,
Año/Vol. 140 (2004). Tomado del sitio electrónico Medigrapic, Literatura Biomédica, pp. S48.
http://www.medigraphic.com/pdfs/gaceta/gm-2004/gms043o.pdf [Consultado: 2/Marzo/2016]
7
“Fundamento y tipos de ELISAs” [en línea] . En Grupo Cultek, S.L. (2006) pp. 3. Tomado del sitio electrónico
http://www.cultek.com/inf/otros/soluciones/Soluciones-ELISA-protocolos.pdf [Consultado: 2/Marzo/2016]
  Fase solida
 Adsorción
 Enzimas
 Lavados
 Anticuerpos

Fase solida

La fase sólida debe ser de un tipo que permita

un fácil manejo (especialmente en los procesos
de lavado) y la reproducibilidad de la unión de antígenos o anticuerpos sobre su
superficie.
 Sustancias que favorecen la adsorción física (por fuerzas electrostáticas) de las
moléculas de antígeno o anticuerpo: poliestireno, cloruro de polivinilo,
polipropileno, nylon y silicona.
 Sustancias que favorecen la fijación covalente: acrilamida, celulosa y
isotiocianato.8
 Las microplacas de 96 pocillos y un volumen de 350µL son especialmente
ventajosas para procesar un elevado número de muestras y una vez tapizadas, el
material inmovilizado permanece reactivo mucho tiempo siempre que se
mantenga seco y a baja temperatura. Normalmente se utilizan microplacas de
poliestireno de fondo plano que pueden adquirirse estériles y con o sin tapa. 9

Los mejores resultados se obtienen con poliestireno y el polivinilo por su transparencia,

rigidez y propiedades adsortivas ya que tienen gran afinidad por proteínas. 10

Adsorción de antígenos y anticuerpo (tapizado)

La unión que se establece entre la fase solida-anticuerpo-antígeno es de tipo físico,
produciéndose una reacción de equilibrio entre las porciones fijas y libres de antígeno 11.
Los métodos empleados son dos fundamentalmente:
 Dilución del antígeno o anticuerpo en tampón carbonato (pH 9,6) e incubación
posterior durante 3h a 37°C o 16h a 4°C.

8
Hernández, Nora. “E.L.I.S.A.: Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay” [en línea]. En Instituto de Higiene,
Universidad de la Republica Uruguay (2007) pp. 21. Tomado del sitio electrónico
http://www.higiene.edu.uy/parasito/trabajos/elisa.pdf [Consultado: 2/Marzo/2016]
9
“Fundamento y tipos de ELISAs” [en línea] . En Grupo Cultek, S.L. (2006) pp. 2. Tomado del sitio electrónico
http://www.cultek.com/inf/otros/soluciones/Soluciones-ELISA-protocolos.pdf [Consultado: 2/Marzo/2016]
10
Hernández, Nora. “E.L.I.S.A.: Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay” [en línea]. En Instituto de Higiene,
Universidad de la Republica Uruguay (2007) pp. 21. Tomado del sitio electrónico
http://www.higiene.edu.uy/parasito/trabajos/elisa.pdf [Consultado: 2/Marzo/2016]
11
Ibídem pp.24
  Tratamiento a 40-50°C en tampón fosfato (PBS) o en agua fisiológica tamponada
pH 7,2-7,4 hasta desecación.12

Enzimas
La enzima escogida como marcador debe unirse fácilmente a antígenos y anticuerpos
mediante enlace covalente, encontrarse en estado puro a un precio razonable y tener un
substrato cromogénico o fluorogénico conveniente y de fácil preparación. Las enzimas
más utilizadas son fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano y ß-galactosidasa 13

Tabla. 1 Enzimas utilizadas en ELISA14

Enzima Sustrato Producto
Fosfatasa alcalina p-nitrofenilfosfato nitrofenolato
Peroxidasa de rábano Peróxido de hidrógeno Cromógeno
o-fenilendiamina produce
un producto color amarillo-
naranja medible
ß-galactosidasa o-nitrofenil-beta- D- nitrofenolado (amarillento)
galactopiranósido
Actualmente existe otra posibilidad de sustituir el conjugado anti-especie para la
detección de IgGs y es la utilización de proteína A o G marcadas con peroxidasa. 15
Las operaciones de marcado o conjugación, llevan implícitas dos etapas:
 Purificación de los anticuerpos a partir de un antisuero bruto mediante una
precipitación generalmente salina de las proteínas del antisuero, seguida de una
diálisis y purificación de la fracción de anticuerpos mediante filtración molecular,
cromatografía o separación en gradiente de densidad mediante
ultracentrifugación. Finalmente, se suele concentrar los anticuerpos purificados y
ajustarlos a una dosis de 1mg/mL.
 Marcado de los anticuerpos con la enzima mediante el uso de un agente puente
que normalmente suele ser el glutaraldehído o el del mperiodato sódico. 16

Una vez se disponga del conjugado debe ser conservado hasta el momento de su
utilización; esta conservación se suele realizar mediante liofilización, congelación a –70°C
o filtrado estéril y conservación a -20°C mezclado con igual volumen de glicerol bidestilado
estéril.
La búsqueda de la concentración óptima de uso depende ligeramente del tipo de ELISA
empleado; para cualquier ELISA que utilice anticuerpos conjugados, se suele probar
12
“Fundamento y tipos de ELISAs” [en línea] . En Grupo Cultek, S.L. (2006) pp. 3. Tomado del sitio electrónico
http://www.cultek.com/inf/otros/soluciones/Soluciones-ELISA-protocolos.pdf [Consultado: 2/Marzo/2016]
13
Ídem
14
Guzmán, Elizabeth V. “V. Las pruebas de Elisa” [en línea]. En Gaceta Médica de México Suplemento No.3,
Año/Vol. 140 (2004). Tomado del sitio electrónico Medigrapic, Literatura Biomédica, pp. S48.-S49.
http://www.medigraphic.com/pdfs/gaceta/gm-2004/gms043o.pdf [Consultado: 2/Marzo/2016]
15
“Fundamento y tipos de ELISAs” [en línea] . En Grupo Cultek, S.L. (2006) pp. 4. Tomado del sitio electrónico
http://www.cultek.com/inf/otros/soluciones/Soluciones-ELISA-protocolos.pdf [Consultado: 2/Marzo/2016]
16
Ibídem pp.3
diferentes diluciones del conjugado (desde 1:100 hasta 1:2000) frente a sucesivas
diluciones de antisuero en placas tapizadas con antígeno a concentración idónea. Aquella
dilución del conjugado que produzca menor reacción inespecífica con muestras negativas
e implique una clara distinción de las muestras positivas, será la óptima. 17

Hoy en día existen muchas variaciones en cuanto a los sustratos y, por lo tanto, el método
de detección de los complejos antígeno-anticuerpo, así tenemos sistemas de detección
colorimétricos, fluorescentes y luminiscentes.

Lavados

Luego de la incorporación de cada componente (antígeno, anticuerpo, conjugado, sustrato

enzimático), debe de efectuarse una serie de lavados con el fin de eliminar el exceso que
no se haya fijado o unido. Dependiendo del ensayo, habitualmente se realizan entre 3-6
lavados en cada una de las etapas.
Como solución se emplea buffer pH 7.2, que tiene además Tween 20 el cual facilita la
separación de las sustancias actuando como humectante, detergente y fungicida. 18

Anticuerpos
Los anticuerpos utilizados en el método ELISA son de origen monoclonal o policlonal que
se suministran como antisuero no fraccionado o fracciones de inmunoglobulina purificada,
pueden ser solubles o estar inmóviles en un soporte sólido, son empleados como
conjugados no marcados o enzimáticos y por ultimo reaccionan con determinante
antigénico específico o de un anticuerpo ligando-específico (anticuerpo primario) según el
protocolo de análisis19

Tipos de ELISA
Los diferentes tipos de ELISA son los que se enumeran a continuación:
 Anticuerpos marcados:
- ELISA Directo
- ELISA Indirecto
- ELISA sándwich
Doble (DAS)
Heterólogo (HADAS)
 Antígeno marcado
ELISA competitivo

17
Ibídem pp.4
18
Hernández, Nora. “E.L.I.S.A.: Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay” [en línea]. En Instituto de Higiene,
Universidad de la Republica Uruguay (2007) pp. 31. Tomado del sitio electrónico
http://www.higiene.edu.uy/parasito/trabajos/elisa.pdf [Consultado: 2/Marzo/2016]
19
Guzmán, Elizabeth V. “ V. Las pruebas de Elisa” [en línea]. En Gaceta Médica de México Suplemento No.3,
Año/Vol. 140 (2004). Tomado del sitio electrónico Medigrapic, Literatura Biomédica, pp. S48.
http://www.medigraphic.com/pdfs/gaceta/gm-2004/gms043o.pdf [Consultado: 2/Marzo/2016]
Todos los tipos de ELISAs descritos se pueden resumir en dos grandes grupos:
 ELISA para detectar antígenos: ELISA sándwich.
 ELISA para detectar anticuerpos: ELISA indirectos.20

Pasos generales para ELISA

1- Tapizado del pocillo con el antígeno o anticuerpo.
2- Adición de la muestra problema con la mezcla de antígenos o anticuerpos.
3- Unión del antígeno o anticuerpo específico al anticuerpo o antígeno tapizado en el
pocillo
4- Lavado del pocillo para eliminar el exceso de antígeno o anticuerpo no unido
5- Adición del anticuerpo secundario marcado con la enzima
6- Unión del anticuerpo secundario al antígeno o anticuerpo
7- Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida
8- Adición del sustrato
9- Unión del sustrato a la enzima
10- Lavado del pocillo para eliminar el sustrato de la enzima no ocupado
11- Desarrollo del color21

Proveedores de ELISA
A continuación se muestra una lista de vendedores o comercializadores que son
fabricantes (productores), exportadores, distribuidores y en general suplidores /
proveedores de kits de ELISA22
 Inolab Especialistas de Servicio
 SurGenoma
 Wako Chemicals USA
 QUIMINMEX
 Trilab:
 Rivers Solutions Elisa para alérgenos
 RYTlabs Elisa para análisis de alimentos
 Lesca Elisa para análisis de alimentos
 ALLScience Elisa para estudios moleculares
 Neogen Latinoamerica Elisa para alérgenos de huevo
 GRUPO LABCA
 Merck Millipore

Aplicaciones de ELISA23

20
“Fundamento y tipos de ELISAs” [en línea] . En Grupo Cultek, S.L. (2006) pp. 1. Tomado del sitio electrónico
http://www.cultek.com/inf/otros/soluciones/Soluciones-ELISA-protocolos.pdf [Consultado: 2/Marzo/2016]
21
Ibídem pp. 2
22
“Proveedores de kits ELISA” [en línea]. En Información y Negocios segundo a segundo (2000-2015),
México D.F. Tomado del sitio quiminet, http://www.quiminet.com/productos/kits-de-elisa-
5211383607/proveedores.htm [Consultad: 2/Marzo/2016]
23
“Fundamento y tipos de ELISAs” [en línea] . En Grupo Cultek, S.L. (2006) pp. 7. Tomado del sitio electrónico
http://www.cultek.com/inf/otros/soluciones/Soluciones-ELISA-protocolos.pdf [Consultado: 2/Marzo/2016]
Patología Animal Patología Vegetal
Enfermedades producidas por parásitos: Enfermedades producidas por virus
 Babesias y tripanosomas  En frutales
 Toxocara canis - PPV
 Toxoplasmosis - CLSV
 Triquinosis - TRSV
Enfermedades producidas por Micoplasmas  En cítricos
Enfermedades producidas por bacterias - CTV
 Mycobacterium tuberculosis  En patata
 Brucelas - PLRV
 Enterotoxinas Vibrio cholerae - PVY
 Estreptococos - PVX
 Salmonella sp. - PVA
Enfermedades producidas por virus - TRV
Enfermedad de Aujeszky  En cereales
Enfermedad de Newcstle  En guisante
Fiebre aftosa  En lúpulo
Leucemia felina  En soja
Peste porcina africana  En ornamentales
Peste porcina clásica  En plantas hortícolas
Rinotraqueitis infecciosa Enfermedades producidas por bacterias
Rotavirus Enfermedades producidas por Micoplasmas
Artritis vírica Enfermedades producidas por hongos
Hormonas
 Gonadotropina coriónica
 Progesterona
 Testosterona
 Hormonas tiroideas
Cuantificación de inmunoglobulinas
 IgG,
 IgE
 IgA
Inmunopatología
 Anticuerpos anti-DNA
 Factor reumatoide
 Inmunocomplejos circulantes

La lectura de los resultados puede ser valorada tanto visual como colorimétricamente. Los
resultados finales de la lectura colorimétrica se reflejan numéricamente mediante valores
de absorbancia o densidad óptica que se obtendrán a la longitud de onda más adecuada
para la coloración final alcanzada.24
24
Ídem
Referencias:
 “Fundamento y tipos de ELISAs” [en línea]. En Grupo Cultek, S.L. (2006). Tomado
del sitio electrónico http://www.cultek.com/inf/otros/soluciones/Soluciones-
ELISA-protocolos.pdf [Consultado: 2/Marzo/2016]
 “Proveedores de kits ELISA” [en línea]. En Información y Negocios segundo a
segundo (2000-2015), México D.F. Tomado del sitio quiminet,
http://www.quiminet.com/productos/kits-de-elisa-5211383607/proveedores.htm
[Consultad: 2/Marzo/2016]
 Guzmán, Elizabeth V. “V. Las pruebas de Elisa” [en línea]. En Gaceta Médica de
México Suplemento No.3, Año/Vol. 140 (2004). Tomado del sitio electrónico
Medigrapic, Literatura Biomédica. Tomado del sitio
http://www.medigraphic.com/pdfs/gaceta/gm-2004/gms043o.pdf [Consultado:
2/Marzo/2016]
 Hernández, Nora. “E.L.I.S.A.: Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay” [en línea]. En
Instituto de Higiene, Universidad de la Republica Uruguay (2007) pp. 31. Tomado
del sitio electrónico http://www.higiene.edu.uy/parasito/trabajos/elisa.pdf
[Consultado: 2/Marzo/2016]
 Fundora, Hermes H; Yamila Puing; Sergio Chiroles; Andrea M. Rodríguez; Juan
Gallardo; Yosaline Milián. “Métodos inmunológicos utilizados en la identificación
rápida de bacterias y protozoarios en aguas” [en línea]. Artículo en revisión por
Instituto Nacional de Nutrición e Higiene de los Alimentos: La Habana, Cuba
(2012). Tomado del sitio electrónico Biblioteca Virtual en Salud de Cuba,
http://bvs.sld.cu/revistas/hie/vol51_1_13/hie09113.htm
[Consultado:2/Marzo/2016]