UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CHIAPAS
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
CAMPUS IV, TAPACHULA
PROGRAMA EDUCATIVO:
LICENCIATURA EN QUIMICO FARMACOBIOLOGO
EXPERIENCIA EDUCATIVA:
INMUNOLOGIA I
TRABAJO:
REPORTE DE PRÁCTICA
PRUEBA DE INMUNODIFUSIÓN RADIAL
INTEGRANTES DEL EQUPO:
BRANDON DANIEL REYES GONZALEZ
URI VAZQUEZ LOPEZ
CHRISTIAN AMERICA MORALES LOPEZ
SARAI ESCOBAR SUMUANO
CECILIA DEL CARMEN VELASCO ROMERO
CATEDRATICO:
DR. CRISPIN HERERA PORTUGAL
GRADO: 6° SEMESTRE
GRUPO: “B”
TAPACHULA, CHIAPAS 28 DE OCTUBRE DEL 2019
INTRODUCCIÓN
La inmunodifusión radial (IDR) es una técnica que puede determinar
cuantitativamente la concentración de un antígeno. Es una técnica sensible que es
usada clínicamente para detectar niveles de proteínas plasmáticas. Un anticuerpo
es incorporado en agarosa fundida, la cual es vertida dentro de una caja de Petri
donde se deja solidificar. Se cortan pequeños pozos dentro de la agarosa y estos
son llenados con concentraciones conocidas de antígeno correspondientes al
anticuerpo, con el objetivo de construir una curva de calibración. Las muestras
desconocidas se colocan dentro de los pozos. Los antígenos en solución
difundirán hacia afuera del pozo en un patrón circular rodeando el pozo. En
anticuerpo está presente en exceso y la difusión del antígeno continuara hasta que
se forme un precipitado antígeno – anticuerpo en forma de anillos estable. Habrá
complejo Ag-Ac en toda la zona circulante al pozo dentro de la línea de precipitina.
En esta línea es donde está presente el mayor número de complejos, ya que en
este punto e antígeno y el anticuerpo están proporciones iguales. Esta es
conocida como la zona de equivalencia.
Generalmente toma de 24 a 48 horas para que ocurra la difusión optima y la
precipitación se haga evidente. Para cada antígeno, se formara una precipitación
final en anillos de cierto diámetro. De las concentraciones conocidas estándar, se
traza una curva de calibración, se colocan dos en los ejes concentración de
antígeno contra mediciones de diámetro cuadrado de los anillos. A partir de esta
curva de calibración lineal, la presencia y cantidad de antígeno en las muestras
desconocidas pueden ser determinadas.
OBJETIVO
Determinar mediante la técnica de inmunodifusión radial proteínas
plasmáticas del suero humano.
Identificar los requerimientos técnicos que se deben considerar para
realizar esta prueba
MATERIAL
Agarosa fundida (3ml)
1 pipeta de 5 ml
1 vaso de precipitado de 250 ml
1 tripie con tela de alambre
Mechero
Placas de petri plásticas
Micropipeta de 1000 ul
4 tubos de ensaye
Antígeno de suero humano
Anticuerpo anti suero humano
Solución salina
METODOLOGIA
1. Se preparó la agarosa, una vez fundida se llevó a 45º C, donde se le
agrego 4 ml de suero de conejo (Anticuerpo), se mezcló hasta que se
incorporó completamente. Luego se depositaron 3 ml en la caja petri.
2. Se dejó enfriar a temperatura ambiente y luego se metió al refrigerador 10
minutos para que estuviera firme la agarosa.
3. Se sacó la caja petri del refrigerador y se practicaron 4 agujeros separados
con una micropiopeta de 1000 ul en forma de media luna.
4. Se realizó previamente diluciones del antígeno de suero humano,
colocando en el tubo uno 1 ml de antígeno de suero humano, del cual se
tomó 500 ul de suero y se puso en el tubo dos con 500 ul de solución
salina, del tubo dos se tomó 500 ul de la mezcla y se colocó en el tubo tres
con 500 ul de solución salina, y del tubo tres se tomó 500 ul de la mezcla y
se colocó en el tubo cuatro con 500ul de solución salina.
5. En cada uno de los agujeros se colocó direntes concentraciones del
antígeno, el primer pozo antígeno concentrado, el segundo pozo dilución
1:2, tercer pozo dilución 1:4, el cuarto pozo dilución 1:8.
6. Se tapó la caja petri y se selló con parafilm para evitar contaminación y se
mantubo a temperatura ambiente por 24 horas, posteriormente se realizó
lectura de los halos de inmunodifusion. En ese tiempo el antígeno difundió
en forma radial a través de la agarosa que contiene el antisuero y formo un
anillo de precipitación.
RESULTADOS
Se puede observar que el antígeno difundió en forma radial a través de la agarosa
que contiene el antisuero y formo un anillo de precipitación cuyo diámetro es
proporcional a la cantidad de antígeno depositado en el pozo.
Dilución del antígeno 1:8
Dilución del antígeno 1:4
Dilución del antígeno 1:2
Antígeno sin dilución
DISCUSION
De acuerdo a los resultados obtenidos en la práctica y a literatura consultada es
preciso mencionar que la inmunodifusion radial es una técnica cuantitativa útil
clínicamente porque nos permite identificar las relaciones de concentración entre
el antígeno y el anticuerpo.
Ahora bien, un estudio realizado por Lic. Leonor Enríquez y colaboradores
indicaron que la prueba de inmunodifusion radial es una técnica muy útil porque
existe relación significativa entre antígeno-anticuerpo los cuales al coincidir
precipitaran dando lugar a la formación de halos.
Respecto a lo anterior también existe un estudio realizado por Esperanza G.
Miranda y colaboradores en donde se demuestra que la técnica de inmunodifusion
radial es útil para diferenciar anticuerpos post-vacunales de anticuerpos por
infección, en bovinos con revacunaciones repetidas de cepa S19 en donde
concluye que la relación de concentraciones de antígeno-anticuerpo diferencia las
vacas infectadas de aquéllas revacunadas repetidamente con dosis reducida de la
cepa s19.
CONCLUSIÓN
Esta técnica se basa en la difusión de la muestra conteniendo el antígeno a medir
en un matriz semisólida de agar en la que se encuentra disuelto el Ac especifico.
Si la concentración de Ac y Ag están en relaciones optimas (equivalentes) la
banda se formara en un punto intermedio, mientras que si la cantidad de Ag esta
en exceso necesitara recorrer una mayor distancia para alcanzar una dilución tal
que se encuentre en equivalencia con el Ac y asi la banda se formara mas cerca
del fondo.
Por lo tanto en la practica realizada se podría decir que estaba en equivalencia el
Ac con el Ag y se observo presipitacion
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CHIAPAS
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
CAMPUS IV, TAPACHULA
PROGRAMA EDUCATIVO:
LICENCIATURA EN QUIMICO FARMACOBIOLOGO
EXPERIENCIA EDUCATIVA:
INMUNOLOGIA I
TRABAJO:
REPORTE DE PRÁCTICA
DOBLE DIFUSION EN PLACA (TECNICA DE OUCHTERLONY)
INTEGRANTES DEL EQUPO:
BRANDON DANIEL REYES GONZALEZ
URI VAZQUEZ LOPEZ
CHRISTIAN AMERICA MORALES LOPEZ
SARAI ESCOBAR SUMUANO
CECILIA DEL CARMEN VELASCO ROMERO
CATEDRATICO:
DR. CRISPIN HERERA PORTUGAL
GRADO: 6° SEMESTRE
GRUPO: “B”
TAPACHULA, CHIAPAS 28 DE OCTUBRE DEL 2019
INTRODUCION
Las interacciones de un anticuerpo (Ab) con un antígeno (Ag) es la reacción
fundamental de la inmunología.
Ab + Ag → Ab-Ag.
La mayoría de los antígenos son proteínas. La identidad exacta de los grupos que
reaccionan con el anticuerpo generalmente no se conoce. Los antígenos
macromoleculares y los anticuerpos forman complejos que se vuelven insolubles y
precipitan. Esta propiedad hace posible realizar ensayos cualitativos y
cuantitativos en el sistema anticuerpo-antígeno. La precipitación ocurre con la
mayoría de los antígenos debido a que el antígeno es multivalente, es decir, tiene
varios determinantes antigénicos por molécula a los que se pueden unir los
anticuerpos. Los anticuerpos tienen al menos dos sitios de unión a antígeno, por lo
que se forman grandes agregados o retículos de antígeno y anticuerpo.
Experimentalmente, se agrega una cantidad creciente de antígeno a una cantidad
constante de anticuerpo en solución. Inicialmente a baja concentración de
antígeno, todo el antígeno está contenido en el precipitado. Esto se llama zona de
exceso de anticuerpos. A medida que se agrega más antígeno, la cantidad de
proteína precipitada aumenta hasta que las moléculas de antígeno y anticuerpo
están en una proporción óptima. Esto se llama zona de equivalencia, o punto de
equivalencia, donde ocurre la precipitación máxima. Cuando la cantidad de
antígeno en solución excede la cantidad de anticuerpo, la cantidad de
precipitación disminuirá. Esto se conoce como la zona de exceso de antígeno
Cuando los anticuerpos y antígenos se insertan en diferentes áreas de un gel de
agarosa, se difunden uno hacia el otro y forman bandas opacas de precipitado en
la interfaz de sus frentes de difusión. Las reacciones de precipitación de
anticuerpos y antígenos en geles de agarosa proporcionan un método para
analizar diversas reacciones anticuerpo-antígeno.
OBJETIVO
desarrollar el método precipitación en gel conocido como doble difusión
bidimensional o prueba de Ouchterlony para la identificación de proteínas.
MATERIAL
Agarosa fundida (3ml)
1 pipeta de 5 ml
1 vaso de precipitado de 250 ml
1 tripie con tela de alambre
Mechero
Placas de petri plásticas
Antígeno albúmina de huevo
Antígeno de suero humano
Anticuerpo antialbúmina de huevo
Tubo capilar
Jeringas de insulina
METODOLOGIA
1. Se colocó en una caja petri se agregó 2 ml de agarosa fundida, se colocó la
tapa, después se dejó solidificar la agarosa a temperatura ambiente, luego
se introdujo a la refrigeración por 10 minutos hasta que solidificara la
agarosa.
2. se trazó en una hoja milimétrica las medidas reales para usarla como
plantilla, la cual se colocó debajo de la placa para realizar los cortes con un
tubo capilar, se hicieron 5 cortes en forma de rosetas: uno central y cuatro
periféricos.
3. Con una jeringa de insulina se colocó en el pozo central una pequeña gota
del suero inmune del conejo (Anticuerpo) a manera de llenar el pocito, sin
derramar el contenido.
4. Con otras jeringas de insulina diferentes para cada uno, se colocaron en los
pozos laterales antígeno de suero humano y en los pozos de arriba y abajo
antígeno de albúmina de huevo.
5. Se tapó la caja y se cubrió alrededor con parafilm para evitar
contaminacion. Se dejó a temperatura ambiente de 24-48 horas al cabo de
las cuales se leyeron los resultados.
6. Tanto el antígeno como el anticuerpo se difunden en la capa del agar y al
encontrarse precipitan formando una banda de precipitación.
RESULTADOS
Se puede observar las bandas de precipitación que se forman al entrecruzarse
formando una gran matriz de agregados antígeno: anticuerpo. Esta técnica es muy
útil debido a que podemos determinar la existencia o no de determinantes
comunes entre anticuerpos según las características de las bandas formadas
Cuando las concentraciones colocadas en los pocillos estén cerca de la
equivalencia la banda se formará a mitad de distancia entre ellos.
Banda de
precipitación
DISCUSIÓN
De acuerdo a la literatura consultada y a los resultados en la práctica se
encontraron líneas de precipitación indicando el complejo antígeno-anticuerpo.
Vladimir Kubes menciona que la relevancia del empleo de esta técnica se
establece en determinar la existencia o no de determinantes comunes entre
anticuerpos según las características de las bandas formadas por lo que es de
importancia clínica debido a que, en esta, un único antígeno se combinara con su
anticuerpo homologo para formar una línea de precipitación. También menciona
que la cantidad de antígeno se añade de manera incrementada a una cantidad
constante de anticuerpo en solución. Inicialmente, a una baja concentración, todo
el antígeno participa en el precipitado, lo cual se conoce como una zona de
exceso de anticuerpo o fenómeno de prozona.
A medida que se añade más antígeno, la cantidad de proteína que precipita,
aumenta hasta que las moléculas de antígeno:anticuerpo alcanzan una proporción
óptima, llamada zona de equivalencia.
La zona de exceso se logra cuando la concentración del antígeno excede a la de
los anticuerpos, y la cantidad de precipitación disminuye (fenómeno de postzona).
CONCLUSION
Constituye un método muy completo ya que permite obtener más información que
los anteriores. En los pocillos que se le ha hecho a la placa de agar se le
adicionara pequeñas cantidades de Ac y el Ag. En este caso los reactivos
difunden en forma radial a partir del pocillo generando bandas de precipitación
cuyas características dependerán de varios factores. Mediante esta técnica
podemos determinar la existencia o no de determinantes comunes entre Ag según
las características de las bandas formadas. La posibilidad de hacer varios pocillos
en una placa permite obtener información sobre similitud de los Ag reaccionantes.
Por lo tanto se podría decir que en la práctica realizada el Ag fue reconocido por el
Ac de acuerdo a su concentración formando un alo alrededor de los pocillos y
estando así en equivalencia.
