UNIVERSIDAD DE LAS FUERZAS ARMADAS- ESPE
INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA
PRÁCTICA Nº2
Nombres: Marcela Manjarrés, Nashla Rosero, Estefanía Soria, Andrés Vásquez
NRC: 5294
Asignatura: Microbiología Aplicada (microbiología)
Fecha: 2019/07/01
Nombre de Docente: Andrés Izquierdo, Ph.D
3) TITULO: Cultivo de microalgas nativas del Ecuador
4) RESUMEN
En la práctica se busca lograr la observación e identificación de microalgas
presentes en muestras recolectadas en varios sitios de Ecuador. El conocimiento
de las distintas microalgas presentes en el país es importante debido a sus distintas
aplicaciones. Se tomaron dos muestras de agua de la laguna de Yahuarcocha en
frascos esteriles, posteriormente se analizaron estas muestras en porta objetos y se
observaron al microscopio, también se analizó muestras de … en una cámara de
Neubauer en donde se realizó el recuento celular. Se pudo observar algunas
microalgas conocidas en las muestras de la laguna y se pudo realizar el conteo
respectivo deFischerella muscicola…. Las microalgas pueden estar presentes en
todos los tipos de agua en donde no hay flujo de corriente.
PALABRAS CLAVES: Identificación, Fischerella muscicola,Yahuarcocha
5) INTRODUCCIÓN
ANTECEDENTES
Hasta el momento se han reportado alrededor de 45.000 especies de algas y se
estima que existe más del doble de especies sin identificar. Las algas son uno de
los principales responsables de la producción primaria mundial y son los
productores primarios por excelencia en ambientes acuáticos. Además, participan
en diferentes ciclos biogeoquímicos globales mediante la producción de oxígeno
atmosférico, regulación del clima y la generación de combustibles (Hu et al., 2008)
(1)
Durante las últimas cinco décadas, la biotecnología de microalgas ha desarrollado
una serie de aplicaciones basadas en este notable grupo de organismos
fotosintéticos unicelulares. Estas aplicaciones varían desde una fuente para
productos cosméticos como champú, ingredientes para el jabón con el que te lavas
la cara, o componentes del maquillaje que utilizas; también en nutrición humana y
animal contribuye en alimentos ricos en proteínas y suplementos dietéticos, como
la Spirulina (Ycaza, 2017). (2)
JUSTIFICACIÓN
Las microalgas y las cianobaterias son microorganismos uniceluláres que tienen la
capacidad de realizar fotosíntesis, difieren unas de otras en muchos aspectos,
especialmente en que las primeras son eucariotas y las segundas son procariotas,
pero desde el punto de vista de la ingeniería de procesos, lo relevante es que crecen
usando luz como energia y CO2 como fuente de carbono (Peñafiel, 2015) (3).
Tienen importancia ecológica y económica debido a su gran diversidad
taxonómica.Su cultivo e identificación son importantes, ya que se utilizan como
fuente de biocombustibles, biofertilizantes, alimentación animal y otros usos en la
industria alimentaria y de medicamentos. Además, se usan en el tratamiento de
aguas residuales (EcuRed, 2012). (4)
6) OBJETIVOS
GENERAL
Identificar la morfología de microalgas nativas del Ecuador y analizar las
características de Fischerella muscicola y Chlorella sorokiniana.
ESPECÍFICOS
● Observar en microscopio de campo claro la morfología de las microalgas de
las muestras obtenidas.
● Comprender las diferencias y semejanzas entre microalgas y cianobaterias..
● Aplicar el método de recuento celular mediante Cámara de Neubauer.
7) HIPÓTESIS
Se encontrarán microalgas en las muestras tomadas de varias fuentes de agua del
Ecuador y se logrará su cultivo.
8) MARCO TEÓRICO
Microalgas
Las microalgas son microorganismos unicelulares que pueden ser tanto eucariotas
como procariotas. Estos son capaces de generar biomasa a partir de CO2 y luz
para obtener O2 utilizando al agua como dador de electrones. Esta capacidad se
debe a que ellos también pueden realizar fotosíntesis (Fernandez, 2014). (5)
Entonces en base a este concepto dado las microalgas son seres fotoautótrofos,
es decir, que usan la luz como fuente de energía y el CO2 como fuente de
carbono.
Las microalgas más abundantes se encuentran formando el fitoplancton, junto con
las cianobacterias. El fitoplancton es un conjunto de microorganismos
fotosintéticos, acuáticos que flotan pasivamente o que presentan una movilidad
reducida (EcuRed, 2012). (4)
Características:
- Coloración: la mayoría de microalgas presentan una coloración verde
debido a la presencia de clorofila, el pigmento que ayuda a la realización de
la fotosíntesis, sin embargo, también hay microalgas con coloración roja o
marrón, debido a que presentan xantofilas.
- Hábitats: se encuentran en casi toda superficie del planeta tierra, en
subáreas acuáticas o terrestres, en lugares secos o fríos, etc.
(PlanctonMarino, 2016). (6)
Clasificación:
Para la clasificación de estos microorganismos se han utilizado diversas
características:
- Estructura de la pared celular:
La pared de algunas microalgas puede tener diferentes composiciones, pueden
estar constituidas por fibras de celulosa adicionado xilano, pectina, ácido fucínico,
etc. Tambien pueden presentar quitina o depósitos de carbonato de calcio, estas
son llamadas calcáreas.
Las microalgas diatomeas, son microorganismos que presentan un caparazón
formado por una capa de silicio sumado polisacáridos y proteínas.
Por último, las microalgas euglenoides son aquellas que no presentan pared
celular (Perdomo, 2018). (7)
- Características morfológicas:
De acuerdo al sistema de clasificación propuesto por Parra y Bicudo (1996) (8), la
división Chlorophyta está representada por órdenes, los cuales son agrupados
según sus características morfológicas en: a) Formas unicelulares y coloniales, b)
Formas filamentosas unicelulares y c) Formas multinucleadas.
Y establecieron un sistema de clasificación para las formas unicelulares y
coloniales a las cuales pertenecen los órdenes Chlorococcales y Volvocales
(Cáceres, 2009). (9)
- Movilidad:
Puede haber microalgas con flagelos como la Euglena pero nunca presentaran
cilios. Gran parte de las microalgas presentan inmovilidad o muy poca movilidad
en su fase vegetativa (madura), sin embargo, sus gametos pueden ser móviles
(Perdomo, 2018).
9) MATERIALES Y MÉTODOS
Insumos
Aceite de Inmersión
Equipos
Microscopio
Portaobjetos
Cubreobjetos
Cámara de Neubauer
Pipeta Pasteur
Muestra
Agua de laguna de Yahuarcocha
Chlorella sorokiana
Métodos
Antes de comenzar la práctica fue necesario hacer el muestreo de agua donde se
note la presencia de algas para lo cual se procedió a tomar una muestra de la
laguna de Yahuarcocha. Para el muestreo se hizo recogiendo con un vaso para
pruebas de orina estéril, la superficie de la laguna y lo sellamos, al contrario que
otras prácticas no se puso en refrigeración, todo lo contrario, se lo puso al sol para
que exista un mayor crecimiento de microalgas.
Una vez con la muestra y en el laboratorio, primero aplicamos las normas de
bioseguridad haciendo el lavado de manos, el uso de guantes y la desinfección del
área de trabajo. Luego se procedió a hacer un reconocimiento de algas por su
morfología en una gota de la muestra con la ayuda del microscopio. Para ello,
primero abrimos el frasco con la muestra de agua de la laguna y con la ayuda de
una pipeta Pasteur cogemos una gota la cual depositamos en un portaobjetos y
ponemos el cubreobjetos encima. Una vez hecho esto procedemos a conectar el
microscopio y a buscar con el lente de 10x a las microalgas. Nos podemos dar
cuenta debido a su coloración verde y su aspecto. Luego que se encontró la
microalga más llamativa colocamos el aceite de inmersión y cambiamos al lente
de 100x para identificar de mejor manera de que tipo de microalga se trata.
Para realizar encontrar la densidad celular se utilizó la cámara de Neubauer,
poniendo pequeñas gotitas en las cuadriculas sobresalientes de la placa para
luego ponerle encima al cubreobjetos. Una vez hecho esto se pone a la cámara en
el microscopio y con el lente de 40x iremos contando las microalgas que
únicamente estén fuera de la cruz del centro de la cuadrícula. Este conteo se
realiza para las 4 cuadriculas de alrededor de la cruz. Finalmente contadas las
microalgas se utiliza la fórmula de la densidad celular utilizando de profundidad
0,01 cm., de superficie 0,04 cm2, y una dilución 3:1.
Se usó una muestra estándar de una Chlorella sorokiana para comparar la
morfología vista con las demás muestras, para ello fue necesario utilizar una
pipeta Pasteur para coger una gota de la muestra, a esta se la puso en un
portaobjetos y se lo tapo con un cubreobjetos. Se procedió a observar en el
microscopio su morfología utilizando aceite de inmersión con el lente de 100x.
10) RESULTADOS
Análisis microscópico de muestra de lagunas, lagos y estanques.
Mediante análisis microscopio y basados en la morfología de cada microalga, como
se puede observar en la figura 1, a partir de la muestra de agua obtenida en la
laguna de Yahuarcocha en la ciudad de Ibarra, se logró la identificación
microscópica de una Leptolyngbya sp. viva y bastante enrollada. Por otro lado, se
evidencio la presencia de Scenedesmus quadricauda viva (Fig. 2) y de Chlorella sp.
viva (Fig. 3) en la muestra obtenida de un estanque. De la muestra sacada del
estanque del Jardín Botánico ubicado en la ciudad de Quito, se identificó una
pequeña Leptolyngbya sp viva (Fig. 4). Para finalizar, se encontró nuevamente
Scenedesmus quadricauda (Fig. 5) y Golenkinia (Fig. 6) de la muestra de agua
obtenida de la laguna del Parque de las Cuadras al Sur de Quito.
Fig.1: Leptolyngbya sp. viva y
enrollada, obtenida de la Laguna de
Yahuarcocha
Fig. 2: Scenedesmus quadricauda
en la muestra obtenida de un
estanque
Fig. 3: Chlorella sp. en la muestra
obtenida de un estanque
Fig. 4: Leptolyngbya sp. viva en la
muestra obtenida del estanque del
Jardín Botánico de Quito
Fig. 5: Scenedesmus quadricauda
en la muestra obtenida de la laguna
del Parque de las Cuadras al Sur de
Quito.
Fig. 6: Golenkinia en la muestra
obtenida de la laguna del Parque de
las Cuadras al Sur de Quito.
Análisis microscópico de Chlorella sorokiniana
En este análisis, se verificó la morfología de Chlorella sorokiniana encontrada en
bibliografía. Como se puede observar en la figura 7, las células son esféricas u
ovoides y se distribuyen de manera solitaria o agrupada.
Fig. 7: Células esféricas agrupadas
de Chlorella sorokiniana
Recuento de Fischerella muscicola en Cámara de Neubauer
Datos conteo 1
Promedio de células = 3.25 células
Superficie = 0,04 cm2
Profundidad = 0,01 cm
Dilución 3:1 → 0,03
𝑃𝑟𝑜𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 𝑑𝑒 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠
𝐷𝑒𝑛𝑠𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑟 =
𝑝𝑟𝑜𝑓𝑢𝑛𝑑𝑖𝑑𝑎𝑑
𝑆𝑢𝑝𝑒𝑟𝑓𝑖𝑐𝑖𝑒 ∗
𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛
3.25 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠
𝐷𝑒𝑛𝑠𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑟 =
0,01 𝑐𝑚
0,04 𝑐𝑚2 ∗ 0,03
𝑐𝑒𝑙
𝐷𝑒𝑛𝑠𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑟 = 243.75
𝑐𝑚3
Datos conteo 2
Promedio de células = 4 células
Superficie = 0,04 cm2
Profundidad = 0,01 cm
Dilución 3:1 → 0,03
𝑃𝑟𝑜𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 𝑑𝑒 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠
𝐷𝑒𝑛𝑠𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑟 =
𝑝𝑟𝑜𝑓𝑢𝑛𝑑𝑖𝑑𝑎𝑑
𝑆𝑢𝑝𝑒𝑟𝑓𝑖𝑐𝑖𝑒 ∗
𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛
4 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠
𝐷𝑒𝑛𝑠𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑟 =
0,01 𝑐𝑚
0,04 𝑐𝑚2 ∗ 0,03
𝑐𝑒𝑙
𝐷𝑒𝑛𝑠𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑟 = 300
𝑐𝑚3
Densidad celular promedio:
𝑐𝑒𝑙 𝑐𝑒𝑙
𝐷𝑒𝑛𝑠𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑟 𝑝𝑟𝑜𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 = 243.75 3
+ 300
𝑐𝑚 𝑐𝑚3
𝑐𝑒𝑙
𝐷𝑒𝑛𝑠𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑟 𝑝𝑟𝑜𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 = 271.88
𝑐𝑚3
Tabulacion de resultados de conteo en Neubauer de F. muscicola
DENSIDAD CELULAR
𝒄𝒆𝒍 𝒄𝒆𝒍 𝒄𝒆𝒍
GRUPO CONTEO 1 ( 𝟑 ) CONTEO 2 ( 𝟑 ) PROMEDIO ( 𝟑 )
𝒄𝒎 𝒄𝒎 𝒄𝒎
1 243,75 300 271,88
2 2887,5 4537,5 3712,5
3 13,13 15 14,07
4 1047,75 1014,75 1031,25
5 11,25 9,38 10,31
11) DISCUSIÓN
En todas las muestras se encontró una variedad de microalgas, se puede deducir
que la variedad de estas microalgas se debe a las diferentes condiciones de los
lugares en los que se recolectó la muestra, los cuales fueron, Lagunas, estanques
y arroyos. Los ríos y arroyos, tienen diferentes profundidades, caudal, lecho,
turbidez, concentración de nutrientes, y aporte o carga contaminante, por lo tanto
aquí la flora fitoplanctónica es muy diversa, y en dependencia de variaciones
estacionales o situaciones espacio temporales, puede existir predominio de ciertas
microalgas específicas. (Gómez, 2007) (10)
La mayor presencia de microalgas se registró en la muestra tomada en el estanque
lo cual puede indicar que este sitio tiene los nutrientes y aportes necesarios para
que las microalgas se desarrollen correctamente, además se encontró la presencia
de Scenedesmus sp. En sitios caracterizados por la inmovilidad de sus aguas,
excepto cuando se manifiesta turbulencia por corrientes convectivas o por la acción
del viento, son representativos los charcos, embalses, lagos y lagunas salobres,
presentando una flora influida por características locales, si estos sitios son ricos en
calcio, es común la presencia de Eudorina sp., Pediatrum sp., Dictyosphaerium sp.,
Closterium sp., Scenedesmus sp. y Straurastrum sp. (Comas, 1992) (11)
12) CONCLUSIONES
● La morfología encontrada con mayor facilidad es Chlorella, que tiene forma
esférica, midiendo de y no posee flagelo.
● Fischerella muscicola posee una membrana muscilaginosa que permite que
se diferencie a simple vista en un cultivo.
● La coloración café de un cultivo de microalgas indica la muerte celular de
este.
13) BIBLIOGRAFÍA
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14) ANEXOS
CONSULTA
1. Diferencias entre cianobacterias y microalgas
CIANOBACTERIAS MICROALGAS
Estructura celular procariota Estructura celular eucariota
Poseen una distribución morfológica Se refiere a un grado ecológico
estructural, mas no a una entidad
biosistemática, no tiene implicaciones
filogenéticas.
En el citoplasma se encuentran En el citoplasma se encuentran
ribosomas 70S. ribosomas 80S y 70S.
División binaria, con tiempos de División binaria, con tiempos de
duplicación de 1 hora o menos. duplicación de 8 a 24h o más.
No poseen reproducción sexual. Reproducción sexual, aunque menos
frecuente.
Rodeadas de membrana citoplasmática Rodeadas de pared celular.
y pared celular.
2. ¿Cuáles son los medios de cultivo usados para microalgas?
Las microalgas requieren para su crecimiento, agua, luz, CO2, y sales minerales
entre las que se encuentran principalmente alguna fuente de nitrógeno como
nitrato o amonio y una fuente de fosforo que suele ser algún fosfato inorgánico.
(Sevilla, 2014) (12)
Algunos medios que pueden ser utilizados para microalgas son:
F/2 de Guillard
Este medio de cultivo se basa en el medio Guillard F/2 y está optimizado
para el cultivo de microalgas unicelulares (fitoplacton) de los géneros:
Tetraselmis, Isochrysis, Monochrysis (Pavlova), Rhodomonas, Chlorella, Nan
nochloropsis, etc. (Fishroom, 2013) (13)
Medio Chu 10
Su composición contiene Ca(NO3)2, K2HPO4, Na2CO3, MgSO4, Na2SiO3, Citrato de
Fierro Amoniacal. El nitrato de calcio sirve como fuente de nitrógeno inorgánico y
otras sales inorgánicas satisfacen los requisitos de crecimiento necesarios.
(HiMedia Laboratories Pvt, 2015) (14)
GoldMedium (gm)
Conveniente para el cultivo de Tetraselmis sp., Isochrysis sp., Monochrysis
(Pavlova) sp., Nannochloropsis sp. (Aqualgae, 2016) (15)
3. Aplicaciones actuales de las microalgas
Evaluación de biomasa de microalgas de la laguna Limoncocha como
materia prima para la obtención de biocombustibles
Realizado en la Universidad Internacional SEK entre abril y junio del 2018.
Buscando alternativas a los combustibles tradicionales, el ser humano ha
experimentado con distintas materias primas de origen agrícola, así se han ido
conociendo combustibles de primera y segunda generación en los cuales figuran la
celulosa, palma, coco, soya, grasas animales y el bagazo de la caña de azúcar.
Con la finalidad de generar soluciones para la disminución de los impactos
generados por los combustibles fósiles en los ecosistemas, con el paso del tiempo,
han aparecido los combustibles de tercera generación, los cuales buscan ser
obtenidos a partir de materias primas no destinadas a la alimentación.
Es por esto que se considera a las microalgas un buen candidato para esta
aplicación ya que, al ser de crecimiento rápido, son biomoléculas de alta densidad
energética.
En la reserva de Limoncocha ubicada en Napo, se establecieron cinco puntos de
muestreo entre afluentes y efluentes para adquirir una variedad de nutrientes y
sacarle el mayor provecho a la biomasa producida por estos microorganismos
fotosintéticos autótrofos o heterótrofos, para iniciar con el proceso, las muestras
fueron cultivadas en medio BBM (Medio Basal de Bold) dentro de fotobiorreactores
a escala de laboratorio, en este sistema cerrado se realiza un seguimiento a su
cinética de crecimiento celular y se mantiene un ambiente óptimo para las
microalgas, así se consigue que estos microorganismos crezcan masivamente para
su posterior caracterización.
En total, se logró caracterizar 4 cepas de microalgas: Vischeria sp, Scenedesmus
sp, Chlorella sp y Monoraphidium Contortum sp. A cada cepa se analizó de la
siguiente manera: cinética de crecimiento de las microalgas mediante conteo celular
y densidad óptica, la productividad de biomasa seca en los fotobiorreactores y los
métodos de caracterización en la cuantificación de lípidos totales y perfil lipídico.
Concluyendo que, la productividad de biomasa de estas cuatro cepas de microalgas
en condiciones de cultivo a escala de laboratorio produce buenos rendimientos en
el crecimiento celular (Subía & Rubio, 2018). (16)
Energía
Aunque las microalgas tienen diversas aplicaciones comerciales, los fines
energéticos son los que contribuyen mucho más.
Como sistemas de cultivo, los sistemas abiertos son los más utilizados para la
producción comercial de microalgas, en este sistema se suelen cultivar microalgas
en estanques de 20 a 50 cm de profundidad. El CO2 lo obtienen por difusión desde
la atmósfera o por gases industriales. Estos sistemas tienen un bajo costo lo cual
les proporciona una ventaja, sin embargo, una desventaja es que hay una facilidad
para la contaminación. Luego de haber cultivado las algas, estas se deben separa
del medio de cultivo, esta etapa es determinante para la economía. Con respecto
al uso de microalgas como productoras de energía, se puede suponer que el
aumento en el cultivo de algas se debe básicamente a estos propósitos energéticos
(Biodiésel), para que estas tecnologías sean económicamente sostenibles, es
necesario que los balances energéticos y de carbono sean favorables, además que
los impactos medioambientales y los costos se reduzcan. Se ha deducido que los
costos pueden bajar hasta en un 50% si el CO2, los nutrientes y el agua se pudieran
obtener a costos bajos. Los principales productos energéticos obtenidos a partir de
biomasa de microalgas son: Biodésel, biometano, bioetanol, biohidrógeno,
bioalcoholes y otros combustibles. El biodiésel es el biocombustible más estudiado
ya que las microalgas son la mejor alternativa para obtener triglicéridos destinados
a producir biodiesel. (Santos & Arechavala, 2017) (17)
Metabolitos de microalgas: una rica fuente de alimento y medicamentos
Las microalgas son de gran importancia en la cadena alimentaria de los
ecosistemas acuáticos y gracias a los avances en la ciencia, se ha logrado que el
ser humano se beneficie de estos nutrientes tanto en medicina como en alimento.
Al año existe una producción comercial de microalgas de alrededor de 5000
toneladas de materia seca y la gran mayoría de este comercio esta ubicado en Asia.
Las microalgas mas conocidas para el uso de alimentos y medicinas que son
cultivables son Spirulina, Chlorella, Haematococcus, Dunaliella, Botryococcus,
Phaeodactylum, Porphyridium, Chaetoceros, Skeletonema, Nitzschia, etc.
Gran parte de los metabolitos obtenidos de las microalgas son utilizados para la
síntesis de una amplia gama de productos valiosos como carotenoides, ácidos
grasos poliinsaturados, polisacáridos y ficotoxina. Pero en los últimos tiempos se ha
utilizado a estos metabolitos como un suplemento de alto valor proteico en nutrición,
en la alimentación y desarrollo de animales marinos (acuicultura) y para propósitos
nutracéuticos. Todas estas investigaciones surgieron a raíz que en una publicación
en 2010 se reporto que los productos de las microalgas estaban compuestos por
40% lípidos, 50% proteínas y 10% en carbohidratos. Este inicio dio como resultado
investigaciones para el biodiesel y para la industria alimenticia y química
(Sathasivam, Radhakrishnan, Hashem, & Abd_Allah, 2017). (18)
4. Microalgas como indicadores de calidad de agua
Existen varios microorganismos que se han desarrollado en situaciones extremas
de contaminación que esto les ha dado un nuevo nombre como: bioindicadores.
Estos microorganismos tienen la capacidad de alimentarse de desechos tóxicos, de
sobrevivir a diversas condiciones y en estado anaeróbico. Sin embargo, se sabe
que mientras más contaminado este el agua, más microorganismos van a crecer,
así pues, se dividen en 4 clases, siendo la 4ta clase la más contaminada y la que
más presencia de microorganismos degradadores de contaminación posee de
todas (Williams, Serrano, Mora, & Torres, 2014). (19)
5. ¿Qué es la eutrofización?
Se conoce como eutrofización al proceso de contaminación, provocado por las altas
concentraciones de fosfatos y nitratos en las aguas de lagos, balsas, ríos y
embalses, generado principalmente por la afluencia de aguas de procedencia
agrícola o urbana. Este fenómeno aumenta el crecimiento de algas y macro filas
acuáticas, y por otro lado, disminuye la cantidad de oxígeno disuelto y la calidad del
agua (Soluciones Medioambientales y Aguas, S.A, 2016). (20)