Laboratorio de Bacteriología Médica
Practica #6 Detección Fenotípica de Producción de ΒlEE
(Β-Lactamasas de Espectro Extendido)
Objetivo: Emplear la prueba fenotípica para detectar la producción de β-lactamasas de espectro extendido
por el método de sinergia con doble disco de Cefotaxima y Ceftazidima con y sin ácido Clavulánico
Introducción: Las β-lactamasas son el principal mecanismo de resistencia bacteriana a los antibióticos
betalactámicos. Estas son enzimas catalíticas de naturaleza proteica cuya producción está controlada por un gen, bien
sea cromosómico o transferido por plásmidos o transposons. Las βLEE, son enzimas derivadas por mutaciones de las
betalactamasas clásicas del grupo 2b de la clasificación de Bush. Los diferentes tipos de BLEE confieren un grado de
resistencia muy variable, la intensidad de hidrólisis de un determinado antibiótico difiere según las cepas
consideradas, pudiendo incluso no tener efecto fenotípicamente detectable en algunos casos en los que únicamente
tiene lugar un aumento de la concentración inhibitoria mínima (CIM). Las βLEE están presente principalmente en
enterobacterias resistentes a betalactámicos, se aislaron por primer vez de E. Coli y Klebsiella son enzimas capaces
de hidrolizar las penicilinas, todas las cefalosporinas (menos las cefamicinas) y las monobactamas, pero no las
carbapenemas. Además, se caracterizan por ser inhibidas por el ácido clavulanico, sulbactam y tazobactam.
Material:
Cajas petri Sensidiscos CAZ/CLA-Ceftazidima/Ácido Clavulánico
Agar Müeller – Hinton Sensidiscos CTX30-Cefotaxima
Vernier o regla graduada en mm Sensidiscos CTX/CLA-Cefotaxima/Ácido Clavulánico
Hisopos estériles
Pinzas
Sensidiscos CAZ30-Ceftazidima
Procedimiento: Para determinar la presencia de βLEE
1.- Inocular con el método de estriado las placas de el tamaño de las zonas de inhibición
agar Mueller-Hinton con la finalidad de obtener
colonias aisladas. Incubar durante 24 horas a 36°C. deben ser más grandes en presencia de
2.-Estandarizar el inóculo bacteriano, para ello se ácido clavulánico al menos 5mm. Es
procede a tomar de 1 a 5 colonias aisladas (cultivo de decir, la diferencia entre los halos de
18 a 24 horas) y disolverlas en solución salina estéril inhibición del antibiótico en presencia o
0.85% (agitar constantemente para evitar formación
de grumos). Se debe ajustar la turbidez de la no del ácido clavulánico debe ser ≥ 5
suspensión bacteriana tomando como referencia el mm para considerarse como βLEE (+).
estándar 0,5 de McFarland.
3.- Sembrar de forma masiva el agar Mueller-Hinton
(4mm de espesor). Para ello, sumergir un hisópo
estéril en la suspensión bacteriana y retirar el exceso
oprimiéndolo contra la pared del tubo. Se debe
asegurarse el cubrir toda la superficie de la placa.
5.- Esperar entre 3 a 5 minutos para que se absorba el
inoculo antes de aplicar los discos.
6.-Colocar (pinzas estériles o aplicador) y presionar
los discos de antibióticos sobre la superficie de la
placa de agar (deben ser distribuidos de forma
constante y no deben quedar a menos de 24 mm de
distancia entre centros).
7.- Invertir las placas para incubar a 36 ºC durante 18-
24 hrs.
8.- Medir el diámetro de las zonas de inhibición
(pasando por el centro del disco).
