TECNICAS BÁSICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR

¿A que se denomina técnicas de biología molecular?

En principio se denomina así a todas las técnicas de laboratorio que se usan par
aislar ADN o extraerlo en alta pureza, visualizarlo para ver su estado, cortarlo y
pegarlo, amplificar una región en una enorme cantidad de moléculas ( clonación
de fragmentos en bacterias u otros vectores como virus, PCR Etc.

REACCIÓN EN CADENA POLIMERASA

• Es una de las técnicas más importantes usadas en biología molecular y

se utiliza básicamente para copiar la DNA.
• La polimerización en cadena permite que una única serie de la DNA sea
amplificada en millones de moléculas de la DNA.
• La polimerización en cadena se puede también utilizar para introducir
mutaciones dentro de la DNA o para introducir sitios especiales de la
enzima de la restricción.
• La polimerización en cadena se utiliza para determinar si cierto fragmento
de la DNA existe en una biblioteca del cDNA.
• Diversos tipos de polimerización en cadena incluyen la polimerización en
cadena reversa de la transcripción (RT-PCR) para la amplificación del
ARN y la polimerización en cadena cuantitativa (QPCR) para medir la
cantidad de presente del ARN o de la DNA.

Puntos más importantes

La reacción en cadena de la polimerasa, o PCR, es una técnica para hacer
muchas copias de una determinada región de ADN in vitro (en un tubo de ensayo
en lugar de un organismo).
La PCR depende de una ADN polimerasa termoestable, la Taq polimerasa, y
requiere de cebadores de ADN diseñados específicamente para la región de
ADN de interés.
En la PCR, la reacción se somete repetidamente a un ciclo de cambios de
temperatura que permiten la producción de muchas copias de la región blanco.
La PCR tiene muchas aplicaciones en la investigación y en la práctica. Se utiliza
de forma rutinaria en la clonación de ADN, el diagnóstico médico y el análisis
forense de ADN.
¿Qué es la PCR?
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica de laboratorio
común utilizada para hacer muchas copias (¡millones o miles de millones!) de
una región particular de ADN. Esta región de ADN puede ser cualquier cosa que
le interese al experimentador. Por ejemplo, podría ser un gen cuya función quiere
entender un investigador o un marcador genético usado por científicos forenses
para relacionar el ADN de la escena del crimen con los sospechosos.
Por lo general, el objetivo de la PCR es producir suficiente ADN de la región
blanco para que pueda analizarse o usarse de alguna otra manera. Por ejemplo,
el ADN amplificado por PCR se puede secuenciar, visualizar por electroforesis
en gel o clonar en un plásmido para otros experimentos.
La PCR se utiliza en muchas áreas de la biología y la medicina, como la
investigación en biología molecular, el diagnóstico médico e incluso algunas
ramas de la ecología.
La Taq polimerasa
Al igual que la replicación de ADN en un organismo, la PCR requiere de una
enzima ADN polimerasa que produzca nuevas cadenas de ADN mediante el uso
de las cadenas existentes como molde. La ADN polimerasa que normalmente se
utiliza en la PCR se llama Taq polimerasa, por la bacteria tolerante al calor de la
que se aisló (Thermus aquaticus).
T. aquaticus vive en aguas termales y fuentes hidrotermales. Su ADN polimerasa
es muy termoestable y su mayor actividad se presenta cerca de los 70 °\text
C70°C70, °, start text, C, end text (temperatura a la que la ADN polimerasa de
ser humano o de E. coli no funcionaría). La Taq polimerasa es ideal para la PCR
gracias a esta estabilidad térmica. Como veremos, la PCR utiliza altas
temperaturas repetidamente para desnaturalizar el molde de ADN o separar sus
cadenas.
Cebadores para PCR
Al igual que otras ADN polimerasas, la Taq polimerasa solo puede hacer ADN si
hay un cebador, una corta secuencia de nucleótidos que proporciona un punto
de partida para la síntesis de ADN. En una reacción de PCR, la región de ADN
que será copiada, o amplificada, se determina por los cebadores que el o la
investigadora elija.
Los cebadores para PCR son pedazos cortos de ADN de cadena sencilla,
generalmente de unos 202020 nucleótidos de longitud. En cada reacción de PCR
se utilizan dos cebadores que están diseñados para flanquear la región blanco
(la región que debe ser copiada). Es decir, les agregan secuencias que harán
que se unan a cadenas opuestas del molde de ADN solo en los extremos de la
región a copiar. Los cebadores se unen al molde mediante complementariedad
de bases.
ADN molde:

Los pasos de la PCR

Los ingredientes clave para una reacción de PCR son Taq polimerasa,
cebadores, ADN molde y nucleótidos (los bloques básicos del ADN). Los
ingredientes se colocan en un tubo, junto con los cofactores que necesite la
enzima, y se someten a ciclos repetidos de calentamiento y enfriamiento que
permiten la síntesis del ADN.
 Los pasos básicos son:
Desnaturalización (96 °): la reacción se calienta bastante para separar, o
desnaturalizar, las cadenas de ADN. Esto proporciona los moldes de cadena
sencilla para el siguiente paso.
Templado (55- 65°C): la reacción se enfría para que los cebadores puedan unirse
a sus secuencias complementarias en el molde de ADN de cadena sencilla.
Extensión (72 °): la temperatura de la reacción se eleva para que la Taq
polimerasa extienda los cebadores y sintetice así nuevas cadenas de ADN.

REPRODUCCIÓN DE LA EXPRESIÓN
Esta técnica ayuda a científicos a entender la función de la proteína. La DNA que
cifra para una proteína determinada se reproduce o se copia usando la
polimerización en cadena en un vector de la expresión llamado un plásmido. El
plásmido se introduce a una célula animal o a una célula bacteriana. Este
plásmido tiene elementos del promotor que puedan estimular la alta expresión
de la proteína deseada para poder entonces examinar su actividad enzimática.

La reproducción de los procariontes y la biotecnología

Puntos más importantes:

 Los procariontes (bacterias y arqueas) se reproducen por fisión binaria. La

mayoría de los procariontes se reproducen con rapidez.
 Las bacterias E. coli son ampliamente utilizadas en biología molecular debido a
su genética sencilla y su crecimiento rápido.
 En el laboratorio, puede transferirse un gen a la bacteria E. coli dentro de una
pequeña molécula de ADN circular llamada plásmido. El plásmido entra en la
bacteria por medio de un proceso llamado transformación.
 Las bacterias E. coli transformadas pueden utilizarse para producir varias copias
del plásmido. En algunos casos también expresarán el gen dentro de este y
sintetizarán las proteínas.
Las bacterias E. coli como fábricas de ADN y proteínas
Hoy en día, se usa a las E. coli como "fábricas" en miniatura para sintetizar ADN
o proteínas. Los investigadores pueden insertar un gen de su interés dentro de
las células de E. coli mediante un proceso llamado transformación (absorción del
ADN que se encuentra en el ambiente), el cual se describe con más detalle en
el artículo sobre variación genética en procariontes. En dichos experimentos, el
gen de interés por lo general va dentro de un fragmento circular de ADN llamado
plásmido, que la bacteria puede copiar y pasar a sus descendientes.
Plásmido para transformación bacteriana. Es una molécula circular de ADN que
tiene un gen diana (como la insulina, en el caso de la producción de insulina
recombinante), un promotor usado para la expresión del gen y un gen de
resistencia a un antibiótico.
Una vez que las células de E. coli tienen el plásmido con el gen que nos interesa,
lo copiarán y transmitirán cada vez que se dividan, lo que produce muchas copias
del ADN plasmídico. Si el plásmido tiene las secuencias de control necesarias,
también puede hacer que E. coli transcriba y traduzca el gen de interés y
produzca su proteína. Por ejemplo, la mayoría de la insulina que usan los
diabéticos es producida por medio de esta estrategia en células de E. coli.

Pasos de la transformación

En un experimento de transformación típico, primero se inserta el gen diana

(ADN color azul, en la ilustración de arriba) en un plásmido. Además del gen
diana, el plásmido lleva un gen que codifica para la resistencia a un antibiótico
particular (ADN rojo). Si el objetivo es usar las bacterias para sintetizar proteínas
a partir de un gen, el plasmido tendrá también una secuencia de control
o promotor (ADN verde) que le permita al gen diana expresarse en la bacteria.
Cuando las copias de los plásmidos se mezclan con las células de E. coli y se
les da un choque térmico a las bacterias (se las expone brevemente a altas
temperaturas), una parte de ellas incorporará el plásmido. Luego, se siembran
todas las E. coli en cajas con un medio de cultivo que tiene nutrientes y el
antibiótico. El propósito del antibiótico es hacer que solo sobrevivan y crezcan
las bacterias que tienen el plásmido.
Electroforesis del gel
Se denomina electroforesis a la técnica mediante la cual se separan las
biomoléculas en disolución cuando se ven sometidas a un campo eléctrico. Se
trata de una técnica fundamentalmente analítica, aunque también se puede
realizar con fines preparativos.
Ésta es otra técnica importante usada en biología molecular para separar la DNA,
el ARN, y las proteínas basadas en su talla aplicando un campo eléctrico pues
la DNA se funciona con a través del gel de la agarosa
• En esta técnica, se separan las moléculas
basaron en su talla y carga eléctrica.
• La muestra de la DNA o de la proteína que
se separará se carga conectado a un gel
poroso colocado en un ambiente iónico
del almacenador intermedio.
• En el uso de la carga eléctrica, cada
molécula que tiene diversas talla y carga
se moverá a través del gel a diversas
velocidades.
• El gel usado en electroforesis del gel se
hace generalmente de un material
llamado la agarosa, que es una substancia gelatinosa extraída de alga
marina.
Usos de la electroforesis del gel
• En la separación de fragmentos de la DNA para que huella dactilar
genética Investigue escenas del crimen
• Para analizar resultados de la reacción en cadena de polimerasa
• Para analizar los genes asociados a una enfermedad determinada
• En la DNA que perfila para que estudios de la taxonomía distingan diversa
especie
• En la prueba de la paternidad usando la huella dactilar genética
• En el estudio de la estructura y de la función de proteínas
• En el análisis de la resistencia antibiótico
• En las técnicas que borran para el análisis de macromoléculas
• En el estudio de lazos evolutivos analizando semejanza genética entre
poblaciones o especie.

MACROMOLÉCULA QUE BORRA Y QUE SONDA

Los procesos tales como borrar meridional, borrar septentrional, borrar

occidental se utilizan para transferir la DNA o las proteínas del ARN sobre una
membrana que borra (a menudo después de que electroforesis del gel) pueden
ser manchados por etiqueta radioactivo y después ser visualizados.
El primer de estos métodos era el borrar meridional en 1975 por Edward
meridional, y se utiliza para descubrir la serie de los fragmentos de la DNA.

Procedimiento
Hay cuatro pasos dominantes en la técnica el borrar meridional:
En el primer paso, la DNA de la muestra se analiza o se digiere hacia
adentro en pedazos más pequeños usando una enzima de la restricción.

Después de la digestión, los fragmentos de la DNA se separan usando

electroforesis del gel. El gel de la agarosa se utiliza generalmente con este
fin. La electroforesis muestra varias bandas que parezcan una mancha
debido a la presencia de varios pequeños fragmentos de la restricción en
el gel. El alcalino entonces se utiliza para desnaturalizar la DNA en únicos
cabos.

Estas bandas entonces se transfieren a la superficie de una membrana

con la ayuda de un gradiente eléctrico que sea normalmente una hoja de
papel llamada el papel secante. La configuración de los fragmentos de la
DNA en el gel sigue siendo lo mismo después de transferencia al papel
secante.
 Ahora, una antena compuesta de únicos fragmentos trenzados de la DNA
se introduce en la mancha blanca /negra. Las bases en la antena de la
DNA emparejarán con series complementarias de la DNA en el gel para
formar la DNA doble-trenzada.

El Dr. Edwin Southern desarrolló una de las primeras técnicas que borraban
llamadas la mancha blanca /negra meridional. Esta técnica descubre series
específicas de la DNA y por lo tanto también se llama una mancha blanca /negra
de la DNA.
Usos
La mancha blanca /negra meridional encuentra varios usos en el laboratorio de
biología molecular moderno del día. Algunos de los usos dominantes de la
mancha blanca /negra meridional son :
 identificación de un único gen en un centro común de los fragmentos de
la DNA
 correspondencia del gen
 análisis de configuraciones genéticas de la DNA
 detección de las series específicas de la DNA en un genoma
 estudio de las supresiones del gen, duplicaciones, y mutaciones que
causan diversas enfermedades
 detección de enfermedades genéticas y de cánceres tales como
mutaciones monoclonales de la leucemia y de la célula falciforme
 descubra la presencia de una familia del gen en un genoma

El borrar septentrional
Esto es una técnica usada para descubrir las moléculas específicas del ARN
presentes dentro de una mezcla del ARN. El borrar septentrional se emplea en
el análisis de una muestra del ARN de un tipo o de un tejido de la célula para
determinar la expresión del ARN de ciertos genes.
El borrar occidental
El borrar occidental es una técnica para descubrir las moléculas de proteína
específicas dentro de una mezcla de la proteína. Esta mezcla pudo incluir todas
las proteínas que se asocian a un cierto tipo o tejido de la célula. La técnica
puede ayudar a determinar la talla de una proteína, y cuánto de él se expresa.
MATRICES - los microarrays de una dna
es una colección de sitios de la dna montados en una superficie sólida tal como
una diapositiva del microscopio que se pueda utilizar para cuantificar
simultáneamente niveles de la expresión de la proteína a través de un gran
número de genes. La técnica se puede también utilizar a diversas diversas
regiones genómicas del genotipo.

Clasificación
De acuerdo con la manera de la preparación del arsenal, los microarrays se
dividen en tres tipos:
El arsenal observado sobre el cristal: las matrices observadas son matrices
hechas en diapositivas de cristal recubiertas polivinílico-lisina del microscopio.
Esto ofrece el atascamiento de la DNA de alta densidad usando las espigas
ranuradas.
matrices Uno mismo-montadas: éstas son matrices de la fibra óptica hechas
por la deposición de la DNA sintetizada en pequeñas molduras del poliestireno.
Las molduras se depositan en los finales grabados el ácido del arsenal.
Matrices sintetizadas "in-situ": estas matrices son hechas por síntesis química
en un substrato sólido. En la síntesis química, combinan a los grupos de
protección photolabile con fotolitografía para realizar la acción. Estas matrices se
utilizan en el análisis de la expresión, genotyping, y ordenando.

MICROARRAY

Un chip de ADN (del inglés DNA Microarray) es una superficie sólida a la cual se
une una colección de fragmentos de ADN. Las superficies empleadas para fijar
el ADN son muy variables y pueden ser de vidrio, plástico e incluso de silicona.
Los chips de ADN se usan para analizar la expresión diferencial de genes, y se
monitorizan de manera simultánea los niveles de miles de ellos. Su
funcionamiento consiste, básicamente, en medir el nivel de hibridación entre la
sonda específica (probe, en inglés), y la molécula diana (target), y se indican
generalmente mediante fluorescencia y a través de un análisis de imagen, lo cual
indica el nivel de expresión del gen.

Suelen utilizarse para identificar genes con una expresión diferencial en

condiciones distintas. Por ejemplo, para detectar genes que producen ciertas
enfermedades mediante la comparación de los niveles de expresión entre
células sanas y células que están desarrollando ciertos tipos de enfermedades.
Historia
Su origen en una técnica muy usada en biología molecular, el Southern blot. En
la era pre genómica la biología estudiaba los genes individualmente, uno a uno,
por lo que los podía estudiar a fondo. Lo que caracteriza la era pos genómica no
es lo que se puede medir sino la cantidad de mediciones simultáneas que se
pueden realizar.
Se fabrican usando una gran variedad de tecnologías. El gran desarrollo de esta
técnica ha llegado al normalizarse el uso de robots que se encargan de la mayor
parte del proceso de manipulación de los chips (sintetizar el ADN molde que se
une al chip, unirlo, añadir los reactivos necesarios, etcétera).

Tipos

1. Microarrays de dos canales

En este tipo de chips de ADN (en inglés spotted microarrays), las sondas son
oligonucleótidos, ADN complementario (adnc) o pequeños fragmentos de
reacción en cadena de la polimerasa, que corresponden con ARN mensajero
(arnm).

2. Chips de oligonucleótidos de ADN

En los chips de oligonucleótidos de ADN o micromatrices de canal único, las

sondas se diseñan a partir de una secuencia conocida o un arnm predicho. Estos
chips de adns dan estimaciones del nivel de expresión, pero en una misma matriz
no pueden observarse distintas condiciones, por lo que por cada condición se
debe utilizar un chip.

3. Chips de ADN para genotipado

Los chips de ADN pueden utilizarse para "leer" las secuencias de un genoma
particular en determinadas posiciones. Los SNP arrays son un tipo particular de
matrices que se utilizan para identificar variaciones individuales y a través de
poblaciones.
Aplicaciones

Los chips de ADN se han aplicado al estudio de casi cualquier tipo de problema
biológico. El número de publicaciones anuales es muy alto y continúa creciendo.
Algunas de sus aplicaciones más frecuentes son:

 Estudio de genes, que se expresan diferencialmente en condiciones

diversas (sanos/enfermos, mutantes/salvajes, tratados/no tratados).
 Clasificación molecular en enfermedades complejas. Identificación de
genes característicos de una patología (firma o signature).
 Predicción de respuesta a un tratamiento.
 Detección de mutaciones y polimorfismos de un único gen (SNP)

SOUTHERN BLOT

Southern blot, hibridación Southern o, simplemente, Southern es un método de

biología molecular que permite detectar la presencia de una secuencia de ADN
concreta en una mezcla compleja de este ácido nucleico

PASOS DE SOUTHERN BLOT

1. Extracción del ADN

Se puede extraer ADN de casi cualquier tejido humano. Las posibles fuentes de
ADN en la escena de un delito incluyen sangre, semen, tejido de una víctima
muerta, células del folículo capilar y saliva.

2. Digestión del ADN con una endonucleasa de restricción

El ADN extraído de la muestra se trata con una endonucleasa de restricción, que

es una enzima que corta el ADN bicatenario en donde tenga una secuencia
característica.

3. Electroforesis en gel de agarosa

Tras la digestión del ADN, los fragmentos de ADN resultantes se separan según
su tamaño mediante electroforesis en geles de agarosa. Durante la
electroforesis, las moléculas de ADN, que poseen carga negativa, migran hacia
el electrodo positivo. Al avanzar las moléculas de ADN, su velocidad de
migración se ve reducida por la matriz del gel de agarosa. Las moléculas
menores se mueven más deprisa a través de los poros del gel que las de mayor
tamaño.

4. Preparación de un ensayo de Southern ("Southern blot")

Tras la electroforesis, las moléculas de ADN separadas se desnaturalizan

mientras permanecen en el gel de agarosa, impregnando éste con una disolución
alcalina. Tras la neutralización de ésta, el DNA monocatenario resultante se
transfiere a la superficie de una membrana de nailon, realizando así una copia o
"calco" (la traducción más literal del inglés blot, conservando este sentido, es
"secante").

5. Hibridación con sonda radioactiva

Una sonda de locus único es una molécula pequeña de ADN o ARN capaz de
hibridar (es decir, de formar un dúplex ADN-ADN o ADN-ARN) con el ADN de un
fragmento de restricción concreto en el ensayo de Southern. La formación de la
molécula dicatenaria (dúplex) depende del emparejamiento de bases
complementarias entre las secuencias de la sonda y del ADN presente en el
"calco". Las sondas de locus único se marcan habitualmente con un isótopo
radiactivo para facilitar su detección, y se eligen para que detecten un locus
genético polimórfico en un solo cromosoma humano.

6. Detección de los rflps mediante autorradiografía

Las posiciones de hibridación de la sonda radiactiva sobre la membrana del

ensayo de Southern se detectan mediante autorradiografía. En esta técnica, la
membrana de nailon se coloca, una vez lavada, junto a una película de rayos X
dentro de una caja que las aísle de la luz.

7. Reensayar el resultado del Southern con sondas adicionales

En un análisis legal de DNA se suelen caracterizar polimorfismos de ADN en

varios cromosomas diferentes. Tras el revelado de una autorradiografía para la
primera sonda, se puede lavar la radiactividad con una disolución a elevada
temperatura, que deja el ADN en su sitio, e hibridarlo con una segunda sonda
radiactiva que se una a un locus diferente. Se repiten así las etapas 5-7,
detectando cada vez un locus diferente. El grupo de autorradiografías de una
misma transferencia de Southern se conoce como un "perfil de ADN"

 Diagnóstico molecular de enfermedades

El Southern Blot es una técnica que puede proveer información que puede ser
usada para el diagnóstico molecular de algunas enfermedades génicas, ejemplo
de ellas serían el Síndrome de Angelman, Síndrome de Prader-Willi y Síndrome
X frágil. Esta técnica resulta ser la más sensible para el diagnóstico de algunas
patologías como es el caso del Síndrome Angelman y el Síndrome de Prader-
Willi.

WESTERN BLOT
El Western blot, inmunoblot o electrotransferencia, es una técnica analítica
usada en biología celular y molecular para identificar proteínas específicas en
una mezcla compleja de proteínas, tal como la que se presenta en
extractos celulares o de tejidos. La técnica utiliza tres etapas para lograr esto:
separación por tamaño, transferencia a un soporte sólido y, finalmente,
visualización mediante la marcación de proteínas con el uso
de anticuerpos primarios o secundarios apropiados.

Esta técnica es hoy en día imprescindible en varios campos de la biología, como

la biología molecular, la bioquímica, la biotecnología o la inmunología.
Mediante una electroforesis en gel se separan las proteínas atendiendo al
criterio que se desee: peso molecular, estructura, hidrofobicidad, etc. Luego son
transferidas a una membrana adsorbente (típicamente de nitrocelulosa) para
poder buscar la proteína de interés con anticuerpos específicos contra ella.
Finalmente, se detecta la unión antígeno-anticuerpo por actividad
enzimática o fluorescencia, entre otros métodos. De esta misma forma se puede
estudiar la presencia de la proteína en el extracto y analizar su cantidad relativa
respecto a las otras proteínas.
DIAGNOSTICO
Prueba de VIH:
Aunque el VIH suele detectarse mediante la técnica ELISA, el Western Blot se
usa como prueba confirmatoria cuando el ELISA da un resultado positivo en un
grupo que no es de riesgo o en una población donde la prevalencia del virus es
muy baja. Mediante el Western blot se buscan los anticuerpos anti-VIH en una
muestra de suero humano. Se transfieren a una membrana las proteínas de
células que, se sabe, están infectadas por el VIH. Entonces, se incuba el suero
que hay que probar con esta membrana. Este paso es equivalente a la
incubación con el anticuerpo primario; si hay anticuerpos anti-VIH en el suero,
serán estos los que realicen el papel de anticuerpo primario. Se lava, para
eliminar los anticuerpos no unidos, y la membrana se vuelve a incubar con un
anticuerpo secundario anti-humano unido a una enzima-señal. La aparición de
bandas indica la presencia de proteínas contra las cuales el suero del paciente
contiene anticuerpos, es decir, el paciente es seropositivo.

NORTHERN BLOT
Northern blot, hibridación northern o ensayo northern es una técnica de
detección de moléculas de ácido ribonucleico (ARN) de una secuencia dada
dentro de una mezcla compleja (por ejemplo, un ARN mensajero para
un péptido dado en una muestra de ARN total).
Procedimiento
El procedimiento general comienza con la extracción del ARN total de una
muestra de tejido homogeneizado. El ARNm se puede aislar
mediante cromatografía para retener solamente los ARN con colas de poli(A).
Las muestras de ARN se separan entonces mediante electroforesis en gel. Dada
la fragilidad de los geles y la dificultad para que las sondas penetren en la matriz,
las muestras de ARN, separadas por tamaño tras la electroforesis, se transfieren
a una membrana de nailon, bien por capilaridad o empleando un sistema de
vacío.
Una membrana de nailon cargada positivamente es el soporte más eficaz para
realizar la hibridación en el northern blot ya que los ácidos nucleicos, que están
cargados negativamente, tienen una alta afinidad por estas membranas. El
tampón de transferencia que se usa en el ensayo suele contener formamida,
dado que esta reduce la temperatura de interacción de las muestras, lo que evita
la utilización de altas temperaturas que podrían desnaturalizar las moléculas de
ARN. Una vez que el ARN se ha transferido a la membrana, se inmoviliza
mediante enlaces covalentes formados con la membrana, lo cual se consigue
por medio de luz ultravioleta o calor. Después del marcaje de la sonda, ésta se
hibrida con el ARN en la membrana. Las condiciones experimentales que pueden
afectar la eficiencia y especificidad de la hibridación están determinadas por las
condiciones iónicas, de viscosidad, la presencia de ARN
bicatenario, bases desemparejadas y composición de las mismas. Finalmente,
la membrana debe lavarse para asegurar que la sonda se ha unido de forma
específica y para evitar ruido de fondo en las señales emitidas por la misma.
Estas señales pueden cuantificarse mediante densitometría. Para crear
controles y poder asegurarnos de que no se están mostrando genes que no nos
interesen se puede realizar posteriormente la determinación empleando chips de
ADN o RT-PCR.

Aplicaciones
El ensayo northern permite observar un patrón particular de expresión genética
entre tejidos, órganos, estadios del desarrollo, niveles de estrés ambiental,
infecciones causadas por patógenos y durante el curso del tratamiento de las
mismas. Esta técnica se ha utilizado para mostrar la sobreexpresión de
oncogenes y la desregulación de genes oncosupresores en células
cancerosas cuando son comparadas con tejidos normales.
Los patrones de expresión obtenidos nos ayudan a conocer las funciones de los
genes. Desde que el RNA se separó por su tamaño, las sondas contra el mismo
pueden darnos una idea de su tamaño, sugerir ayuste alternativo, o motivos
repetidos en la secuencia. La variación en el tamaño del producto de un gen
puede además indicarnos deleciones o errores en el proceso de transcripción.
Alterando la sonda podemos conocer la secuencia e incluso determinar qué
región del RNA ha sido delecionada.