UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS
Universidad del Perú, DECANA DE AMÉRICA
FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ANALITICA INSTRUMENTAL
TEMA DE PRÁCTICA:
El espectrofotómetro, manejo, cuidados y calibración. Obtención
de espectros y su interpretación.
INTEGRANTES:
17040084 Bonifacio Velez de Villa, Eliezer
17040012 Sinche Solis, Mirian Liliana.
17040086 Cuzcano Ramos, Jonathan Santiago
17040028 Rojas Quispe, John Edison
17040066 Magallanes Quispe, Victor Rodrigo
17040020 Pumacayo Hinostroza, Janet Livia
170400 Huarhua Jimenez, Victor Nolberto
PROFESORA RESPONSABLE:
[Link] CASAS, NORMA ANGELICA.
HORARIO:
Jueves (10:00am – 2:00pm)
LIMA-PERÚ
2018
OBJETIVOS
➢ Conocer el uso, el manejo y cuidado del espectrofotómetro.
➢ Obtener las gráficas del espectro de absorción del azosulfamida.
FUNDAMENTO DEL MÉTODO
Espectrofotómetro
El espectrofotómetro UV-visible es un equipo de uso fácil y las determinaciones que
en él se realizan son de tipo cuantitativo.
La técnica analítica utilizada es la espectrofotometría UV-visible que permite
determinar la concentración de un compuesto en solución.
Se basa en que las moléculas absorben las radiaciones electromagnéticas y a su vez
que la cantidad de luz absorbida depende de forma lineal de la concentración. Para
hacer este tipo de medidas se emplea un espectrofotómetro, en el que se puede
seleccionar la longitud de onda de la luz que pasa por una solución y medir la cantidad
de luz absorbida por la misma.
El fundamento de la espectroscopía se debe a la capacidad de las moléculas para
absorber radiaciones, entre ellas las radiaciones dentro del espectro UV-visible. Las
longitudes de onda de las radiaciones que una molécula puede absorber y la
eficiencia con la que se absorben dependen de la estructura atómica y de las
condiciones del medio (ph, temperatura, fuerza iónica, constante dieléctrica), por lo
que dicha técnica constituye un valioso instrumento para la determinación y
caracterización de biomoléculas.1
Cuando la luz (considerada como energía) es absorbida por una molécula se origina
un salto desde un estado energético basal, E1, a un estado de mayor energía (estado
excitado), E2, y solo se absorberá la energía que permita el salto al estado excitado.
Cada molécula tiene una serie de estados excitados (o bandas) que la distingue del
resto de moléculas. Como consecuencia la absorción que a distintas longitudes de
onda presenta una molécula; esto es, su espectro de absorción que constituye una
señal de identidad de la misma. Por último, la molécula en forma excitada libera
energía absorbida hasta el estado energético fundamental.2
Ley de Beer Lambert
Se conoce también como ley de Beer o de Beer Lambert Bouguer e identifica la
relación existente entre la concentración de la muestra y la intensidad de la luz
transmitida a través de la misma. Con relación a la ley en mención. Hay implícitos dos
conceptos: transmitancia [T] y absorbancia [A]. 3
Transmitancia [T]
Es la fracción de la luz incidente que a una determinada longitud de onda pasa a
través de la muestra. Se define por la siguiente relación:
El porcentaje de transmitancia [%T] puede expresarse por la siguiente ecuación:
La concentración de moléculas absorbentes de luz en la muestra es proporcional a la
absorbancia [A] de la muestra. Matemáticamente se expresa así:
METODOLOGÍA
CÁLCULOS
● Para la preparación de diluciones, se llevó a cabo los siguientes cálculos:
5g → 100 mL
0.05g → 1 mL
● Convertimos a µm :
50000µm/mL
● 1 mL de esta concentración 50000µm/mL fue llevada a una fiola de 100mL ,
por lo tanto tendríamos lo siguiente:
50000µm/mL → 100 mL
500µm/mL → 1 mL
● Con esto se tendría la sustancia patrón de concentración 500µm/mL
● A partir de ella se realizarán las siguientes disoluciones, teniendo en cuenta
que estas soluciones deben ser calculadas de mayor concentración a menor
concentración.
● Para obtener una concentración de 100µm/mL debemos utilizar una
concentración 500µm/mL y hacer los siguientes cálculos:
C1V1=C2V2
500 µm/mLxV=100 µm/mLx100 mL
V=20 mL
● Para las concentraciones siguientes de 80, 60, 50, ...1.5 µm/mL se realizara
el calculo se manera similar al cálculo anterior.
RESULTADOS
Representación mediante gráfica de las lecturas del porcentaje de transmitancia (Y)
versus longitud de onda (X).
GRÁFICA Nº1(Anexo)
Donde:
Porcentaje de transmitancia (%T) será representada en el eje de las ordenadas(Y).
Longitud de onda (λ) será representada en el eje de las abscisas (X).
Tabla de datos:
Longitud de onda (nm) %T
450 75.9
460 74.1
470 71
480 67
490 63
500 59.6
510 56.6
520 55.2
530 55
540 56.5
550 59.9
560 65
570 71.1
580 77.2
590 82.3
600 86.3
DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS
Durante la experiencia se empleó como reactivo un compuesto orgánico cromóforo
como la azosulfamida, cuyo solvente fue el agua. Al tratarse de un compuesto
coloreado, se trabajó con longitudes de onda que se encontraban dentro del rango de
la luz visible (450 – 600 nm). Esto concuerda con lo dicho por K.A. Connors “Las
mediciones se realizan con la cubeta de la muestra respecto a la cubeta del disolvente
con un espectrofotómetro tomando lecturas desde 450 a 600 nm (Esta etapa es
necesaria porque tal vez las dos cubetas no sean ópticamente iguales)”.5
De esta manera, se calculó el porcentaje de transmitancia a diferentes longitudes de
onda, obteniendo su valor mínimo a 530 nm con un porcentaje de transmitancia del
55%, este valor no es muy bueno ya que no responde a lo descrito por el Dr. Olsen
en donde “el error relativo es mínimo para la mayoría de instrumentos, si los valores
de transmitancia son de alrededor del 37%”.6
El analito utilizado debe ser diluido en un solvente que no interfiera en el análisis
espectrofotométrico y además debe cumplir con la ley de Beer, el cual nos menciona
que el analito se debe encontrar en concentraciones relativamente [Link] la
práctica se utilizó como solvente agua destilada y se usó una muestra a una
concentración mínima para así disminuir los posibles errores de medición.6
Se maniobró con cuidado la cubeta para no dejar huellas digitales esto porque como
nos dice Skoog “La transmitancia se debe medir de diluciones del analito que se
encuentran en cubetas transparentes”. 7
Según Skoog, para conseguir espectros complejos bien resueltos se requieren
anchura de rendija estrechas. En la práctica se usó una anchura de banda de 10
nm,se obtuvo los resultados y se graficó la curva espectral, con esta gráfica se
determinó la longitud de onda espectral la cual nos da un valor de 530 nm. Al usar
una anchura de banda que no es efectiva la pérdida progresiva de los detalles
espectrales es clara. Para estudios cualitativos tales pérdidas son de gran
importancia.7
CONCLUSIONES
➢ Se llegó a conocer el manejo y los cuidados que se deben de tener con el
espectrofotómetro de absorción UV-visible ,el uso del espectrofotómetro nos
relaciona tanto concentración como transmitancia de una muestra de una
manera directamente proporcional lo cual nos facilita el encontrar la
concentración de las sustancias por medio de gráficas de linealidad.
➢ Se obtuvo las gráficas del espectro de absorción de la azosulfamida tanto de
la forma manual como de forma automática
APORTE BIBLIOGRÁFICO
CALIBRACIÓN DE UN ESPECTROFOTÓMETRO
En la calibración de un espectrofotómetro, el primer paso debe ser la limpieza y
alienación del sistema óptico, después se realiza la calibración de la longitud de onda,
y al final se verifica la respuesta de la absorbancia.
Los cristales de óxido de holmio son los marcos de referencia idóneos para calibrar
la longitud de onda, debido a que estas sustancias presentan espectros de absorción
de bandas finas. Este comportamiento se debe a que ambos cristales poseen poseen
pocos átomos y sus estructuras cristalinas limitan los grados de libertad , en
consecuencia la probabilidad de las transiciones disminuye.8
¿Qué cuidados se debe de tener para realizar una correcta lectura?
➔ Colocar el instrumento en un lugar en donde no esté sujeto a vibraciones, calor
excesivo, humedad o luz directa.
➔ Proteger el instrumento del polvo. Nunca tocar las superficies ópticas tales
como lentes y filtros. Seguir las instrucciones que da el fabricante para la
limpieza de tales componentes.
➔ Permitir que el instrumento se caliente antes de hacer algún procedimiento.
➔ Hacer un chequeo periódico (cada semana) del ajuste de la longitud de onda,
cuando se sospeche que ha variado, con el Tubo de Didimium.
➔ Verificar el 0 y el 100% T cada vez que se vaya a hacer lecturas y cuando varíe
la longitud de onda.
➔ Asegurarse de que las cubetas estén limpias y libres de rayaduras y huellas
digitales. Esto debe hacerse cada vez que va a usarse.4
¿Cómo se compone un espectrofotómetro?
Para que un espectrofotómetro realice las funciones correctas es necesario que
cuente con aquellos componentes que lo ayudarán en su labor. Por lo tanto, un
espectrofotómetro se compone de:
Fuente de luz
La fuente de luz ilumina la muestra química o biológica, pero para que realice su
función debe cumplir con las siguientes condiciones: estabilidad, direccionabilidad,
distribución de energía espectral continua y larga vida.
Las fuentes de luz que puede tener un espectrofotómetro son:
- Lámpara de wolframio (también llamado tungsteno)
- Lámpara de arco de xenón
- Lámpara de deuterio que es utilizada en los laboratorios atómicos
Monocromador
El monocromador de un espectrofotómetro aísla las radiaciones de longitud de onda
deseada, logrando obtener luz monocromática.
Un monocromador está constituido por las rendijas de entrada y salida, colimadores
y el elemento de dispersión.
Colimador
El colimador es un lente que lleva el haz de luz entrante con una determinada longitud
de onda hacia un prisma, el cual separa todas las longitudes de onda de ese haz
logrando que se redireccione hacia la rendija de salida.
Compartimiento de muestra
En el compartimento de muestra es donde se lleva a cabo la interacción R.E.M. con
la materia.
Detector
El detector se encarga de evidenciar una radiación para que posteriormente sea
estudiada y saber a qué tipo de respuesta se enfrentarán (fotones o calor).
Registrador
Convierte el fenómeno físico en números proporcionales al analito en cuestión.
Fotodetectores
Los fotodetectores de un espectrofotómetro perciben la señal en forma simultánea en
16 longitudes de onda y cubren al espectro visible, de esta manera se reduce el
tiempo de medida y minimiza las partes móviles del equipo.
Fig 5. Partes del espectrofotómetro
BIBLIOGRAFÍA
1. Harris, D. Análisis Químico Cuantitativo; 3° ed. Barcelona: Reverté; 2007. Pág. 407-
408.
2. Pino, F; Perez D. Análisis de elementos por espectrometría de absorción molecular
UV-visible; 1°ed. Córdova: Universidad de Sevilla; 1983. Pág.123.
3. Salud OPd. Manual de Mantenimiento para Equipo de Laboratorio Villamil JE,
editor. Washington, D. C; 2005.
4. Colombia EyLd. Equipos y Laboratorio de Colombia. [Online].; 2011 [cited 2018
agosto domingo 20. Available from:
[Link]
5. K.A. [Link] de análisis farmacéutico.1 ° ed. Barcelona: Reverté; 1981.
Pág. 240.
6 Olsen E. Métodos ópticos de análisis, 1°ed. Barcelona: Reverté; 1990. Pág. 97.
[Link] [Link] de análisis instrumental. 5° Edición. CENGAGE Learning
Editores.México, D.F.2008. Pág:12-15,247-250.
[Link] W. Análisis Ultravioleta-visible.1°ed. Córdova: Universidad de Autónoma
de yucatán 2006. Pag 73.
9. [Link] [Online].; 2011 [cited 2018 agosto domingo 20. Available from:
[Link]
[Link]
UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS
Universidad del Perú, DECANA DE AMÉRICA
FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ANALITICA INSTRUMENTAL
TEMA DE PRÁCTICA:
Determinaciòn de la longitud de onda òptima de una sustancia orgánica
e inorgánica [Link] de [Link]ón de la zona de
trabajo. Determinación de la concentración óptima.
INTEGRANTES:
17040084 Bonifacio Velez de Villa, Eliezer
17040012 Sinche Solis, Mirian Liliana.
17040086 Cuzcano Ramos, Jonathan Santiago
17040028 Rojas Quispe, John Edison
17040066 Magallanes Quispe, Victor Rodrigo
17040020 Pumacayo Hinostroza, Janet Livia
170400 Huarhua Jimenez, Victor Nolberto
PROFESORA RESPONSABLE:
[Link] CASAS, NORMA ANGELICA.
HORARIO:
Jueves (10:00am – 2:00pm)
LIMA-PERÚ
2018
OBJETIVOS
● Realizar la curva de Ringbom mediante las diluciones de
azosulfamida.
● Determinar las concentraciones mínima y máxima mediante la
curva de Ringbom
Fundamento del Método
Cuando se realiza un análisis espectroscópico se debe trabajar, en lo
posible, con concentraciones que permitan que se cumpla la ley de Beer,
con el fin de obtener una curva de calibración que tenga una relación
lineal.
Para obtener intervalo óptimo de concentraciones primero se construye
la curva de Ringbom, que consiste en construir una gráfica de
absorbancia(100-%T) vs. lg Concentración los datos se obtienen
preparando una serie de soluciones patrón del analito, que cubren una
variación de por lo menos dos órdenes de magnitud de concentración de
este y se miden las transmitancias correspondientes a la longitud de onda
analítica escogida. Para la mayoría de los sistemas la curva de Ringbom
corresponde a una curva en forma de S. La parte lineal de esta gráfica
permite obtener el intervalo de concentraciones óptimo o el intervalo que
presentará una relación lineal entre absorbancia y concentración. En esta
gráfica los cruces de la parte recta (la intermedia), con la parte baja y con
la parte alta pueden servir para determinar un valor para los límites de
detección mínimo y máximo, respectivamente.
Metodología
Determinación de la
curva de Ringbom Materiales:
-Espectrofotómetro
-Diluciones de
Primero realizar las azosulfamida
diferentes diluciones -
de azosulfamida(0,1 Fiolas(100mL,50mL,10
ug/mL;2 mL).
ug/mL;...;100ug/mL) -Papel Semilogarítmico
-Agua destilada
Encender el
Espectrofotómetro
dejarlo calibrar y hallar
la longitud de onda
óptima.
Finalmente,obtenemos los
siguientes datos de
transmitancia a diferentes
Colocar el blanco y
concentraciones y
cuando llegue al
calculamos la absortancia
100%T, muestra por
para graficar en el papel
muestra vamos
semilogarítmico
calculando su
transmitancia a 525 nm
Cálculos
C (µg/mL) %T 100-%T (Absortancia)
0.1 94.5 5.5
0.2 91 9
0.5 91 9
1 85.7 14.3
2 78.2 21.8
5 61.7 38.3
12 39.9 60.1
15 33.6 66.4
20 16.9 83.1
25 13.8 86.2
30 9.5 90.5
40 4.6 95.5
50 2 98
60 1 99
80 0.2 99.8
100 0.2 99.8
Resultados
Concentración mínima = 2 µg/mL
Concentración máxima = 50 µg/mL
Concentración Óptima = 10.5 µg/mL
Discusión de los Resultados:
● Calculamos la longitud de onda óptima de la azosulfamida, lo cual
nos dio 2 posibles resultados a 525 nm y a 530 nm; usualmente se
calcula una longitud de onda óptima de la azosulfamida de 530
nm(1) , pero ya que el espectrofotómetro nos daba bandas de 5 en
5 se decidió usar una longitud de onda óptima de 525 nm ya que
nos iba a dar mejores resultados.
● Usamos diferentes concentraciones desde 0.1 ug/mL hasta 100
ug/mL con el fin de obtener nuestra curva de ringbom, en la cual
comparamos la Absortancia vs Logaritmo de las concentraciones,
todo esto para poder determinar nuestra zona de trabajo en donde
hallamos la concentración mínima(2 ug/mL), máxima(50 ug/mL) y
óptima(10.5 ug/mL) para posteriormente determinar la curva de
calibración, no obstante esta técnica posee incertidumbres que se
dividen en 3 categorías ; en el caso I se observan en los
espectrofotómetros o fotómetros ultravioleta y visible más baratos
que están equipados con medidores o lectores digitales de
resolución limitada(2), otros de los errores que se suelen cometer
sería todo con lo relacionado a la muestra(la pureza, diluciones
erróneas,etc)(3) .
● También debemos tener en cuenta las diluciones, para determinar
la curva de ringbom nosotros usamos un rango de concentraciones
desde 0.1 ug/mL hasta 100 ug/mL esto se debe a que si agregamos
diluciones más concentrados el analito retendrá la luz impidiendo el
paso de ello y obtendremos un valor de 0% T, es decir el equipo
tiene un límite de detección máximo(4).
Conclusiones:
● Se realizó la gráfica de la curva de Ringbom mediante las
concentraciones de azosulfamida de 0.1-100 µg/mL.
● Se determinó mediante la curva de Ringbom la concentración
mínima (2µg/mL), máxima (50µg/mL) y óptima (10.5µg/mL).
Cuestionario:
❖ Verificacion de la correcta función del espectrofotómetro:
El Responsable del Sistema de Gestión de Calidad del Laboratorio (SGC) deberá
definir el programa de verificación del equipamiento del laboratorio, en el cual incluirá
las actividades a realizar, sus responsables y la periodicidad de los controles. Esta
última se define en función de las condiciones de uso y el registro acumulado de
funcionamiento de los equipos. Las principales pruebas recomendadas en la
bibliografía consultada, para verificar el correcto funcionamiento de un
espectrofotómetro incluyen: la exactitud de la longitud de onda, la exactitud y precisión
fotométrica, la linealidad fotométrica y la verificación de la luz difusa o parásita.
5.1. Soluciones de calibración Se encuentran disponibles en el mercado, materiales
de referencia certificados de estas soluciones, aunque las mismas se pueden
preparar en el laboratorio a partir de reactivos de alta pureza y cuyas propiedades
físicas y químicas sean conocidas. Para materiales sin evidencia formal de la
trazabilidad (y su incertidumbre) es responsabilidad de los laboratorios demostrar que
los mismos son aptos para el fin previsto.
5.1.1. Solución de óxido de holmio en ácido perclórico. Disolver en un vaso de
precipitados 4,0 g de óxido de holmio (III) en 96,0 g de ácido perclórico al 10% (v/v).
Calentar y agitar para facilitar su disolución y luego dejar en reposo por 24 hs, a
temperatura ambiente.
5.1.2. Solución de sulfato de cobre en ácido sulfúrico. Disolver en un vaso de
precipitados 20,0 g de sulfato de cobre pentahidratado, de una pureza mayor al
99,9%, en suficiente agua destilada. Adicionar, con cuidado, 10 ml de ácido sulfúrico
(d = 1,84 g cm-3), y trasvasar cuantitativamente la solución a un matraz aforado de 1
litro. Enrasar con agua destilada y homogeneizar.
5.1.3. Solución de ácido sulfúrico 0,005 mol L-1 Pesar en un vaso de precipitados
0,49 g de ácido sulfúrico (d = 1,84 g cm-3), diluir con agua destilada y trasvasar
cuantitativamente a un matraz de 1 litro. Enrasar con agua destilada y homogeneizar.
5.1.4 Soluciones de Dicromato de potasio
a) Solución de concentración 0,10 g L-1 Secar aproximadamente 1 g de dicromato de
potasio, de una pureza mínima de 99,95%, en estufa a 105 ºC por 2 horas y enfriar
en desecador. Pesar 0,10 g y disolver en un vaso de precipitados con la solución de
ácido sulfúrico 0,005 mol L-1. Trasvasar cuantitativamente a un matraz de un litro,
enrasar con la solución de ácido sulfúrico 0,005 mol L-1 y homogeneizar.
b) Serie de soluciones de Dicromato de potasio Preparar cuatro soluciones de
dicromato de potasio de diferente concentración, requeridas para los controles, a
partir de la solución de 0,10g L-1, tal como se indica en la tabla 1, enrasando a un
volumen final de 100 ml con ácido sulfúrico 0,005 mol L-1.
5.2. Parámetros
5.2.1 Control de la exactitud de la longitud de onda La desviación de la longitud de
onda puede causar errores en los resultados cuantitativos de la lectura en el UV-Vis.
En este control se verifica el grado de concordancia entre la longitud de onda
seleccionada para la máxima absorbancia y la longitud de onda de referencia. Con
una misma cubeta, ajustar el cero (0) del instrumento VI IBEROLAB 3 con la solución
de ácido perclórico al 10%. Se recomienda medir según el rango espectral una
longitud de onda para el espectro UV y tres longitudes de onda para el espectro Vis.
Dependiendo del ancho de banda del equipo, la máxima absorción de la solución de
óxido de holmio en ácido perclórico se detectará a las longitudes de onda indicadas
en la tabla 2.
Tabla 2. Longitudes de onda (λ) de máxima absorción de la solución de óxido
de Holmio en ácido perclórico.
5.2.2. Control de la exactitud fotométrica La exactitud fotométrica se determina
comparando la absorbancia de una solución de referencia (Tabla 3) con la lectura de
ésta, obtenida en el espectrofotómetro. Para cubrir satisfactoriamente el rango UV-
Vis del espectro, se utilizan dos soluciones diferentes: dicromato de potasio, para el
espectro UV y sulfato de cobre, para el espectro Vis.
Tabla 3. Absorbancias de referencia de las soluciones en el rango UV-Vis
• Control en el rango UV: Realizar 6 lecturas consecutivas de la solución de dicromato
de potasio en ácido sulfúrico de concentración 0,06 g L-1 a las longitudes de onda de
235, 257, 313 y 350 nm, registrando los valores y confrontándolos con los valores de
referencia.
• Control en el rango Vis: Realizar 6 lecturas consecutivas de la solución de sulfato de
cobre en ácido sulfúrico a las longitudes de onda de 600, 650, 700 y 750 nm,
registrando los valores y confrontándolos con los valores de referencia.
5.2.3. Control de la precisión fotométrica Se denomina precisión fotométrica a la
medida de la dispersión de una serie de mediciones de absorbancia alrededor de la
media, y se expresa como coeficiente de variación porcentual. Para la determinación,
utilizar los datos obtenidos en la prueba de exactitud fotométrica (5.2.2), con la
solución de dicromato de potasio de 0,06 g L-1 a las siguientes longitudes de onda:
235, 257, 313, 350 nm.
5.2.4. Control de la linealidad fotométrica El estudio de la linealidad fotométrica
permite establecer el rango de absorbancia en el que el instrumento tiene respuesta
proporcional a los cambios de concentración. Para ello se determina la respuesta del
espectrofotómetro a diferentes concentraciones de una sustancia que cumpla con la
ley de Lambert-Beer. Se evalúa la linealidad fotométrica realizando lecturas de
absorbancia de la serie de soluciones de dicromato de potasio (0,02; 0,04; 0,06; 0,08
y 0,1 g L-1), utilizando la solución de ácido sulfúrico 0,005 mol L-1 para realizar el
ajuste a 0 de absorbancia del equipo. Las longitudes de onda a que se realizan las
lecturas serán: 235, 257, 313 y 350 nm.
5.2.5. Control de Luz difusa o parásita Se denomina así a toda radiación
electromagnética de longitud de onda distinta a la seleccionada por el monocromador,
que alcanza el detector y por lo tanto queda registrada por el instrumento. Este control
se basa en la medida del porcentaje de transmitancia de una solución de nitrito de
sodio 50 g L-1. Esta sustancia tiene la propiedad de que sus soluciones absorben
toda la radiación incidente de longitudes de onda menores a los 390 nm, es decir, que
es ópticamente opaca a la luz. Por lo tanto, la transmitancia a 340 nm de esta solución
debe ser igual a cero, y toda transmitancia detectada corresponde a luz parásita. El
ajuste del equipo a 0 de transmitancia se realiza con aire, luego se mide la
transmitancia de la solución de nitrito de sodio a una longitud de onda de 340 nm.
Realizar las lecturas por triplicado.
● Longitudes de onda óptima de máxima absorbancia de otros
compuestos.
Compuesto Longitud de onda analítica
Sulfapiridina, tableta UV: 254 nm
Sulfasalazina UV-visible: 359 nm
Sulfinpirazona UV: 259 nm
Ketoconazol, tabletas UV: 270 nm
(1)
Referencias Bibliográficas:
[Link] XXXVIII Farmacopea Americana y National Formulary XXXVIII ,
edición 2015.
[Link] D., Holler F., Crouch S. Principios de análisis instrumental. 6°
Edición. CENGAGE Learnig Editores.México, D.F.2008. Pág:12-15,247-
250.
[Link]ñez Maria, Garcìa [Link]ón de la incertidumbre en la
cuantificación de fósforo por Espectrofotometría Ultravioleta-
[Link] de Sonora,vol. 17, num 3, 25 de Septiembre 2015,pp.
34-41
[Link]¨{Internet}.2013{Actualizado 10 de Septiembre del 2013,
Citado 11 de Septiembre del 2018} URL disponible en :
[Link]
[Link] M.P, et al. GUIA PARA LA VERIFICACIÓN DE
ESPECTROFOTÓMETROS UV-VISIBLE UTILIZADOS EN EL ANÁLISIS
DE SUELO Y AGUA. IBEROLAB.
UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS
Universidad del Perú, DECANA DE AMÉRICA
FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ANALITICA INSTRUMENTAL
TEMA DE PRÁCTICA:
Trazado de la Curva de calibración y su validació[Link]ón
de principios activos empleando curva de calibración.
INTEGRANTES:
17040086 Cuzcano Ramos, Jonathan Santiago
17040012 Sinche Solis, Mirian Liliana.
17040028 Rojas Quispe John Edison
17040066 Magallanes Quispe Victor Rodrigo
17040084 Bonifacio Velez de Villa, Eliezer
17040020 Pumacayo Hinostroza, Janet Livia
170400 Huarhua Jimenez, Victor
PROFESOR RESPONSABLE:
CARLOS CASAS, NORMA ANGELICA
HORARIO:
Jueves (10:00am – 2:00pm)
LIMA-PERÚ
2018
OBJETIVOS:
● Realizar una representación gráfica de la curva de calibración
absorbancia versus concentración del analito.
FUNDAMENTO:
Una curva de calibración se prepara plasmando los datos en una gráfica
o ajustándose una ecuación matemática aceptable, como la ecuación de
la recta dada por la pendiente y la ordenada en el punto de corte que se
usa en el método de los mínimos cuadrados lineales. La calibración se
consigue al obtener la señal de respuesta (absorbancia, altura del pico,
área del pico) en función de la concentración conocida del analito 1. Es
decir que existe una correlación lineal entre la respuesta (absorbancia en
este caso) y la concentración del analito. Dicha relación es graficable.
Basados en dicha correlación se puede predecir el resultado más
probable. Es decir que a partir de una respuesta se puede obtener una
concentración y viceversa.
La curva de calibracion requiere de condiciones analiticas que deben
estar presentes previamente. Dichas condiciones incluyen: la sustancia
estándar, el cual es el elemento de comparación del analito; longitud de
onda óptima, la cual es determinada por la curva de Ringbow; el solvente
adecuado y, naturalmente, el instrumento debe estar calibrado
correctamente. En general existen seis parámetros de calidad que se
tienen en cuenta al usar un determinado método de análisis, en este caso
consideraremos dos: la sensibilidad y el límite de detección. La
sensibilidad está relacionada con la magnitud del cambio en un
instrumento con los cambios en la concentración del analito, es decir la
cantidad de analito que puede producir un cambio en la respuesta del
[Link] límite de detección refiere a la menor cantidad posible que
podemos detectar con cierto grado de confianza o significación, está
relacionada con la mínima cantidad de analito que el instrumento puede
detectar. No está demás decir que pueden existir interferencias en el
análisis que influyan en la absorbancia real del analito dado que se suele
trabajar en una solución donde esta el analito y un patrón. Las variaciones
pueden ser producto de diferencias en el pH, la viscosidad, fuerzas
iónicas, impurezas, etc. Es por ese motivo se recomienda calibrar el
sistema patrón-analito con el denominado “protocolo de adición de
patrón”.
METODOLOGÍA EXPERIMENTAL
Una vez obtenido la longitud de onda óptima mediante la curva
espectral(absorbancia vs longitud de onda)y el rango de concentraciones
óptimos mediante curva de Ringbom(absortancia vs logaritmo de la
concentración) se procede a graficar la curva de calibración.
RESULTADOS:
La curva de calibración realizada se realizó utilizando los datos de la
absorción que nos brindaba el espectrofotómetro colocando la muestra
en blanco en la cubeta 1 y las diluciones de azosulfamida de 2ug/ml ,
5ug/ml , 9ug/ml , 20ug/ml y 40ug/ml en la cubeta número 2 obteniéndose
las absorbancias de 0.072 , 0.162 , 0.31 , 0.755 , 1.489 respectivamente
con el cual se trazó la curva de calibración en papel milimetrado , la
dilución del aseptil rojo se evaluó en el espectrofotómetro y marcó una
absorbancia de 0.54 con lo cual con ayuda de la curva de calibración se
halló la concentración de 14.5 ug/ml lo que nos sirvió para hallar el
porcentaje de la muestra que fue de 4,0277%. Gráfica Nº3 Anexos
DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS:
● Esta experiencia es comparable con una práctica de laboratorio de
la cátedra de quimica analitica instrumental de la UNMSM en el año
2014 2, en el que se utilizó la misma técnica experimental pero a
diferentes concentraciones para armar una curva de calibración
como 4ug/ml, 8ug/ml, 16ug/ml, 20ug/ml y 32ug/ml obteniéndose
también diferentes absorbancias 0.1355 0.2645 , 0.4025 ,0.872 ,
1.304 y para hallar la concentración de la muestra (aseptil rojo)
utilizaron la ecuación de la recta tomando los dos puntos de
concentración más altos obteniendo una de 22.734ug/ml lo cual les
sirvió para hallar el porcentaje de su muestra que fue de 3,789 %
cabe resaltar que en este experimento también se utilizó el aseptil
rojo de 5%. .
● A partir del experimento se pudo determinar la concentración del
aseptil rojo la cual es de 14.5 ug/ml según nuestros cálculos lo que
corresponde a 4,0277 % siguiendo el procedimiento indicado , lo
cual es muy bajo de acuerdo a lo indicado con el producto en el cual
nos afirma que posee un porcentaje de 5%, de acuerdo a un
documento emitido por la DIGEMID( 4) esto se puede deber a que
hay falsificaciones de este producto en donde, además de que la
azosulfamida está muy por debajo de las especificaciones ,
presenta hongos de hifas las cuales según el libro Introduccion a la
microbiologia ( 3) nos indica que estos hongos crecen en medios en
donde hay un pH ácido (aproximadamente 5) y en donde haya una
temperatura de 22 a 30 °C de lo cual podemos deducir que el
producto no ha sido guardado en la mejor de las condiciones.
CONCLUSIÓN:
Es posible utilizar la curva de calibración para predecir y hallar la
concentración de diferentes sustancias en estudio esta se realizará con
ayuda del espectrofotómetro con el cual se hallará la absorbancia para
una determinada concentración , también a través de la curva de
calibración es posible verificar si algunos productos cumplen con los
estándares con los que indican.
REFERENCIAS :
1. Skoog D., Holler F., Crouch S. Principios de análisis instrumental.
6° Edición. CENGAGE Learnig Editores.México, D.F.2008. Pág:12-
15,247-250.
2. Cueva L.,Huayta E.,Julca K., Villar K. Cuantificación de una muestra
por curva de calibración y por comparación con un estándar.
Informe de [Link]. Lima 2014.
3. García V. Introducción a la microbiología. 2° Edición. EUNED
Editorial. 2005. Pág: 85-89.
4. DIGEMID. ALERTA DIGEMID N° 5 - 99:Falsificación del producto
aseptil rojo.1999.(Internet) Recuperado de:
[Link]/Upload/Uploaded/PDF/Alertas/1999/A
LERTA_05-[Link]
