PRACTICA 6
Tinciones Bacterianas Compuestas
1.Objetivos
- Aplicar algunos de los métodos de coloración, basándose en las propiedades estructurales de las
bacterias para observación de estructuras internas y externas de los microorganismos.
- Familiarizarse con las bases químicas y teóricas de la técnica de coloración diferencial de Gram.
- Describir las características morfológicas y tintoriales de las estructuras observadas.
- Adquirir destreza en la preparación de frotis bacterianos.
2.Materiales
Microscopio.
Papel para limpiar lentes.
Láminas o portaobjetos.
Asas bacteriológicas.
Mechero de bunsen.
Bandeja de coloración.
Baño serológico.
Pinzas de madera.
Papel absorbente.
Solución Salina estéril.
Hisopos.
Goteros.
Aceite de inmersión.
3. Reactivos
Reactivos de coloración de Gram.
Reactivos para coloración de Ziehl-Neelsen.
Reactivos para coloración de esporas.
Reactivos para coloración de cápsula.
Reactivos para coloración de flagelos.
Reactivos para coloración de gránulos.
Cultivos bacterianos de 24 horas.
Vacuna de BCG.
4. Marco Teórico
La morfología de los microorganismos puede ser observada a partir de preparados frescos o fijados y teñidos
por algunos de los métodos de tinción conocidas, ya que por su misma estructura son difíciles de visualizar en
su estado natural. Las tinciones biológicas y los procedimientos de tinción en unión con la microscopía de luz
son una herramienta básica importante en microbiología, permitiendo estudiar las propiedades de los
microorganismos y su división en grupos específicos para propósitos diagnósticos.
En algunas ocasiones se hace necesario fijar los microorganismos y durante este proceso se produce la muerte
celular debido a la coagulación del protoplasma, preservándose la morfología celular además de adherirlos a
la lámina. El agente más utilizado para fijar es el calor, aunque puede también utilizarse alcohol y otros
compuestos químicos que frecuentemente permiten una mejor diferenciación de los detalles como las
soluciones de etanol-éter, alcohol sublimado (Cloruro de Mercurio II, Etanol absoluto y agua destilada), y
solución de ácido Ósmico (vapores).
En el laboratorio de microbiología se utilizan diversos métodos de tinción o coloración para visualizar los detalles
morfológicos de las bacterias, algunas de las coloraciones más empleadas en microbiología son: coloración de
Gram, coloración de Ziehl-Neelsen, coloración de Alberth, Coloración de Stoltemberg, coloración de Hiss,
coloración de Dorner, etc.
Químicamente un colorante se define como un compuesto orgánico que contiene un grupo benceno más un
grupo cromóforo y un auxocromo. Un cromóforo es un grupo químico que imparte color al benceno (solvente
orgánico) mientras un auxocromo es un grupo químico que le confiere la propiedad de ionización al cromógeno,
capacitándolo para formar sales y unirse a fibras o tejidos. La habilidad de un colorante para unirse a
macromoléculas de componentes celulares (proteínas, ácidos nucleicos, etc.) radica en la carga eléctrica tanto
de la porción cromogénica como del componente celular a teñir.
Los colorantes ácidos son aniónicos, es decir que en forma ionizada la porción cromogénica exhibe una carga
negativa que tendrá afinidad por los constituyentes de la célula cargados positivamente. Las proteínas,
componentes celulares cargados positivamente se unirán y aceptarán el color de un cromógeno aniónico
cargado negativamente de una tinción ácida.
Los colorantes básicos son catiónicos, es decir la ionización de la porción cromogénica exhibe una carga
positiva lo cual permite una fuerte afinidad por los constituyentes de la célula cargados negativamente. Los
ácidos nucleícos, componentes celulares cargados negativamente, se unirán y aceptarán cromógenos
catiónicos cargados positivamente; un ejemplo es el azul de metileno.
Los colorantes básicos son los más comúnmente empleados para tinciones bacterianas, la presencia de carga
negativa en el exterior celular, repele los colorantes ácidos y evita su penetración en la célula. La siguiente tabla
resume algunas técnicas de tinción y los propósitos de cada una:
TIPOS DE TÉCNICAS DE TINCIÓN
Tinciones Diferenciales Tinciones Simples
Emplea dos colorantes: tinción y contraste Usa un solo colorante
Separación en Grupos Visualización de Estructuras Para visualización de:
Tinción de flagelos. Morfología microscópica (cocos,
Tinción de Gram. Tinción de cápsula. bacilos, espirales) y arreglos o
Tinción ácida-rápida. Tinción de esporas. agrupaciones (cadenas, pares,
Tinción nuclear. tétradas, etc.)
TINCIÓN DE GRAM
Nombrada así en honor al bacteriólogo Christian Gram. Clasifica y diferencia las bacterias en dos grupos
principales: Gram positivas y Gram negativas. La tinción emplea 4 reactivos diferentes:
1. Cristal Violeta: Colorante primario de color violeta, su función es dar color a todas las células.
2. Yodo de Gram (Lugol): Reactivo que sirve como mordiente, formando un complejo cristal violeta-yodo (CV-
I) insoluble por unión al colorante primario. Sirve para intensificar el color en la tinción. En este punto todas
las células permanecerán violeta oscuro. Solo en células Gram positivas, el complejo se une al componente
ácido ribonucléico-magnesio de la pared celular (Mg-ARN-CV-I), este complejo resultante es más difícil de
remover que el complejo más pequeño cristal violeta-yodo.
3. Alcohol etílico al 95% o Alcohol-acetona (etanol 95% y acetona 70:30): Agente decolorante. Un agente
decolorante puede o no remover el colorante primario de la célula entera o solo de ciertas estructuras
celulares.
Tiene doble función, como solvente de lípidos y como agente deshidratante de proteínas. Su acción en el
procedimiento está determinada por la cantidad de lípidos de la envoltura celular. En células Gram positivas,
la baja concentración de lípidos es importante para retener el complejo Mg-ARN-CV-I, siendo los lípidos
disueltos por el agente decolorante, formándose pequeños poros de pared celular que son cerrados por la
acción deshidratante del alcohol. Como consecuencia la tinción primaria se une fuertemente y es difícil de
remover, permaneciendo las células de color púrpura. En células Gram negativas, la alta concentración de
lípidos en la capa externa es disuelta por el alcohol formándose grandes poros que no cierran a causa
también de la deshidratación de las proteínas. Así se facilita la liberación del complejo CV-I dejando a las
células decoloradas o desteñidas.
4. Safranina: reactivo de contratinción. Tiene un color de contraste al colorante primario (rojo). Si después de
la decoloración el colorante primario ha sido lavado los componentes decolorados de la célula tomarán el
color del colorante de contraste. Solo las células Gram negativas, que se decoloran, absorben el color rojo
del colorante de contraste, mientras las células Gram positivas retienen el color púrpura del colorante
primario.
Recuerde:
Lo más crítico del procedimiento es el paso de decoloración, si el este paso no se remueve completamente
los complejos CV-I, organismos Gram negativos aparecerán falsamente como Gram- positivos.
Es imperativo remover completamente con agua el reactivo anterior de manera que se preparare la lámina
para el subsiguiente reactivo.
Preparaciones teñidas con Gram se realizan con cultivos frescos, es decir hasta con 24 horas de cultivo.
Cultivos viejos y especialmente de bacterias Gram positivas tienden a perder la habilidad para retener el
colorante primario apareciendo “Gram variables”, es decir algunas células púrpura y otras rojas.
Un frotis grueso causa decoloración inadecuada.
Un tiempo excesivo de decoloración puede llevar a la observación errónea del color tomado por las bacterias.
La remoción de frotis durante el secado puede eliminar la muestra de la lámina.
Procedimiento Para Tinción De Gram:
1. Realice el frotis con la técnica adecuada y fíjelo al calor.
2. Vierta sobre el frotis cristal violeta y déjelo actuar por 1 minuto.
3. Lave con agua de la llave y escurra.
4. Cubra ahora el frotis con Lugol (iodo de Gram) y deje actuar por 1 minuto.
5. Lave con agua de la llave y escurra.
6. Cubra ahora con solución decolorante (alcohol-acetona) por 30 segundos.
7. Lave con agua de la llave y escurra.
8. Cubra ahora con colorante de contraste (Safranina o fuschina) y deje actuar por 45 segundos.
9. Lave con agua de la llave y escurra
10. Permita que se seque al aire dejando la lámina en posición inclinada.
11. Observe al microscopio.
TINCIÓN DE ZIEHL-NEELSEN (ZN)
Se usa para bacterias que no se tiñen fácilmente por los colorantes corrientes debido a su alto contenido de
lípidos en la pared celular (Mycobacterium). Se fundamenta en que las bacterias ácido-alcohol resistentes, en
especial las Mycobacterias por su composición de pared, difícilmente toman los colorante, pero una vez teñidas,
retienen el color y no lo pierden aún por la acción energética de los ácidos. Los bacilos ácido alcohol resistentes
se tiñen de rojo por la carbol-fuscina y los microorganismos restantes se tiñen de azul por el colorante de
contraste.
Técnica De Coloración de Z-N:
1. Cubrir la preparación con fuschina y calentar hasta la emisión de vapores. Mantener así por 10 minutos
evitando el secado del colorante sobre la preparación.
2. Lavar con agua.
3. Decolorar completamente con alcohol-ácido.
4. Lavar con agua.
5. Cubrir con azul de metileno por 2 minutos.
6. Lavar con agua y colocar en posición vertical, dejar secar y observar al microscopio con el objetivo de 100X.
NOTA: la coloración de KENYOU es igual que la coloración de Ziehl-Neelsen, sólo difiere en que no es
necesario calentar la fuschina la cual es más concentrada, los demás colorantes son exactamente iguales
TINCIÓN DE ESPORAS
Cuando el medio ambiente de las bacterias se torna desfavorable, muchas de ellas entran en latencia, algunas
especies bacterianas forman esporas, para contrarrestar la adversidad del medio con la deshidratación, el calor,
el frío, o la escasez de nutrientes. Si las condiciones ambientales retornan a la normalidad, la espora absorbe
agua, rompe la pared interna y la célula bacteriana viva vuelve a surgir por el proceso de germinación.
Las esporas están formadas por una cubierta alrededor del ADN y una pequeña porción de citoplasma dentro
de ella; esta estructura posee una mayor resistencia a los agentes físicos y químicos que la célula vegetativa.
El diámetro de la espora con respecto a la célula bacteriana y la posición que ocupa dentro de ella son
características distintivas de las especies.
Las esporas no se colorean por métodos corrientes por consiguiente se recurre a métodos de coloración
especiales para su observación. Algunas coloraciones para esporas son: Coloración de Möller y de Schaeffer-
Fulton.
Schaeffer Fulton: En este tipo de tinción se utiliza como colorante primario el Verde de Malaquita y uno de
contraste (Safranina o Fucsina).
Por medio de esta técnica se pueden diferenciar las endosporas producidas por algunos géneros de bacterias
y la célula vegetativa. De acuerdo con ella, se aplica el colorante primario en solución acuosa al espécimen y
se le hace vaporizar para incrementar la penetración de los recubrimientos relativamente impermeables de las
esporas. Las esporas sometidas correctamente al método resistirán la sustitución por el colorante de contraste
y a menudo se podrán observar ESPORAS VERDES DENTRO DE CÉLULAS ROJAS. En esta forma se puede
determinar la ubicación intracelular (terminal, subterminal y central), de la endospora de ciertos
microorganismos y usarse también con fines taxonómicos.
Técnica de coloración de Schaeffer Fulton:
1. Prepare el frotis y fíjelo al calor
2. Agregue unas gotas de Verde de malaquita hasta cubrir totalmente la preparación; caliente por 5 minutos
hasta que se observe la emisión de vapores, pero sin dejar hervir ni secar el colorante. La placa puede ser
cubierta con papel filtro para evitar salpicaduras y siempre tenga en cuenta que el montaje debe estar lo
suficientemente húmedo.
3. Deje enfriar y lave con agua destilada
4. Contracolorear con Safranina al 0,5 % por 1 minuto
5. Retire el exceso de colorante lavando con agua destilada
6. Deje secar al aire
7. Realice la observación al microscopio con objetivo de inmersión y dibuje lo observado.
Técnica De De Coloración De Método De Möller:
1. Realice un frotis de la muestra en estudio, déjelo secar al aire y fíjelo
2. Cubra el frotis con fuschina carbólica de ZN y caliéntelo hasta que desprenda vapores. Tenga cuidado de
no dejar secar ni hervir el colorante. Continúe este proceso por 5 minutos.
3. Lave con agua
4. Decolore con ácido sulfúrico al 1%.
5. Lave con agua.
6. Cubra con azul de metileno de Löeffler durante 2 minutos.
7. Lave con agua, deje secar y observe al microscopio en objetivo de inmersión.
Las esporas aparecen rojas y las células vegetativas de color azul
TINCIÓN DE CÁPSULA
Tinción negativa: En esta tinción se puede identificar la estructura externa que envuelve a algunas bacterias
como Klebsiella sp, Streptococcus pneumoniae y Clostridium perfringens. Utiliza como colorante primario tinta
china o nigrosina
La técnica de tinción negativa incorpora materiales como la tinta china, que se compone de partículas
demasiado grandes para penetrar en la célula; después de haber utilizado el colorante primario se adiciona el
de contraste que penetra fácilmente a la célula bacteriana. Al examinar la preparación, la cápsula aparecerá
como una zona transparente que rodea a la pared celular. No se puede afirmar con certeza absoluta que todas
las regiones claras observadas sean cápsulas, debido a que el encogimiento de las células o la recesión o
separación de la tinta china pueden producir resultados anormales. Sin embargo, en general, cuando un frotis
tratado presenta muchas zonas transparentes con siluetas uniformes, es posible que sean reales y no
artificiales.
Técnica de tinción de Negativa:
1. Sobre un portaobjetos limpio y desengrasado deposite en un extremo una gota de tinta china.
2. Tome una gota del cultivo y mezcle a lo largo del portaobjetos (técnica del frotis sanguíneo). También puede
mezclar en un tubo, partes iguales de cultivo y tinta china.
3. Tome la muestra, suspéndala sobre la lámina y realice el extendido.
4. Deje que el extendido seque naturalmente (nunca fije al calor).
5. Cubra con Safranina por 10 segundos y luego retire el exceso de colorante con agua destilada muy
cuidadosamente para no eliminar el frotis.
6. Deje secar al ambiente.
7. Realice la observación bajo el microscopio con objetivo de inmersión y dibuje lo observado.
Tinción de Hiss: Se emplea para coloración de cápsula en las bacterias. Las células se ven teñidas
intensamente y la cápsula de azul o rosado según se use violeta o fuscina.
Técnica De Coloración de Hiss:
1. Previamente se cultivan las bacterias para el desarrollo máximo de cápsula.
2. Fijar los frotis con vapores de ácido ósmico durante 10 a 20 seg.
3. Dejar secar sin calentar.
4. Fijar con alcohol flameándolo.
5. Cubrir son una solución de fucsina básica o cristal violeta calentando ligeramente hasta la emisión de
vapores.
6. Retirar el colorante mediante solución al 20% de sulfato de cobre en agua.
7. Secar con papel filtro y examinar al microscopio. Si emplea cristal violeta la cápsula aparecerá azul claro en
contraste con el color púrpura oscuro de la célula.
Tinción de Rojo Congo: Se emplea para coloración de cápsula en las bacterias.
Técnica de tinción de Rojo Congo:
En un tubo de ensayo coloque 0.5 de colorante de rojo congo.
Con el asa previamente esterilizada tome una colonia y emulsiónela en el colorante.
Deje actuar por 20 minutos.
Con el asa esterilizada emulsione de nuevo y tome una gota, extendiéndola sobre la lámina y deje secar a
temperatura ambiente.
NO FIJE AL CALOR, y observe luego del secado bajo el objetivo de inmersión.
TINCIÓN DE FLAGELOS
Los flagelos son órganos de locomoción delgados, de naturaleza proteica que se originan en la región
protoplásmica inmediatamente debajo de la pared celular. No todos las bacterias poseen estas estructuras y
en consecuencia, la presencia de flagelos, al igual que la distribución y las cantidades en que están presentes
en ellas son características útiles para su clasificación (patrones de flagelación: polar, peritricos, monotricos,
lofotricos, anfítricos). La observación de flagelos se realiza comúnmente en microscopios electrónicos, sin
embargo, con la técnica adecuada se pueden observar en microscopios ópticos, cuando se aplican mordientes
y colorantes alrededor de ellas, ya que estas incrementan el diámetro de los flagelos (Los flagelos se observan
de color rosado y la célula de color rojo).
Técnica de Tinción de Flagelos modificada de Loeffer:
1. Coloque una gota de un cultivo bacteriano de 18 horas cerca de un extremo de la lámina.
2. Incline el portaobjetos para que la muestra se deslice a lo largo de él.
3. Deje secar al aire.
4. Cubra la extensión con el mordiente de Loeffer para flagelos por un tiempo de 5 minutos.
5. Lave cuidadosamente con agua destilada.
6. Adicione colorante de Loeffer en caliente y deje actuar por 30 minutos. Durante este tiempo mantenga la
preparación sobre un baño serológico para que el vapor de agua actúe calentando el montaje.
7. Lave con agua destilada cuidadosamente y deje secar al ambiente.
8. Realice el montaje al microscopio y esquematice lo observado.
TINCIÓN DE GRÁNULOS
Tinción de Alberth: Se usa para teñir gránulos metacromáticos de Babest-Ernst los cuales se tiñen de color
rojizo mientras el cuerpo de la célula se tiñe de color azul-verdoso, es una técnica de tinción útil para observar
los gránulos de las Corynebacterias.
Técnica de Coloración de Alberth:
Se cubre la preparación con el colorante y se deja obrar por 15 a 20 minutos; si se desea acelerar el proceso
se calienta por 5 minutos, se lava y se le adiciona lugol por 30 seg.
Tinción de Stoltemberg: Tiene el mismo fundamento que la coloración de Alberth.
REACTIVOS PARA COLORACIÓN
COLORACIÓN DE GRAM
1. Cristal Violeta (Hucker’s)
Solución A
Cristal violeta (90% de contenido seco) 2.0gr
Alcohol etílico (95%) 20mL
Solución B
Oxalato de amonio 0.8gr
Agua destilada 80mL.
Solución de Trabajo: diluir la solución A en proporción 1:3 con agua destilada y mezclarla con 4 partes de
solución B. Guardar en un frasco ámbar y conservar por 24 horas antes de utilizarse. Filtrar cuando se observe
formación de precipitado.
2. Yodo de Gram (Lugol)
Yodo 1gr.
Yoduro de Potasio 2gr.
Agua destilada 300mL
Colocar el yoduro de potasio en un mortero, agregar yodo y triturarlo perfectamente. Agregar el agua en poca
cantidad, mezclar y envasar en frasco ámbar. Lavar cada vez el mortero con poca cantidad de agua hasta
completar el volumen de 300mL.
3. Alcohol etílico (95%)
Alcohol etílico (100%) 95mL
Agua destilada 5mL
4. Safranina
Safranina O 0.25mL
Alcohol etílico (95%) 10mL
Agua destilada 100 mL (completar a este volumen).
COLORACIÓN DE ZIEHL NEELSEN
1. Fucshina
Solución Madre de Fucshina fenicada de Ziehl:
Fucshina básica para microscopía C22H24CIN3 10gr.
Etanol 95° 100mL.
Triture la fucshina en un mortero con el alcohol, agregándolo poco a poco; trasvase a un frasco ámbar. En caso
que no disponga de un mortero, coloque directamente la fucshina y el alcohol en el frasco ámbar y agite hasta
su completa disolución.
Coloque la solución madre de fucshina a 37°C por 8 días, para su maduración: agite diariamente para extraer
la mayor cantidad de colorante procedente del polvo de fucshina. Rotule y almacene a temperatura ambiente
protegida de la luz. Filtre con papel filtro antes de usar.
Solución de fenol al 5%:
Fenol 5mL.
Agua destilada 95mL.
Funda los cristales de fenol en baño maría; utilice cámara de extracción; mida en probeta los 5 ml y complete
con agua destilada a 100mL. Envase, rotule y almacene a temperatura ambiente protegida de la luz.
Solución de trabajo de fucshina fenicada:
Solución de fucshina filtrada 10mL.
Solución de fenol al 5% 90mL.
Envase en frasco ámbar. Rotule y almacene a temperatura ambiente protegido de la luz.
2. Alcohol ácido al 3%
Ácido clorhídrico 37% 3mL
Etanol 95° 97mL.
Agregue lentamente el ácido sobre el alcohol. Envase, rotule y almacene a temperatura ambiente.
3. Azul de Metileno
Solución Madre de azul de metileno:
Azul de metileno para microscopía C16H18CIN3S.2H2O 10gr.
Etanol 95° 100mL.
Coloque la solución madre de azul de metileno a 37°C por 8 días, para su maduración; agite diariamente para
extraer la mayor cantidad del colorante procedente del polvo de azul de metileno. Rotule y almacene a
temperatura ambiente protegida de la luz. Filtre con papel filtro antes de usar.
Solución de trabajo de azul de metileno:
Solución madre filtrada 30mL.
Agua destilada 70mL.
COLORACIÓN DE SCHEFFER-FULTON
1. Verde de Malaquita:
Verde de Malaquita 5.0gr.
Agua Destilada 100mL.
2. Safranina: la misma de la tinción de Gram
COLORACIÓN DE MÖELLER
Fuschina carbólica de Zeehl-Neelsen, ácido sulfúrico al 1%, azul de metileno de Zeehl-Neelsen.
COLORACIÓN DE HISS
1. Fuscina
Fuscina básica 0.15-0.30gr.
Agua destilada 100ml.
2. Sulfato de cobre al 20% en agua destilada.
3. Cristal violeta
Cristal violeta 0.05-0.1gr.
Agua destilada 100ml.
COLORACIÓN DE ROJO CONGO
En un frasco color ámbar adicione:
Rojo congo. 1gr.
Etanol 10ml.
Agua destilada 90ml.
Antes de usar mezcle y filtre.
COLORACIÓN DE FLAGELOS MODIFICADA DE LOEFFER
1. Fascina básica al 1.2% en Etanol al 95%.
2. Ácido tánico al 3% en agua destilada. La suspensión debe tener un color amarillo para ser satisfactoria, se
agrega fenol en una proporción 1 a 2000 para evitar la aparición de mohos durante el almacenamiento.
3. Cloruro de sodio al 1.5% en agua destilada.
4. Para preparar la solución colorante se mezclan volúmenes iguales de los tres stocks anteriores. El colorante
está listo para ser usado después de la preparación y debe almacenarse en frascos bien cerrados. La vida
útil de la solución tintorial es de una semana a temperatura ambiente, un mes en el refrigerador e indefinida
si se congela.
COLORACIÓN DE ALBERTH
Azul de toluidina 0.15gr.
Verde de malaquita 0.02gr.
Ácido acético glacial 1ml.
Alcohol etílico (95%) 2ml.
Agua destilada 100ml.
COLORACIÓN DE STOLTEMBERG
1. Verde de malaquita 1.25gr.
Agua destilada 500ml.
2. Azul de toluidina 0.25gr.
Ácido acético 15ml.
3. Hematoxilina 0.05gr.
Alcohol etílico 15ml.
Cada colorante se macera en morteros diferentes, se mezclan y se filtran.
5. Procedimiento
A partir de las muestras y/o cultivos bacterianos indicados por el tutor realice una cloración para visualización
de: bacterias Gram positivas y Gram negativas, bacilos ácido-alcohol-resistentes, esporas, cápsula y para
gránulos metacromáticos. Observe cada una al microscopio con el objetivo de 100X detallando cada una de las
estructuras que desea resaltar con la coloración, así como el color que estas toman con la técnica respectiva.
6. Cuestionario
- Realice dibujos sobre las coloraciones observadas
-Indique ejemplos de microorganismos característicos de cada coloración realizada
7. Bibliografía
López L., Hernández M. (2014). Las tinciones básicas en el laboratorio de microbiología. Laboratorio de
Infectología, Centro Nacional de Investigación y Atención a Quemados (CENIAQ), Vol. 3. Recuperado de:
http://www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir-2014/ir141b.pdf
Olivas E. (2001). Manual de prácticas de Microbiología. Juárez, Universidad Autónoma de Ciudad Juárez. Pg.
14. Disponible en:
https://books.google.com.co/books?id=pWQQxlTIPIsC&pg=PA12&dq=coloraciones+simples+y+compuestas+
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