CÓDIGO: FO-DOC-112
UNIVERSIDAD DE LOS LLANOS
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PROCESO GESTION DE APOYO A LA ACADEMIA FECHA: 02/09/2016
FORMATO GUÍA PARA PRÁCTICAS DE LABORATORIO VIGENCIA: 2016
LABORATORIO DE BIOLOGIA MOLECULAR
UNIDAD ACADEMICA: PROGRAMA DE BIOLOGÍA
CURSO: BIOLOGÍA MOLECULAR
PRACTICA Nº 05: DETECCIÓN DE ADN MEDIANTE ELECTROFORESIS EN GELES DE AGAROSA
1. OBJETIVOS
• Identificar los materiales y equipos usados para electroforesis vertical.
• Familiarizar al estudiante con el uso de métodos electroforéticos para la detección de Ácidos Nucleicos.
• Utilizar la electroforesis de agarosa como método de separación y calidad de Ácidos nucleicos.
• Entender las bases conceptuales de la electroforesis vertical.
2. CONSULTA PREVIA
Los estudiantes indagarán sobre la temática que se está desarrollando en la parte teórica y la relacionarán con
la parte práctica. Investigar sobre las técnicas de electroforesis y su importancia en el campo de la biología
molecular.
3. FUNDAMENTO TEORICO
Para detectar los productos obtenidos después de varios de los procedimientos realizados en un laboratorio
molecular, como son: extracción de ADN, cortes con enzimas de restricción y amplificación de ADN o ADNc
mediante PCR se requiere la utilización de la electroforesis como metodología analítica que permite visualizar
estos productos.
La electroforesis es un procedimiento en el cual una partícula cargada se hace desplazar a través de un medio
aplicando un campo eléctrico. Por lo tanto, ésta permite que macromoléculas como aminoácidos, péptidos,
proteínas, nucleótidos y ácidos nucleicos, se muevan hacia el polo positivo o negativo, en función de la carga
que posean y de esta manera se separen por la velocidad de migración bajo la acción de un campo eléctrico. A
diferencia de las proteínas, las cuales pueden tener una carga positiva o negativa, los ácidos nucleicos están
cargados de forma negativa debido a su esqueleto de grupos fosfato. Por lo tanto, en una electroforesis, los
ácidos nucleicos migrarán hacia el polo positivo, es decir, el ánodo.
La agarosa puede ser utilizada como soporte para la corrida electroforética. La agarosa es un polisacárido
extraído de algas marinas que tiene la propiedad de mantenerse en estado sólido a temperatura ambiente pero
que a altas temperaturas se torna líquida. Esta característica permite una fácil preparación de una matriz porosa
para ser usada en electroforesis: simplemente se pesa la cantidad de agarosa requerida, se disuelve en un
amortiguador adecuado, se calienta y se vierte sobre un molde particular. Una ventaja que posee la agarosa
sobre la acrilamida es que no es un compuesto tóxico y además permite el análisis de ácidos nucleicos con
pesos moleculares muy variados. Sin embargo, su poder de resolución es menor que el de los geles de
poliacrilamida. Algunos de los usos de la electroforesis de ácidos nucleicos en geles de agarosa son: determinar
los tamaños moleculares de los ácidos nucleicos, analizar los fragmentos cortados con enzimas de restricción,
comparar los tamaños entre sí de distintos tipos de ADN y aislamiento y recuperación de fragmentos de ADN
purificados.
4. EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS
Se debe listar los equipos, materiales y reactivos requeridos para el desarrollo de la práctica.
Equipos Materiales Sustancias y/o Reactivos
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ADN extraido previamente. TBE (Tris-Borato-EDTA)
Micropipetas de 2ul, 10ul, 20µl, 100ul, Tubos de centrifuga 1.5 o 2.0 ml Isopropanol
200ul y 1000µl. Buffer de carga
Beaker o Erlenmeyer de 125mL Bromuro de etidio o
Vórtex Espátula SyberGreen
Camara de electroforesis horizontal Puntas para micropipetas Agarosa
Buffer TE (Tris – EDTA)
Transiluminador de luz ultravioleta (UV) Guantes NaCl
Equipos de laboratorio PVP
B-Mercaptoetanol
SDS
5. PROCEDIMIENTO O METODOLOGÍA
Pesar 0.64 g de agarosa (agarosa al 0.8%).
Disolver la agarosa en 80 ml de amortiguador TBE 0.5X. Calentar en el microondas por 45 s, luego se
agita con movimientos circulares hasta que se disuelvan todas las partículas de agarosa translúcidas. Se
debe tener precaución con los recipientes calientes ya que pueden causar quemaduras.
Incorporar 1.0 μl de bromuro de etidio en la solución caliente de agarosa y agitando con movimientos
circulares.
El soporte para verter el gel debe estar limpio y seco, se ajusta en el molde portagel o tabla niveladora y
se colocan los peines que generarán los pozos para aplicar las muestras.
Cuando la agarosa alcanza los 50–60 °C aproximadamente se vierte en el centro de la bandeja para gel
evitando la formación de burbujas.
Se deja reposar, el gel tarda de 20–40 minutos para solidificar a temperatura ambiente.
Una vez solidificado el gel se quitan los peines, sujetándolo con ambas manos y halando
cuidadosamente hacia arriba.
Posteriormente se traslada el soporte para el gel hasta la cámara de electroforesis, colocando los pozos
más cercanos al borde hacia el polo negativo (de color negro) debido a que las muestras migrarán hacia
el ánodo (de color rojo) durante la electroforesis. Se agrega TBE hasta sumergir el gel unos 2 a 6 mm.
Con una micropipeta tomar 3 µl de ADN más 2 μl de tampón de carga y mezclar.
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Para iniciar la corrida electroforética, colocar la tapa, asegurándose que los electrodos estén en
contacto y conectados a la fuente de poder. Encienda la fuente de poder. La electroforesis se realiza a
100 V, 50 miliamperios durante 30 minutos aproximadamente.
Finalizada la electroforesis, apagar la fuente de poder, se destapa la cámara y se retira el soporte para
gel de la cámara, sosteniendo con los dedos los bordes para evitar que el gel se caiga.
Examine el gel bajo la lámpara de luz ultravioleta para determinar la posición de las bandas en el gel.
6. RESULTADOS
Los resultados obtenidos durante la práctica se pueden expresar en tablas, gráficos, dibujos; y el informe
deberá ir acompañado del siguiente cuestionario resuelto
¿En qué consiste el proceso de la electroforesis?
¿Cuáles son las diferencias entre electroforesis horizontal y vertical?
¿En qué caso se utiliza la poliacrilamida para separación de ácidos nucleicos?
¿Qué factores afectan la velocidad de migración del DNA en geles de agarosa?
¿Por qué se utiliza la luz Ultravioleta para visualizar el ADN?
¿Cómo funciona el bromuro de etidio en la visualización de ácidos nucleicos? Explique en un diagrama el
fundamento exacto de éste. ¿Cuáles son los efectos biológicos adversos puede tener el bromuro de etidio?
Investigue las propiedades físico-químicas de la Agarosa y la Poliacrilamida.
Discuta y argumente, porque se utilizan diferentes concentraciones de geles de agarosa para visualizar ADN
total (0.8%) y productos PCR (1.2%).
¿Qué es el buffer de carga y que propósitos cumple en la electroforesis? ¿Cuáles son los buffers de
electroforesis en agarosa más comunes?
Explique detalladamente cuáles son los buffers utilizados en el corrido electroforético y sus componentes (TAE,
TBE). ¿Cuáles son sus propiedades y cuando se utilizan?
¿Cuáles son los métodos más utilizados para visualizar y cuantificar el ADN en un corrido electroforético?
7. BIBLIOGRAFIA
ALMONACID, C PINILLA G. Introducción al análisis Bioquímico y a sus métodos de separación. 2008.
PERBAL, B. A practical guide to molecular cloning. 2da edition John Wiley & Sons, 1988.
DAVID, L.G. DIBNER, M.D.& BATTERY, J..F. Bassic methods in molecular biology. Elsiever Science publishing
Co. Ind. NY. 1986.
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HAMES, BD.& RICKWOOD, D. Gel electroforesis of protein, a practicla approach. IRL. Perss. Oxford.
Washington D.C. 1983
HAMES, BD.& RICKWOOD, D. Gel electroforesis of nucleid acids, a practice a approach. IRL. Perss. Oxford.
Washington D.C. 1984
SAMBROOK, J., FRITSCHH, AND MANIATIS, T. 2012. Molecular cloning a Laboratory. 4° Edición. Cold Spring
Harbor Laboratory Press.
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