INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
LABORATORIO DE MÉTODOS DE ANÁLISIS

NOMBRE DE LA PRÁCTICA:
DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE ENZIMAS
PROTEOLÍTICAS.
MÉTODO DE KUNITZ

PROFESOR: FERNANDO HERNÁNDEZ DERRAMADERO

ALUMNO:
LUIS FELIPE MORALES ALCOCER
GRUPO: 5QV2
SECCIÓN: 4

FECHA DE REALIZACIÓN: 16/08/2019

FECHA DE ENTREGA: 26/08/2019

OBJETIVOS

 Determinar la actividad proteolítica de la bromelaína y papaína utilizando el método de Kunitz.

 Determinar la actividad enzimática de la bromelaína y la papaína (enzimas proteolíticas) a partir de una curva
estándar de actividad enzimática de la Tripsina.
 Determinar cuál de las enzimas empleadas tienen mayor actividad enzimática sobre el mismo sustrato.

FUNDAMENTO DEL MÉTODO DE KUNITZ

El método se fundamenta en el cambio de solubilidad de una proteína en ácido tricloroacético cuando está sujeta a la
acción de una enzima proteolítica. Mide la cantidad de péptidos y/o aminoácidos que sean solubles durante la hidrólisis,
aprovechando la capacidad, de algunos de ellos, de absorber selectivamente a 280 nm.

RESULTADOS

TABLA 1. ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA TRIPSINA.

Tubo Concentración de A280

Tripsina (mg/mL) A280 corregida
Problema Testigo
T1 y 1 0.04 0.380 0 0.380
T2 y 2 0.08 0.493 0.004 0.489
T3 y 3 0.12 0.510 0.019 0.491
T4 y 4 0.16 0.572 0.01 0.562
T5 y 5 0.20 0.614 0.043 0.571
PROBLEMAS
TIyI Bromelaína 1:10 0.630 0.091 0.539
T II y II Bromelaína 1:20 0.737 0 0.737
T III y III Papaína 1:2 0.888 0.083 0.802
T IV y IV Papaína 1:4 0.893 0.009 0.884

GRÁFICA 1. ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA TRIPSINA.

0.7
Absorbancia corregida a 280 nm

0.6

0.5

0.4

0.3
y = 1.1375x + 0.3621
0.2 R² = 0.8818

0.1

0
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25
Concentración de trripsina (mg/mL)

Unidades trípticas por miligramo de tripsina

Pendiente de la recta 1.1375
Unidades Trípticas = = = 0.056875
20 minutos 20
CÁLCULO DE UNIDADES TRÍPTICAS POR TUBO

Si existen 0.056875 UT en 1 mg:

Tubo 1 Tubo 3 Tubo 5

0.056875 UT 0.04 mg 0.056875 UT 0.12 mg 0.056875 UT 0.20 mg

| | = 0.0022 UT | | = 0.0068 UT | | = 0.0113 UT
1 mg 1 mg 1 mg

Tubo 2 Tubo 4

0.056875 UT 0.08 mg 0.056875 UT 0.16 mg

| | = 0.0045 UT | | = 0.0090 UT
1 mg 1 mg

TABLA 2. CURVA DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA ESPECÍFICA PARA LA DIGESTION DE CASEÍNA POR TRIPSINA.

Tubo Unidades Trípticas A280 corregida

1 0.0022 0.380
2 0.0045 0.489
3 0.0068 0.491
4 0.0090 0.562
5 0.0113 0.571

GRÁFICA 2. CURVA DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA ESPECÍFICA PARA LA DIGESTIÓN DE CASEÍNA POR

TRIPSINA.

0.7
Aborbancia corregida a 280 nm

0.6

0.5

0.4

0.3
y = 20.044x + 0.3631
0.2

0.1

0
0 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 0.012
Unidades Tripticas

TABLA 3. UT/g DE BROMELAÍNA Y PAPAÍNA.

Tubo con solución UT UT/g de muestra

Bromelaína 1:10 0.0087 0.1148
Bromelaína 1:20 0.0186 0.4910
Papaína 1:2 0.0218 0.0523
Papaína 1:4 0.0259 0.0310
CALCULOS

Absorbancia corregida: Absorbancia a 280 problema – Absorbancia a 280 testigo

A partir de la ecuación e la recta de la curva de actividad enzimática específica, obtenemos:

y = 20.044x + 0.3631

Para obtener las UT de muestra despejamos “x” de la ecuación anterior:

x = y – 0.3631/20.044

Donde “y” es la Absorbancia a 280 corregida de las diluciones de bromelaína y papaína.

[UT](Factor de dilución)(volumen de etracto)
UT/g de muestra =
Gramos de muestra
Tubo con solución de bromelaína 1:10
0.539 − 0.3631
X= = 0.0087
20.044
0.0087(10)(33 mL)
UT/ g de muestra = = 0.1184
25 g

Tubo con solución de bromelaína 1:20

0.737 − 0.3631
X= = 0.0186
20.044
0.0186(10)(33 mL)
UT / g de muestra = = 0.4910
25 g

Tubo con solución de papaína 1:2

0.802 − 0.3631
X= = 0.0218
20.044
0.0218(2)(30 mL)
UT / g de muestra = = 0.0523
25 g

Tubo con solución de papaína 1:4

0.884 − 0.3631
X= = 0.0259
20.044
0.0259 (30 mL)
UT/ g de muestra = = 0.0310
25 g

DISCUSIÓN

Se realizó una curva de la actividad específica de la tripsina ya que se conoce el comportamiento de esta enzima cuando
hidroliza la caseína a diferencia de las enzimas de las frutas. Por lo tanto se realizó el cálculo de las unidades trípticas
que relaciona a las enzimas aisladas con la tripsina. También resulta importante conocer el uso de los tubos testigos,
pues estos tienen como función principal evidenciar la presencia de sustancias extrañas que absorban a 280 nm y que se
encuentren presentes antes y después de la hidrólisis de la caseína. Estas sustancias afectan la lectura de absorbancia,
debido a que después de realizar la hidrólisis en los tubos problema, la solución absorberá como si esta tuviera una
cantidad de proteína mayor a la adicionada. Por lo tanto debe obtenerse una absorbancia corregida, siendo esta la
diferencia entre la absorbancia del problema y la absorbancia del testigo, lo anterior con la finalidad de obtener
resultados experimentales más confiables.
En la práctica se utilizaron las enzimas, tripsina, papaína y bromelaína. Inicialmente para preparar la curva de actividad
de tripsina, se utilizarón tubos con tripsina a diferentes concentraciones con caseína que fue tratada posteriormente con
ácido tricloroacético, que sirve para precipitar las proteínas. Lo que se midió fueron la cantidad de aminoácidos que
fueron separados de la caseína. Con el fin de comparar la actividad enzimática de cada proteasa, se obtuvieron unidades
específicas de la tripsina (unidades trípticas). La actividad enzimática específica por miligramo de muestra de la tripsina
fue de 0.056875.Posteriormente, se graficó unidades trípticas contra absorbancía a 280 nm, para posteriormente con la
ecuación de la recta despejar las unidades trípticas de la bromelaína y la papaína. Así mismo, comparando la actividad
enzimática de la papaína y la bromelaína, se obtuvo que ésta última tiene mayor actividad enzimática puesto que tiene
valores más altos de UT/g de muestra.

CONCLUSIÓN

Las proteasas son enzimas proteolíticas que actúan rompiendo los enlaces que unen los aminoácidos de las proteínas
para facilitar su digestión. Básicamente hidrolizan la unión entre el carboxilo de un aminoácido y el grupo α-amino del
siguiente aminoácido dentro de la proteína. Para la determinación de la actividad proteolítica se empleó uno de los
métodos más comunes, el cual fue el método de Kunitz, dicho método consiste en la medición de la cantidad de
péptidos y aminoácidos solubles liberados durante la hidrólisis y aprovecha la capacidad de algunos de estos de
presentar absorción a 280 nm por poseer grupos aromáticos. Las enzimas que se analizaron resultan ser proteolíticas,
así mismo con el método de Kunitz se obtuvo el cálculo de actividad enzimática utilizando la caseína y las unidades
trípticas permitieron relacionar la actividad de la tripsina y de las demás enzimas, es decir la bromelaína y la papaína.

PREGUNTAS ADICIONALES

a) Defina actividad enzimática y actividad enzimática específica.

Actividad enzimática: manera de expresar la cantidad de la enzima presente en un momento determinado. Indica la
cantidad de sustrato transformado en producto, por la acción catalítica de la enzima por unidad de tiempo.

Actividad enzimática especifica: es el número de unidades de enzima por miligramo de proteína (U/mg proteína) o por
mililitro de disolución (U/ml).

b) Escriba la clasificación de las proteasas, en función de su mecanismo de acción y diga en que grupo se ubican las
determinadas en la práctica.

Oxidorreductasas, transferasas, hidrolasas, liasas, isomerasas, ligasas. Las enzimas que se determinaron en la práctica
corresponden a la clasificación de las hidrolasas.

c) ¿Para qué se adiciona cisteína en las muestras de piña y papaya?

El mecanismo catalítico de las cisteín proteasas involucra la formación de un intermediario enzimático acilado. El ataque
nucleofílico se realiza a través de in grupo tiol reactivo de una cisteína presente en el sitio activo. El tiol se transforma en
un nucleófilo al desprotonarse gracias a un residuo de histidina adyacente.

d) ¿Cuál es la especificidad de enlace de la tripsina?

Presenta una cierta especificidad de sustrato (la lisina y la arginina).

REFERENCIAS

Lenhninger A., Nelson D., Cox M., (1999), Principios de Bioquímica. Ediciones Omega.

http://xml.cie.unam.mx/xml/ms/Doctos/FRX_CUANTITATIVO.pdf