LABORATORIO DE BIOQUÍMICA.
SÁBADO 13:00-16:00, - 2020A
Informe de Laboratorio Nº1 Profesor: Yamil Liscano
ESPECTROFOTOMETRÍA
Steven Perdomo, Leidy Quevedo, Karen Guayara.
Facultad de ciencias básicas, Departamento de Química
Universidad Santiago de Cali
Cali, Fecha 07 de marzo 2020
Resumen: La espectrofotometría UV-visible es una técnica analítica que permite determinar la concentración
de un compuesto en solución. En la práctica de laboratorio se realizó una curva de calibración y un barrido
espectral con los cuales se logró determinar el comportamiento de cada una de las soluciones (permanganato
de potasio y rojo Congo más azul de bromotimol) y finalmente aplicando la ley de Beer-Lambert se
determinó la concentración de una muestra problema. Para realizar el barrido espectral se realizaron lecturas
cada 30 nm de 400 a 700 nm determinado así la longitud de onda de máxima absorbancia para cada
solución, con la cual se realizó la curva de calibración. Se encontró una concentración de 12,5 mg/L para la
muestra problema.
PALABRAS CLAVE: Absorbancia, espectro, solución.
1. Introducción La ley de Beer-Lambert también puede expresarse de la siguiente
manera:
La espectrofotometría es una técnica instrumental que se utiliza
para medir cuanta luz absorbe una sustancia química, la A=k . c 3
intensidad de la luz es medida mediante la ley de Beer-Lambert;
el principio básico de esta técnica es que todos los compuestos Al expresarse de esa manera, se asemeja mucho a una ecuación
absorben o transmiten luz a determinada longitud de onda; el de una línea recta y = mx + b sin el término b que representa el
principio subyacente de la espectrofotometría dice que el color de intercepto, esto indica que los patrones estarán representados y
la solución es una medida de la cantidad del material que esta las muestras problemas estarán representados sobre una recta y el
posea, lo que indica que por el color se puede determinar a blanco estará siempre representado en el punto de origen de la
simple vista que tan concentrada está una solución, siendo la de gráfica3. El objetivo de la práctica fue aplicar la ley de Beer-
un color más intenso, la solución más concentrada1. Lambert en un indicador, en este caso azul de bromotimol, para
obtener su espectro visible, y obtener la concentración de una
Un segundo principio de la espectrofotometría indica que cada muestra problema medida a la longitud de onda de máxima
sustancia absorbe o transmite a ciertas longitudes de ondas de absorbancia.
energía radiante pero no a otras longitudes de onda; como
ejemplo se encuentra la clorofila que siempre absorbe la luz roja
y violeta, mientras que transmite luz amarilla, verde y azul; la
2. Objetivos
energía de luz absorbida o transmitida debe coincidir de manera
exacta con la energía necesaria para una transición (un • Determinar por medio de espectrofotometría UV/VIS
movimiento de un electrón de un nivel cuántico a otro) en la los máximos de absorbancia de las muestras.
sustancia considerada; además de que se debe tener en cuenta que
solo ciertos fotones satisfacen la condición de energía es por esto • Analizar una muestra problema de KMnO4 por medio
que se dice que cada sustancia tiene una longitud de onda de de espectrofotometría UV/VIS y por medio del método de
absorción y transmisión característica1. cuantificación de estándar externo, determinar la concentración.
En la espectrofotometría es muy común el uso de la ley de Beer-
Lambert para poder determinar la concentración de una solución, 3. Metodología
dicha ley está expresada por la siguiente ecuación matemática 2:
Se prepara la muestra de rojo Congo y azul de bromotimol en
solución buffer pH 7,5; tomando un mL de cada una y
I
A=−log 10 ( )
I0
=¿ ε . L. c ¿2 depositándolos en un tubo de ensayo, se lleva el volumen a 10
mL con agua destilada.
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Se prepara la muestra de KMnO4 depositando un mL en un tubo El azul de bromotimol también posee grupos cromóforos debido
de ensayo y llevando el volumen a 10 mL con agua destilada. a la presencia de electrones de no enlace, grupos OH, entre otros.
El viraje de color se debe al medio, en medio básico el azul de
Se realiza un barrido espectral de 400 nm a 700 nm con bromotimol presenta una tonalidad azul, en medio ácido varia
intervalos de 30 nm entre medidas, se usa como blanco agua debido a que se empiezan a desprotonar los grupos OH. De igual
destilada. forma que el rojo Congo, se observa el color complementario,
por ende, el colorante absorbe en un rango de longitud de onda de
Se realiza una curva de calibración por método de estándar 590-625 nm.
externo de KMnO4, se preparan 10 mL de solución con las
siguientes concentraciones: 2,5 g/L, 5g/L, 10g/L, 15g/L, 20g/L, La solución de KMnO4 posee gran cantidad de electrones de no
30g/L y 40g/L. se toman las lecturas de cada una en el enlace que pueden hacer transiciones electrónicas en el espectro
espectrofotómetro a 520nm. visible, por lo cual tiene una tonalidad oscura. Según la ley de
Lambert-Beer la concentración de una sustancia es proporcional
Se analiza en el espectrofotómetro una muestra problema de a la cantidad de luz que absorbe según se demuestra en la
KMnO4. formula.
Se grafican los resultados. El máximo de absorbancia encontrado es el registrado en la
literatura e implementando el método de adición de estándar
4. resutados externo, se pudo realizar la cuantificación de una muestra
problema. los resultados obtenidos concordaron con los datos
De la grafica se obtuvo una pendiente de 0,0205 y un teóricos de la curva de calibración obteniendo un resultado de
intercepto de 0,0471. correlación aceptable.
Para calcular la concentracion en la muestra proble se aplico
la ley de Lambert-Beer con la ecuación de la recta 6. Conclusiones
y=mx + b. despejando x se obtiene que x= (y-b)/m Con la realización de la práctica se concluye que los espectros
de absorción visible son totalmente diferentes a cada una de
En la tabla 4 se tiene que la absorbancia de la muestra es de las sustancia que se efectuó, los cuales fue el KMnO 4 y la
0,303 mezcla de azul de bromotimol y rojo congo.
Aplicando la formula se obtiene que La muestra a analizar para la determinación de longitud de onda
fue el KMnO4, lo cual se agregó una sola concentración a
x=(0,303-0,0471)/0,0205 = 12,48 g/L diferentes longitudes de onda en la cual su pico más alto nos
indica su absorción máxima que fue de 520nm.
Se obtuvo un error porcentual de
%E= (|12,48-12,5|/12,5)*100 = 0,16% Para comprobar la ley de Beer-Lambert después haber
determinado la longitud de onda de la sustancia KMnO 4, se
disolvió esta sustancia a diferentes concentraciones con una
5. Análisis de resutados absorbancia de 520nm y teniendo una concentración problema de
12,5 g/L para determinar su absorbancia en el rango que se
Durante las lecturas en el espectrofotómetro de la mezcla del rojo obtuvó.
Congo y el azul de bromotimol a pH 7,5; se pudo evidenciar la
presencia de dos picos en la grafica 2. En este caso, se pudo Referencias
aplicar la ley de Lambert-Beer para una mezcla pues, no
interacción entre los dos colorantes. (Rubinson & Rubinson, 1. El espectrofotómetro. (2017). Espectrofotometría.
2002). El rojo Congo es un colorante que absorbe radiación Recuperado de:
electromagnética en el espectro visible ddebido a la presencia de [Link]
grupos cromoforos como los diazos (N=N). La tonalidad rojiza 2. Rubinson, K., & Rubinson, J. (2002). Análisis
del colorante se debe a que absorbe radiación electromagnética instrumental. Madrid: Prentice Hall.
entre 470-500 nm, sin embargo, en ese rango de longitudes de 3.
onda, no se absorbe el color rojo sino entre verde y azul, pero por
fenómenos ópticos, el color observado es el rojo porque es el
complementario a los nombrados anteriormente, por este motivo Anexos.
se puede ver la solución de color rojizo en pH básico
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Barrido espectral KMnO4
0.3
0.25
Absorbancia
0.2
0.15
0.1
0.05
0
350 400 450 500 550 600 650 700 750
Longitud e onda en nm
Gráfica 1. Espectro del KMnO4 evidenciando el pico más alto en
la longitud de onda de 520nm
Tabla 1 Descomposición del espectro en colores de acuerdo con la
radiación electromagnética
7. Metodología Longitud de Absorbanci
onda λ a
Para la realización de la práctica se realizó una disolución
400 0.92
estándar para determinar el espectro de la absorción de la muestra
problema. 430 0.906
460 0.912
Longitud de Absorbanci 490 0.984
onda λ a 520 0.971
400 0.04 550 0.989
430 0.025 580 1.205
460 0.052 610 1.594
490 0.132 640 1.177
520 0.244 670 0.314
550 0.242 700 0.049
Tabla 3. Determinación de los espectros de azul de bromotimol y
580 0.088 rojo congo pH 7.5
610 0.033
640 0.028
670 0.021
700 0.013
Tabla 2. Determinación de los espectro de absorción de la
sustancia KMnO4
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Barrido espectral rojo congo + azul de Curva de calibración KMnO4
bromotimol pH 7,5 1
0.8
Absorbancia
1.8 f(x) = 0.02 x + 0.05
1.6 0.6 R² = 1
1.4 0.4
1.2 0.2
Absorbancia
1 0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
0.8
0.6 Concentracion g/L
0.4
0.2
0 Gráfica 3. Curva de calibración KMnO4
350 400 450 500 550 600 650 700 750
Longitud de onda en nm
Gráfica 2. Absorbancia vs longitud de onda
Concentracion concentracion
real g/L Absorbancia
2,53 2,5 0,099
4,68 5 0,143
9,80 10 0,248
16,53 15 0,386
18,73 20 0,431
30,39 30 0,67
39,90 40 0,865
muestra 12,5 teorica 0,303
Tabla 4. Curva de calibración KMnO4
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