PRACTICA No 5.
MICROSCOPIA
PRELABORATORIO
1. Dibuje el microscopio óptico y sus funciones
SISTEMA MECÁNICO
Dentro del sistema mecánico se incluyen todos los elementos estructurales que dan
estabilidad al microscopio y mantienen los elementos ópticos correctamente alineados.
Base o pie: Es la pieza que se encuentra en la parte inferior del microscopio y sobre la cual
se montan el resto de elementos. Acostumbra a ser la parte más pesante para
proporcionar suficiente equilibrio y estabilidad al microscopio. Es habitual que incluya
algunos topes de goma para evitar que el microscopio se deslice sobre la superficie donde
se encuentra.
Brazo: El brazo constituye el esqueleto del microscopio. Es la pieza intermedia del
microscopio que conecta todas sus partes. Principalmente conecta la superficie donde se
coloca la muestra con el ocular por donde ésta se puede observar. Tanto las lentes del
objetivo como del ocular se encuentran también conectadas al brazo del microscopio.
Platina: Esta es la superfície donde se coloca la muestra que se quiere observar. Su
posición vertical con respecto a las lentes del objetivo se puede regular mediante dos
tornillos para generar una imagen enfocada. La platina tiene un agujero en el centro a
través del cual se ilumina la muestra. Generalmente hay dos pinzas unidas a la platina que
permiten mantener la muestra en posición fija.
Pinzas: Las pinzas tienen la función de mantener fija la preparación una vez esta se ha
colocado sobre la platina.
Tornillo macrométrico: Este tornillo permite ajustar la posición vertical de la muestra
respecto el objetivo de forma rápida. Se utiliza para obtener un primer enfoque que es
ajustado posteriormente mediante el tornillo micrométrico
Tornillo micrométrico: El tornillo micrométrico se utiliza para conseguir un enfoque más
preciso de la muestra. Mediante este tornillo se ajusta de forma lenta y con gran precisión
el desplazamiento vertical de la platina.
Revólver: El revólver es una pieza giratoria donde se montan los objetivos. Cada objetivo
tiene proporciona un aumento distinto, el revólver permite seleccionar el más adecuado a
cada aplicación. Habitualmente el revólver permite escoger entre tres o cuatro objetivos
distintos.
Tubo: El tubo es una pieza estructural unida al brazo del telescopio que conecta el ocular
con los objetivos. Es un elemento esencial para mantener una correcta alineación entre los
elementos ópticos.
SISTEMA ÓPTICO
El sistema óptico incluye todos los elementos necesarios para generar y desviar la luz en
las direcciones necesarias y así acabar generando una imagen aumentada de la muestra.
Foco o fuente de luz: Este es un elemento esencial que genera un haz de luz dirigido hacia
la muestra. En algunos casos el haz de luz es primero dirigido hacia un espejo que a su vez
lo desvía hacia la muestra. La posición del foco en el microscopio depende de si se trata de
un microscopio de luz transmitida o de luz reflejada.
Condensador: El condensador es el elemento encargado de concentrar los rayos de luz
provenientes del foco a la muestra. En general, los rayos de luz provenientes del foco son
divergentes. El condensador consiste en un seguido de lentes que cambian la dirección de
estos rayos de modo que pasen a ser paralelos o incluso convergentes.
Diafragma: El diafragma es un pieza que permite regular la cantidad de luz incidente a la
muestra. Normalmente se encuentra situado justo debajo la platina. Regulando la luz
incidente es posible variar el contraste con el que se observa la muestra. El punto óptimo
del diafragma depende del tipo de muestra observada y de su transparencia.
Objetivo: El objetivo es el conjunto de lentes que se encuentran más cerca de la muestra y
que producen la primera etapa de aumento. El objetivo suele tener una distancia focal
muy corta. En los microscopios modernos distintos objetivos están montados en el
revólver. Este permite seleccionar el objetivo adecuado para el aumento deseado. El
aumento del objetivo junto con su apertura numérica suele estar estar escrito en su parte
lateral.
Ocular: Este es el elemento óptico que proporciona la segunda etapa de ampliación de
imagen. El ocular amplia la imagen que ha sido previamente aumentada mediante el
objetivo. En general, el aumento aportado por el ocular es inferior al del objetivo. Es a
través del ocular que el usuario observa la muestra. En función del número de oculares se
puede distinguir entre microscopios monoculares, binoculares e incluso trinoculares. La
combinación de objetivo y ocular determina el aumento total del microscopio.
Prisma óptico: Algunos microscopios incluyen también prismas en su interior para corregir
la dirección de la luz. Por ejemplo, esto es imprescindible en el caso de los microscopios
binoculares, donde un prisma divide el haz de luz proveniente del objetivo para dirigirlo
hacia dos oculares distintos.
2. Consulte que preparaciones y que objetivos utiliza según las preparaciones
Para realizar observaciones de los microrganismos presentes en una muestra es necesario
manipular previamente dicha muestra. Esta manipulación permite obtener una
preparación microscópica, que es el material que finalmente se colocara en la pletina del
microscopio.
Esta preparación constará obligatoriamente de un portaobjetos (ya sea convencional o de
uso específico), una porción de la muestra (que en muchos casos habrá sido modificada) y
podrá o no incluir un cubreobjetos y otros materiales. Las preparaciones microscópicas se
obtienen de modos diversos que dependen de la naturaleza de la muestra y de los
parámetros que queremos observar.
Hay distintos criterios que pueden utilizarse para clasificar las diferentes preparaciones
microscópicas existentes. El criterio que vamos a seguir aquí consiste en establecer tres
grupos:
a) Preparaciones para examen en fresco sin modificar
b) Preparaciones para examen en fresco ligeramente modificadas
c) Preparaciones fijadas y teñidas
PREPARACIONES PARA EXAMEN EN FRESCO.
Consiste en observar los microorganismos vivos que puede haber en la muestra de estudio y la
presencia de otros elementos, como son leucocitos, células, eritrocitos, cristales, etcétera, que
puedan ser de gran ayuda en la valoración de las muestras. Y se prepara de la siguiente manera:
Es una técnica fácil de realizar, en la que la muestra a examinar se sitúa entre un portaobjetos y
cubreobjetos. Si la muestra proviene de una muestra sólida, se debe de emulsificar en una gota
de agua destilada o solución salina; si el material es líquido, se deposita directamente entre el
porta y cubreobjetos.
Entendemos por preparaciones en fresco sin modificar o simplemente preparaciones en fresco
aquellas en las que la muestra se examina directamente, sin modificar o, como mucho, se diluye o
concentra.
Presentan las ventajas siguientes :
Algunos elementos que queremos observar (microorganismos, células humanas, cristales,
etc.) se observan suficientemente bien en fresco, ya sea utilizando el microscopio de
campo claro o el de contraste de fases.
Permiten observar la movilidad de los microorganismos vivos, dato que en ocasiones
tiene interés analítico.
Algunas son preparaciones que se elaboran de forma rápida, simple y económica.
Observación de determinados fenómenos microscópicos, tales como división celular
(células animales, levaduras, etc.) o formación de esporas.
Sus inconvenientes son estos:
No tienen validez universal: muchos microorganismos no son observables de este modo.
Hay características interesantes de los microorganismos que no son observables de este
modo.
1. Montaje húmedo o técnica de la cámara húmeda. Consiste en verter una gota del líquido
que contiene los microorganismos en el centro de un portaobjetos y cubrirlo después con
un cubreobjetos, sin apretar demasiado para no adelgazar excesivamente la lámina de
líquido incluida entre porta y cubre. La evaporación acorta la vida de esta preparación.
Puede disminuirse la velocidad de evaporación sellando con vaselina o una sustancia
similar el espacio que hay entre portaobjetos y cubreobjetos.
2. Muestras sólida, semilíquida o líquida demasiado espesa para su observación puede
también examinarse de este modo diluyéndola previamente con agua que puede contener
alguna sal. La utilización de agua con sales se hace para que la presión osmótica del medio
no sea demasiado baja .En muestras clínicas y también con otros tipos de muestras suele
utilizarse como diluyente NaCl 0'9 %, que es isotónico con el plasma humano.
La observación suele hacerse con el objetivo de 40 aumentos. No debe utilizarse el objetivo de
inmersión, pues al desplazar la preparación el cubreobjetos permanece adherido al objetivo y esto
crea turbulencias en el líquido de la preparación.
3. Técnica de la gota pendiente. Para la realización de la técnica de observación mediante el
método de la gota pendiente, se utilizan unos portas especiales con una o dos
excavaciones que permiten colocar un cubreobjetos invertido del que pende una pequeña
gota de la suspensión bacteriana que vamos a observar. Al tener un hueco, el volumen de
líquido que mantiene el porta es mayor de manera que la preparación tienen un mayor
tiempo de vida.
PREPARACIONES PARA EXAMEN EN FRESCO LIGERAMENTE MODIFICADAS
Nos referimos a preparaciones en fresco en las que a la muestra se le ha agregado una sustancia
que facilita o mejora la observación de los microorganismos. Son principalmente montajes
húmedos tratados con un solo colorante o reactivo. Suelen usarse colorantes, aunque no siempre
es así.
1. Tinción vital. también llamada tinción o coloración supravital, es un procedimiento
intermedio entre el examen en fresco sin modificación y las técnicas de fijación seguida de
tinción.Tiene por objeto poner de relieve detalles estructurales o de movilidad de los
microorganismos que no es posible observar en fresco ni tras realizar modificaciones
físicas y químicas profundas, como sucede con la fijación seguida de tinción.
Se prepara del mismo modo que un montaje húmedo, pero antes de cubrir la gota de
muestra con el cubreobjetos se agrega una gota de un colorante que no mate los
microorganismos, se mezcla con el asa y se cubre con el cubreobjetos. Los
microorganismos que nos interesa observar absorberán el colorante más que el medio y
que los otros elementos formes (si el colorante está bien elegido). Al observarlos en
campo claro absorberán más la luz y aparecerán coloreados más intensamente que otros
elementos formes y que el medio que los rodea.
Los colorantes usados suelen ser los mismos que se utilizan para las tinciones simples aunque muy
diluídos (diluciones de 1/10.000). Esto se hace porque los colorantes son tóxicos para las células.
La superior dilución disminuye su toxicidad y esto permite observar microorganismos teñidos y
vivos. No hay que olvidar, sin embargo, que la superior dilución del colorante no anulará su
toxicidad; tan sólo retrasará la muerte de los microorganismos.
2. Preparación con KOH al 10 %. El empleo de KOH al 10 % en agua permite distinguir los
elementos estructurales de los hongos miceliformes en muestras frescas. El álcali digiere
parcialmente las proteínas presentes (tanto del hongo como de las células infectadas y del medio)
pero no actúa sobre los polisacáridos de las paredes celulares de los hongos. La preparación se
realiza colocando una pequeña cantidad de muestra sobre un portaobjetos. Se agrega una gota de
KOH 10 %. Se cubre con un cubreobjetos y se presiona ligeramente el portaobjetos, con el
cubreobjetos hacia abajo, sobre papel de filtro para eliminar el exceso de líquido. La preparación
puede observarse después de esperar varios (3‑10) minutos a temperatura ambiente. No es
conveniente calentar para acelerar la proteólisis, pues puede deteriorarse la muestra.
PREPARACIONES FIJADAS Y TEÑIDAS.
La extensión de la muestra sobre el portaobjetos se hará de diferentes formas, dependiendo de
la procedencia de la muestra a examinar. Si es líquida, se deposita una pequeña cantidad del
material en el centro del portaobjetos y se extiende con otro portaobjetos hasta conseguir una
capa fina y homogénea.
Si el material de estudio es sólido, se emulsificará en una gota de agua destilada o solución
salina estéril, colocado en el centro del portaobjetos, y se extiende de la misma forma que una
muestra líquida.
Secado:
Una vez realizado el frotis, debemos dejar secar al aire la preparación, cuando está seca la
superficie pasa de ser brillante a mate; para acelerar el secado se puede calentar ligeramente la
parte inferior del portaobjetos (sin quemar).
Fijado:
La fijación es el último paso antes de proceder a la tinción, y tiene como objetivo no permitir
que la muestra de estudio se pierda (o se barra) en el proceso de tinción.
En frotis hematológicos no se requiere de fijación debido a que existe una coagulación rápida de
las albúminas citoplasmáticas; o si el material a teñir posee abundante material celular, se
recomienda fijar con alcohol metílico después de secar la preparación.
Los frotis de origen microbiológicos se deben de fijar con calor suave, pasando el portaobjetos
sobre una llama, tras la fijación es muy importante esperar que se enfríe antes de proceder a
realizar cualquier procedimiento de tinción.
Tinción:
Consiste en cubrir la preparación con uno o varios colorantes de forma secuencial durante un
tiempo determinado, si adiciona el colorante en un frotis sin enfriar, puede provocar la
precipitación del colorante y la visualización de artefactos que pueden confundir en el proceso
de observación al microscopio.
Después de la tinción, la preparación se lava con agua, procurando que el chorro no caiga con
fuerza sobre la preparación, y finalmente se seca al aire o mediante absorción con papel.
Para observar las características morfológicas de las bacterias y también de otras células las
preparaciones fijadas y teñidas son las que se emplean con mayor frecuencia. Las ventajas de este
procedimiento son:
Las células son más fácilmente visibles después de teñidas.
Pueden diferenciarse especies bacterianas diferentes mediante procedimientos de tinción
diferencial.
En la tinción es imprescindible utilizar colorantes de alta calidad. La presencia de impurezas puede
hacer que varíen las características del colorante y con ello las características de la tinción.
También es relativamente frecuente que aparezcan partículas sólidas que se depositan sobre la
extensión y son confundidas con gérmenes u otros elementos formes. Tanto a los colores
anormales como a los elementos formes observados que no proceden de la muestra se les llama
artefactos. Su concentración debe ser la adecuada. En algunos procedimientos es necesario
calentar y en otros añadir reactivos adicionales, como el lugol en la tinción de Gram. Controlar el
tiempo de tinción es fundamental. En general oscila entre 30 segundos y 10 minutos. Si nos
pasamos la muestra se tiñe en exceso, y si el tiempo es insuficiente, no conseguiremos suficiente
contraste .
1. Tinción simple. Los pasos esenciales son: Obtener una extensión de la muestra: A esta
extensión también se le llama frote, frotis o película. Debe ser suficientemente delgada y los más
homogénea posible. Fijar la extensión Tinción: Que puede ser por inmersión o por vertido. Lavado
Secado
2. Tinción diferencial. Se llama así a los procedimientos de tinción que ponen de manifiesto
diferencias entre distintas células, o bien entre las distintas partes de una célula. Estas diferencias
pueden observarse gracias no sólo a diferencias de forma sino también de color. Habitualmente
implican el uso de más de un colorante en etapas sucesivas.
3. Tinción de Gram. Esta coloración, ideada por Hans Christian Gram a fines del siglo XIX, permite
dividir a las especies bacterianas en dos grandes grupos: Grampositivas: aquellas que toman el
colorante básico (cristal violeta, violeta de genciana o violeta de metilo) resistiendo a la
decoloración en las condiciones que más adelante se describen y por tanto se observan de color
violeta intenso. Gramnegativas: aquellas que son decoloradas por alcohol o alcohol/acetona,
observándose del color de un colorante de contraste, que puede ser safranina O (las bacterias se
observan de color rojo amarillento), fuchsina o fuchsina fenicada diluída 1/10 (las bacterias se
observan de color rosado).
Objetivo de 4 o 5 aumentos: se emplea para observar objetos grandes (parásitos,
etc.) o para localizar una zona de la preparación
Objetivo de 10 aumentos: usos similares al anterior y observación de micelio de
hongos.
Objetivo de 40 aumentos: observación de células eucariotas. En general,
observación de objetos de 5 a 20 μ m de diámetro.
Objetivo de 100 aumentos: observación de bacterias. En general se usa para la
observación de objetos de 0'2 μ m a unas pocas μ m. Este objetivo es de inmersión
en aceite
OBJETIVOS
Reconocer las partes mecánicas y ópticas de un microscopio, además de sus
funciones y su correcto empleo en el laboratorio.
Establecer las condiciones para enfocar en el microscopio y la manipulación del
mismo según la muestra a observar.
Realizar observación de muestras de diferentes orígenes en preparaciones frescas
y coloreadas para aplicar diferentes objetivos.
Conocer los fundamentos de los distintos tipos de microscopios utilizados
en Microbiología.
MARCO TEORICO
Las fuentes históricas procedentes de civilizaciones antiguas como la asiria, la clásica o la árabe,
mencionan el poder amplificador de las lentes biconvexas y de la utilización de técnicas de
amplificación de las imágenes. El termino microscopio fue acuñado por primera vez por Jean Faber
en 1624. Sin embargo, el impulsor más significativo de la microscopia fue el holandés Anton Van
Leeuwenhoek (1623-1723), el construyo sus propios microscopios con lentes convexas que el mismo
pulía. Entre sus aportaciones más importantes está la de ser uno de los primeros en estudiar la
composición de la sangre y en observar y cubijar protozoo; en 1676 descubrió microrganismos de
mínimo tamaño agrupados los cuales años después denominaría “bacterias”.
En microbiología el microscopio se utiliza de forma rutinaria, ya que proporciona importante
información para la identifi cación temprana y definitiva de los microorganismos. En la valoración
de las muestras, es trascendente el poder de resolución del microscopio, el cual se defi ne como la
capacidad que posee un objetivo para distinguir la distancia mínima entre dos puntos del objeto
para que se puedan visualizar como dos puntos separados. El poder de resolución de un objetivo es
el responsable de la calidad, claridad, nitidez y fineza detallada de la imagen, y depende de la
longitud de onda (λ) del haz de luz utilizado y de la apertura numérica del objetivo empleado. El
máximo poder de resolución en un microscopio de luz emitida es de 0.2 μm, por lo que se requiere
de una amplificación entre 1000-1400x, mientras que el poder de resolución del ojo humano es de
aproximadamente 0.2 mm.
Los microorganismos son demasiado pequeños para ser detectados por el ojo humano, por ello, es
esencial la observación microscópica para determinar la forma, el tamaño, agrupamiento y
características de coloración de los mismos. Generalmente, éstos son los primeros datos que se
obtienen cuando se desea saber que tipo de bacteria u hongo es. Con el microscopio óptico se
consigue un amplio margen de aumento que puede alcanzar desde 10 a 1000 diámetros.
Existen varios tipos de microscopios y se han desarrollado numerosos métodos que permiten
examinar con gran detalle las muestras que contienen microorganismos. Cada tipo de microscopio
y cada técnica de preparación de las muestras ofrece determinadas ventajas para la demostración
de ciertos caracteres morfológicos.
PROCEDIMIENTO
1. Clase teórica uso de los objetivos del microscopio
2. Clase teórica partes ópticas y mecánicas del microscopio
3. Indicaciones del uso del microscopio
4. Calculo del IIO ((x/5)*10mm)
5. Visualización de las láminas previamente fijadas
6. Registro de las laminas
RESULTADOS
1. Calculo del IIO ((x/5)*10mm)
2. Imágenes de resultados (visualización en microscopio)
3. Tabla de registro de las laminas
POST-LABORATORIO
1. Liste 10 muestras que pueden ser observadas en fresco y con coloraciones.
MUESTRAS OBSERVADAS EN FRESCO
1) Protozoos
2) Trichomonas vaginalis en secreciones vaginales
3) Levaduras
4) Cortes de tejidos vegetales
5) Agua de charca (algas, hongos, protozoos)
6) Células sanguíneas (Eritrocitos y leucocitod)
7) Células epiteliales de la boca
8) Plancton (Fito y zoo)
9) Orina
10) Esperma
11) Suspensión de colonia bacteriana
MUESTRAS OBSERVADAS COLORANTES
1) Bacterias grampositivas y gramnegativas (Tinción de gram) (cristal violeta, lugol, acetona,
fucsina)
2) Micobacterias (acido-alcohol resistentes) (Tinción de Ziehl-Neelsen)(fucsina, HCl, azul de
metileno)
3) Glomerulo de un riñón/ Células EUCARIOTAS ( Tinción hematoxilina-eosina)
4) Bacterias con esporas (géneros bacterianos, entre los que destacan Clostridium y Bacillus)
(Tinción WIRTZ-CONKLIN) (Verde malaquita y safrina)
5) Fibras del tejido conjuntivo (métodos tricrómicos como el Mallory, el Mallory-Azan y el
método de Masson)
6) Células Epitelio de cebolla (Lugol) (Diferenciación de nucleo)
7) Microorganismos con capsulas (Tinciones negativa)
8) Diferenciación de células sanguíneas (Tincion de Wright)
9) Hongos (Tinción de azul algodón de lactofeno)
10) Material fecal niveles de grasa (Sudan)
11) Tejido nervioso (Tinción argentica)
12) Hueso (tionina o tinción negativa)
13) Higado H-E (Tinción tricrómico, reticulina, PAS y PAS-distasa, azul de Pearls).
CONCLUSIONES
RECOMENDACIONES
Aprender los fundamentos de microscopia para evitar daños en la salud visual a largo
plazo.
Calcular correctamente el IIO para facilitar graduar la distancia binocular en la observación
microscópica.
El laboratorio debería contar con nuevos microscopios o por lo menos establecer fechas
de revisión de los equipos, debido a que algunos microscopios presentan fallas técnicas y
otros son completamente afuncionales.
Tener un adecuado manejo de todos los reactivos a emplear en la coloración para evitar
un desperdicio de los mismo (cantidades excesivas) y machas que puedan enlodar en área
de trabajo.
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