Practica de laboratorio SSR: análisis de
mutaciones e identificación de microsatélites.
Mariana Rosselin Guevara Cortes.
Yalma L. Vargas Rodríguez
Universidad de Guadalajara, Centro Universitario de los Valles, CUVALLES, Carretera
Guadalajara-Ameca km. 45, C.P. 46600, Ameca, Jalisco, México.
*E-mail:
[email protected]Introducción a la práctica:
Se obtuvieron 100,000 secuencias del genoma de un árbol de Jalisco. De estas
secuencias, se espera que el 20% contenga microsatélites.
Parte 1
Utilizando métodos bioinformáticos, tienes que identificar cuales secuencias contienen las
repeticiones y en qué posición de la cadena están. Para ser considerados como
microsatélites se elegirán repeticiones de dos nucleótidos o tres, repitiéndose al menos 10
veces y hasta 25 repeticiones.
Entra a la página web: wsmartins.net/websat/
Copia y pega todas las secuencias de arriba en la página web. Deja los valores por default
y da click en “submit”. En seguida te mostrará en análisis de cada secuencia y en color
amarillo la región identificada como microsatélite. También puedes ver las instrucciones en:
https://www.youtube.com/watch?v=LwWrEaGY1Oc
En las siguientes secuencias, tendrás que identificar cuáles contienen microsatélites. Se
obtuvieron varias secuencias, de diferentes partes del genoma. Cada secuencia inicia con
el símbolo > seguido del nombre y en el siguiente renglón la cadena de DNA
Análisis:
¿Cuántas y cuáles secuencias contienen microsatélites?
>CONS1050_2_A, <CONS1053_2_A, >CONS1056_2_A, >CONS1058_2_A,
>CONS1059_2_A, >CONS1064_2_A, >CONS1066_2_A, >CONS1074_3_A,
>CONS1078_2_A
¿Cuáles microsatélites cumplen con las características arriba señaladas?
>cons1053_2_A, >cons1056_2_a, >cons1064_2_A y >cons1078_2_A.
Parte 2
Una vez que sabes que tu genoma contiene microsatélites y has elegido cuales regiones
son las que serían importante aislar, se tienen que diseñar cebadores (primers) que
ayudarán a aislar y amplificar solamente las regiones con microsatélites. Esto se logra con
la técnica de PCR (https://www.youtube.com/watch?v=V9PtQlp-e7g).
Utilizando métodos bioinformáticos, de las regiones que contienen microsatélites, se
seleccionarán pares de cebadores que flanquean las regiones con microsatélites.
Algunas características que deben de tener los cebadores es que sean de 18 a 30 pares
de bases y que no estén inmediatamente adyacentes a la región de microsatélites.
Utiliza la misma página web con la que identificaste a los microsatélites, Corre el análisis
de nuevo. Para conocer cuales cebadores se pueden usar para amplificar los microsatélites,
da click sobre el microsatélite resaltado en amarillo.
Análisis:
¿De cuáles microsatélites si se pudieron obtener cebadores?
>CONS1050_2_A, >CONS1053_2_A, >CONS1064_2_A Y >CONS1066_2_A
¿Los cebadores cumplen con los requisitos anteriormente señalados?
No, por el número de pares de bases que contienen, sin embargo no todos se alejan de
estar en un microsatélite
>CONS1050_2_A
GACCAACGAC GCATCGTCCC GAGAACTATG AGTAGATAGG GTTTACATAG CTTGCTAGTA
ACCTGTTTTA GTTTATTTTA AAATTGTTTT ATATCATGTG AGCTATCGAG GAGTCGCCCC
AAAAGTATGA CTTTACTGTT ATAAACGTAT ATCGATTTTA GTGTTTGTGG ATAGGTTTTT
ATGAGATTGA TGATACCGAG TATGATTTTG AGGATACCAT GAGAGGGCAT GATGACATTG
ATATATATAT ATACATGNNT TTTTATATGA TGACATATAT GATGGTTGTT ACCCTTGGTT
TTACGGGTTT ACCCGTATTA TAACTTTGTT TTGTTTAGTT TTACTCGTGT TATACGGTG
>CONS1054_2_A
GATACGTAGG CACAAGAAGT AAGAAGTAGA CGTAATTGTG ATTTTTGACT ATTTTAACTT
GTTAAAATTG CTTTTTAGTC AAAAGTTAAA TTTTTTTTTT AGTTTGGACN AAAATACCCT
AATTTTAAAT TTTGATTAAA AAAATAAAAA AAANTTGACG TTGATGAGAC AGACTTCAAG
CATAAAGTAA NCAAAAACAA TCTCTCTCAT TCTAACAAAT TTGGCTGATT TTTTTTTNCA
CTCTCTTGTT CTCTCTTGNC TTTGGTTGTG ATTTGTGTTT AAAGTGTTTG ACTTCCTCTA
AATTTTCACT CACTCGT
>CONS1064_2_A
GGTACAGCTG ANTGATATTA GGCGTGAGAT TGCAGCTTTC TTTGCACATG TCACGCATGA
GACTGGACGT AAGATCTCTC TCTCTCTCTC TCTCACAAAC TTNAAACAGA CTTTCATTTT
CCTACCATTT TNCACATTAA TATCCACAAG GTTAGTCCNA GTTATAGTAA GGAAAGGAAC
TTACTTTCTT TGCTAATCAG GATTCAATAC TTGTGGGAGA GTACTTCATT GAAAAATCTT
GATTTCGTGN CTTTTGTTTG TACAGNNNTT TTTGCTACAT AGAAGAGATA AATGGTGCAA
CCAGGG
>CONS1066_2_A
CTAACTTGTT CTAAAAANCA CATAACATCA TGCAAATGGA TGCTCACTTC CACACGTCAA
TCATAAACAC ACACACACCC TCATTTGCAA TGGACAAACC CTCACTACAC ATACTATTAT
GATAAGACCT GTTGAAACTA ATGAATATCA AATAGGCTAG CTTTACATCC ATGCGAGGCA
TGCTGAGAGA GAAGAAATAA ATTGGCCACC CGAAATGAGC AAAAATGAAA ATTTTCATTC
ATGAGAAACA ATCCCAAACG GGATTACAAA ACATGTCAAC AACCTTGGAC TTTCAGTTTC
GCTGTGAACA AGACACCAAA GTGAACTGGG AGAACACCAA GGATTTACAA ATC
Entra a Google académico y realiza una búsqueda de investigaciones que han usado
microsatélites para estudiar plantas o animales. Elije dos artículos científicos y describe
para qué usaron los microsatélites.
Investigaciones de artículos:
Diversidad genética de dos poblaciones del caracol Strombus
gigas (Gastropoda: Strombidae) en Yucatán, México, con
microsatélite
El caracol rosado S. gigas, es una especie de gran importancia pesquera en la región del
Caribe que incluye la Península de Yucatán, en la cual, se analizó la diversidad y estructura
genética de dos poblaciones (Arrecife Alacranes y Banco Chinchorro) mediante el uso de
cinco marcadores moleculares del tipo microsatélites. Los resultados indican que las dos
poblaciones analizadas se encuentran en el mismo rango de diversidad genética (He) de
0.613 a 0.692. En ambas poblaciones también se observó una desviación significativa al
equilibrio H-WE, la cual fue atribuida a factores como la endogamia a consecuencia de una
sobre-explotación pesquera. Sin embargo otra explicación posible es que se deba a una
mezcla de individuos de dos o más poblaciones, y la existencia de alelos nulos. Los niveles
de estructura genética indican la existencia de una sola población homogénea en la
península de Yucatán (FST de 0.003, p=0.49) y el flujo genético fue significativo (2.3
individuos) entre las dos poblaciones. Los resultados de este estudio aceptan la hipótesis
de que las poblaciones S. gigas forman parte de una sola población panmíctica en la
Península de Yucatán, por lo tanto, el recurso pesquero debe regularse de igual manera en
ambas regiones.
El caracol rosado S. gigas, es una especie de gran importancia pesquera en la región del
Caribe que incluye la Península de Yucatán, en la cual, se analizó la diversidad y estructura
genética de dos poblaciones (Arrecife Alacranes y Banco Chinchorro) mediante el uso de
cinco marcadores moleculares del tipo microsatélites. Los resultados indican que las dos
poblaciones analizadas se encuentran en el mismo rango de diversidad genética (He) de
0.613 a 0.692. En ambas poblaciones también se observó una desviación significativa al
equilibrio H-WE, la cual fue atribuida a factores como la endogamia a consecuencia de una
sobreexplotación pesquera. Sin embargo, otra explicación posible es que se deba a una
mezcla de individuos de dos o más poblaciones, y la existencia de alelos nulos. Los niveles
de estructura genética indican la existencia de una sola población homogénea en la
península de Yucatán (FST de 0.003, p=0.49) y el flujo genético fue significativo (2.3
individuos) entre las dos poblaciones. Los resultados de este estudio aceptan la hipótesis
de que las poblaciones S. gigas forman parte de una sola población panmíctica en la
Península de Yucatán, por lo tanto, el recurso pesquero debe regularse de igual manera en
ambas regiones.
Empleo de los microsatélites para determinar paternidad en
bovinos cubanos
Se analizó el polimorfismo de ocho microsatélites bovinos recomendados por la ISAG para
pruebas de paternidad en 20 animales pertenecientes a una familia, en la que está
involucrada un animal de alto valor genético con elevada producción de leche de alta
calidad. Se calcularon las frecuencias alélicas, la heterocigocidad y el contenido de
información polimórfica (PIC), evidenciándose que el microsatélite SPS 115 es el menos
polimórfico (PIC=0.3515) y el TGLA 122 el más polimórfico (PIC=0.7052). Los valores
promedios de HET=0.6259 y PIC=0.5582 demuestran que estamos en presencia de una
población poco polimórfica, lo que hace comprobar la relación filogenética de estos
animales. (Palabras clave: microsatélites; paternidad; PIC)
Debido al desarrollo que ha adquirido la industria ganadera en Cuba, se ha hecho necesario
el empleo de nuevos métodos de identificación de individuos, pues los tradicionales, como
son la determinación de grupos sanguíneos y el polimorfismo bioquímico, tienen bajo poder
de discriminación y un número limitante de tejidos para hacer las determinaciones. Gracias
al desarrollo de la biotecnología, el surgimiento de los marcadores moleculares y el
conocimiento del genoma bovino, se desarrollan cada vez más los métodos de
identificación genética. Los marcadores moleculares, y dentro de estos los microsatélites
(9), han adquirido notable importancia en los estudios de paternidad por su alto valor de
fiabilidad (95-98%) (8); estos últimos consisten en secuencias cortas de 1 a 4 nucleótidos
repetidos entre 10 y 50 veces a lo largo del genoma de la especie y están flanqueados por
regiones altamente conservadas, por lo que es posible detectarlos por PCR. Los resultados
son fáciles de interpretar, pues de los alelos presentes en un microsatélite dado, uno es
heredado de la madre y otro del padre
