INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLOGICAS
PRÁCTICA: DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD DE ENZIMAS PROTEOLITICAS. METODO DE KUNITZ
INTRODUCCIÓN: 0.7
Las enzimas son catalizadores biologicos selectivos, 0.6
f(x) = 20 x + 0.39
Abs corregida a 280nm
catalizan las reacciones de las rutas metabolicas 0.5 R² = 0.75
centrales, necesarias para mantener la vida, son muy
0.4
especificas para los reactivos o sustratos sobre los que
actuan, las proteasas son enzimas que rompen los 0.3
enlaces peptidicos que conforman las proteinas, por lo 0.2
que se dice que tienen actividad proteolitica. Entre los
0.1
metodos mas utilizados en la determinacion de este tipo
de enzimas es el metodo de Kunitz, el método se basa en 0
0 0 0 0.01 0.01 0.01 0.01
el cambio de solubilidad de una proteína en ácido
tricloroacetico (ATC) cuando está sujeta a la acción de Unidades Tripticas mg/mL
una enzima proteolítica. Mide la cantidad de péptidos
y/o aminoácidos que sean solubles durante la hidrólisis.
0.7
Dichos compuestos, o al menos algunos, absorberán a
280 nm. 0.6
f(x) = 1.07 x + 0.39
OBJETIVOS: 0.5 R² = 0.75
Absorbancia
Elaborar una curva estandar de actividad 0.4
enzimatica
0.3
Determinar la actividad proteolitica de la
bromelaína, la papaína y otras proteasas. 0.2
0.1
RESULTADOS:
0
Tabla 2:1:Actividad enzimática específica para la 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14 0.16 0.18 0.2 0.22
Tabla Actividad enzimática de la tripsina
digestión
Concentración de caseína por tripsina A280 Concentracion en mg/mL de proteina
Tubo Unidades
de tripsina mg/mL Problema As Testigo
280 corregida
T1 yTubo
1 Trípticas
0.04 (UT) 0.476 corregida
0.034 0.442 Figura 1: Grafica de la actividad enzimática de tripsina
T2 y 21 0.00213
0.08 0.54 0.442
0.026 0.514 Figura 2: Curva de actividad enzimática específica para
T3 y 3 2 0.00426
0.12 0.492 0.514
0.022 0.47 la digestión de caseína por tripsina.
T4 y 43 0.00639
0.16 0.555 0.4700.019 0.536
T5 y 54 0.00852
0.2 0.672 0.5360.028 0.644 CALCULOS:
5 0.01065Problemas 0.644
TI y I Bromelaína 1:10 0.949 0.114 0.835 [ UT ] = m = 1.065 =0.05325 en 1 mg de proteina
TII y II Bromelaína 1:20 0.673 0.08 0.593 t 20
TIII y III Papaína 1:2 0.977 0.258 0.719
TIV y IV Papaína 1:4 0.588 0.127 0.461 UT: Unidades Trípticas.
t: Tiempo que duro el experimento.
m: Pendiente de la ecuación de la recta obtenida de la
Figura 1
y=1.065 x +.3934 (1)
Pero ahora, ¿Cuántas UT hay en las cantidades
ensayadas? Se realiza la siguiente proporcionalidad.
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0.05325 UT =1 mg de proteina
0.00213 UT =.04 mgde proteina
Actividad específica en UTs por gramo de muestra de la
Papaína dilución 1:2
Bromelaína y la papaína:
y=20 x +.3934 (2)
Bromelaína, dilución 1:10
Despejando a x tenemos
Usando la ecuación de la recta obtenida de la Figura 2
.719−.3934
x= =.01628UT
y=20 x +.3934 (2) 20
Dónde:
Y: absorbancia. Multiplicando por el factor de dilución de la muestra y
X: UT. por la cantidad de extracto de piña obtenemos:
Despejando a x tenemos .01628∗2=.03256 UT.03256∗28 mL=.911UT /mL
.835−.3934 25 g
x= =.02208UT =27.42UT /gr
20 .911 UT
Multiplicando por el factor de dilución de la muestra y Para la dilución 1:4
por la cantidad de extracto de piña obtenemos:
y=20 x +.3934 (2)
.02208∗10=.2280 UT.2208∗29 mL=6.70UT /mL Despejando a x tenemos
25 g .461−.3934
=3.40UT / gr x= =.00338 UT
6.70UT 20
Para la dilución 1:20 Multiplicando por el factor de dilución de la muestra y
por la cantidad de extracto de piña obtenemos:
y=20 x +.3934 (2)
Despejando a x tenemos .00338∗4=.01352UT
.01352∗28 mL=.3786 UT /mL
.0117−.3934
x= =.02208 UT
20 25 g
=66.03UT / gr
.3786UT
Multiplicando por el factor de dilución de la muestra y
por la cantidad de extracto de piña obtenemos: DISCUSIÓN:
.0117∗20=..234 UT.2208∗28 mL=6.78UT /mL La tripsina, es una enzima de tipo proteasa, clasificada
dentro de las endopeptidasa, rompe al péptido en
25 g posiciones donde está el carboxilo terminal, teniendo
=3.68UT / gr
6.78UT especificidad por las uniones donde se encuentran los a.a
(a.a: aminoácidos) Arginina y Lisina, naturalmente se
encuentra en el páncreas y secretada en el duodeno.
Mientras que la papaína, es una proteasa que se
encuentra en la papaya (Carica papaya) posee baja
especificidad hidroliza tanto proteínas como péptidos de
pequeño tamaño, posee más preferencia por partes donde
se encuentran a.a básicos como leucina, glicina así como
arginina, lisina y fenilalanina, es activada por la cisteína.
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Por último la bromelaína, es una enzima del grupo de las Otra razón por la que los valores de UT son altos puede
cisteino proteasas que se encuentra naturalmente en la ser la activación de la papaína por la cisteína que se
piña (Ananas comosus), actúa sobre aminoácidos básicos agregó antes del experimento, para poder favorecer un
y aromáticos de las proteínas, en la industria alimentaria ambiente reducido, al estar activada la enzima puede
se utiliza como ablandador de carne. llevar de manera más eficiente las reacciones
enzimáticas.
Dado que las enzimas dependen mucho de la
especificidad hacia los sustratos, la cantidad de proteína La figura 1 describe el cambio de absorbancia a las
que hidrolizan depende de lo mismo, pues a mayor diferentes concentraciones de proteína, caseína, se puede
afinidad tenga una enzima por el sustrato, mayor será la ver que a mayor cantidad de proteína que está
cantidad de producto que se obtenga por acción reaccionando con la enzima, mayor es el valor de
enzimática, la unidad con la que estamos midiendo la absorbancia obtenido, esto se debe a que al haber una
actividad de las enzimas proteolíticas son las unidades cantidad mayor de proteína, habrá por consecuencia una
trípticas [UT], que se definen como “cantidad de enzima cantidad mayor de residuos de a.a libres en la solución.
que origina, bajo las condiciones experimentales, un Detectados por el espectrofotómetro.
aumento de una unidad de absorbancia a 280nm, por
CONCLUSIONES:
minuto de digestión” donde ese aumento de absorbancia
lo interpretaremos como los residuos de a.a resultantes 1. Se puede obtener una curva de actividad enzimática
del proceso enzimático. Por lo tanto a mayor valor de estándar que sea independiente de la enzima
absorbancia obtenido a la longitud de onda de 280nm se proteolítica siempre y cuando se utilice el mismo
puede decir que la cantidad de proteína hidrolizada fue sustrato y las mismas condiciones experimentales
mayor, en la tabla 2 se pueden ver los valores de UT (pH, Temperatura, etc.)
obtenidos para la enzima tripsina, estos valores son los 2. -Se obtuvo una actividad enzimática para tripsina de:
0.0532 UT/mg
más bajos si los comparamos con los valores de UT a las
3. -Se obtuvo una actividad enzimática para bromelaína
diferentes diluciones para las enzimas de bromelaína y de: 3.90 y 3.68 UT/g. (respectivamente para dilución
de papaína (ver cálculos). Por lo que podemos decir que 1:10 y 1:20).
para la proteína cisteína es un mal sustrato para la 4. -Se obtuvo una actividad enzimática para papaína de:
tripsina, pero es un buen sustrato para la papaína y para 27.42 y 66.03 UT/g (respectivamente para dilución
la bromelaína. 1:2 y 1:4).
La preferencia que tienen estas dos enzimas por
diferentes a.a y la concentración, causo que los valores BIBLIOGRAFIA:
para bromelaína y papaína fueran más altos que los
1. Horton, H. Moran, L. 2008. “Principios de
valores para tripsina, pues ambas enzimas, pueden Bioquímica”. 4° Edición. Editorial Pearson
hidrolizar a.a básicos y aromáticos, sin embargo, cuando Educación de México. México. pp 129-130
se habla en términos de eficiencia la bromelaína es más 2. Cinéticas enzimáticas de actividades proteolíticas de
eficiente que la papaína pues al hacer una dilución 1:10 productos utilizando látex de papaya (Carica papaya)
y 1:20 se está disminuyendo 10 y 20 veces la para lograr el ablandamiento de la carne. Ramírez
concentración de la bromelaína obteniendo valores de Karla; Cruz y Victoria M.C Fecha de consulta:
UT de 3.40 y 3.68 respectivamente, a comparación de 08/02/19, disponible en. https://smbb.mx/congresos
las diluciones 1:2 y 1:4 para papaína, donde se %20smbb/morelia07/TRABAJOS/Area_III/Carteles/
disminuye 2 y 4 veces la concentración de la enzima en CIII-8.pdf
la solución; obteniendo valores de UT de 27.42 y de 3. Desarrollo de la actividad de la tripsina pancreática
66.03 aunque los valores de UT para la papaína son en conejos alimentados con dieta comercial y dieta
mayores, se destaca que la concentración para la misma experimental Cordova Torres, A.V.; Aguilera
Barreyro, A.; Hernández Jaramillo S., Bernal Santos,
fue mayor que para la bromelaína, por lo tanto se
G; Reis de Souza, T.C.; Guerrero Carrillo, M.J. Fecha
necesita de una concentración y cantidad más elevada de
de consulta: 08/02/19, disponible en:
papaína para obtener un valor alto que de bromelaína.
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PRÁCTICA: DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD DE ENZIMAS PROTEOLITICAS. METODO DE KUNITZ
https://www.uaq.mx/investigacion/difusion/veranos/
memorias-2007/30_6UAQCordovaTorres.pdf
4. Cinética de la bromelaína obtenida a partir de la piña
perolera (Ananas Comosus) de Lebrija-Santander
Clavijo Diego , Portilla Martínez Maghdiel
Cecilia ,Quijano Parra Alfonso fecha de consulta:
08/02/19, disponible en:
https://www.redalyc.org/pdf/903/90326388008.pdf
