TESIS DOCTORAL

ANTIOXIDANTES ALIMENTARIOS:
MECANISMOS DE OXIDACIÓN ELECTRÓDICA,
MEDIDA ELECTROQUÍMICA DE CAPACIDAD
ANTIOXIDANTE Y COMPOSICIÓN EN TÉS,
INFUSIONES Y ESPECIAS

Rafael Estévez Brito

2016
TITULO: ANTIOXIDANTES ALIMENTARIOS: MECANISMOS DE OXIDACIÓN
ELECTRÓDICA, MEDIDA ELECTROQUÍMICA DE CAPACIDAD
ANTIOXIDANTE Y COMPOSICIÓN EN TÉS, INFUSIONES Y
ESPECIAS

AUTOR: Rafael Estévez Brito

© Edita: Servicio de Publicaciones de la Universidad de Córdoba. 2016

Campus de Rabanales
Ctra. Nacional IV, Km. 396 A
14071 Córdoba

[Link]/publicaciones
publicaciones@[Link]
 UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA
FACULTAD DE CIENCIAS

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA FÍSICA

Y
TERMODINÁMICA APLICADA

ANTIOXIDANTES ALIMENTARIOS: MECANISMOS DE OXIDACIÓN

ELECTRÓDICA, MEDIDA ELECTROQUÍMICA DE CAPACIDAD
ANTIOXIDANTE Y COMPOSICIÓN EN TÉS, INFUSIONES Y
ESPECIAS

Tesis Doctoral
Rafael Estévez Brito
Córdoba, 2016
 Trabajo presentado para optar al Grado de Doctor en Química

Fdo.: Rafael Estévez Brito

Licenciado en Ciencias Químicas

Título de Tesis:
ANTIOXIDANTES ALIMENTARIOS: MECANISMOS DE OXIDACIÓN
ELECTRÓDICA, MEDIDA ELECTROQUÍMICA DE CAPACIDAD ANTIOXIDANTE
Y COMPOSICIÓN EN TÉS, INFUSIONES Y ESPECIAS

Los directores del trabajo:

Fdo.: José Miguel Rodríguez Mellado Fdo.: Mercedes Ruiz Montoya

Catedrático del Departamento de Profesora Titular adscrita al
Química Física y Departamento de Ingeniería
Termodinámica Aplicada Química, Química Física y
Universidad de Córdoba Química Orgánica
Universidad de Huelva
TÍTULO DE LA TESIS: ANTIOXIDANTES ALIMENTARIOS: MECANISMOS DE
OXIDACIÓN ELECTRÓDICA, MEDIDA ELECTROQUÍMICA DE CAPACIDAD
ANTIOXIDANTE Y COMPOSICIÓN EN TÉS, INFUSIONES Y ESPECIAS

DOCTORANDO: Rafael Estévez Brito

INFORME RAZONADO DEL/DE LOS DIRECTOR/ES DE LA TESIS
El trabajo presentado como Tesis Doctoral por D. Rafael Estévez Brito, ha sido realizado
bajo nuestra dirección en los laboratorios del Departamento de Química Física y
Termodinámica Aplicada de la Universidad de Córdoba y en los laboratorios Joseph
Banks de la School of Life Sciences de la Universidad de Lincoln, Inglaterra, y reúne
las condiciones exigidas según la legislación vigente.

Durante la elaboración de la Tesis la labor del doctorando ha sido altamente

satisfactoria, desarrollando las tareas de investigación según el plan de trabajo
marcado para alcanzar los objetivos previstos. En el proceso, el doctorado ha
demostrado su iniciativa, tanto en el diseño de nuevos experimentos como en la
consecución de los objetivos, contribuyendo a la interpretación y discusión de los
resultados y a establecer las conclusiones del trabajo. Su estancia en la universidad de
Lincoln ha permitido una colaboración con los especialistas de la misma que ha
contribuido a mejorar los aspectos teóricos y prácticos del trabajo.

Por todo ello, se autoriza la presentación de la tesis doctoral.

Córdoba, 18 de marzo de 2016

Firma de los directores

Fdo.: José Miguel Rodríguez Mellado Fdo.: Mercedes Ruiz Montoya

Mediante la defensa de esta memoria se pretende optar a la
obtención de la mención de “Doctorado Internacional”, habida
cuenta que el doctorando reúne los requisitos exigidos para tal
mención:

1. Se cuenta con informes favorables de dos doctores expertos, con

experiencia investigadora acreditada, pertenecientes a alguna
institución de educación superior o instituto de investigación fuera
de España.

2. En el Tribunal, que ha de evaluar la Tesis, existe un miembro de

un instituto de educación superior o centro de investigación de un
país distinto al nuestro.

3. Parte de la redacción y defensa de esta Memoria se realizará en

una de las lenguas habituales para la comunicación científica y
distinta a cualquiera de las lenguas oficiales en España.

4. El doctorando ha realizado dos estancias de investigación en la

School Of Life Sciences de la University Of Lincoln (Lincoln,
England, de más de tres meses cada una, siendo una de ellas gracias
a la concesión de una ayuda para la movilidad con objeto de obtener
el Doctorado con Mención Internacional, concedida por la
Universidad de Córdoba.
La investigación realizada en la presente Memoria, forma parte de
la programación plurianual de actividades del Grupo de
Investigación FQM-198 de la Universidad de Córdoba, para la cual
ha recibido financiación a través de:

- El apoyo financiero de la Junta de Andalucía a los Grupos de

investigación FQM-198, RNM-371 y FQM-348.

- El apoyo financiero de la CICYT dentro del marco del proyecto

CTQ 2011-28937.

- El apoyo financiero de la Universidad de Córdoba en el marco de

las "Ayudas puente para el Desarrollo de Proyectos de I + D
precompetitivos 2015".
Agradecimientos:

Me gustaría empezar agradeciendo la labor desarrollada por los directores de tesis,

José Miguel y Mercedes. A José Miguel, en primer lugar por haber apostado por mí,
por su paciencia y por ser tan “polvorilla”. Siempre con unas ganas de trabajar y una
curiosidad contagiosas, que me han llevado a aprender mucho, además de química. A
Mercedes me gustaría agradecerle el estar ahí para lo que hemos necesitado,
aportando su granito de arena siempre en momentos decisivos.

Por supuesto, agradecer a mis padres su apoyo, desde que nací hasta este momento,
inculcándome valores y enseñándome…haciéndome como soy hoy en día,
especialmente mis cosas buenas. Recuerdo con especial cariño a mi madre, cuando era
pequeño y estábamos de vacaciones, y me ponía a mezclar todo lo que sobraba de la
comida en vasos, porque me llamaba la atención ver las distintas fases que se
formaban...y “guarreaba” (como ella me decía)…supongo que fue el hecho que los
llevó a regalarme mi Quimicefa en Navidad. También, especialmente a mi padre, que
me ha inculcado la constancia en el trabajo, y que se sentaba las horas conmigo para
hacer las “tareas de mates”, repasar la tabla periódica, o lo que surgiese. Muchas
Gracias a los dos.

También me gustaría agradecer el apoyo de todos los compañeros del departamento,

comenzando por Sara, con la que he pasado tantas tardes de los viernes haciendo
voltametría y compartiendo una caja de donettes. Gente maravillosa como “mi
Guadita”; mi compi de despacho a la que tanto he torturado con la música, por si no
tenía bastante con estar embarazada y escribiendo la tesis, Luisa; Toñi, que al principio
me denominaba “el muchacho del bocata”… ¿qué sería la hora de comer sin un poco
de chinche entre nosotros?; a Pilar, una compañera de grupo “tela de apañá” y a la que
deseo toda la suerte del mundo (y que no se ponga muy nerviosa), para su lectura, que
ya le queda poco; Alain, a quien también deseo mucha suerte… ¡Ánimo, que eres el
siguiente!; y por supuesto a dos grandes amigos que me llevo de esta experiencia,
Mauri y Alex, sois geniales. También a Alberto Palma de la Universidad de Huelva, un
compañero en la distancia que ha contribuido significativamente al desarrollo de esta
investigación. A los “profes”, que por suerte siempre han sido tan llanos y cercanos
conmigo, ayudando siempre en todo lo que han podido: Mari Tere, que es como una
compañera más y me ha hecho sentir siempre tan a gusto en el departamento; Teresa,
Elo, Manolo (Sr. Decano), Luis, José Manuel, José Luis, Rafa, Marta, muchas gracias a
todos por todo. A Gustavo, de las últimas “adquisiciones” del departamento, pero que
crea tan “buenrollismo” en el laboratorio.

Me gustaría extender el agradecimiento a los compañeros de los laboratorios de

Lincoln. A José González por haberme tratado tan bien, especialmente durante las
estancias, siempre buscando un hueco para preguntar cómo iban las cosas, claro que
como su tiempo es extremadamente limitado, lo mejor era hablarlo en The Shed o en
algún sitio de los que conoce en la ciudad (¿qué le íbamos a hacer?...). A Leonie y a
Tom, los técnicos de laboratorio, que siempre estaban dispuestos a echar una mano en
todo cuanto hiciera falta, solucionando cualquier problema de la forma más rápida y
eficaz, lo que transmitía una gran seguridad a la hora de trabajar con técnicas y
equipos nuevos para mí, tan sólo por tenerlos a ellos en el laboratorio. Y por supuesto,
a “the Boss” (my very good friend Bakhtiyar) y a “the King” (Samuel), que siendo cada
uno de una punta del mundo, al menos a mí, me hicieron sentir como en casa.

Y cómo no, aunque no esté en este edificio, pero sí en este departamento, en el área de
motores, a Micky (Miguel Carmona), simplemente decir que MUCHAS GRACIAS por
todo, y sabes que me quedo corto, ya que eres lo más parecido a un hermano que tengo.

Por último, y para nada menos importante, agradecer la oportunidad que me ha

brindado este departamento, tanto a nivel profesional como personal, ya que me ha
permitido conocer a muchas personas, y también reencontrarme con otras. Ahí es
donde entra ella, Rebeca (mi “Rubi”), a la que quiero agradecer simplemente que sea
como es, por su apoyo, por su cariño y por su paciencia (a veces creo que infinita), ya
que me hace sentir el más afortunado del mundo, algo que deseo para la nueva etapa
que comienza en mi vida, y por supuesto, para todas las que vengan.
A mis padres,
y a Rebeca
CAPÍTULO I: INTRODUCCIÓN: 1
1.1. El Estrés Oxidativo: 3
1.1.1. El Estrés Oxidativo en la Salud Humana: 3
1.1.2. Daño biomolecular ocasionado por el estrés oxidativo: 5
[Link]. Daño oxidativo a Proteínas: 5
[Link]. Daño oxidativo a Lípidos: 6
[Link]. Daño oxidativo a Glúcidos: 7
[Link]. Daño Oxidativo al ADN: 7
1.2. Los Radicales libres y las Especies Reactivas de Oxígeno como especies
oxidantes: 8
1.2.1. Los Radicales Libres: 8
1.2.2. Principales ROS: 8
[Link]. Oxígeno Singlete: 9
[Link]. Anión radical superóxido y radical hidroperoxilo: 10
[Link]. Peróxido de Hidrógeno: 11
[Link]. Radical Hidroxilo: 11
[Link]. Radical alcoxilo y radical peroxilo: 12
[Link]. Ozono: 12
1.2.3. Formación de Radicales Libres: 13
[Link]. Fuentes Exógenas: 13
[Link]. Fuentes Endógenas: 14
1.3. Los Antioxidantes: 15
1.3.1. Antioxidantes Fenólicos: 16
1.3.2. Clasificación de los Compuestos Fenólicos: 17
1.3.3. Los Compuestos Fenólicos en la dieta: 17
1.3.4. La Actividad Antioxidante de los Compuestos Fenólicos: 18
1.3.5. Determinación de la Actividad Antioxidante: 18
[Link]. Reacciones SET y reacciones HAT: 19
[Link].1. Métodos antioxidantes que utilizan mecanismos SET: 21
[Link].1.1. FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power): 21
[Link].1.2. CUPRAC (Cupric Reducing Antioxidant Capacity): 21
[Link].1.3. DMPD (N,N-Dimethylphenylenediamine
Dihydrochloride): 22
[Link].2. Métodos antioxidantes que utilizan mecanismos HAT: 22
[Link].2.1. ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity): 22
[Link].2.2. TRAP (Total Radical-Trapping Antioxidant Parameter): 22
[Link].2.3. CBA (Crocin Bleaching Assay): 22
[Link].2.4. TBARS (Tiobarbituric Acid Reactive Substances): 23
[Link].2.5. TOSC (Total Oxyradical Scavenging Capacity): 23
[Link].2.6. LDL’s (Low Density Lipoprotein): 23
[Link].2.7. Ensayo de la Desoxirribosa: 24
 [Link].2.8. Ensayo de la Xantina Oxidasa: 24
[Link].3. Métodos antioxidantes que utilizan mecanismos SET y HAT: 25
[Link].[Link](2,2’-Azino-Bis-3-Ethylbenzothiazoline-6-Sulphonic
Acid - Ácido 2,2'-azino-bis-3-etilbenzotiazolín-6-sulfónico): 25
[Link].3.2. TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity -
Capacidad Antioxidante Equivalente en Trolox): 25
[Link].3.3. DPPH (1,1-Difenil-2-Picrilhidrazilo): 26
[Link].4. Técnicas Electroquímicas: 28
1.4. Técnicas Cromatográficas en el estudio de la composición de extractos de tés,
infusiones y especias: componentes principales y antioxidantes: 31
1.5. Bibliografía: 36
Summary: 46

CAPÍTULO II: NUEVOS MÉTODOS DE MEDIDA ELECTROQUÍMICA DE

CAPACIDAD ANTIOXIDANTE: 49

2.1. Introducción: 53
2.2. Objetivos de este capítulo: 54
2.3. Experimental: 55
2.3.1. Instrumental: 55
2.3.2. Electrodos: 55
2.3.3. Reactivos y disoluciones: 55
2.3.4. Condiciones de trabajo: 56
2.3.5. Procedimiento de trabajo en la simulación del daño a ácidos nucleicos: 57
2.4. Resultados y Discusión: 60
2.4.1. Simulación del daño a ácidos nucleicos: 60
[Link]. Optimización de variables para la inmovilización de los nucleósidos
Adenosina y Guanosina sobre GCE: 60
[Link].1. Adenosina: 60
[Link].2. Guanosina: 65
[Link].3. Adenosina + Guanosina: 70
[Link]. Optimización de variables para la inmovilización de los nucleósidos
Adenosina y Guanosina sobre CPE: 72
[Link].1. Guanosina: 73
[Link].1. Adenosina: 76
[Link]. Validación del sensor con GCE: 77
[Link]. Validación del sensor con CPE: 80
2.4.2. Uso de un hidroperóxido sintético: 81
2.5. Bibliografía: 91
Summary: 92
CAPÍTULO III: MECANISMOS DE OXIDACIÓN ELECTROQUÍMICA DE
ANTIOXIDANTES: 95

3.1. Introducción: 97
3.2. Objetivos del capítulo: 98
3.3. Experimental: 98
3.3.1. Instrumental: 98
3.3.2. Células y electrodos: 99
3.3.3. Reactivos y disoluciones: 100
3.3.4. Condiciones de trabajo: 100
3.4. Resultados y Discusión: 102
3.4.1. Oxidación electroquímica del sesamol: 102
[Link]. Determinación de la constante de disociación: 102
[Link]. Mecanismo de oxidación sobre electrodo de carbón vitrificado: 105
3.4.2. Constantes de disociación de los grupos fenólicos de ácido gálico y 2,4- y
2,5- dihidroxibenzaldehídos en relación con sus actividades antioxidantes: 127
3.4.3. Mecanismo de oxidación del 2,5-dihidroxibenzaldehído sobre GCE: 138
3.5. Bibliografía: 160
Summary: 163

CAPÍTULO IV: COMPOSICIÓN DE EXTRACTOS ALIMENTARIOS EN

RELACIÓN CON LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE: 165
4.1. Introducción: 169
4.2. Objetivos del Capítulo: 177
4.3. Materiales y Métodos: 177
4.3.1. Cromatografía de Gases – Espectrometría de Masas (CG-EM): 178
[Link]. Preparación de las Muestras/Extractos: 178
[Link]. Método utilizado en CG-EM: 178
4.3.2. Cromatografía Líquida de Alta Eficacia (HPLC): 179
[Link]. Preparación de las muestras/extractos: 179
[Link]. Método utilizado en HPLC: 180
4.4. Resultados de CG-EM: 184
4.4.1. Tés: 190
[Link]. Té Blanco: 190
[Link]. Té Negro: 192
[Link]. Té Rojo: 194
[Link]. Té Verde: 195
[Link]. Mezcla de 3 Tés: 197
4.4.2. Infusiones: 199
[Link]. Manzanilla: 199
[Link]. Menta-Poleo: 201
 [Link]. Rooibos: 203
[Link]. Salvia: 205
[Link]. Tila: 207
4.4.3. Especias: 209
[Link]. Albahaca: 209
[Link]. Canela en polvo: 212
[Link]. Canela en rama: 214
[Link]. Clavo: 215
[Link]. Comino: 216
[Link]. Cúrcuma: 218
[Link]. Jengibre: 221
[Link]. Nuez Moscada: 224
[Link]. Orégano: 226
[Link]. Romero: 228
[Link]. Tomillo: 230
4.5. Resultados de HPLC: 233
4.5.1. Tés: 236
[Link]. Té Blanco: 236
[Link]. Té Negro: 238
[Link]. Té Rojo: 240
[Link]. Té Verde: 241
[Link]. Mezcla de 3 Tés: 243
4.5.2. Infusiones: 246
[Link]. Manzanilla: 246
[Link]. Menta-Poleo: 247
[Link]. Rooibos: 248
[Link]. Salvia: 249
[Link]. Tila: 250
4.5.3. Especias: 251
[Link]. Albahaca: 251
[Link]. Canela en polvo: 252
[Link]. Canela en rama: 254
[Link]. Clavo: 255
[Link]. Comino: 256
[Link]. Cúrcuma: 257
[Link]. Jengibre: 258
[Link]. Nuez Moscada: 259
[Link]. Orégano: 260
[Link]. Romero: 261
[Link]. Tomillo: 262
4.6. Comparativa de los extractos en agua y en metanol obtenidos en CG-EM: 264
4.6.1. Tés: 264
[Link]. Té Blanco: 264
[Link]. Té Negro: 264
 [Link]. Té Rojo: 265
[Link]. Té Verde: 265
[Link]. Mezcla de 3 Tés: 265
4.6.2. Infusiones: 266
[Link]. Manzanilla: 266
[Link]. Menta-Poleo: 266
[Link]. Rooibos: 267
[Link]. Salvia: 267
[Link]. Tila: 268
4.6.3. Especias: 269
[Link]. Albahaca: 269
[Link]. Canela en polvo: 270
[Link]. Canela en rama: 270
[Link]. Clavo: 271
[Link]. Comino: 271
[Link]. Cúrcuma: 272
[Link]. Jengibre: 273
[Link]. Nuez Moscada: 274
[Link]. Orégano: 274
[Link]. Romero: 275
[Link]. Tomillo: 276
4.6.4. Comentarios sobre los resultados obtenidos en CG-EM y HPLC: 277
4.7. Comparativa del Contenido en Antioxidantes de los extractos en agua y en
metanol: 279
4.7.1. Tés: 279
4.7.2. Infusiones: 281
4.7.3. Especias: 282
4.8. Bibliografía: 284
Summary: 287

CAPÍTULO V: CONCLUSIONS: 293

ANEXO: 301
Artículos y Comunicaciones a Congresos
CAPÍTULO I

INTRODUCCIÓN
 Capítulo 1

1.1. El Estrés Oxidativo

1.1.1. El Estrés Oxidativo en la Salud Humana
En nuestro planeta existe una gran cantidad de oxígeno y, por tanto, en la naturaleza
casi todos los materiales se oxidan: las grasas se enrancian, los tornillos se cubren de
óxido, la goma pierde elasticidad, el papel se amarillea, la fruta madura y se pudre, etc.
Estas reacciones de óxido-reducción son muy importantes ya que los seres vivos
obtienen la mayor parte de su energía a partir de ellas, por ejemplo, en la fotosíntesis y
en el metabolismo aeróbico.
A pesar de que el oxígeno es imprescindible para la vida, puede ser también fuente de
enfermedades a través de una producción incontrolada de radicales libres entre los que
se encuentran las especies reactivas de oxígeno (ROS: “Reactive Oxygen Species”), que
dañan las macromoléculas (lípidos, proteínas, hidratos de carbono y ácidos nucleicos)
y alteran los procesos celulares (funcionalidad de las membranas, producción de
enzimas, respiración celular, inducción génica, etc.) [1-3]. Estos ROS son iones de
oxígeno, radicales libres y peróxidos tanto inorgánicos como orgánicos. Físicamente,
son moléculas muy pequeñas altamente reactivas debido a sus de electrones
desapareados. Estas especies se forman de manera natural como subproducto del
metabolismo normal del oxígeno y tienen un importante papel en la señalización celular,
pero en épocas de estrés ambiental sus niveles pueden aumentar mucho, rompiendo el
equilibrio y provocando daños significativos a las estructuras celulares, provocando una
situación conocida como estrés oxidativo.
Los radicales libres son moléculas que se producen durante muchas reacciones
metabólicas, mientras las células del organismo transforman los alimentos en energía,
especialmente en situaciones de hiperoxia, ejercicio intenso e isquemia, aunque también
se producen por exposición a determinados agentes externos como las radiaciones
ionizantes o luz ultravioleta, polución ambiental, humo del tabaco, etc.
Las ROS inorgánicos más importantes son: el oxígeno molecular O2, el radical-anión
superóxido (O2–), el radical hidroxilo (HO–) y su precursor, el peróxido de hidrógeno
(H2O2). También hay ROS orgánicos como el radical peroxilo (ROO–), el hidroperóxido
orgánico (ROOH) y los lípidos peroxidados.
Gran parte de las ROS desempeñan papeles fisiológicos de vital importancia, aunque
también se encuentran implicadas en reacciones de oxidación no deseadas, frente a las
que el organismo ha desarrollado ciertas defensas antioxidantes [4]. La producción
endógena de una determinada cantidad de ROS en condiciones normales, sin sobrepasar
unos límites concretos, es un proceso celular normal e inevitable exento del más mínimo
daño oxidativo gracias a la provisión por parte de la célula, que resulta imprescindible
para la vida de ésta por ser un proceso implicado en la regulación y producción de
energía metabólica, activación o inactivación de biomoléculas, etc.[5-10] y que cuenta
3
Capítulo 1

con mecanismos antioxidantes con los que la célula combate estos daños. Sin embargo,
en el momento en que tiene lugar un aumento considerable de la velocidad de formación
de ROS con respecto a lo establecido en condiciones normales, casi siempre se origina
como consecuencia una disminución de los propios mecanismos de defensa, derivando
en una situación de desequilibrio entre las especies oxidantes (más numerosas ahora) y
las antioxidantes, lo que origina unos daños oxidativos importantes sobre determinadas
moléculas presentes en el organismo, reflejándose en sus funciones biológicas. El
balance existente entre los agentes oxidantes y antioxidantes determinará el estado
redox, manteniendo una “homeostasis redox” o estado de equilibrio de las condiciones
de oxidación-reducción finales.
En oposición a los radicales libres, se encuentran los antioxidantes, que son sustancias
que presentes en concentraciones bajas, en comparación con el sustrato oxidable,
retrasan significativamente o evitan la oxidación de éste [11, 12]. En función de cómo
interaccionan con los agentes oxidantes, los antioxidantes pueden ser:
- Antioxidantes primarios: impiden la formación de radicales libres, especialmente las
ROS. Algunos ejemplos de estos, son: la vitamina E [13], polifenoles como resveratrol
[14] o enzimas antioxidantes, con lo que indirectamente reducen el daño en el ADN y
en las membranas [15-16].
- Antioxidantes secundarios: interrumpen la propagación de radicales libres (ejemplos:
α-tocoferol, ácido ascórbico) o desplazan las ROS (ejemplos: ácido ascórbico,
carotenoides, glutatión y enzimas antioxidantes), inhibiendo la generación de ROS, e
impidiendo la activación metabólica de carcinógenos [17-18].
- Antioxidantes terciarios: reparan el daño causado por los radicales libres o eliminan
moléculas que se han estropeado, modificando el potencial redox mejorando la
reparación del ADN [19-20]. Algunos ejemplos son: la vitamina C, polifenoles, selenio
o N-acetilcisteína.
En la dieta humana, existen numerosos antioxidantes de especial interés debido a su
posible acción protectora contra los radicales libres producidos por el estrés oxidativo.
Los efectos dañinos de los radicales libres están controlados por una gran variedad de
antioxidantes, como son los antioxidantes endógenos o propios del organismo
(coenzima Q, glutatión, albúmina, transferrina, ceruloplasmina, ácido úrico, ácido
tióctico, bilirrubina…), antioxidantes exógenos o adquiridos a través de la dieta
(vitaminas E y C, carotenoides, flavonoides, escualeno, selenio, compuestos
fenólicos…), enzimas antioxidantes (Superóxido-dismutasa (SOD), Catalasa,
Glutatión-peroxidasa, Licopeno…) y Cofactores antioxidantes ( Cobre, Magnesio,
Manganeso, Selenio…).
El estrés oxidativo [21-24] es la exposición a diversas fuentes de formación de radicales
libres que originan una alteración del equilibrio que debe existir entre las especies o

4
 Capítulo 1

factores oxidantes y los mecanismos antioxidantes encargados de controlar la

producción y/o propagación de las primeras. Este desequilibrio puede ser debido a un
incremento brusco de las sustancias oxidantes (principalmente ROS), a una
insuficiencia de agentes antioxidantes, o a una combinación de ambos factores. En estas
circunstancias, las células se encuentran expuestas a un ambiente oxidante que genera
efectos adversos sobre el estado redox celular, provocando daños reversibles o
irreversibles a todo tipo de biomoléculas, incluyendo proteínas, lípidos, glúcidos, ácidos
nucléicos (ADN)[25, 26] y componentes de la matriz extracelular, e iniciando una serie
de reacciones químicas capaces de producir alteraciones en la relación
estructura/función de órganos, sistemas o grupos celulares especializados, lo que está
asociado directamente con un número creciente de síndromes de interés médico y social.
Se ha comprobado experimentalmente que más de un centenar de enfermedades se
relacionan con el desequilibrio redox: procesos patológicos como la enfermedad de
Erdheim-Chester [27], el Alzheimer [28], el Parkinson [29], la enfermedad de Crohn
[30], ciertos tipos de cáncer [31-33], diabetes mellitus [34], patologías cardiovasculares
[35], ateroesclerosis[36], procesos reumáticos [37], patologías gastroentéricas [38] y
afecciones broncopulmonares [39]. También los procesos fisiológicos como el
envejecimiento [40], el daño causado por el ejercicio físico agotador [41], etc.

1.1.2. Daño biomolecular ocasionado por el estrés oxidativo

La naturaleza del daño ocasionado por el estrés oxidativo depende principalmente de
dos factores: la reactividad del radical libre que lo produce y la disponibilidad de un
sustrato susceptible de ser atacado en las proximidades de la formación de dicho radical
libre. A pesar de la amplia variedad de daños que pueden darse, los mecanismos por los
que se producen son comunes, y consisten en la captación de un átomo de hidrógeno, o
de un electrón, de una determinada molécula cercana (molécula diana) por parte del
radical libre, estabilizándose el electrón desapareado del radical mediante la formación
de un par electrónico. De una u otra manera, se genera un nuevo radical que
generalmente posee la reactividad de su predecesor (aunque en contadas ocasiones,
puede no presentar reactividad).

[Link]. Daño oxidativo a Proteínas

Hoy en día, existen pruebas experimentales que relacionan de manera directa los
mecanismos de proteólisis con los radicales libres y su interacción con las proteínas
[42]. Algunas de las proteínas implicadas, se caracterizan además por ser dianas de la
acción de los radicales libres además de por su capacidad para generar o propagar estas
especies reactivas. El daño oxidativo sobre las proteínas, además de modificarlas como
sustrato implicado en los mecanismos proteolíticos, afecta también a éstos.
5
Capítulo 1

Los aminoácidos presentes en las proteínas presentan residuos susceptibles de ser

atacados por los radicales libres. Los ataques que se producen pueden ser de naturaleza
difusa dando lugar a modificaciones generalizadas, o por el contrario, ataques selectivos
que modifican zonas específicas. Las modificaciones de tipo general, pueden producir
la alteración de la estructura proteica, lo que tiene como consecuencia directa la pérdida
o modificación de su función biológica, procesos de inactivación, fragmentación,
desnaturalización y/o degradación proteica, alteraciones de funciones celulares como la
producción de energía, interferencias en los potenciales de membrana y cambios en el
tipo y nivel de proteínas celulares [43,44].
Los ataques selectivos son los que están catalizados por metales de transición, de manera
que las enzimas que los poseen en su estructura, son las que presentan un mayor riesgo
de este tipo de ataques [45]. La principal modificación que se da en la degradación
proteolítica es la oxidación de grupos tioles de los aminoácidos [46], lo que origina que
las proteínas con más grupos -SH se oxiden en un mayor grado con respecto a otras
proteínas que resultan más resistentes frente a la eliminación mediante proteólisis
celular, favoreciéndose la acumulación de las mismas [5]. Esta acumulación de
proteínas dañadas, incrementa con el paso de los años como consecuencia del aumento
de la velocidad de oxidación y/o la disminución de la capacidad degradativa de las
mismas [47], lo que está intrínsecamente asociado al proceso de envejecimiento.

[Link]. Daño oxidativo a Lípidos

El proceso de peroxidación lipídica o “enranciamiento” es el daño oxidativo más
importante en los lípidos. Consiste en un daño de los tejidos que puede ser iniciado por
diversos ROS: O2, el 1O2 , el H2O2 y el OH, y afecta a estructuras con alto contenido en
ácidos grasos poliinsaturados, presentes en cantidades importantes en las membranas
celulares. Cuanto mayor es el número de dobles enlaces en la estructura del lípido, éste
es más susceptible de ser atacado [48]. El enranciamiento es un proceso continuo y
fisiológico que en condiciones normales actúa como un renovador de membranas
biológicas, pero cuando su activación es excesiva se relaciona con la patogénesis de
numerosas enfermedades y ciertos procesos patológicos de interés: Alzheimer, diabetes
mellitus, etc. [49, 50]. Es un proceso que consta de tres etapas fundamentales: iniciación,
propagación y terminación [48]:

6
 Capítulo 1

Iniciación: L + OH H2O + L

Propagación: L + O2 LOO
L + RH LH + R
LOO + RH LOOH + R
Terminación: 2L L2
L + LOO LOOL
 
L +R LR
R + LOO LOOR

[Link]. Daño oxidativo a Glúcidos

Algunos polisacáridos tienen funciones protectoras, mientras que la mayoría de los
monosacáridos se autooxidan en condiciones fisiológicas formando cetoaldehídos e
intermediarios como el radical O2–, el cual es captado por moléculas de glucosa
impidiendo su posterior acción radical. Algunos monosacáridos como la manosa o el
manitol, presentan también la capacidad de capturar radicales tales como OH y el O2–
[51], pese a esto, los radicales libres provocan una importante disminución del contenido
de ATP intracelular, alterando así la vía glucolítica y mitocondrial.

[Link]. Daño Oxidativo al ADN

A pesar de que el ADN es una molécula bien protegida, es propenso al daño oxidativo
[52], especialmente por parte de los radicales OH y H2 O2– [26, 53], centrado
principalmente en sus bases nitrogenadas. La alteración más frecuente de las bases
púricas consiste en la abstracción de un protón de la posición C-8 de la guanina por
parte del radical OH, originando el nucleósido 8-hidroxi-2-desoxiguanosina (8-OHdG),
de elevado efecto mutagénico. Los glicoles de timina y citosina, así como los hidratos
de pirimidina, dan lugar a la fragmentación del ADN. La cuantificación de la formación
de 8-hidroxi-2-desoxiguanosina (8-OHdG), se utiliza como indicador de la extensión
del daño oxidativo sobre el ADN [54].
Las enzimas reparadoras de los fragmentos dañados no son capaces de eliminar las
lesiones oxidativas en su totalidad [55], y se van acumulando produciendo un aumento
gradual y permanente de mutaciones con la edad, generándose diversos procesos
patológicos relacionados con este tipo de daño, como carcinogénesis y envejecimiento.
También pueden originar mutaciones, roturas espontáneas en las cromátidas y pérdida
de fragmentos cromosómicos, llegando incluso a provocar la pérdida total de
cromosomas en situaciones extremas [56].

7
Capítulo 1

1.2. Los Radicales libres y las Especies Reactivas de Oxígeno como especies
oxidantes
1.2.1. Los Radicales Libres
Desde un punto de vista químico, un radical libre (RL) es una especie química, átomo,
molécula, o fragmento de molécula, que posee al menos un electrón desapareado, bien
por pérdida o ganancia, en su orbital más externo [57]. Puede presentar carga.
La presencia del electrón desapareado, conlleva un momento magnético que da lugar a
propiedades paramagnéticas, y a inestabilidad en la configuración electrónica, lo que se
traduce en una elevada reactividad para conseguir una mayor estabilidad [58].
La forma en que el radical libre reacciona con otros compuestos químicos puede ser:
- El radical cede su electrón desapareado (radical reductor).
- El radical toma un electrón de una molécula estable apareando así su propio electrón
(radical oxidante).
- El radical se enlaza covalentemente a una molécula estable.
En cualquier caso, el radical compensa su orbital incompleto desestabilizando la
configuración electrónica del compuesto químico con el que reacciona, lo que provoca
la formación de un nuevo radical libre [59], aunque también pueden formarse radicales
libres por ruptura homolítica de una molécula estable [60].
De esta forma, los radicales libres dan lugar a reacciones en cascada con formación
continua de especies altamente reactivas. La única forma de finalizar este proceso de
reacción/formación de radicales libres, es que coincidan dos radicales que puedan
combinar sus electrones desapareados y unirse mediante un enlace covalente, aunque
en ocasiones, pueden formarse especies estables como radicales [61]. La alta reactividad
de los radicales libres, es la responsable de su toxicidad y de su corta vida media [62,
63].

1.2.2. Principales ROS

Los radicales libres más destacados son las especies reactivas de oxígeno (ROS, del
inglés Reactive Oxygen Spices), no sólo por su elevada abundancia procedente de la
respiración aeróbica, sino también por sus conocidas implicaciones en procesos
relevantes como el deterioro de alimentos, el envejecimiento celular y una gran
diversidad de patologías de enfermedades crónico-degenerativas [64-67]. En la Tabla 1
se indican las principales especies reactivas de oxígeno (ROS) [65].

8
 Capítulo 1

Especies Radicales Especies NO Radicales

Anión Superóxido O2– Oxígeno Singlete 1O2
Hidroxilo OH
Hidroperoxilo HO2 Ozono O3
Alcoxilo RO
Peróxido de Hidrógeno H2O2
Peroxilo RO2

Tabla 1. Principales ROS

De manera análoga a las ROS, existen especies reactivas de nitrógeno (RNS), de cloro
(RClS) y de bromo (RBrS).
El oxígeno tiene dos electrones desapareados en su orbital más externo, lo que
proporciona carácter paramagnético a la molécula y hace que la molécula de O2 sólo
interactúe con radicales cuyos electrones tengan spin complementario a los suyos,
fenómeno conocido como “restricción de spin”, lo que previene la adición directa de un
par de electrones hacia la molécula, ya que sería necesaria la inversión del spin de uno
de los electrones antes de la unión, lo cual está impedido por el Principio de Exclusión
de Pauli. Como este proceso de inversión de spin es relativamente lento comparado con
la vida media de los elementos en contacto con el oxígeno, la molécula de oxígeno en
su estado fundamental se comporta como un oxidante relativamente débil, permitiendo
la coexistencia de la materia orgánica y el oxígeno libre.
El oxígeno es un aceptor final de electrones en la respiración celular, donde se lleva a
cabo la reducción del oxígeno (en este caso tetravalente) para producir agua en la cadena
de transporte electrónico. A pesar de que éstos son procesos seguros (no se crean ROS),
el ambiente reductivo del medio intracelular favorece la reducción del O2 en su estado
fundamental, con formación de ROS. Esta es la principal causa del envejecimiento, lo
que se conoce como la paradoja del oxígeno [68].

[Link]. Oxígeno Singlete

El Oxígeno singlete (1O2) se corresponde con el estado electrónicamente excitado de
menor energía del oxígeno molecular, en el que los dos electrones albergados en
orbitales antienlazantes se disponen con spines opuestos, dando como resultado un
carácter fuertemente oxidante, y en consecuencia, una especie electrófila altamente
reactiva, a pesar de no tratarse de un radical libre propiamente dicho.
Esta ROS se genera cuando el oxígeno molecular en estado fundamental (triplete)
absorbe energía electromagnética e invierte de manera transitoria el spin de uno de sus

9
Capítulo 1

electrones desapareados, consiguiendo así una orientación antiparalela del spin de los
electrones de los orbitales antienlazantes más externos [69, 70].

3 հν 1
O2 O2

[Link]. Anión radical superóxido y radical hidroperoxilo

El anión radical superóxido es un radical libre cargado negativamente que se forma por
la reducción univalente del oxígeno molecular. Se origina en todas las células eucariotas
animales, generalmente en la mitocondria [1-3] y el retículo endoplasmático [71].
Durante la respiración celular, aproximadamente entre el 1% y el 2% de los electrones
transportados en la cadena respiratoria mitocondrial no participan en la reducción
completa de oxígeno a agua, sino en la formación de este radical [3].
O2 + e– + H+ HO2 O2– + H+
El radical O2– es la base conjugada de un ácido débil, el radical hidroperoxilo (HO2),
capaz de atravesar membranas y actuar como molécula bio-señalizadora en el
crecimiento y desarrollo celular, así como en respuesta a situaciones de estrés. Ambos
radicales se mantienen en equilibrio; sin embargo, como el pKa de disociación es 4.88,
en entornos de pH fisiológicos el radical predominante es el anión superóxido [72], el
cual se dismuta produciendo peróxido de hidrógeno y oxígeno.
2 O2– + 2 H+ H2O2 + O2
O2– + H+ + HO2 H2O2 + O2

Las principales reacciones responsables de la formación del O2– son:

- Reacciones enzimáticas catalizadas por enzimas deshidrogenasas flavoproteínicas
[73], oxidasas e hidroxilasas [74].
- Autooxidación de moléculas como gliceraldehído, ascorbato, hidroquinonas, tioles
(cisteína, catecolaminas, flavinas y hemoproteínas), en presencia de algunos metales
a nivel de trazas [75].

Debido a este tipo de reacciones, se calcula, que cada célula del organismo puede
producir más de un millar de moléculas de O2– por día [76].
Aunque este ROS es relativamente poco reactivo e inestable, es potencialmente tóxico,
ya que es la principal fuente de formación de H2O2 cuando se elimina a nivel celular,
mediante su reducción, catalizada por la enzima superóxido dismutasa.

10
 Capítulo 1

[Link]. Peróxido de Hidrógeno

El H2O2 no es un radical libre, ya que no posee electrones desapareados. Siendo la
especie menos reactiva, es un importante precursor de otros radicales libres, lo que
unido a su capacidad para atravesar las membranas biológicas [77], le permite
protagonizar reacciones de oxidación en diversos puntos de la célula, distantes del lugar
de producción de este ROS, creándose así nuevos radicales libres.
Existen diversas fuentes de formación de peróxido de hidrógeno; la principal es la
debida a la reducción directa del oxígeno molecular, en la que participan dos electrones
y dos protones [64]. En menor proporción se produce por la dismutación del radical O2–
mediante la enzima superóxido dismutasa [78, 79], como producto de algunas enzimas
(glucosa oxidasa, uricasa, etc.) [80], o a través de reacciones de autooxidación [73].
El H2O2 no es tóxico cuando se encuentra en concentraciones fisiológicas, pero
mediante la reacción de Fenton-Haber-Weiss [81] puede dar lugar al radical OH (el
ROS que presenta mayor toxicidad) en presencia de catalizadores metálicos como el
hierro o el cobre, y en combinación con el anión radical superóxido:
Fenton: Fe3+ + O2– Fe2+ + O2
Fe2+ + H2O2 Fe3+ + OH + OH–
Fe3+/ Fe2+
Haber- Weiss: O2– + H2O2 OH + OH– + O2

La naturaleza del daño producido por estas reacciones depende de la disponibilidad y

localización de estos metales de transición. La reducción del H2O2 para producir agua,
está catalizada por sistemas enzimáticos como la glutatión peroxidasa [33].

[Link]. Radical Hidroxilo

El radical hidroxilo, es el radical libre de mayor reactividad, y presenta una vida media
de 109 segundos [82]. Aunque no se difunde fácilmente, es el radical más dañino que
existe. Se desconoce la existencia de una enzima capaz de eliminarlo de manera directa.
Una posible fuente de formación es la disociación (poco frecuente) de la molécula de
agua como consecuencia de radiaciones de alta energía (rayos X, rayos γ).
հν
H2O2 OH + H

La radiación ultravioleta (UV) no tiene suficiente energía como para disociar una
molécula de agua, pero sí una molécula de H2O2 en dos moléculas del radical hidroxilo.
UV
H2O2 2 OH

11
Capítulo 1

El proceso más importante de formación de este radical, es el debido a las reacciones de

Fenton-Haber-Weiss (vistas en el apartado anterior), en las que una molécula de
peróxido de hidrógeno reacciona con una molécula de anión radical superóxido, u otro
agente reductor, para producir OH, OH– y O2. La velocidad de estas reacciones es
demasiado baja como para ser importantes a nivel fisiológico, aunque algunos metales
de transición como el hierro o el cobre, actúan como catalizadores acelerando su
velocidad notablemente [32].
La alta reactividad del OH queda demostrada por su capacidad para reaccionar con las
bases púricas y pirimidínicas del ADN, lo que hace que se considere un agente
genotóxico [83]. También puede extraer un protón de la cadena carbonada procedente
de ácidos grasos poliinsaturados, iniciando de esta forma la peroxidación lipídica [84],
así como provocar daños a aminoácidos y proteínas [85].

[Link]. Radical alcoxilo y radical peroxilo

Ambos radicales son especies reactivas generadas durante la lipoperoxidación como
consecuencia del ataque de otros radicales libres sobre las cadenas carbonatadas de los
ácidos grasos, resultando fundamentales en el desarrollo del proceso al contribuir en el
inicio y propagación de la reacción. Sus correspondientes reactividades son inferiores a
la del radical hidroxilo, sin embargo su selectividad es superior a la de éste [86].

[Link]. Ozono
La molécula de ozono está compuesta por tres átomos de oxígeno; se forma al disociarse
el oxígeno en dos átomos que se unen, cada uno de ellos, a otra molécula de oxígeno
gaseoso (O2). Este proceso ocurre cuando el oxígeno del medio ambiente, se somete a
un pulso de mucha energía, como por ejemplo un rayo.
հν
O2 2O

O + O2 O3
La presencia de ozono en la estratosfera, protege del exceso de radiación ultravioleta,
pero debido a su elevado poder oxidante y a su elevada reactividad, su presencia en la
troposfera puede afectar a la vegetación natural, los cultivos e incluso a la salud humana.
Dependiendo de la concentración y el tiempo de exposición al ozono, los daños serán
más o menos perjudiciales.
El ozono es un potente oxidante que reacciona con proteínas y lípidos, especialmente
con las membranas biológicas. Su elevada reactividad, limita su acumulación. Una

12
 Capítulo 1

exposición prolongada a ozono a una concentración tan baja como 0,1 p.p.m., puede
provocar un envejecimiento prematuro.
Por su elevado poder oxidante se emplea como desinfectante, depurador y purificador
de aguas minerales ya que elimina los olores y sabores del agua por oxidación de la
materia orgánica, no deja residuos, es compatible con otros tratamientos, no afecta al
pH, no colorea el agua y no deja ningún residuo químico perjudicial.

1.2.3. Formación de Radicales Libres

Los radicales libres se producen fisiológicamente en cantidades moderadas, ya que
participan en importantes funciones biológicas. Si alcanzan niveles elevados en el
organismo, provocan daños celulares de diversos tipos, teniendo una repercusión
importante en la salud. La formación de radicales libres puede deberse a la acción de
fuentes exógenas o endógenas [87].

[Link]. Fuentes Exógenas

Las principales fuentes exógenas de producción de radicales libres se pueden clasificar
en:
1) Factores Ambientales: la contaminación atmosférica producida por contaminantes
fotoquímicos, el humo del tabaco inhalado directamente o indirectamente, la hiperoxia,
los plaguicidas, los compuestos xenobióticos (cloroformo, paracetamol, etanol,
tetracloruro de carbono, etc.), los metales pesados, los disolventes, los anestésicos y los
hidrocarburos aromáticos. Todos estos compuestos pueden poseer radicales libres de
manera intrínseca como el humo del tabaco, o bien generarlos a través del metabolismo
celular y los procesos relacionados con éste [88].
2) Compuestos de naturaleza prooxidante (con marcado carácter oxidante por sí
mismos) que entran en el organismo a través de la dieta, ya que se encuentran en gran
parte de los aditivos químicos utilizados en los alimentos en conservas y embutidos
(conservantes, colorantes, saborizantes, etc.), las grasas animales y vegetales calentadas
al fuego o por hidrogenación, bebidas alcohólicas, azúcares refinados, etc.
3) Contaminantes químicos, componentes de perfumes, cremas para la piel, champús,
jabones, pinturas, detergentes para la ropa, productos de limpieza, etc. son radicales
libres o precursores de estos.
4) Agentes antineoplásicos y antibióticos, fármacos que se utilizan por su capacidad
para reducir el O2 a O2–, el H2O2 y el OH: adriamicina, bleomicina, daunorubicina y
algunos antibióticos con grupos quinoides o metales [89].

13
Capítulo 1

5) Irradiaciones sobre los organismos, las cuales pueden provocar el paso de un

compuesto a su estado excitado, lo que puede originar un radical o acentuar su carácter
oxidante. Son radiaciones solares, ultravioleta, rayos X y rayos γ, e ionizantes
(electrones, protones, neutrones, deuterones y partículas α y β) [90].
6) Metabolización de determinados fármacos [91].

[Link]. Fuentes Endógenas

Las mitocondrias presentes en los tejidos sanos son la principal fuente de radicales libres
en los organismos aerobios [92], ya que estos orgánulos son los responsables de más del
90% del consumo del oxígeno celular. La cadena de transporte electrónico, constituida
por una serie de proteínas con propiedades redox capaces de reducir el oxígeno
molecular hasta la formación de agua, se encuentra acoplada a su vez a la fosforilación
oxidativa para producir ATP. Estos procesos constituyen la principal fuente endógena
de ROS.
Entre el 1% y el 2% de los electrones transportados por la cadena mitocondrial no
alcanza su destino final, por lo que no intervienen en la producción de ATP, sino que
están implicados en las reducciones parciales del O2. Entre el 1% y el 5% de las
moléculas de O2 son activadas por incorporación directa de un electrón generando el
anión radical superóxido. Dicha producción es proporcional a la actividad de la cadena
de transporte electrónico, pero no es necesariamente proporcional al consumo de O2 en
el organismo [93]. En determinadas ocasiones, la actividad de la cadena de transporte
electrónico se mantiene constante en el tiempo, constituyendo un estado estable de
formación de O2– capaz de reducir metales de transición, favoreciendo así la formación
de OH. La liberación de ROS hacia el exterior mitocondrial depende del potencial de
membrana, principalmente cuando se alcanza el potencial máximo [94].
Aunque la principal fuente de formación de ROS es la hiperactividad mitocondrial, otras
fuentes no menos importantes son la isquemia-reperfusión, las reacciones enzimáticas
e inmunitarias, la autooxidación de catecolaminas, la producción de ácido láctico, etc.
[95].
Las fuentes endógenas de formación de ROS pueden clasificarse en dos grupos, según
cómo las regulen los sistemas de homeostasis del organismo:
- Fuentes de formación regulada. En este grupo se incluye el sistema inmune, con su
necesidad fisiológica de ROS. Los macrófagos y neutrófilos (fagocitos activados)
requieren un ambiente oxidativo controlado, donde se pueda desarrollar su metabolismo
y la eliminación de antígenos y células apoptóticas [96].

14
 Capítulo 1

- Fuentes de formación no regulada. Las que se producen espontáneamente en respuesta

a determinados estímulos, como el ejercicio físico, la dieta, la temperatura ambiental o
las radiaciones.

1.3. Los Antioxidantes

Los antioxidantes son compuestos que desarrollan una función vital en el organismo, ya
que actúan como sistema de defensa en la prevención del daño oxidativo provocado por
los radicales libres, en especial las ROS.
Actualmente existe un gran interés en la investigación de productos y antioxidantes de
origen natural frente a los de origen sintético [97, 98]. Algunos, como BHT
(Butilhidroxitolueno), TBHQ (Terbutilhidroquinona), BHA (Butilhidroxianisol) o el
propilgalato se utilizan frecuentemente como aditivos alimentarios en productos de
consumo habitual y están regulados por la ley, debido a sus posibles efectos tóxicos
cuando se consumen en exceso. Se ha establecido una relación de condimentos y
especias con propiedades médicas y fisiológicas de alto interés para la sociedad [99,
100], siendo de especial interés los antioxidantes alimentarios en la prevención de
lesiones inflamatorias, deficiencias nutricionales, enfermedades autoinmunes,
Parkinson, infartos de miocardio, neurodegeneración, envejecimiento, neoplasias,
aterosclerosis y diabetes [101] relacionándolo directamente con la producción de
radicales libres. Este hecho ha provocado que en las últimas décadas, el número de
publicaciones científicas relacionadas con antioxidantes, especialmente los de origen
natural, haya experimentado un crecimiento exponencial.
Este gran interés se debe fundamentalmente a tres razones:
1) El poder antioxidante de una amplia variedad de agentes fitoquímicos.
2) Los beneficios del consumo de antioxidantes naturales frente a las enfermedades
crónico-degenerativas y el proceso de envejecimiento.
3) La inseguridad que suscita en las personas el consumo de antioxidantes sintéticos.
Existe una preferencia generalizada en la población mundial, acerca de consumir
antioxidantes naturales frente a los de origen sintético, resultando los naturales mucho
más aceptados y demandados comercialmente [102]. El consumo de antioxidantes
naturales a través de la dieta supone un refuerzo considerable de las defensas naturales
propias del organismo, teniendo esto como resultado, el reconocimiento de que el
consumo de antioxidantes es sinónimo de salud.

1.3.1. Antioxidantes Fenólicos

15
Capítulo 1

Los compuestos fenólicos constituyen un importante y heterogéneo grupo de

compuestos ampliamente repartidos en el reino vegetal, formado por más de 8.000
estructuras identificadas [103]. Presentan entre sus propiedades, la capacidad de
precipitar macromoléculas tales como proteínas, carbohidratos y enzimas digestivas, lo
que reduce la digestión de ciertos alimentos y que generó antiguamente, el término de
antinutrientes. En la década de los 90 del siglo pasado, la percepción sobre estos
compuestos cambia drásticamente, aumentando el interés en ellos por sus efectos
beneficiosos sobre la salud, descritos en determinadas enfermedades cardiovasculares
[104, 105], enfermedades neurodegenerativas [106,107], en la prevención y tratamiento
de distintos tipos de cáncer [105,108] y, en general, en todas aquellas enfermedades
relacionadas con el estrés oxidativo. Los numerosos beneficios aportados por la extensa
variedad de compuestos fenólicos responden a sus propiedades antiinflamatorias [109],
anticancerígenas [110] y, fundamentalmente, a sus propiedades antioxidantes [107]. La
influencia de estas últimas en la mejora de la salud, así como la gran abundancia de
estos compuestos en nuestra dieta cotidiana, han despertado un gran interés desde el
punto vista científico-empresarial, tanto en el campo de los ingredientes funcionales,
como en el campo farmacológico.
Los compuestos fenólicos constituyen una de las principales fracciones de metabolitos
secundarios sintetizados por las plantas, ya que intervienen en procesos fisiológicos
referentes al crecimiento y la reproducción, en la respuesta a condiciones de estrés, en
procesos defensivos frente a herbívoros, patógenos, parásitos, polución, radicación UV,
temperaturas extremas, etc. [111], y son los principales responsables de propiedades
como el color, la astringencia, el sabor y el aroma.
A pesar de la gran variedad de compuestos fenólicos que existen, la mayoría presenta
un origen metabólico común: la ruta del ácido shikímico (plantas superiores) y la del
ácido malónico (bacterias y hongos) [112]. En ellas tiene lugar una biosíntesis que
conduce a la producción de ácidos benzoicos y cinámicos, así como a ciertos
aminoácidos aromáticos (fenilalanina y tirosina). En su mayoría, se trata de moléculas
muy solubles que presentan como elemento común un anillo bencénico con uno o varios
grupos hidroxilo en sus estructuras moleculares, que además pueden incluir grupos
funcionales como ésteres, metil ésteres, glicósidos, etc. [113, 114]. No obstante, ciertos
compuestos fenólicos son solubles sólo en disolventes orgánicos.

1.3.2. Clasificación de los compuestos Fenólicos

Teniendo en cuenta la amplia variedad de compuestos fenólicos que existen, y el gran
número de estos, resulta difícil establecer un criterio de clasificación. La forma más
simple de ordenar este tipo de compuestos es en base a su número de átomos de carbono
(“esqueleto”), de esta forma tendremos: fenoles simples y fenoles complejos.

16
 Capítulo 1

En los Fenoles Simples se distinguen tres grandes grupos:

- Los fenil-propanoides simples: son aquellos que presentan un esqueleto básico de
fenil-propanoide (un anillo aromático unido a una cadena de 3 carbonos). Por ejemplo,
el ácido trans-cinámico, el ácido p-cumárico y sus derivados como el ácido cafeico.
- Las lactonas fenil-propanoides (o "ésteres cíclicos"), conocidas como cumarinas:
poseen un esqueleto fenil-propanoide, pero el propano está ciclado. Por ejemplo: la
umbeliferona, oel "psoralen" (cumarina con un anillo de furano).
- Los derivados del ácido benzoico: en estos, el esqueleto es un anillo aromático unido
a un carbono, es decir, son formados a partir de fenil-propanoides que pierden dos
átomos de carbono del grupo propilo. Ejemplos: vainillina, ácido salicílico.
En los Fenoles Complejos se pueden distinguir dos grandes grupos:
- Los Lignanos, metabolitos secundarios de las plantas que se encuentran en una gran
variedad de plantas como las semillas de lino, calabaza o ajonjolí, el centeno, la soja, el
brócoli, los frijoles y en algunas bayas. Aunque están ampliamente distribuidos en la
naturaleza, sus cantidades son muy pequeñas, del orden de μg/g de producto seco.
- Los Flavonoides: son compuestos que sintetizan todas las plantas terrestres, así como
algunas algas. La síntesis de estos compuestos presenta una parte común, pero la
composición química de sus productos finales es muy diferente de unas especies a otras,
así como los mecanismos de regulación de su biosíntesis, por lo que la composición y
concentración de flavonoides es muy variable, dependiendo de las especies e incluso
del ambiente.

1.3.3. Los Compuestos Fenólicos en la dieta

Los productos naturales con alto contenido en antioxidantes fenólicos, adquieren un
papel imprescindible por la tendencia generalizada en la población hacia una
alimentación basada en el consumo de productos saludables. Su presencia en los
alimentos de origen vegetal como frutas, vegetales, café, té, especias y condimentos,
etc. [115] aporta aproximadamente un gramo diario, dependiendo de la dieta [116].

1.3.4. La Actividad Antioxidante de los Compuestos Fenólicos

La capacidad antioxidante de los compuestos fenólicos reside en su estructura química,
idónea para reaccionar con los radicales libres. El fundamento de la interacción
“Antioxidante-Radical Libre” se basa en la facilidad del antioxidante para donar
electrones o átomos de hidrógeno del grupo hidroxilo unido al grupo aromático [117] y
en la capacidad del nuevo radical que se origina, para deslocalizar el electrón

17
Capítulo 1

desapareado (efecto resonante) en el sistema de dobles enlaces característico del anillo

aromático [118], pudiendo estabilizarse mediante la formación de quinonas [119]. A
esto hay que sumarle que los compuestos fenólicos presentan una gran capacidad de
captación de iones metálicos, principalmente hierro y cobre, de manera que inhiben la
formación de radicales libres a través de la reacción de Fenton.
Es muy importante el grado de metoxilación e hidroxilación [120] del compuesto
fenólico, ya que está directamente relacionado con la capacidad antioxidante de éste.
Otros factores de gran influencia son: la concentración, la localización de los grupos
hidroxilos y el nivel de oxidación que presente el antioxidante [120, 121].

1.3.5. Determinación de la Actividad Antioxidante

La determinación de la actividad antioxidante de compuestos puros, resulta
imprescindible para conocer la protección frente a la oxidación o el deterioro del
alimento que lo alberga en su composición. Además de que estos antioxidantes se
encuentran en diferentes proporciones, no se encuentra uno solo en cada alimento, sino
que lo más normal es encontrarse con mezclas donde hay diferentes compuestos
antioxidantes, y cada uno con una capacidad diferente, lo que dificulta la tarea.
Hay una necesidad de adquirir métodos unificados estandarizados que permitan servir
de protocolo para una correcta aplicación del ensayo, comparar los resultados entre
alimentos o productos comerciales, su aplicación útil como herramienta en el control de
calidad, así como proveer de estándares para la regulación y las declaraciones de efectos
en la salud [122]. De manera adicional, debe exigirse el cumplimiento de otros
requisitos como pueden ser la utilización de un radical biológicamente relevante,
capacidad de medición de antioxidantes lipofílicos e hidrofóbicos, utilidad para el
control de calidad de rutina de un volumen amplio de muestras, presentación de un
punto final de ensayo definido con mecanismo conocido, instrumentación fácilmente
accesible, alta sensibilidad, alta reproducibilidad, simplicidad, rapidez y bajo coste,
entre otros.
Las elevadas exigencias requeridas constituyen el principal motivo por el cual, de
manera generalizada, ningún método o ensayo exprese con precisión, por sí sólo, la
capacidad antioxidante total de una muestra, puesto que este parámetro deberá expresar
la capacidad de antioxidantes lipofílicos e hidrofóbicos, reflejar y diferenciar los
diferentes mecanismos antioxidantes y evaluar la reactividad del antioxidante frente a
diferentes especies reactivas, hechos que a día de hoy imposibilitan la existencia de
métodos mundialmente unificados para tal propósito. Con el fin de esclarecer en toda
su extensión la capacidad antioxidante, tratando de esta manera facilitar la comparación
e interpretación de los resultados, se opta por la planificación de diseños que involucren
diferentes metodologías,[123] permitiendo minimizar la problemática ocasionada por la

18
 Capítulo 1

disparidad en la condiciones experimentales de éstas, la alta complejidad de los sistemas

estudiados (presencia de AO con dependencia de la zona de muestra analizada, amplio
número y variedad de estructuras químicas antioxidantes y existencia de posibles
efectos sinérgicos), los procesos de oxidación y la diversidad de matrices que requieren
ser evaluadas.

[Link]. Reacciones SET y reacciones HAT

Los ensayos para determinar la capacidad antioxidante in vitro se pueden clasificar, en
dos categorías sobre la base de las reacciones químicas implicadas: ensayos basados en
reacciones de transferencia de átomos de hidrógeno (HAT, del inglés Hydrogen Atom
Transfer) y ensayos basados en reacciones de transferencia de electrones (SET, del
inglés Single Electron Transfer) [122, 124].
En las reacciones SET se da la transferencia de un electrón para reducir un compuesto,
incluyendo metales, carbonilos y radicales. La reactividad relativa de un antioxidante
que involucra este tipo de reacciones está basada fundamentalmente en la
desprotonación y, por consiguiente, está gobernada por el potencial de ionización (PI),
[125] de manera que los valores disminuyen con el aumento del pH, reflejando un
incremento en la capacidad electrodonador con la desprotonación.
Las reacciones HAT miden la capacidad de un antioxidante para estabilizar un RL
mediante la transferencia de átomos de hidrógeno. La reactividad depende de la energía
de disociación del enlace del grupo que contiene el hidrógeno a transferir. Ciertos
aspectos estructurales como la presencia de un grupo hidroxilo en posición orto o la
posible formación de enlaces intermoleculares entre distintos sustituyentes, pueden
contribuir a reducir la entalpía de disociación facilitando la formación de un radical
estable. Estas reacciones son rápidas e independientes del pH y del disolvente, pero son
sensibles a la presencia de metales y agentes reductores, pudiendo generar una aparente
mayor reactividad del antioxidante. El disolvente puede ejercer una marcada influencia
en métodos como el ORAC y el ABTS [126].

Reacciones
Método o Ensayo Siglas
Implicadas
Poder de Reducción Antioxidante del Hierro FRAP
SET Capacidad Antioxidante Reductor de Ión Cúprico CUPRAC
N,N-dimetil-p-fenilendiamina DMPD
HAT Capacidad de Absorción del Radical Oxígeno ORAC

19
Capítulo 1

Parámetro Antioxidante de Captura de Radicales TRAP

Oxidación de la Crocina CBA
Especies Reactivas del Ácido Tiobarbitúrico TBARS
Capacidad de Eliminación Total de Oxi-radicales TOSC
Inhibición de la Oxidación de los Lípidos de Baja Densidad LDL's
Desoxirribosa -
Xantina Oxidasa -
Ácido 2,2'-azino-bis-3-etilbenzotiazolín-6-sulfónico ABTS
SET y HAT Capacidad Antioxidante Equivalente en Trolox TEAC
1,1-difenil-2-picrilhidrazilo DPPH

Tabla 2. Clasificación de los ensayos de actividad antioxidante.

Así pues, los métodos basados en reacciones SET hacen referencia a la reacción redox
del antioxidante como indicador del punto final del ensayo, mientras que la mayoría de
los métodos que responden a un mecanismo HAT consisten en la monitorización de una
cinética competitiva entre, generalmente, un generador de RL sintético, un compuesto
molecular fácilmente oxidable y el respectivo antioxidante objeto del estudio. De una u
otra manera, las metodologías basadas en ambos tipos de reacciones fueron
desarrolladas para determinar la capacidad de captura radical, no así la capacidad
antioxidante preventiva que pueda poseer cierta muestra.
A continuación, se describen brevemente los principales métodos utilizados en la
determinación de la capacidad antioxidante en base a sus mecanismos de reacción: SET,
HAT, o ambos.

20
 Capítulo 1

[Link].1. Métodos antioxidantes que utilizan mecanismos SET

[Link].1.1. FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power)
Metodología basada en la reducción del complejo de la tripiridiltriazina (TPTZ) férrica
al complejo ferroso por la acción de un antioxidante en medio ácido.[127] La reacción
provoca un cambio de intensidad de color proporcional a la actividad reductora de la
muestra antioxidante que se monitoriza midiendo la absorbancia a 595 nm durante 30
minutos.[128] Los resultados se expresan en equivalente de Trolox (ácido 6-hidroxi-
2,5,7,8-tetrametil-cromán-2carboxílico) (μmol Trolox/g o μmol Trolox/L), análogo
hidrosoluble de la vitamina E, tras previa realización de la curva de calibrado del mismo.
La reducida aplicación del método responde a diversas críticas, entre las que destacan
el pH no fisiológico al que se realiza [124], el valor sobreestimado por la presencia de
cualquier compuesto donador de electrones, incluso sin propiedades antioxidantes, con
potencial redox inferior al del complejo Fe(III)-TPTZ a Fe(II)-TPTZ (ERed = 0.77
V),[124] o bien, que exista absorción a 573 nm por parte de compuestos antioxidantes
como la bilirrubina oxidasa.[129] Asimismo, hay compuestos como el ácido ascórbico
que, además de reducir el ion férrico a ferroso, pueden reaccionar con éste último para
generar nuevos radicales libres.[129]
Finalmente, dado que el FRAP se define como una medida del poder antioxidante total,
incluye indistintamente sustancias reductoras y antioxidantes. Sin embargo, dicho
ensayo no implica a ningún oxidante ni a ningún sustrato oxidable. De igual forma que
ciertos reductores que transforman el ión Fe(II) a ión Fe(III) no son antioxidantes, hay
antioxidantes que no pueden llevar a cabo esta reacción, como el glutatión (GSH), un
importante antioxidante natural que da resultados negativos en el ensayo FRAP.[130]

[Link].1.2. CUPRAC (Cupric Reducing Antioxidant Capacity)

El método CUPRAC es una variante del FRAP usando cobre en lugar de hierro [131].
El ensayo se basa en la reducción de Cu(II) a Cu(I) por la acción combinada de los
antioxidantes presentes en la muestra. La molécula neocuproína forma un complejo con
el Cu(I), el cual absorbe a 450 nm. La medida de absorbancia de la muestra antioxidante
analizada se convierte a equivalentes de ácido úrico o de Trolox mediante curvas de
calibrado con estándares. El potencial redox del cobre es más bajo que el del hierro, lo
que se traduce en reacciones más selectivas: azúcares y ácidos cítricos, que interfieren
en el ensayo FRAP, no son oxidados en el ensayo CUPRAC. No obstante, para
potenciales redox bajos se incrementa el ciclo redox, así que la reducción de cobre puede
ser un indicador incluso más sensible del potencial de la actividad oxidante de los
antioxidantes [122].

21
Capítulo 1

[Link].1.3. DMPD (N,N-Dimethylphenylenediamine Dihydrochloride)

Requiere de un radical libre, DMPD•+, generado a partir de diclorhidrato de
N,Ndimetilfenilendiamina (DMPD) que, en presencia de una disolución oxidante de
cloruro férrico y a pH ácido, se convierte en un radical catiónico coloreado y estable, el
cual presenta un máximo de absorbancia a 505 nm. La monitorización del descenso de
la absorbancia durante 10 minutos tras la adición sobre la disolución del radical de una
determinada muestra antioxidante, y tras comparación con la de un blanco, es indicativa
de la actividad antioxidante del mismo, expresándose los resultados en equivalentes de
Trolox.[132]

[Link].2. Métodos antioxidantes que utilizan mecanismos HAT

[Link].2.1. ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity)
Se determina la capacidad de captación del radical peroxilo, generado a partir de la
molécula orgánica dihidrocloruro de 2,2'-azo-bis-(2-amidinopropano) (AAPH). El
radical ataca a la molécula de fluoresceína oxidándola; la molécula oxidada no emite
fluorescencia y, por consiguiente, se observa un descenso de la misma. Los
antioxidantes reaccionan con los radicales peroxilo, y la capacidad antioxidante se
obtiene comparando el descenso en la fluorescencia producido en presencia y ausencia
del antioxidante [133]. La cinética de la reacción puede sufrir variaciones en función de
la concentración de antioxidante, hecho que limita su aplicación.

[Link].2.2. TRAP (Total Radical-Trapping Antioxidant Parameter)

El ensayo TRAP, al igual que sucede el ORAC, determina la captación del radical
peroxilo, en este caso generado a partir de la molécula 2,2'-azo-bis-(2amidipropropano)
(ABAP). En una etapa inicial, la oxidación es inhibida por el antioxidante durante un
cierto periodo de tiempo (periodo de inducción). La capacidad de captación se mide
comparando la duración de dicho periodo en la muestra y en el Trolox utilizado como
referencia [134]. Su aplicación también se ve limitada por inconvenientes como la
existencia de distintos puntos finales de medida establecidos por distintos autores,
dificultándose la comparación de resultados, y el hecho de que no todos los
antioxidantes poseen un periodo de inducción claramente establecido [124, 135].

[Link].2.3. CBA (Crocin Bleaching Assay)

Consiste en la oxidación (decoloración) de la crocina, un derivado natural de
carotenoides, por radicales peroxilo generados a partir del AAPH. La actividad
antioxidante se obtiene de la medida de la tasa de decoloración de la crocina en

22
 Capítulo 1

presencia y en ausencia de antioxidantes a 443 nm. Los resultados se expresan en

equivalentes de Trolox [136].
Al igual con los ensayos anteriores, se han planteado diversas críticas del método [129,
122, 124]. La crocina es una mezcla de pigmentos naturales extraídos del azafrán que
presenta una gran variabilidad entre distintos lotes, lo que limita su aplicación a gran
escala. La coincidencia de la longitud de onda a la que se mide con la de muchos
pigmentos alimentarios como los propios carotenoides, así como la alta variabilidad de
los mecanismos de reacción entre la crocina y los diferentes antioxidantes, dificulta en
exceso la interpretación de los resultados, aunque se ha propuesto una estandarización
del método [136].

[Link].2.4. TBARS (Tiobarbituric Acid Reactive Substances)

Se mide la absorbancia a 532 nm de un complejo formado entre el ácido tiobarbitúrico
(TBA) y el ácido malondialdehído (MDA), siendo éste último un producto secundario
de la oxidación lipídica. La presencia de antioxidantes con elevada actividad se asocia
con una menor cantidad generada de MDA y, por consiguiente, con una menor
absorbancia [137]. El MDA puede reaccionar con otros compuestos presentes en la
muestra provocando interferencias en la medida de absorbancia asociada a los
compuestos antioxidantes [138].

[Link].2.5. TOSC (Total Oxyradical Scavenging Capacity)

Se basa en la oxidación del ácido α-ceto-γ-metilbutírico (KMBA) a etileno por la acción
de radicales hidroxilo, peroxilo y peroxinitrito generados a partir del 2,2'-azobis(2-
amidopropane) o ABAP. Se analiza la formación de etileno por cromatografía de gases
y se cuantifica el área bajo la curva que define la inhibición de la formación de etileno
por la presencia de antioxidantes en función del tiempo, comparada con la obtenida para
un patrón, que puede ser Trolox [139, 140]. No obstante, existen dificultades a la hora
de establecer comparaciones entre los resultados debido a que cinética de la reacción no
tiene una relación dosis-respuesta establecida entre la cantidad de antioxidante utilizada
y el porcentaje de inhibición.

[Link].2.6. LDL’s (Low Density Lipoprotein)

La oxidación de las lipoproteínas LDL por los RL es un proceso que ocurre en los seres
vivos, que constituye una de las primeras etapas de la aterosclerosis. En este método se
induce la oxidación de LDL aisladas de distintos individuos mediante diferentes
especies como Cu(II) o AAPH, midiéndose la absorbancia a la longitud de onda 234 nm
a la cual absorben los dienos conjugados generados durante el proceso [141]. La
23
Capítulo 1

modificación de la absorbancia con el tiempo está constituida por un periodo de

inducción, en la que los dienos no se han comenzado a formar por la presencia de
antioxidantes en la muestra y la absorbancia no varía, una fase de propagación, en la
que la absorbancia aumenta de manera exponencial por la formación de dienos, y una
fase final de descomposición, en la que la absorbancia tiende a bajar lentamente. Los
resultados del ensayo se pueden expresar a través de varios parámetros de medida, desde
la comparación de la duración del periodo de inducción entre un blanco y la muestra
antioxidante, la cantidad inicial de dienos conjugados, su cantidad máxima [142] o el
parámetro CLT50, que mide la cantidad de antioxidante necesaria para aumentar el
periodo de inducción en un 50 % respecto al control [143].

[Link].2.7. Ensayo de la Desoxirribosa

Se determina la capacidad de captura de radicales hidroxilo, generados por reacción de
peróxido de hidrógeno con un complejo de hierro(II)-AEDT, previamente obtenido del
complejo de hierro(III) por reducción con ácido ascórbico:
Fe (III)-AEDT + ASC Fe (II)-AEDT + ASC oxidado
Fe (II)-AEDT + H2O2 Fe (III)-AEDT + OH + OH–
La desoxirribosa (DR) capta el radical generado para formar un cromógeno rosa, tras el
calentamiento con ácido tiobarbitúrico a pH bajo.
OH + DR Fragmento + MDA
2 TBA + MDA Cromógeno
Los antioxidantes que actúan como “atrapadores” (“scavengers”) de radicales, compiten
con la desoxirribosa por los radicales hidroxilo, disminuyendo la formación de
cromógeno y por tanto, la absorbancia a λ=533 nm [144]. Se sugiere que el ensayo de
la desoxirribosa es una alternativa sencilla y barata para la determinación de constantes
de velocidad, aplicable en la mayoría de las moléculas biológicas susceptibles de
interaccionar con radicales hidroxilo.

[Link].2.8. Ensayo de la Xantina Oxidasa

La xantina oxidasa es una de las principales fuentes de ROS en los seres vivos. Es una
deshidrogenasa que transfiere el electrón al NAD (nicotinamida adenina dinucleótido),
oxidando la xantina o la hipoxantina a ácido úrico [145]. Sin embargo, en condiciones
de estrés oxidativo se transforma en una oxidasa por proteólisis limitada reaccionando
en este caso con el oxígeno, en lugar de con el NAD, y produciendo superóxido y
peróxido de hidrógeno. La capacidad de captura del ion superóxido que presentan

24
 Capítulo 1

muchos antioxidantes, se mide a partir de la inhibición de este radical a través del

sistema hipoxantina/xantina [146], expresando los resultados en porcentaje de
inhibición de la actividad enzimática, a partir de los cambios producidos en la
absorbancia a λ=295 nm, tras la adición de la muestra de antioxidante y comparados
con los producidos en presencia de un blanco.
Recientemente, se han desarrollado modificaciones del método en las que la reacción
no se monitoriza mediante la medida de cambios en la absorbancia, sino por
cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) [147], o bien, determinándose la
evolución en la formación de ácido úrico [148].

[Link].3. Métodos antioxidantes que utilizan mecanismos SET y HAT

[Link].3.1. ABTS (2,2’-Azino-Bis-3-Ethylbenzothiazoline-6-Sulphonic Acid - Ácido
2,2'-azino-bis-3-etilbenzotiazolín-6-sulfónico)
El ABTS se utiliza comúnmente como sustrato con peróxido de hidrógeno para una
enzima peroxidasa (como la peroxidasa de rábano picante) o con enzimas multi-cobre
oxidasa (como la bilirrubina oxidasa). Su uso permite el estudio de la cinética de
reacción de las peroxidasas. Esto también nos permite utilizar el ABTS para seguir
indirectamente la cinética de reacción de cualquier productor de peróxido de hidrógeno
o simplemente para cuantificar la cantidad de peróxido de hidrógeno que hay en una
muestra.
Los potenciales de reducción del ABTS son lo suficientemente altos como para que
actúe como un donador de electrones en la reducción de especies como oxígeno
molecular y peróxido de hidrógeno, especialmente a valores de pH menos extremos,
donde se dan las catálisis biológicas.

[Link].3.2. TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity - Capacidad Antioxidante

Equivalente en Trolox)
En el ensayo TEAC está basado en la capacidad de los antioxidantes para capturar el
catión radical ABTS. El ABTS se convierte a su catión radical mediante la adición de
persulfato de sodio. Este radical posee una coloración azul/verdosa, con un máximo de
absorción a λ=415 nm y una serie de máximos secundarios a λ=645, 660, 734, 815 y
820 nm [143]. El catión radical ABTS + es reactivo frente a la mayoría de los
antioxidantes fenólicos, incluyendo tioles y vitamina C. Durante esta reacción, el catión
radical, de color azul, pasa a convertirse de nuevo a su forma neutra, incoloro. La
reacción es monitorizada por espectrofotometría. La reactividad de los diversos
antioxidantes se compara con la del Trolox, que es un análogo de la Vitamina E, soluble
en agua.
25
Capítulo 1

Dependiendo de la variante del método TEAC que se utilice, se emplean distintas

longitudes de onda, siendo las más frecuentes 415 nm y 734 nm [118]. En el desarrollo
del método se suelen emplear dos estrategias: inhibición y decoloración.
En la inhibición, los antioxidantes se añaden previamente a la generación del radical
ABTS + y lo que se determina es la inhibición de la formación del radical, que se traduce
en un retraso en la aparición de la coloración azul verdoso.
En la segunda decoloración, los antioxidantes se añaden una vez se ha formado el
ABTS + y se determina entonces la disminución de la absorbancia debida a la reducción
del radical, es decir, la decoloración de éste.
El ensayo TEAC presenta además variaciones en el modo mediante el cual se genera el
radical catión ABTS +, que puede ser: de manera enzimática (con mioglobina o
peroxidasa de rábano), químicamente (con MnO2, K2S2O8 o radical peróxido O22–), o
bien, electroquímicamente [149].
En el método original [150] se generaba el radical directamente en presencia del
antioxidante, con metamiglobina y peróxido de hidrógeno que oxidaba a la
metamioglobina, y esta a su vez oxidaba el ABTS. Sin embargo, se observó que
determinados polifenoles como la quercetina podían interaccionar con los reactivos
impidiendo la formación del radical y dando un valor de capacidad antioxidante
sobreestimado, por lo que se pasó a generar el radical antes de la adición del antioxidante
[151]. El descenso producido por el Trolox, empleado como patrón, es comparado con
el producido en el mismo periodo de tiempo por el antioxidante analizando [149].
Aun así, se han planteado ciertas críticas a esta modificación, en el sentido de que los
polifenoles, además de reaccionar con el radical para dar lugar a la molécula original,
pueden dar lugar a otros compuestos, generando de esta forma problemas a la hora de
determinar la estequiometría de la reacción entre el ABTS y el antioxidante, o bien,
relaciones de estructura-actividad, puesto que el cálculo no se podría basar en los moles
de molécula no radicálica [152, 153]. También puede ocurrir que los compuestos
polifenólicos formen aductos con el radical, por lo que no toda la pérdida de absorbancia
se debería a que el radical volviera a su forma inicial, lo que se ha observado al someter
a este tipo de ensayo la catequina [153].

[Link].3.3. DPPH (1,1-Difenil-2-Picrilhidrazilo)

En el año 1958, Marsden Blois demostró por primera vez la capacidad del radical libre
DPPH para aceptar un átomo de hidrógeno proveniente de una molécula de cisteína
[154]. En la actualidad, se emplea principalmente el protocolo de ensayo propuesto en
el año 1995 por Williams y sus colaboradores [155].

26
 Capítulo 1

El 1,1-difenil-2-picrilhidrazilo (DPPH), es una molécula comercial de origen sintético

y uno de los pocos radicales orgánicos con átomos de nitrógeno en su estructura, que
presenta estabilidad, la cual es debida a la deslocalización de un electrón desapareado
sobre la molécula, y por tanto, a diferencia de la mayoría de los radicales libres, no sufre
proceso de dimerización. La deslocalización del electrón, provoca además una
intensificación en el ya de por sí intenso color violáceo característico del radical, que
disuelto en medio metanólico, absorbe a una λ=515 nm. En presencia de un antioxidante
que puede donar o transferirle un átomo de hidrógeno, oxidándose y reduciendo de esta
forma el DPPH, la coloración violácea de la disolución se atenúa, dando paso a su
forma reducida (DPHP-H) de color amarillento.
En un principio, se creyó que este ensayo involucraba una reacción HAT, sin embargo,
tras investigarse el mecanismo de reacción, se ha visto que la reacción que tiene lugar
se corresponde con un mecanismo SET [156]. Se ha determinado que el proceso de
reacción del DPPH con antioxidantes polifenólicos, ocurre en dos etapas:
- En una primera etapa, se da una transferencia electrónica de un anión fenóxido al
DPPH. Es un proceso rápido, y es la etapa determinante de la velocidad de la reacción.
- En una segunda etapa, el radical nitrogenado sustrae el átomo de hidrógeno al
antioxidante fenólico. Es un proceso que se da más despacio en disolventes con enlaces
fuertes, capaces de aceptar hidrógenos, como son el etanol y el metanol, siendo este
último, el disolvente que se suele emplear en los ensayos.
Además, los autores indicaron que la aparición de ácidos o bases presentes como
contaminantes en el disolvente, pueden influenciar drásticamente el equilibrio de
ionización de fenoles, alterando así los valores de la constante de velocidad de la
reacción [157]. Es por esto que la reacción de estabilización del radical transcurre
principalmente mediante un mecanismo SET, con un ligero aporte de un mecanismo
HAT con metanol como disolvente [129].
En este ensayo, un simple seguimiento de la disminución de absorbancia asociado al
proceso de interacción entre el antioxidante y el radical DPPH permite evaluar
eficazmente la actividad antioxidante del mismo. Pese a que existen diversas propuestas
a la hora de presentar los resultados, la mayoría de los estudios coinciden en el uso del
parámetro “EC50” o “Concentración Efectiva”, y cuyo significado se corresponde con
la cantidad de antioxidante requerida para disminuir en un 50% la concentración inicial
del radical en el estado estacionario. Para simplificar los términos, es preferible expresar
los datos como “1/EC50” o “Poder Antirradical” (ARP, del inglés Anti-Radical Power).
Las ventajas principales que presenta este método, son la simplicidad y disponibilidad
instrumental, características determinantes que establecen este método como prueba
habitual en la determinación de la eficacia antirradicálica de multitud de compuestos

27
Capítulo 1

aislados y extractos de naturaleza y origen variado (vinos, zumos, compuestos

polifenólicos, etc.).
Sin embargo, el ensayo DPPH presenta algunas desventajas que limitan, en cierta
manera, su aplicación. Los altos potenciales que poseen los monómeros de la anilina y
del pirrol, se relacionan con una mayor dificultad para interaccionar con radicales
DPPH [158], lo que significa que dicho ensayo es válido sólo para compuestos
termodinámicamente capaces de reaccionar con él, es decir, aquellos que poseen un
potencial de oxidación inferior al potencial formal de reducción del radical DPPH
(0,340 V frente al electrodo de Ag/AgCl a pH 7.0). Sin embargo, otros radicales menos
estables y de interés biológico, como el radical peroxilo o hidroxilo, muestran
potenciales formales de reducción superiores [159] y pueden reaccionar normalmente
con un mecanismo de reacción diferente, con especies que presenten potenciales de
oxidación bajos, impidiendo de este modo la viabilidad del ensayo.
La diferencia de estabilidad entre el radical DPPH y el radical ROO, altamente reactivo
frente a antioxidantes, se refleja en la cinética lenta de la interacción, de manera que
algunos antioxidantes concretos resultan inertes frente al DPPH. Existen algunos
métodos acertados para el estudio de ROS, tales como el ensayo fluorimétrico para el
H2O2, los métodos RSE/RPE (resonancia de spin electrónico y resonancia
paramagnética electrónica respectivamente), etc. [160-164]
Además, como la longitud de onda utilizada en este método, se encuentra próxima a la
región visible, la capacidad antioxidante de la muestra puede ser subestimada debido a
la interferencia de compuestos como los carotenoides u otros compuestos presentes en
la muestra que también absorben en la región próxima del radical [122].
Otras desventajas adicionales son el impedimento estérico en las moléculas con mayor
peso molecular [165], y la relación no lineal existente entre la concentración de
antioxidante y la cinética de reacción asociada a la interacción con el DPPH [166], por
lo que resulta un tanto arbitrario medir la capacidad antioxidante mediante el uso del
parámetro EC50.
Finalmente, hay que tener en cuenta casos como el del isoeugenol y fenoles con una
estructura similar (o-metoxifenoles), que reaccionan de forma reversible con el DPPH
[167], ocasionando lecturas de capacidad antioxidante bajas en aquellas muestras que
los contienen, restando validez a dichos resultados.

[Link].4. Técnicas Electroquímicas

En los últimos años, los métodos espectrofotométricos han adquirido cierta repercusión
en el análisis in vitro de la capacidad antioxidante de muestras biológicas y extractos
vegetales. La sencillez y el bajo coste asociado al ensayo de captura radical DPPH lo

28
 Capítulo 1

destaca como una de las metodologías más empleadas en este campo. Sin embargo, de
manera aún más reciente, el empleo de diversas técnicas electroquímicas ha demostrado
ser una alternativa válida para llevar a cabo la evaluación del poder antioxidante de
diferentes muestras con similares ventajas al ensayo DPPH en cuanto a sencillez y bajo
coste de los análisis, pero extremadamente más rápidas [168]. En general, los
compuestos antioxidantes actúan como agentes reductores y, en disolución, tienden a
ser fácilmente oxidados sobre la superficie de un electrodo. En base a este hecho, se
establece una relación intrínseca entre el comportamiento electroquímico del compuesto
antioxidante y su consiguiente actividad antioxidante [168, 169].
Se han propuesto métodos directos e indirectos para evaluar la actividad antioxidante
de productos naturales [161]. Las medidas electroquímicas son una prueba rápida para
estimar la capacidad antioxidante de un gran número de moléculas orgánicas [168-172],
posibilitándose así el análisis de la interacción entre el antioxidante y las ROS. Los
análisis electroquímicos permiten correlacionar potenciales de oxidación, intensidad de
corriente u otros parámetros electroquímicos como el potencial de onda media, con la
capacidad antioxidante, mostrándose más selectivos y sensibles que los métodos
espectrométricos [168, 171] y más reproducibles que los análisis biológicos para la
evaluación del poder antioxidante. La sensibilidad, selectividad y reproducibilidad del
método varía en cuanto a los distintos tipos de electrodos que pueden ser empleados en
los análisis. En algunos casos, la gran capacidad de adsorción de las especies objeto de
estudio, puede llegar a comprometer la respuesta del electrodo de trabajo empleado.
Recientemente se ha utilizado la voltametría cíclica para la evaluación de la actividad
antioxidante [169, 173-175]. Resulta una técnica acertada en el estudio de compuestos
antioxidantes de manera individualizada, pero cuando se aplica a mezclas complejas no
permite la determinación específica de cada compuesto, sino que aporta información
valiosa en cuanto a la cantidad de grupos funcionales diferentes responsables de cada
pico registrado [168, 172]
Se han utilizado los potenciales de oxidación de los picos obtenidos en voltametría
cíclica para comparar actividades antioxidantes de diversos compuestos tales como
ácidos fenólicos, flavonoides, ácidos cinámicos, etc. [175,176] empleando electrodos
de carbón vitrificado (GCE). La voltametría cíclica resulta especialmente adecuada
debido a su simplicidad instrumental y de preparación de muestras, rapidez y,
fundamentalmente, a la posibilidad tanto de analizar capacidades antioxidantes en
mezclas sin necesidad de medir la actividad específica de cada componente, como de
poder ser utilizado directamente sobre muestras biológicas [93, 94, 177], siempre con
sensibilidades superiores a las requeridas para las concentraciones de antioxidantes
fisiológicas. Una limitación de la técnica es que requiere que el antioxidante sea inactivo
en el rango de potenciales donde ocurre la reducción del oxígeno en las condiciones
experimentales utilizadas [178]. Además, cuando hay antioxidantes cuyos potenciales

29
Capítulo 1

de oxidación difieren en más de 80-120 mV (dependiendo de la reversibilidad de los

procesos) aparecen dos o más señales, por lo que es muy arbitraria la asignación de
carácter antioxidante. No obstante, es una buena aproximación a la capacidad
antioxidante de compuestos individuales [166].
El estudio electroquímico de la capacidad antioxidante de distintas especies se ha
desarrollado ampliamente utilizando electrodos de mercurio [179, 180]. La reacción de
oxidación anódica del peróxido de hidrógeno se usa como fuente de ROS, y se emplea
para la evaluación de la capacidad antioxidante de compuestos fenólicos, vinos, bebidas
alcohólicas fuertes o cervezas [181-186]. La ventaja que presenta este método es que el
H2O2 es muy estable en células, en comparación con otros ROS que necesitan ser
producidos “in vivo”. El uso de la polarografía para la electroxidación de peróxido de
hidrógeno, con la consiguiente formación de radicales peróxido, permite registrar la
corriente de oxidación de dicha reacción [183]. La disminución de la corriente de
oxidación en presencia de un antioxidante se utiliza para determinar la capacidad
antioxidante.
Sužnjević y sus colaboradores, utilizaron la intensidad de pico de un máximo
polarográfico para medir la corriente de oxidación [183-186]. El origen del máximo se
debe a menudo al aumento en el transporte de las especies electroactivas hacia el
electrodo por movimientos en la disolución, de modo que la intensidad de pico depende
de las condiciones hidrodinámicas. Como resultado, la cantidad de especies
electroactivas que alcanzan el electrodo es mayor que la transportada por difusión.
Desafortunadamente, la intensidad del máximo se modifica por la presencia de especies
superficialmente activas, como ciertos disolventes orgánicos. De hecho, el electrodo de
Hg es muy sensible a cambios en la concentración de disolventes orgánicos, los cuales
se utilizan en muchos casos para eliminar los máximos polarográficos debido a procesos
que ocurren en la fase adsorbida.
Algunos antioxidantes estudiados mediante oxidación polarográfica y voltamétrica del
peróxido de hidrógeno sobre electrodos de mercurio han sido: la 3–hidroxicumarina, el
carvacrol, la vainillina y el ácido gálico. El mecanismo ocurre por formación de los
radicales superóxidos e hidroperóxido:
+ –
H2O2  H + HO2
–
HO2  HO2 + e–
– +
HO2  O2  + H
–
O2   O2 + e–
Para la interacción entre los radicales formados y los antioxidantes, los resultados
experimentales concuerdan con las predicciones teóricas, por lo que se propuso un

30
 Capítulo 1

parámetro cinético para evaluar la actividad de captación de radicales por parte de los
antioxidantes [179].
Por otro lado Kituchi y Murayama [187] propusieron en 1976 que la onda anódica se
debe a la oxidación de Hg a Hg2+ con la posterior formación de un complejo mixto con
iones HO2‾ y OH ‾:

Hg  Hg2+ + 2e–
– –
Hg2+ + HO2 + HO  Hg (HO2) (HO)
El mecanismo fue revisado por Sužnjević, quien lo verificó por valoración con HgCl 2
[181, 183]. Pero si estas reacciones fuesen los únicos procesos que se diesen en el
electrodo, la adición de un antioxidante no tendría ningún efecto sobre la onda de
oxidación, ya que éstos no reaccionan con el ion Hg2+ en ausencia de peróxido de
hidrógeno [180]. Además, tampoco se da la reacción de los antioxidantes con los iones
HO2‾ y OH‾, por lo que hay que considerar reacciones adicionales:
1 2+
(1) Hg  Hg2 + 2e–
2
1 2+ 2+
(2) 2
Hg2 e- Hg
1 2+ 2+
(2’) 2
Hg2 HO2– Hg + HO2
– –
(3) Hg2+ + HO2 + HO  Hg (HO2) (HO)
En ausencia de antioxidantes, la reacción (2’) tiene solo lugar a nivel de trazas. Cuando
se añade un atrapador de radicales, reacciona con el radical hidroperóxido producido en
la reacción (2’) y disminuye la concentración disponible de Hg (I), disminuyendo a su
vez la concentración de Hg (II), por lo que la corriente anódica disminuye [180]. El
radical hidroperóxido formado reacciona de forma diferente con los distintos
antioxidantes, y esto permite proponer un parámetro relacionado con la capacidad de
reacción entre los distintos antioxidantes y los radicales libres; dicho parámetro estará
relacionado con la disminución del área de pico de oxidación en voltametría de pulso
diferencial [188].

1.4. Técnicas Cromatográficas en el estudio de la composición de extractos de tés,

infusiones y especias: componentes principales y antioxidantes
El té es la segunda bebida más consumida en el mundo, sobrepasando su popularidad
tan sólo el agua [189]. Este hecho, ha llevado a una amplia investigación en cuanto a su
composición y sus propiedades, determinándose que los principales compuestos que se
encuentran en los extractos son: catequinas, ácidos oxiaromáticos, flavonoles,

31
Capítulo 1

teaflavinas, teagallinas, terubiginas, pigmentos, alcaloides, azúcares, aminoácidos,

vitaminas, ácidos dibásicos, lignanos y saponinas triterpenoides [190]. De entre todos
ellos, hay que destacar el conjunto de polifenoles totales, el ácido gálico y la cafeína (o
teína), como los principales componentes de los extractos que se obtienen de cualquier
tipo de té, por ejemplo [191]:
Contenido mg/g de té seco
Tipo de Té Polifenoles Totales Ácido Gálico Cafeína
Té Verde Meifoo 112.50 0.74 26.8
Té Oolong Fujian 40.89 1.42 7.44
Té Negro Fujian 15.31 2.06 21.60
Té Pu-erh 12.78 5.53 22.40

En el estudio de las composiciones se han empleado diversos tipos de técnicas

cromatográficas, así como diferentes métodos de extracción [190-192] y tipos de
extractantes [193] siendo el más común el agua. También se han realizado estudios en
cuanto a la composición de aceites esenciales de té [194] y otros tipos de hierbas.
En la actualidad, se está prestando especial atención a la capacidad antioxidante de los
alimentos y a la relación con su composición, y por supuesto, dada la extensión del
consumo de té, este es uno de los principales objetivos de estudio [193, 195-197]. La
mayor parte de estas investigaciones, se centran en el alto contenido en polifenoles que
presentan los tés, siendo los más característicos las epicatequinas, los epicatequin-
galatos, las epigalocatequinas y los epigalocatequin-galatos [198, 199], empleándose
técnicas como HPLC con detector de fotodiodos para muestras homogenizadas en
nitrógeno líquido y liofilizadas para después realizar una extracción con metanol o
HPLC acoplada a espectrometría de masas.
Las infusiones, son bebidas cuya preparación consiste en añadir una serie de hojas,
flores, frutos o semillas de diversas hierbas y/o plantas a agua cercana al punto de
ebullición, para llevar a cabo la extracción de sus nutrientes, e ingerirlos así. Son un tipo
de bebidas cuyo consumo también se encuentra muy extendido en el mundo debido a
su gran variedad y las diferentes propiedades de cada una de ellas.
De este tipo de plantas, sin embargo, al contrario que con el té, el formato más estudiado
es el de aceites esenciales. En este caso, los compuestos más representativos para las
infusiones que se han estudiado como aceites esenciales, han sido:
- Para la Manzanilla [200, 201]: β-Farneseno (1.23%), Espatulenol (1.32 %), Óxido de
Bisabolol B (6.57%), Óxido de Bisabolol A (53.59%), Óxido de Bisabolona (29.86%),
Chamazuleno (2.27%).

32
 Capítulo 1

- Para la Menta [202]: cis-epóxido de piperitona (7.8-77.6%), óxido de piperitenona

(1.5-49.1%), carvona (0.0-21.5%), pulegona (0.3-5.4%), mentona (0.0-16,6%), timol
(1.5-4.2%), β-tuyona (0.2-3.2%), carvacrol (0.0-2.7%), y (E)-cariofileno (0.9-2.5%),
mirceno (0.3-2.5%), carvacrol (0.0-2.7%), borneol (0.9-1.8%), y p cimeno (0.2-1.9%).
- Para el Rooibos [203]: 99 compuestos están presentes en el aceite volátil del té de
rooibos. Los componentes principales son: guayacol (24.0%), 6-metil-3,5-heptadien-2-
un isómero (5.2%), damascenona (5.0%), geranilacetona (4.2%), alcohol β-feniletilo
(4.1%) y 6-metil-5-hepten-2-ona (4.0%).
- Para la Salvia [204]: α-tujona (18-43%), β-tujona (3-8.5%), alcanfor (4.5-24.5%), 1,8-
cineol (5.5-13%), humeleno (0-12%), α- pineno (1-6.5%), canfeno (1.5-7%), limoneno
(0.5-3%), linalool (libre y esterificado (1% como máximo)) y acetato de bornilo (2.5%
como máximo).
- Para la Tila [205]: las flores contienen polisacáridos mucilaginosos (3%), taninos (2%)
y flavonoides (1%), siendo el principal flavonoide, la isoquercitrina. Las flores frescas
(con un rendimiento aproximado de 0.2 mg/g de aceite esencial) contienen alcanos
(52.1-59.9%), 2-feniletil-alcohol y sus ésteres (1.0-7.4%), geraniol (0.5-5.9%), eugenol
(1.0-2.5%), y cis-trans farnesol (0.3-1.6%).
Los métodos de estudio se han adaptado al carácter oleaginoso de las muestras,
empleándose extracción con CO2 supercrítico [206], cromatografía líquida
bidimensional [207] y cromatografía en fase reversa [208].
También se han estudiado estos aceites por sus propiedades antibacterianas [209],
antimicrobiales [210], insecticidas [211], antifúngicas [212] y por su capacidad
antioxidante (de especial interés en este trabajo), la cual varía incluso dentro del mismo
tipo de plantas [213-215]:

Capacidad Antioxidante DPPH IV50 (mg/mL)

Mentha Piperita chocolate mint 54.75
Mentha Piperita grapefruit mint 36.60
Mentha Aquatica lavander mint 6.75
Mentha Canadiensis Japanese mint 3.31
Mentha Spicata mentol mint 1.25
Mentha Australis 44.78

Sin embargo, estos aceites se corresponden con una fracción apolar, que dista mucho
del extracto en agua que se realiza de estas plantas cuando se preparan las bebidas
conocidas propiamente como infusiones, así los valores obtenidos no nos dan idea de
los nutrientes ni de la capacidad antioxidante de estas bebidas que ingerimos en la dieta.

33
Capítulo 1

Algo similar a lo que ocurre con las plantas utilizadas para la preparación de infusiones,
podemos observar con la gran mayoría de especias y condimentos, lo más estudiado son
los aceites esenciales y los extractos en metanol y/o etanol, así como diferentes
disolventes apolares [216-224]. En este caso, también debido a la gran cantidad de tipos
que existen, no es fácil comparar compuestos comunes, observándose de nuevo
variabilidad en la composición incluso dentro del mismo tipo de especia o condimento,
en función de su origen, método de extracción, época de recolección, etc. [223].
También para las especias se han estudiado las diferentes propiedades de estos aceites
esenciales, bien como agentes antifúngicos [218], antimicrobiológicos [219-221],
antibacteriana [224, 225] y su capacidad antioxidante [209, 217, 222] (que es para lo
que en ocasiones, se emplean los extractos acuosos).
Para este grupo de muestras, estudiadas también como aceites esenciales, los
compuestos más representativos que se han estudiado han sido:
- Albahaca [226]: el linalool es el componente más abundante (56.7-60.6%), seguido
del epi-α-cadinol (8.6-11.4%), α-bergamoteno (7.4-9.2%) y γ-cadineno (3.2-5.4%). Las
muestras recogidas en invierno son más ricos en monoterpenos oxigenados (68.9%),
mientras que las recogidas en verano contenían una mayor cantidad de hidrocarburos
sesquiterpénicos (24.3%).
- Canela [227, 228]: para la Cinnamomum zeylanicum Blume de Sri Lanka, se ha
determinado que el componente básico del aceite es el eugenol (74.9-79.8%), seguido
de β-cariofileno (4.1%), benzoato de bencilo (3.0%), linalool (0.14-2.5%), acetato de
eugenol (2.1%) y cinamil acetato (1.8%), safrol (1.3%), α-pineno (1.2%) y
cinamaldehído (1.1-16.25%). Mientras que para la Cinnamomum Burmanni, la
diferencia más llamativa en cuanto a la composición fue en el eugenol (17.62%) y el
cinamaldehído (60.17%).
- Clavo [229]: eugenol (76.8%), β-cariofileno (17.4%), α-humeleno (2.1%), y acetato
de eugenilo (1.2%) son los componentes principales del aceite esencial de clavo.
- Comino [230]: Cuminaldehído (36%), b-pineno (19.3%), p-cimeno (18.4%) y γ-
terpineno (15.3%) forman la principal fracción del aceite esencial de esta especia.
- Cúrcuma [231]: se han estudiado los aceites esenciales de rizomas secos de C.
Aromatica Salisb., C. Longa L. y C. Sichuanensis determinándose como principales
compuestos para la C. Aromatica el curcumol (35.77%) y 1,8-cineol (12.22%), para la
C. Longa la ar-turmerona (49.04%), el óxido de humuleno (16.59%) y el β-selineno
(10.18%), y para la C. Sichuanensis la ar-turmerona (43.52%), el β-selineno (13.36%)
y el δ-cadineno (13.22%).
- Jengibre [232]: el zingibereno (10.5-16.6%) es el principal constituyente de los aceites
esenciales del jengibre. En la variedad Majhauli, una de las que presenta mayor

34
 Capítulo 1

contenido en este compuesto, encontramos también e-citral (12.0%), z-citral (8.8%),

canfeno (7.6%) y ocimeno (6.5%).
- Nuez Moscada [233]: para el aceite esencial de nuez moscada, los componentes
principales son la miristicina (13.57%), safrol (4.28%), el 4-terpineol (13.92%),
terpinoleno (1.62%), α-terpineol (3.11%), linalool (0.75%), limoneno (5.57%) y α-
pineno (10.23%).
- Orégano [234]: los compuestos más abundantes son el γ-terpineno (7.9-12.7%), p-
cimeno (9.9%-10.1%), carvacrol (7.8%), y timol (63.3%-78%), que constituyen entre
93.7-96% del aceite.
- Romero [234]: el componente principal es el 1,8-cineol, que compone el 88.9% del
aceite esencial, también se encuentran α-pineno (2.7%), p-cimeno (0.7%), ocimeno
(0.7%), borneol (1.5%), α-terpineol (1.3%) y alcanfor (2.4%).
- Tomillo [234]: γ-terpineno (4.3%), p-cimeno (23.5%), carvacrol (2.2%) y timol
(63.6%), que juntos componen el 93.6% del aceite esencial.
La importancia del estudio de la composición de los extractos acuosos así como en
disolventes apolares, de las especias y condimentos, radica en que cuando se usan en la
cocina y en alimentación, no se suelen emplear en forma de aceites esenciales, sino
como hierbas aromáticas o en polvo, pudiendo extraerse diferentes compuestos en
función de cómo estén preparados los platos, si tienen una base acuosa, oleaginosa o
están cocinados con bebidas alcohólicas.

35
Capítulo 1

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45
Capítulo 1

Summary:
In our planet there is a large amount of oxygen and therefore in nature almost all
materials are oxidized. These redox reactions are very important because living
organisms obtain most of their energy from them, as in photosynthesis and aerobic
metabolism.
Although oxygen is essential for life, it can also be a source of disease through
uncontrolled production of free radicals among which are the reactive oxygen species
or ROS, which damage macromolecules (lipids, proteins, carbohydrates and nucleic
acids) and alter cellular processes (membrane function, production of enzymes, cellular
respiration, gene induction, etc.). These ROS can be radical or non-radical species. In
the radical species group can be found Superoxide ion, Hydroxyl, Hydroperoxyl,
Alkoxyl and Peroxyl. Non-radical ROS are Singlet Oxygen, Ozone and Hydrogen
Peroxide.
ROS are very small molecules highly reactive due to their unpaired electrons. These
species are formed naturally as by-product of the normal metabolism of oxygen and
have important roles in cell signaling. The oxidative stress is the exposure to various
sources of formation of free radicals that cause an alteration of the balance that must
exist between species or oxidizing factors and antioxidant by mechanisms to control
production and/or propagation of the radicals. This imbalance may be due to an abrupt
increase of oxidizing substances (mainly ROS), to a lack of antioxidants, or a
combination of both factors. In these circumstances, the cells are exposed to an
oxidizing environment, which generate adverse effects on the cellular redox state,
causing reversible or irreversible damage to all types of biomolecules, including
proteins, lipids, carbohydrates, nucleic acids (DNA) and components of the extracellular
matrix, and initiating a series of chemical reactions which can produce alterations in the
structure/function of organs, systems or specialized cell groups relationship, which is
directly associated with a growing number of syndromes of medical and social interest.
More than a hundred diseases are related to the redox imbalance: pathological processes
such as-Chester Erdheim, Alzheimer’s disease, Parkinson’s disease, Crohn’s disease,
many types of cancer, diabetes mellitus, cardiovascular diseases, atherosclerosis,
rheumatic processes, gastroenteric and bronchopulmonary diseases. Also physiological
processes such as aging, the damage caused by strenuous physical exercise, etc.
Much of the ROS play physiological roles of vital importance, but also are involved in
unwanted oxidation reactions, against which the body has developed certain
antioxidants defenses. The endogenous production of certain amounts of ROS under
normal conditions, without exceeding specific limits, is a normal and inevitable exempt
from the slightest oxidative damage thanks to the provision by the cell, which is
essential to the life of this cellular process to be a process involved in regulating

46
 Capítulo 1

metabolic and energy production, activation or inactivation of biomolecules, etc. and

has antioxidant mechanisms with which these combat cell damage. At the same time, a
considerable increase in the rate of formation of ROS with respect to the normal
conditions, generally result in a decrease in defense mechanisms, and in an imbalance
between the (now larger) antioxidant and oxidizing species. This implies a significant
oxidative damage on certain molecules reflected in their biological functions.
In contrast to ROS or free radicals, the antioxidants are substances, present in low
concentrations, which delay or prevent oxidation significantly of a substrate. Depending
on how they interact with the oxidizing agents, antioxidants may be:
- Primary antioxidants: they prevent the formation of free radicals, especially the ROS.
Vitamin E, some polyphenols such as Resveratrol or antioxidant enzymes. Thereby
indirectly they reduce DNA and membranes damage.
- Secondary antioxidants: they interrupt the propagation of free radicals (for example
Ascorbic Acid) or displace ROS (for example Carotenoids and Glutathione), by
inhibiting ROS generation, and preventing the metabolic activation of carcinogens. In
this group are the antioxidants denominated “Scavengers”.
- Tertiary antioxidants: they repair the damage caused by free radicals or eliminate
molecules that have been damaged by modifying the redox potential to improve DNA
repair. Examples are Vitamin C, some Polyphenols, Selenium and N-acetylcysteine.
In the human diet, there are numerous antioxidants of particular interest because of its
possible protective action against free radicals produced by oxidative stress. The
harmful effects of free radicals are controlled by a variety of antioxidants, such as
endogenous or body's own antioxidants (Coenzyme Q, Glutathione, Albumin,
Transferrin, Ceruloplasmin, Uric Acid, Thioctic Acid, Bilirubin...), exogenous
antioxidants or acquired through the diet (Vitamins E And C, Carotenoids, Flavonoids,
Squalene, Selenium, Phenolics...), antioxidant enzymes (Superoxide Dismutase (SOD),
Catalase, Glutathione Peroxidase, Lycopene...) and cofactors antioxidants (Copper,
Magnesium, Manganese, Selenium...).
The food industry seeks customer satisfaction by applying technical modifications to
consumer products, such as adding flavours and aromas that provide unique tastes and
smells, appreciated by consumers. The addition of flavourings is under continuous
observation and evaluation by the European Community (according to Council
Directive 88/388 / EEC) to ensure that consumption do not danger humans. A main
feature understudied in this "continuous observation" is the antioxidant capacity, an
important feature in preventing many diseases.
There is great interest in product research and antioxidants of natural origin against
those of synthetic origin. Some synthetic antioxidants are frequently used as food
47
Capítulo 1

additives in consumer products and are regulated by law, because of their possible toxic
effects when consumed in excess. It has been established a relationship of condiments
and spices with medical and physiological properties, highly interesting to society.
The determination of the antioxidant activity of pure compounds it is essential for the
knowledge of the protection against oxidation or deterioration of food with these
components. Antioxidants are usually found in different proportions, foods containing
mixtures of different antioxidants, each of them having a different activity, this making
the determination of the antioxidant activity a difficult task.
So, it is mandatory to acquire standardized unified methods that serve as a protocol for
the proper application of the tests, and that be able to compare results between food or
commercial products. It is required to comply with other requirements, the use of a
biologically relevant radical, the possibility of measurement in lipophilic and
hydrophilic media and a useful method for quality routine control of large volumes of
samples. In addition, the instrumentation should be easily accessible, with high
sensitivity, high reproducibility, simple, high speed and low cost, among others.
Actually, the most used methods for the antioxidant capacity determination are based
on two reaction types: Hydrogen Atom Transfer (HAT) and Single Electron Transfer
(SET). The SET methods are: Ferric Reducing Antioxidant Power (FRAP), Cupric
Reducing Antioxidant Capacity (CUPRAC) and N,N-Dimethylphenylenediamine
Dihydrochloride (DMPD). The HAT methods are: Oxygen Radical Absorbance
Capacity (ORAC), Total Radical-Trapping Antioxidant Parameter (TRAP), Crocin
Bleaching Assay (CBA), Tiobarbituric Acid Reactive Substances (TBARS), Total
Oxyradical Scavenging Capacity (TOSC), Low Density Lipoprotein (LDL’s),
Deoxyribose assay and Xanthine oxidase assay. There is another group more, where are
combined the HAT and the SET reactions, and the methods are: 2,2'-azino-bis(3-
ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid (ABTS), Trolox Equivalent Antioxidant
Capacity (TEAC) and 1,1-Diphenyl-2-Picrylhydrazyl (DPPH).
In recent years, the spectrophotometric methods have gained some impact on the in vitro
analysis of the antioxidant capacity of biological samples and plant extracts, with the
main advantages of simplicity, low cost, high speed, in addition to that the results are
similar to those obtained by the DPPH method.
In general, the antioxidants act as a reducing agents and, in solution, they tend to be
easily oxidized on the surface of an electrode. Based on this fact, an intrinsic relationship
between the electrochemical behaviour of the antioxidant activity of the compounds is
established.
Glassy Carbon Electrodes (GCE) have been used to determinate the antioxidant capacity
of many compounds using Cyclic Voltammetry. One limitation of the technique is that
it requires that the antioxidant compound must be inactive in the range of potential

48
 Capítulo 1

where oxygen reduction occurs. Furthermore there are antioxidants whose oxidation
potentials differ by more than 80 to 120 mV, so two or more signals appear. However,
it is a good approximation to the antioxidant capacity of individual compounds.
The electrochemical study of the antioxidant capacity of different species has been
widely developed using mercury electrodes and Differential Pulse Voltammetry (VPD)
for wines, hard liquors or beers samples. The advantage of this method is that H2O2 is
stable in cells, compared to other ROS that need to be produced "in vivo". The use of
polarography for the hydrogen peroxide electro-oxidation, with consequent formation
of peroxide radicals, is useful to record the oxidation current of this reaction. The
decreasing oxidation current in presence of an antioxidant is used to determine the
antioxidant capacity.
It has been shown that it is very important to know the antioxidant capacity of foods and
drinks, being also important the relation between this property and their composition.
For this reason, in this Thesis it has been decided to study the extracts in aqueous and
methanol media of some of the most popular teas, infusions and spices, using two of the
most extended analytical technics: High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
and Gas Cromatography-Mass Spectrum (GC-MS).

49
Capítulo 1

50
 CAPÍTULO II

NUEVOS MÉTODOS DE
MEDIDA ELECTROQUÍMICA
DE CAPACIDAD
ANTIOXIDANTE
 Capítulo 2

2.1. Introducción

Los primeros organismos vivos sobre la tierra proliferaron bajo condiciones

atmosféricas con poco oxígeno. Al aumentar la proporción de oxígeno, muchos de estos
organismos murieron y otros comenzaron a evolucionar y a desarrollar un sistema de
defensa antioxidante para proteger sus células contra la toxicidad del oxígeno, llegando
incluso, algunos de ellos, a adaptar su biología y emplear algo de este oxígeno en
producir energía celular.

Los seres vivos que dependen del oxígeno para obtener energía metabólica en forma de
ATP, producen además especies moleculares oxidantes cuya reactividad y potencial
citotóxico debe ser estrictamente controlado. Dicho control se lleva a cabo por
moléculas conocidas como antioxidantes, algunas producidas por el organismo y otras
adquiridas mediante la dieta. Una porción del oxígeno que respiramos se reduce, por
una vía alternativa de la citocromo oxidasa, dando lugar a formas moleculares de
oxígeno parcialmente reducidas conocidas como ROS (Reactive Oxygen Species o
Especies Reactivas de Oxígeno).

La reducción del oxígeno molecular (O2) produce el radical anión superóxido (O2–) y es
el precursor de la mayoría de otras especies de oxígeno reactivo (ROS):

O2 + e– → O2–

Dismutación del superóxido para producir peróxido de hidrógeno (H2O2):

2 H+ + O2– + O2– → H2O2 + O2

El peróxido de hidrógeno puede ser parcialmente reducido a radical hidroxilo (OH·):

H2O2 → OH + OH

O puede reducirse completamente a agua y oxígeno molecular, comenzando así de

nuevo el ciclo:

H2O2 + H2O2 → H2O + H2O + O2

Hay muchas situaciones en las que la formación de ROS aumenta, como ocurre a causa
de alteraciones nutricionales y metabólicas, en la exposición a contaminantes
ambientales, durante procesos de sobrecarga física, o bien, en estados carenciales de las
funciones orgánicas que provocan cáncer y envejecimiento. La reactividad de las ROS
les permite interaccionar con macromoléculas de diversa naturaleza, entre las que se
incluyen los lípidos, las proteínas y los ácidos nucleicos, modificando su estructura y su
función. Por ello se ha encontrado relación entre la formación de ROS y diversas

53
Capítulo 2

enfermedades, especialmente aquellas de carácter degenerativo [1]: Lesiones

inflamatorias, deficiencias nutricionales, enfermedades autoinmunes, Parkinson,
Alzheimer, infartos de miocardio, neurodegeneración, envejecimiento, neoplasias,
aterosclerosis, diabetes, etc.

Para contrarrestar los efectos negativos de las ROS, las células han desarrollado a lo
largo de su evolución mecanismos moleculares muy efectivos que implican especies
con actividad antioxidante (antioxidantes) para proporcionar al organismo una cobertura
defensiva muy eficaz. Un antioxidante es aquella molécula capaz de prevenir y/o evitar
la oxidación de otra molécula, bien por interacción y estabilización de especies reactivas
o bien por la transformación de éstas en configuraciones más estables y de reactividad
reducida. Su función es de gran importancia, ya que mantienen a las especies reactivas
por debajo de sus umbrales citotóxicos.

Los antioxidantes pueden ejercer su efecto mediante diferentes modos de acción. El que
ocupa este capítulo está relacionado con el daño ocasionado por las especies oxidantes
a los ácidos nucleicos. Los antioxidantes pueden impedir o reparar dicho daño.

2.2. Objetivos de este capítulo

Este capítulo, tiene como objetivo principal evaluar el daño que un productor de ROS
provoca a moléculas de nucleósidos que simulan la estructura genética (ADN), y cómo
un antioxidante interacciona con ese oxidante “protegiendo” los nucleósidos. Para ello,
se lleva a cabo la inmovilización electroquímica de purinas, concretamente los
nucleósidos adenosina y guanosina, sobre electrodos de carbón para desarrollar capas
de bio-reconocimiento estables para la detección voltamétrica de la capacidad
antioxidante de diversos compuestos. Se presta especial atención al estudio de la
influencia de las condiciones experimentales sobre la capa inmovilizada, además de la
electrooxidación de las purinas. Tales variables son: la concentración del compuesto
inmovilizado, el tiempo de deposición, el pH y el potencial aplicado para la deposición
de la purina en el electrodo de carbón.

La composición del sistema de detección electroquímico consiste en la capa de

adenosina o guanosina sobre electrodos de carbón vitrificado (GCE) y de pasta de
carbón (CPE), como objetivo para la oxidación. Se utiliza una reacción de tipo Fenton
para generar radicales OH, que interactúen con los nucleósidos.

En una segunda aproximación se utilizará un hidroperóxido sintético. El Hidroperóxido

de cumeno, para generar electroquímicamente radicales aromáticos en lugar de los
radicales OH, con objeto de desarrollar un método de medida electroquímica de

54
 Capítulo 2

actividad antioxidante, distinto de los propuestos en la bibliografía y comentados en el

capítulo 1 de esta tesis.

2.3. Experimental

2.3.1. Instrumental

Para las pesadas de los reactivos y otras sustancias empleadas se utilizó una balanza
Sartorius, que proporciona una precisión de ±0.00001 g y una balanza analítica de
precisión Mettler Toledo AB104, con una sensibilidad de 0.1 mg.

Las medidas de pH se realizaron con un pH metro Crison GLP 21, con una precisión
de ±0.01 unidades de pH, calibrado previamente con disoluciones tampón
estandarizadas de pH 7.00 y 4.00.

Los registros electroquímicos en voltametría cíclica se llevaron a cabo con un sistema

IJ Cambria, CH Instruments, CHI650A Electrochemical Workstation conectado a un
PC con el software adecuado proporcionado por la casa.

2.3.2. Electrodos

Todas las medidas se llevaron a cabo en celdas de 25 mL de capacidad. Las celdas

poseen entrada para los electrodos y el nitrógeno.

 Electrodos de trabajo:

o Electrodo de carbón vitrificado de CH Instruments Inc modelo CHI104.

o Electrodo de pasta de carbón de gran superficie (de síntesis en el

laboratorio) de la casa Metrohm.

 Electrodo de referencia: Ag/AgCl/3M KCl de Metrohm modelo 6.0733.100

 Electrodo auxiliar: Pt de Metrohm modelo 6.0301.100

2.3.3. Reactivos y disoluciones

Los reactivos empleados fueron: ácido clorhídrico (HCl), ácido fosfórico (H3PO4),
hidróxido de sodio (NaOH), Adenina y Ácido Ascórbico de Merck; Adenosina de
Aldrich-Chem.; Guanina, Guanosina, Ácido Gálico e Hidroperóxido de Cumeno de
Sigma-Aldrich.

55
Capítulo 2

Para la preparación del electrodo de pasta de carbón, se emplearon: grafito de tamaño

<20 micras (C) de Sigma-Aldrich y Parafina líquida de calidad espectroscópica, de
Merck.

Para el Reactivo Fenton, se empleó: cloruro de hierro (II) (FeCl2) de Sigma-Aldrich;

peróxido de hidrógeno (H2O2) y ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) de Merck.

Adenosina Guanosina

2.3.4. Condiciones de trabajo

La temperatura de trabajo se mantuvo constante durante los experimentos, a un valor

de 25 ± 0.1ºC.

Para la limpieza del GCE, se realizaron etapas sucesivas de pulido mecánico: en primer
lugar, se pulió con papel abrasivo de carburo de silicio durante dos minutos
aproximadamente, después se utilizó pasta de diamante (0.25µm), y por último
Alúminas A y B de 0.3 y 0.05 µm respectivamente. Los residuos fueron eliminados de
la superficie del electrodo en un baño de ultrasonidos durante 30 minutos.

Antes de cada medida, se activó electroquímicamente el GCE. El acondicionamiento se

llevó a cabo en una celda de 25 mL de capacidad con H3PO4 0.2 M, mediante la
aplicación de un potencial de 1.7 V durante un tiempo de 300 segundos. A continuación
se realizó una voltametría cíclica de 5 ciclos entre 0.2 y 1.5 V a una velocidad de barrido
de 0.1 V/s.

Para la construcción del electrodo de pasta de carbón, se mezclaron 0.5 g de grafito (<20
micras) con 750 µL de parafina de alta pureza hasta formar una pasta densa. Se fue
introduciendo, prensando continuamente, sobre la varilla de vidrio que conforma el
electrodo.

Las disoluciones de los reactivos se realizaron con agua ultrapura, empleando un

sistema Millipore MILLI Q, y se almacenaron a temperatura ambiente. Se comprobó

56
 Capítulo 2

que las disoluciones no se alteraban con el tiempo al menos durante todo el tiempo que
fueron utilizadas, siendo reproducibles los experimentos realizados a lo largo de varios
días.

Las experiencias con hidroperóxido de cumeno (HPC) se realizaron a una concentración

en célula de 1·10–3 M, excepto en los casos en que se hicieron estudios con la
concentración.

Las medidas se llevaron a cabo después de eliminar el oxígeno, para lo cual se pasó una
corriente de nitrógeno durante 10 minutos.

La activación electroquímica, fue la única parte del proceso que se realizó sin agitación.
La adsorción de los nucleósidos y las posteriores medidas voltamétricas, se llevaron a
cabo con agitación (estado estacionario).

2.3.5. Procedimiento de trabajo en la simulación del daño a ácidos nucleicos

Para cada experiencia se utilizaron varias celdas de medida.

Las medidas para la optimización de variables para la inmovilización de los nucleósidos,

se llevaron a cabo de la siguiente manera:

Paso 1: En la celda A, se realizó la activación electroquímica del electrodo mediante la

aplicación de un potencial de 1.7 V durante 300 segundos. Posteriormente, se realizó
una voltametría cíclica de 5 ciclos entre 0.2 y 1.5 V a una velocidad de barrido de 0.1
V/s, como parte de la activación electroquímica, con la que se comprobaba que la
superficie del electrodo estaba completamente limpia, ya que no se debía obtener señal
alguna. En caso de que se obtuviera alguna señal correspondiente al nucleósido o a
cualquier otro compuesto en este voltagrama, se repetía el proceso de activación, y si
aun así persistía la señal, se pasaba a repetir el pulido mecánico. En ninguna de las

57
Capítulo 2

experiencias realizadas, se obtuvo señal al realizar el voltagrama de la activación

electroquímica del electrodo. Después de esto, pasamos a la celda B.

Paso 2: En la celda B, se realizó una voltametría cíclica de 5 ciclos entre 0.2 y 1.5 V a
una velocidad de barrido de 0.1 V/s, para comprobar que en esta celda sí se obtenía
señal en el rango de potencial de trabajo, debido al nucleósido presente en la disolución.
Una vez comprobado el voltagrama obtenido, se procedió a la inmovilización de dicho
nucleósido en las condiciones que se establecieron para cada experiencia.

Paso 3: Por último, para la medida de la señal voltamétrica correspondiente al

nucleósido inmovilizado, pasamos de nuevo el electrodo de trabajo a la celda A, y es en
ésta donde realizamos la medida. Una vez obtenido el voltagrama, comenzamos de
nuevo con la activación electroquímica (Paso 1).

Para la validación del sensor, se emplearon tres celdas:

Teniendo en cuenta esto, el proceso que se utilizó para las medidas de la actividad
antioxidante, era muy parecido al utilizado para la inmovilización de los nucleósidos en
el electrodo de trabajo:

Paso 1: En la celda A, se realizó la activación electroquímica del electrodo mediante la

aplicación de un potencial de 1.7 V durante 300 segundos. Posteriormente, se realizó
una voltametría cíclica de 5 ciclos entre 0.2 y 1.5 V a una velocidad de barrido de 0.1
V/s, como parte de la activación electroquímica, con la que se comprobaba que la
superficie del electrodo estaba completamente limpia, ya que no se debía obtener señal
alguna. En caso de que se obtuviera señal correspondiente al nucleósido o a cualquier
otro compuesto en este voltagrama, se repetiría el proceso de activación, y si aun así
persistiese la señal, se pasaría a repetir el pulido mecánico. En ninguna de las
experiencias realizadas, se obtuvo señal al realizar el voltagrama de la activación
electroquímica del electrodo. Después de esto, pasamos a la celda B.

Paso 2: En la celda B, se realizó una voltametría cíclica de 5 ciclos entre 0.2 y 1.5 V a
una velocidad de barrido de 0.1 V/s, para comprobar que en esta celda sí se obtenía

58
 Capítulo 2

señal en el rango de potencial de trabajo, debido al nucleósido presente en la disolución.

Una vez comprobado el voltagrama obtenido, se procedió a la inmovilización de dicho
nucleósido en las condiciones que se establecieron como óptimas, con anterioridad.

Paso 3: En este paso, se llevó el electrodo de trabajo con el nucleósido ya inmovilizado,

a la celda C donde se dejó reaccionar con el reactivo de Fenton durante un tiempo fijo,
para que la reacción se desarrollase siempre en el mismo grado (simplemente introducir
el electrodo en la celda C, y esperar el tiempo estipulado). Pasado este tiempo de
reacción, se sacó el electrodo de trabajo y se introdujo de nuevo en la celda A.

Paso 4: Una vez hemos sacado el electrodo de trabajo de la celda C y lo pasamos a la

celda A, se procedió a medir la señal correspondiente al nucleósido que quedaba
inmovilizado en la superficie del electrodo de trabajo, después de haber reaccionado en
la celda C. Se hizo de esta manera, para evitar que la reacción siguiese avanzando, ya
que al cambiar el electrodo a la celda A, que carecía de reactivo Fenton, la reacción se
paraba, y siempre después de un mismo tiempo de reacción. Además, la medida debía
hacerse en la celda A, para asegurarnos de que ninguno de los reactivos interfiriese en
la señal obtenida. Una vez se obtuvo la señal, pasamos a comenzar de nuevo el proceso
para otra experiencia (Paso 1).

Para la validación del sensor utilizando un antioxidante, lo único que se modificaría es

la Celda C, donde se añadiría dicho compuesto, siendo la manera de proceder,
exactamente igual que se acaba de indicar, pero con el siguiente esquema de celdas:

59
Capítulo 2

2.4. Resultados y Discusión

2.4.1. Simulación del daño a ácidos nucleicos

[Link]. Optimización de variables para la inmovilización de los nucleósidos

Adenosina y Guanosina sobre GCE

Para la optimización de las diferentes variables, concentración, pH, potencial y tiempo

de deposición, se han realizado experimentos consistentes en una serie de medidas de
voltametría cíclica en disoluciones de adenosina de manera que de las cuatro variables
se mantienen constantes tres de ellas y se varía la cuarta.

[Link].1. Adenosina

Para la optimización del potencial de deposición se han realizado medidas de

voltametría cíclica en disoluciones de adenosina a concentración, pH y tiempo de
deposición constantes. En la Figura 2.1 se representan los voltagramas para los
diferentes potenciales de deposición.

100
0,2V
0,4V
80 0,6V
0,8V
60 1V
i/A

1,2V
40 1,4V

20

0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6

E/V

Figura 2.1. Voltagramas cíclicos para distintos valores de potencial de deposición a 0.1 V·s–1.
Concentración de adenosina: 1.68·10–5 M. pH 4.15. Tiempo de deposición: 180 s.

La Figura 2.2 muestra la dependencia de las intensidades de pico, medidas extrapolando

la intensidad del voltagrama a potenciales previos a la oxidación de la adenosina, en
función del potencial aplicado.

60
 Capítulo 2

70

60

50

40

ip/A
30

20

10

0
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4
E/V

Figura 2.2. Representación de la intensidad de pico vs. potencial de deposición. Concentración

de adenosina: 1.68·10–5 M. pH 4.15. v= 0.1 V·s–1. Tiempo de deposición: 180 s.

Como puede apreciarse en la figura anterior, los potenciales de deposición a los cuales
se obtienen las mayores intensidades son los más altos, aunque a partir de 1.2 V hay una
disminución, probablemente debido a que comienza a darse la oxidación de la
adenosina, por lo cual se concluye que el potencial óptimo de deposición es de 1.2 V.
De todas formas, las señales medidas a potenciales de deposición en torno a 0.5 V son
también suficientes para asegurar un buen recubrimiento del electrodo.

Para la optimización del pH de deposición se han realizado medidas de voltametría

cíclica en disoluciones de adenosina a concentración, potencial y tiempo de deposición
constantes.

El pico de oxidación se desplaza hacia potenciales menos positivos a medida que

aumenta el pH del medio. Esto quiere decir que en el proceso de oxidación hay una
reacción de disociación ácido-base que tiene lugar antes o en la etapa determinante de
la velocidad del mecanismo de oxidación. Esto se aprecia en la Figura 2.3, en la que se
representan los voltagramas para los diferentes valores de pH. En este caso se ha tenido
que utilizar un potencial de deposición más bajo para garantizar que durante el tiempo
de deposición no se generan productos de oxidación de la adenosina que puedan
modificar la naturaleza de la capa adsorbida sobre el electrodo.

En la Figura 2.4 se observan las intensidades de pico obtenidas para cada valor de pH.
Como puede verse, los valores de pH a los cuales se obtienen las mayores intensidades
son los más bajos. A partir de pH 5.0 hay una disminución muy importante, debida
probablemente a que la molécula en medios ácidos se encuentra protonada (su pK es de

61
Capítulo 2

3.6 [2]) dando lugar a que en la disolución aparezca una especie cargada positivamente
y cuya adsorción a los potenciales de trabajo (positivos), es más difícil que la de la
especie no cargada. Por tanto se concluye que el pH óptimo de trabajo es de 5.0.
100
2
3,03
80 4
5,01
60 6,01
8,02
i/A
40 10,14

20

0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6

E/V

Figura 2.3. Voltagramas cíclicos para distintos valores de pH. v= 0.1 V·s–1. Concentración de
adenosina: 1.68·10–5 M. Potencial de deposición: 0.4 V. Tiempo de deposición:
180 s.

70

60

50

40
ip/A

30

20

10

0
2 4 6 8 10
pH

Figura 2.4. Representación de la intensidad de pico vs. pH. v= 0.1 V·s–1. Concentración de
adenosina: 1.68·10–5 M. Potencial de deposición: 0.4 V. Tiempo de deposición:
180 s.

La optimización del tiempo de deposición es importante debido a que es una variable

que condiciona la elaboración del electrodo que se utilizará posteriormente para
medidas de capacidad antioxidante. Un tiempo de deposición grande implica un mayor

62
 Capítulo 2

tiempo de medida en los experimentos globales. Interesa disminuir en lo posible este

tiempo.

Se han realizado medidas de voltametría cíclica en disoluciones de adenosina a

concentración, pH y potencial de deposición constantes.

En la Figura 2.5 se representan los voltagramas para los diferentes valores de tiempo
de deposición, mientras que en la Figura 2.6 se pueden observar las intensidades de
pico obtenidas para cada tiempo de deposición.

80
10s
60s
60 90s
120s
150s
i/A

40 180s
210s
240s
20

0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6

E/V
Figura 2.5. Voltagramas cíclicos para distintos tiempos de deposición. Concentración de
adenosina: 1.68·10–5 M. pH 4.7. Potencial de deposición: 0.4 V. v= 0.1 V·s–1.

80

70
60

50
ip/A

40
30

20
10

0
0 50 100 150 200 250
t/s

Figura 2.6. Representación de la intensidad de pico vs. tiempo de deposición. Concentración

de adenosina: 1.68·10–5 M. pH 4.7. Potencial de deposición: 0.4 V. v= 0.1 V·s–1.

63
Capítulo 2

Como puede apreciarse en la figura anterior, la tendencia general de la intensidad

máxima de pico es aumentar conforme aumenta el tiempo de deposición, lo cual es
lógico, ya que a mayor tiempo de deposición, mayor cantidad de adenosina se depositará
(hasta llegar a saturarse el electrodo), y por eso se obtiene una señal mayor. Los tiempos
de deposición a los cuales se obtiene las mayores intensidades son 180 segundos y 240
segundos, fijándose como tiempo de deposición óptimo 180 segundos, ya que la mejora
de la señal no compensa la espera. Uno de los objetivos de la optimización es reducir
en lo posible el tiempo de preparación del electrodo.

Para la optimización de la concentración de adenosina se han realizado medidas de

voltametría cíclica en disoluciones a pH, potencial y tiempo de deposición constantes.

En la Figura 2.7 se representan los voltagramas para los diferentes valores de

concentración, mientras que en la Figura 2.8 se pueden observar las intensidades de
pico máximas obtenidas para cada concentración.

120
0,00374 mM
100 0,01123 mM
0,01871 mM
80 0,02619 mM
0,03742 mM
i/A

60 0,0449 mM
0,05613 mM
40 0,07484 mM
0,11225 mM
20

0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6

E/V

Figura 2.7. Voltagramas cíclicos para distintas concentraciones de Adenosina. pH 3.99.

Potencial de deposición: 0.4 V. Tiempo de deposición: 180s. v= 0.1 V·s–1.

64
 Capítulo 2

140

120

100

80

ip/A
60

40

20

0
0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12
C/mM

Figura 2.8. Representación gráfica de Intensidad de pico vs. concentración de Adenosina. pH

3.99. Potencial de deposición: 0.4 V. Tiempo de deposición: 180s. v= 0.1 V·s–1.

Como puede apreciarse, la concentración óptima es 0.056 mM, ya que a mayores

concentraciones se obtiene una intensidad de pico algo mayor, pero se desplaza a
potenciales mayores, con lo que la señal se solapa con la del electrolito soporte y se
comete un mayor error en la medida de la intensidad.

En definitiva, las condiciones óptimas de deposición de la adenosina sobre el GCE son:

 Potencial Óptimo de Deposición: Eóptimo = 1.2 V

 pH Óptimo de Deposición: pHóptimo = 5.0
 Tiempo Óptimo de Deposición: tóptimo = 180 segundos
 Concentración Óptima en la celda B para la Deposición: [Adenosina] = 0.056 mM

[Link].2. Guanosina

Como en el caso anterior, para la optimización del potencial de deposición se han

realizado medidas de voltametría cíclica en disoluciones de guanosina a concentración,
pH y tiempo de deposición constantes.

En la Figura 2.9 se representan los voltagramas para los diferentes potenciales de

deposición, mientras que en la Figura 2.10 se pueden observar las intensidades de pico
a cada potencial.

65
Capítulo 2

Ed 0,2V
60 Ed 0,4V
Ed 0,6V
Ed 0,8V
40

i/A
20

0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4

E/V

Figura 2.9. Voltagramas cíclicos a 0.1 V·s–1para distintos valores de potencial de deposición.
Concentración de guanosina: 1.7·10–5 M. pH 4.15. Tiempo de deposición: 180 s.

20

15
ip/A

10

0
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
Edeposicion/V

Figura 2.10. Representación de la intensidad de pico vs. potencial de deposición. v= 0.1 V·s–1.
Concentración de guanosina: 1.7·10–5 M. pH 4.15. Tiempo de deposición: 180 s.

El potencial de deposición al cual se obtiene la mayor intensidad es a 0.4 V, fijándose

éste como potencial óptimo de deposición para la Guanosina.

Para la optimización del pH de deposición se han registrado voltagramas cíclicos a

concentración, potencial y tiempo de deposición constantes.

Las Figuras 2.11 y 2.12 recogen, respectivamente, los voltagramas para los diferentes
valores de pH, y las intensidades de pico máximas a cada valor de pH.

66
 Capítulo 2

100
pH 2,01
pH 3,00
80 pH 4,18
pH 5,05
60 pH 6,00

i/A
pH 7,00
pH 8,00
40
pH 9,09

20

0.4 0.8 1.2 1.6

E/V

Figura 2.11. Voltagramas cíclicos para distintos valores de pH. v= 0.1 V·s–1. Concentración
de guanosina: 1.7·10–5 M. Potencial de deposición: 0.4V. Tiempo de deposición:
180 s.

25

20

15
iP/A

10

0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
pH

Figura 2.12. Representación de la intensidad de pico vs. pH. v= 0.1 V·s–1. Concentración de
guanosina: 1.7·10–5 M. Potencial de deposición: 0.4 V. Tiempo de deposición:
180 s.

Los valores de pH a los cuales se obtienen las mayores intensidades son los más bajos,
aunque a partir de 5.0 hay una disminución, por lo cual se concluye que el pH óptimo
de trabajo es de 5.0.

67
Capítulo 2

Para la optimización del tiempo de deposición se han realizado medidas de voltametría

cíclica en disoluciones de guanosina a concentración, pH y potencial de deposición
constantes.

En la Figura 2.13 se representan los voltagramas para los diferentes valores de tiempo
de deposición, mientras que en la Figura 2.14 se pueden observar las intensidades de
pico máximas obtenidas para cada tiempo de deposición.

100
90s
80 120s
180s
250s
60
i/A

40

20

-20
0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6
E/V

Figura 2.13. Voltagramas cíclicos para distintos tiempos de deposición. Concentración de

guanosina: 1.7·10–5 M. pH 4.21. Potencial de deposición: 0.4 V. v= 0.1 V·s–1.

30

25

20
iP/A

15

10

0
60 90 120 150 180 210 240 270
tdeposicion/s

Figura 2.14. Representación de la intensidad de pico vs. tiempo de deposición. Concentración

de guanosina: 1.7·10–5 M. pH 4.21. Potencial de deposición: 0.4 V. v= 0.1 V·s–1.

68
 Capítulo 2

La tendencia general de la intensidad máxima de pico es aumentar conforme aumenta

el tiempo de deposición, lo cual es lógico, ya que a mayor tiempo de deposición, mayor
cantidad de guanosina se depositará (hasta llegar a saturarse el electrodo), y por eso se
obtiene una señal mayor. Los tiempos de deposición a los obtiene las intensidades son
mayores son 180 segundos y 240 segundos, fijándose como tiempo de deposición
óptimo 180 segundos, ya que la mejora de la señal no compensa la espera. Uno de los
objetivos de la optimización es reducir en lo posible el tiempo de preparación del
electrodo.

Para la optimización de la concentración de guanosina se han realizado medidas de

voltametría cíclica en disoluciones a pH, potencial y tiempo de deposición constantes.

En la Figura 2.15 se representan los voltagramas para los diferentes valores de

concentración, mientras que en la Figura 2.16 se pueden observar las intensidades de
pico máximas obtenidas para cada concentración.

80
0,0035mM
70 0,01mM
60 0,017mM
0,035mM
50
0,053mM
i/A

40
30
20
10
0
-10
0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4
E/V
Figura 2.15. Voltagramas cíclicos a 0.1 V·s–1 para distintos valores de concentración de
Guanosina a pH 5.05. Potencial de deposición: 0.4 V. Tiempo de deposición: 180s.

69
Capítulo 2

30

25

20

iP/A
15

10

0
0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06
C/mM

Figura 2.16. Representación de la intensidad de pico vs. concentración de Guanosina. pH 5.05.

Potencial de deposición: 0.4 V. Tiempo de deposición: 180 s. v= 0.1 V·s–1.

Como puede apreciarse en la figura anterior, la concentración óptima es 0.035 mM, ya

que a mayores concentraciones, apenas aumenta la intensidad, manteniéndose
prácticamente constante.

En definitiva, las condiciones óptimas de deposición de la guanosina sobre el GCE son:

 Potencial Óptimo de Deposición: Eóptimo = 0.4 V

 pH Óptimo de Deposición: pHóptimo = 5.0
 Tiempo Óptimo de Deposición: tóptimo = 180 segundos
 Concentración Óptima en la celda B para la Deposición: [Guanosina] = 0.035 mM

[Link].3. Adenosina + Guanosina

Para la medida por voltametría cíclica de la intensidad de señal, en función de la

concentración de Guanosina y Adenosina en medidas conjuntas, se han realizado
diferentes experiencias en las que se variaba la concentración de ambas en igual
proporción.

En primer lugar, se realizaron medidas para las siguientes concentraciones (en cada uno
de los componentes): 0.5, 3, 9, 15 y 21 p.p.m. (correspondientes a las concentraciones
molares indicadas en la Figura 2.17).

70
 Capítulo 2

100
-1
Adenosina y Guanosina (mol·L )
-6
80 1.9·10
-5
1.1·10
60 -5
3.4·10

i/A
-5
40 5.6·10
-5
7.9·10
20

0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6

E/V

Figura 2.17. Voltagramas cíclicos para mezclas de Adenosina y Guanosina. pH 3.99. Potencial
de deposición: 0.4 V. Tiempo de deposición: 240 s. v= 0.1 V·s–1.

A continuación se realizaron medidas para las siguientes concentraciones (en cada uno
de los componentes): 30, 40, 50, 60 y 100 p.p.m. (correspondientes a las
concentraciones molares indicadas en la Figura 2.18).

-1
100 Adenosina y Guanosina (en mol·L )
-5
10.8·10
-5
80 14.4·10
-5
18.0·10
60 -5
21.6·10
i/A

-5
36.0·10
40

20

0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6

E/V

Figura 2.18. Voltagramas cíclicos para mezclas de Adenosina y Guanosina. pH 4.14. Potencial
de deposición: 0.4 V. Tiempo de deposición: 240 s. v= 0.1 V·s–1.

Finalmente, se llevó a cabo un barrido de medida entre las concentraciones mínimas y

máximas que se habían realizado en las dos experiencias anteriores, registrando los
voltagramas para las siguientes concentraciones (en cada uno de los componentes): 3,

71
Capítulo 2

12, 21, 42 y 84 p.p.m. (correspondientes a las concentraciones molares indicadas en la

Figura 2.19).

100 -1
Adenosina y Guanosina (en mol·L )
--5
1.1·10
80 --5
4.4·10
--5
60 7.7·10
--4
i/A 1.54·10
--4
40 3.08·10

20

0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6

E/V

Figura 2.19. Voltagramas cíclicos para mezclas de Adenosina y Guanosina. pH 3.94. Potencial
de deposición: 0.4 V. Tiempo de deposición: 240 s. v= 0.1 V·s–1.

Como principal resultado se encontró que cuando se codepositan adenosina y guanosina

conjuntamente, en ambos casos las señales disminuyen alrededor de un 20% con
respecto a las obtenidas en las deposiciones de disoluciones monocomponentes. La
superficie del electrodo se ocupa por igual por ambos componentes de manera que en
la codeposición no se dan efectos sinérgicos ni tampoco inhibición de un nucleósido a
otro, más allá del hecho de que el electrodo debe alcanzar antes la saturación y eso
origina que la cantidad de material depositado para cada nucleósido sea algo menor que
en ausencia del otro adsorbato.

[Link]. Optimización de variables para la inmovilización de los nucleósidos

Adenosina y Guanosina sobre CPE

En esta sección solamente se presentan resultados relevantes, específicos para el CPE.

Los potenciales de deposición elegidos, tras los estudios experimentales fueron los
mismos que para GCE y se analizan aquí solamente los tiempos de deposición y las
concentraciones óptimas, los cuales variaron con respecto al GCE.

72
 Capítulo 2

[Link].1. Guanosina

Para la optimización del tiempo de deposición se han realizado medidas de voltametría

cíclica en disoluciones de guanosina a concentración, pH y potencial de deposición
constantes.

En la Figura 2.20 se representan los voltagramas para los diferentes valores de tiempo
de deposición, mientras que en la Figura 2.21 se pueden observar las intensidades de
pico máximas obtenidas para cada tiempo de deposición.

140
50 s
120 100 s
150 s
100
200 s
80
i/A

60
40
20
0
-20
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4
E/V

Figura 2.20. Voltagramas cíclicos a distintos tiempos de deposición a pH 5.04. Concentración

de guanosina: 3·10–4 M. Potencial de deposición: 0.4 V. v= 0.1 V·s–1.

40

30
iP/A

20

10

0
0 50 100 150 200
t/s

Figura 2.21. Representación de la intensidad de pico en función del tiempo de deposición a pH

5.04. Concentración de guanosina: 3·10–4 M. Potencial de deposición: 0.4 V.
v= 0.1 V·s–1.

73
Capítulo 2

Como puede apreciarse, la tendencia general de la intensidad máxima de pico es a

aumentar conforme aumenta el tiempo de deposición, lo cual es lógico, ya que a mayor
tiempo de deposición, mayor cantidad de guanosina se depositará (hasta llegar a
saturarse el electrodo), y por eso se obtiene una señal mayor. Los tiempos de deposición
a los cuales se obtienen las mayores intensidades son 150 segundos y 200 segundos,
fijándose como tiempo de deposición óptimo 150 segundos, ya que la mejora de la señal
no compensa la espera. En el caso de la adenosina los resultados fueron similares.

Para la optimización de la concentración de guanosina se han realizado medidas de

voltametría cíclica en disoluciones a pH, potencial y tiempo de deposición constantes.

En la Figura 2.22 se representan los voltagramas para los diferentes valores de

concentración, mientras que en la Figura 2.23 se pueden observar las intensidades de
pico máximas obtenidas para cada concentración.

150 0.1mM
0.2mM
0.3mM
100 0.5mM
0.6mM
i/A

0.8mM
1mM
50

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6

E/V

Figura 2.22. Voltagramas cíclicos para distintas concentraciones de Guanosina. pH 5.09.

Potencial de deposición: 0.4 V. Tiempo de deposición: 150 s. v= 0.1 V·s–1.

74
 Capítulo 2

150

125

100

iP/A
75

50

25

0
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
c/mM

Figura 2.23. Representación de la intensidad de pico vs. concentración de Guanosina. pH 5.09.

Potencial de deposición: 0.4 V. Tiempo de deposición: 150 s. v= 0.1 V·s–1.

Como puede apreciarse, se alcanza una concentración de 1.0 mM sin llegar a saturar el
electrodo. Se toma por tanto como concentración óptima 1.0 mM, ya que a mayores
concentraciones, se requeriría el uso de mayores concentraciones de antioxidantes, lo
que podría generar problemas de solubilidad.

En definitiva, las condiciones óptimas de deposición de la guanosina sobre el CPE son:

 Tiempo Óptimo de Deposición: Eóptimo = 150 segundos

 Concentración Óptima en la celda B para la Deposición: [Guanosina] = 1.0 mM

La variación más importante, en cuanto a la optimización de variables para la

inmovilización en CPE frente a la optimización de variables realizada para el GCE, se
encuentra en la concentración óptima en la celda B para llevar a cabo la deposición,
debido a la diferencia de superficie del electrodo con el GCE. El resto de variables del
proceso, serían las mismas a aplicar que con el GCE:

 Potencial Óptimo de Deposición: Eóptimo = 0.4 V

 pH Óptimo de Deposición: pHóptimo = 5.0

75
Capítulo 2

[Link].1. Adenosina

Para la optimización de la concentración de adenosina se han realizado medidas de

voltametría cíclica en disoluciones a pH, potencial y tiempo de deposición constantes.

En la Figura 2.24 se representan los voltagramas para los diferentes valores de

concentración, mientras que en la Figura 2.25 se pueden observar las intensidades de
pico máximas obtenidas para cada concentración.

1200
fondo
Adenosina 0.1mM
1000
Adenosina 0.2mM
800 Adenosina 0.4mM
Adenosina 0.6mM
i/A

600 Adenosina 0.8mM

Adenosina 1mM
400

200

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8
E/V

Figura 2.24. Voltagramas cíclicos para distintas concentraciones de Adenosina. pH 4.23.

Potencial de deposición: 0.4 V. Tiempo de deposición: 200 s. v= 0.1 V·s–1.

400

300
iP/A

200

100

0
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
c/mM

Figura 2.25. Representación de la intensidad de pico vs. concentración de Adenosina. pH 4.23.

Potencial de deposición: 0.4 V. Tiempo de deposición: 200 s. v= 0.1 V·s–1.

76
 Capítulo 2

La intensidad de pico aumenta hasta llegar a 0.6-0.8 mM (hay poca variación); luego,
la intensidad disminuye. Se toma como valor de concentración óptimo 0.8 mM.

En definitiva, las condiciones óptimas de deposición de la adenosina sobre el CPE son:

 Concentración Óptima en la celda B para la Deposición: [Adenosina] = 0.8 mM

Al igual que ocurrió con la guanosina, para la adenosina la variación más importante en
cuanto a la optimización de variables para la inmovilización en CPE frente a la
optimización de variables realizada para el GCE, también la encontramos en la
concentración óptima en la celda B para llevar a cabo la deposición, debido a la
diferencia de superficie del electrodo con el GCE. El resto de variables del proceso,
serían las mismas a aplicar que con el GCE:

 Potencial Óptimo de Deposición: Eóptimo = 1.2 V

 pH Óptimo de Deposición: pHóptimo = 5.0
 Tiempo Óptimo de Deposición: Eóptimo = 180 segundos

[Link]. Validación del sensor con GCE:

Todo el proceso descrito anteriormente, en busca de la optimización de las variables,

tanto para Adenosina como para Guanosina, tenía como fin fabricar un sensor capaz de
medir la capacidad antioxidante tipo daño a ácidos nucleicos. A continuación, se
comprobará la acción del reactivo de Fenton (oxidante) sobre los nucleósidos
inmovilizados en la superficie del GCE. Posteriormente, para poder medir la capacidad
antioxidante de un compuesto, se medirá la pérdida de nucleósido inmovilizado en la
superficie del electrodo, en presencia de dicha sustancia antioxidante y un oxidante
(como por ejemplo el reactivo de Fenton).

El reactivo de Fenton se forma a partir de un compuesto capaz de suministrar iones Fe2+

en disolución, como el Cloruro de hierro (II) FeCl2. Al añadir H2O2 el Fe2+ reacciona
con el H2O2, liberando radicales OH– (proporcionalmente a la concentración de iones
Fe2+), que son los encargados de reaccionar con el nucleósido inmovilizado. Esto ocurre
porque el Fe2+ se oxida pasando a Fe3+, y el H2O2 se reduce, según la siguiente reacción:

2Fe2+ + H2O2  2Fe3+ + 2 OH–

A continuación, los radicales atacan al substrato (en este caso el nucleósido o la mezcla
de nucleósidos) el cual es oxidado por vía radicálica, la cual puede ser muy compleja:

77
Capítulo 2

OH– + substrato  OH– + R

Como resultado, hay una disminución de la concentración del/los nucleósido/s que se

detecta por la disminución de la señal voltamétrica.

Este ataque a los nucleósidos sobre el electrodo es similar al que se produce cuando los
mismos radicales reaccionan con ácidos nucleicos. El problema es que con los ácidos
nucleicos hay además una serie de reacciones colaterales originadas sobre todo por
cambios conformacionales al modificarse la distribución y naturaleza de las bases en la
cadena, que no siempre quedan reflejados en las medidas experimentales. La idea es
utilizar los nucleósidos depositados sobre los electrodos como una medida directa de la
reacción de los radicales OH– con estas bases.

Para la validación del sensor con guanosina se han realizado medidas de voltametría
cíclica en disoluciones de concentración de guanosina, pH, concentración H2O2, tiempo
de reacción, potencial y tiempo de deposición constantes, donde el factor determinante
era la concentración de Fe2+.

Teniendo en cuenta la reacción vista anteriormente, cabe esperar que cuanto mayor sea
la concentración de Fe2+ añadida (siempre con una concentración de H2O2 constante y
en exceso), mayor será la pérdida de la señal proporcionada por el nucleósido, ya que
se generarán más radicales OH– que atacarán al nucleósido inmovilizado en la
superficie del electrodo de trabajo.

La Figura 2.26 recoge voltagramas para diferentes concentraciones de Fe2+.

225
2+
200 Fe =1.0mM
2+
175 Fe =1.5mM
2+
150 Fe =2.0mM
Ip/A

2+
125 Fe =2.5mM
100
75
50
25
0

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8
E/V

Figura 2.26. Voltagramas cíclicos a 0.1 V·s–1. para distintos valores de concentración de Fe2+.
pH 4.15. [Guanosina]=0.04 mM. [EDTA]=1.0 mM. [H 2O2]=10 mM. Edeposición:
0.4 V. Tiempo de deposición: 180 s. Tiempo de reacción: 3 minutos.

78
 Capítulo 2

Se puede apreciar que la señal disminuye conforme se añade Fe2+. Si ahora se utiliza un
antioxidante, como por ejemplo ácido ascórbico, la señal debería ir aumentando, ya que
los radicales OH– reaccionarían antes (velocidad de reacción mayor) con el ácido
ascórbico que con el nucleósido (guanosina en este caso). La recuperación de la señal
se relaciona con el efecto protector del antioxidante.

Los resultados obtenidos se muestran en las Figuras 2.27 y 2.28. Las medidas se
realizaron a concentración de guanosina, pH, concentración H2O2, concentración de
Fe2+, tiempo de reacción, potencial y tiempo de deposición constantes, donde el factor
determinante era la concentración de ácido ascórbico (AA).

As, can be seen, the presence of ascorbic acid protects the adsorbed guanosine from the
action of the Fenton reagent, this protection being more effective at higher ascorbic acid
concentrations. The problem arising from the evaluation of the antioxidant effect by
using this strategy is the evident saturation effect shown in the inset of the figure. So,
the maximum recovery is, evidently, 100%, and the linearity of the graph of recovery
versus antioxidant dose is observed in a narrow range of concentrations.

Sin tratar
20 Sin AA
14,75 M AA
34.27 M AA
16 94.40 M AA
I/A

12

0
0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6
E/V

Figura 2.27. Voltagramas cíclicos para distintos valores de concentración de ácido ascórbico.
pH 4.15. [Guanosina]=0.04 mM. [EDTA]=1.0 mM. [H 2O2]=10 mM. Fe2+]=0.25
mM. Edeposición: 0.4 V. Tiempo de deposición: 180 s. Tiempo de reacción: 3
minutos. v= 0.1 V·s–1.

79
Capítulo 2

100

80

% recuperación
60

40

20

0
0 20 40 60 80 100
mol/L AA
Figura 2.28. Porcentaje de recuperación de la señal en función de la concentración de ácido
ascórbico. Mismas condiciones que en la figura 2.27

[Link]. Validación del sensor con CPE:

Para la validación del sensor con Guanosina se han realizado medidas de voltametría
cíclica en disoluciones de concentración de guanosina, pH, concentración H2O2, tiempo
de reacción, potencial y tiempo de deposición constantes, donde el factor determinante
era la concentración de Fe2+. Para el CPE, se utilizó la Voltametría de Pulso Diferencial.

En la Figura 2.29 se representan los voltagramas para diferentes concentraciones de

Fe2+.

Fondo
24 2+
Fe =0.0 mM
2+
Fe =12.0 mM
22 2+
Fe =31.2 mM
2+
Fe = 45.0 mM
20
i/A

18

16

14

0.90 0.95 1.00 1.05 1.10

E/V
Figura 2.29. Voltagramas de Pulso Diferencial para distintos valores de concentración de Fe2+.
pH 4.23. [Guanosina]=0.04 mM. [EDTA]=1.0 mM. [H 2O2]=10 mM. Edeposición: 0.4
V. Tiempo de deposición: 180 s. Tiempo de reacción: 3 minutos. v= 0.01 V·s–1.

80
 Capítulo 2

En esta gráfica también se puede apreciar cómo disminuye la señal, al ir aumentando la

concentración de Fe2+. A continuación, se presenta la Figura 4.30, que corresponde a la
representación gráfica obtenida cuando se añade un antioxidante, el ácido ascórbico.

28 Sin reactivo de Fenton

AA = 0M
AA = 14.75M
26 AA = 31.27M
AA = 94.4M
AA = 0.472mM
24
i/A
22

20

18

0.92 0.96 1.00 1.04 1.08 1.12 1.16

E/V

Figura 2.30. Voltagramas de Pulso Diferencial para distintos valores de concentración de

Ácido Ascórbico. pH 4.23. [Guanosina]=0.04 mM. [EDTA]=1.0 mM. [H 2O2]=10
mM. [Fe2+]=12 mM. Edeposición: 0.4 V. Tiempo de deposición: 180 s. Tiempo de
reacción: 3 minutos. v= 0.01 V·s–1.

Puede observarse, que la señal es mucho más intensa cuando no hay reactivo de Fenton.
Dicha señal disminuye drásticamente cuando se hace expone el sensor a la acción del
reactivo de Fenton, sin antioxidante en el medio. Por último, se aprecia como aumenta
la intensidad de la señal cuando vamos aumentando la concentración de ácido ascórbico,
que intercepta los radicales OH– y reacciona con ellos, en lugar del nucleósido
inmovilizado en la superficie del CPE.

No obstante, la sensibilidad del CPE a la presencia del antioxidante es mucho menor

que la del GCE.

2.4.2. Uso de un hidroperóxido sintético

Para cubrir los objetivos indicados al inicio del capítulo, esto es, utilizar hidroperóxido
de cumeno para determinar capacidad antioxidante, es necesario asegurarse de que se
producen radicales libres en el proceso electródico susceptibles de ataque por parte de
los antioxidantes. Pero en la bibliografía no hay referencias acerca del proceso de
electrooxidación del HPC, razón por la cual en primer lugar se realiza una
caracterización electroquímica de dicho proceso.

81
Capítulo 2

La voltametría cíclica del HPC sobre electrodo de carbón vitrificado da lugar a un único
pico de oxidación como se observa en la Figura 2.31.

Figura 2.31. Voltagramas cíclicos de HPC 1·10–3 M a diferentes valores de pH. v= 0.1 V·s–1.

Los voltagramas registrados en medios muy ácidos no se han representado para evitar
la confusión provocada por la acumulación de curvas en la figura. La ausencia de picos
de reducción a potenciales cercanos a los de los picos de oxidación indica que el proceso
total es irreversible.

El potencial de pico del pico de oxidación se desplaza hacia valores más negativos a
medida que aumenta el pH, con una pendiente de –125 mV por unidad de pH, como se
muestra en la Figura 2.32.

El valor de la constante de disociación ácida del HPC es 12.6 [3], lo cual significa que
la forma presente en la disolución es el HPC no disociado incluso a valores de pH
básicos. Por lo tanto, la dependencia de la señal de oxidación en voltametría con el pH
se debe a la existencia de esta disociación ácida previa a la reacción de oxidación.

Además, a pH constante, el potencial de pico es independiente de la concentración de

HPC, la intensidad de pico es independiente del pH y es proporcional a la concentración
de HPC, a concentraciones por debajo de 2·10–3 M (Figuras 2.33 y 2.34).

82
 Capítulo 2

1.6

1.4

1.2

EP/V
1.0

0.8

0.6

0.4
4 6 8 10 12
pH

Figura 2.32. Dependencia con el pH del potencial de pico de oxidación del voltagrama de CHP
1·10–3 M. v= 0.1 V·s–1.

17.5
15.0
12.5
10.0
IP/A

7.5
5.0
2.5
0.0
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
pH

Figura 2.33. Dependencia con el pH de la intensidad de pico de oxidación del voltagrama de

HPC 1·10–3 M. v= 0.1 V·s–1.

83
Capítulo 2
1.4
15
1.3
12
1.2

EP/V
9
Ip/A
1.1

6 1.0

3 0.9

0 0.8
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 -3.6 -3.4 -3.2 -3.0 -2.8 -2.6
C/mM log (C/M)

Figura 2.34. Dependencia del voltagrama de oxidación del HPC a pH 4.7. Izquierda: intensidad
de pico. Derecha: Potencial de pico. v= 0.1 V·s–1.

Todos estos datos indican que el proceso electródico es de primer orden con respecto a
la concentración de HPC, y consistente en una transferencia monoeletrónica irreversible
seguida por etapas química y electroquímicas para dar lugar a los productos de
oxidación.

Por último, la función de corriente Ip/v1/2 es independiente de la velocidad de barrido, v,

a bajos valores de v como se muestra en la Figura 2.35. Esto quiere decir que los
procesos de adsorción, si los hay son débiles.

1.2

1.0

0.8
IP/v1/2

0.6

0.4

0.2

0.0
10 20 30
1/2
v

Figura 2.35. Dependencia de la función de corriente del voltagrama de oxidación del HPC con
la velocidad de barrido. C=1·10–3 M a pH 4.75. (Intensidades en μA, velocidad
de barrido en V·s–1).

84
 Capítulo 2

Los productos finales de la reacción de descomposición catalizada por ácidos del HPC
son fenol y acetona [4-6]. La acetona es inerte electroquímicamente en las condiciones
experimentales de este trabajo. De hecho, se utiliza habitualmente como codisolvente
para solubilizar especies apolares. Sin embargo, el fenol se oxida sobre electrodos de
carbón para formar radicales fenóxido como intermedios y originando finalmente para-
benzoquinona [7]. Este compuesto es estable en disolución y presenta en voltametría
cíclica un par reversible de picos a potenciales menores que los correspondientes a la
oxidación del HPC [8]. Por esa razón se han realizado experimentos en voltametría
cíclica con barridos múltiples como se muestra en la Figura 2.36.

Figura 2.36. Voltagramas cíclicos de HPC 1·10–3 M a pH=2.0, a 0.1 V·s–1 y potenciales de
inversión del barrido 1.75V (línea roja punteada) y 1.90V (línea negra continua).

Cuando el potencial de inversión del barrido es suficientemente alto, aparece un par de

picos rédox en la zona de potenciales correspondiente a la oxidación-reducción de la p-
benzoquinona [8], como cabe esperar si el fenol, el producto final plausible de la
oxidación, se oxida a estos potenciales.

A continuación, se aplicó un potencial constante a un valor mucho más positivo que el

potencial de pico de oxidación del HPC, realizando una electrolisis a diferentes tiempos.
Para cada uno de estos tiempos, se sacó el electrodo de la disolución de HPC, se
introdujo en disolución tampón en ausencia de HPC y se registró el voltagrama cíclico
en la zona de potenciales correspondiente a la oxidación-reducción de la p-
benzoquinona. Los resultados se muestran en la Figura 2.37.

85
Capítulo 2

Figura 2.37. Deposición a 1.25V de HPC 1·10–3 M a pH=7.0. Voltagramas cíclicos del electrodo
en una disolución en ausencia de HPC en las mismas condiciones. En la figura se
indican los tiempos de deposición. v= 0.1 V·s–1.

Como puede observarse, se obtiene un sistema de picos correspondiente a un par rédox,

prácticamente reversible. Los picos del par aumentan en intensidad a medida que se
aumenta el tiempo de electrolisis, alcanzando valores prácticamente constantes a los
150-200 s. Estos picos tienen las características del par rédox correspondiente a la
oxidación-reducción de la p-benzoquinona, lo que indica que este es el producto de
oxidación a los potenciales empleados en la electrolisis.

Teniendo en cuenta todos estos resultados y conclusiones, las primeras etapas de la

oxidación del HPC se pueden representar con el esquema siguiente:

86
 Capítulo 2

En la oxidación química del HPC se ha propuesto la formación del radical peróxido de

cumilo que se muestra en el esquema y que aparece después de la primera transferencia
electrónica [9]. Este radical se descompone en acetona (uno de los productos finales de
la oxidación) y radical fenoxilo, el cual es precisamente el intermedio de reacción
formado en la primera transferencia electrónica en la oxidación del fenol, como se
muestra en el esquema siguiente. Este radical fenoxilo posteriormente da lugar a un ion
fenoxonio que, tras reaccionar con agua, origina hidroquinona, la cual se oxida
finalmente a orto- y para- benzoquinona [7]:

87
Capítulo 2

En la Figura 2.37 se aprecia que hay un par rédox de intensidad mucho menor que la
del par principal a potenciales unos 0.1V más positivos, lo que apoyaría eh hecho de
que haya trazas de o-benzoquinona, cuyo potencial formal es ligeramente mayor que el
de la p-benzoquinona.

Así pues, se puede afirmar que en la oxidación electroquímica del HPC sobre electrodos
de carbón vitrificado se originan radicales libres capaces de interaccionar con
antioxidantes.

Esta afirmación se ha comprobado realizando enxperimentos en presencia de un

antioxidante como el ácido ascórbico. La Figura 2.38 muestra voltagramas cíclicos del
HPC en presencia de concentraciones crecientes de ácido ascórbico (AA).

88
 Capítulo 2

300 HPC
HPC + AA 5 mM
250 HPC + AA 7.5 mM
HPC + AA 10 mM
200

I/A
150

100

50

-50
-0.5 0.0 0.5 1.0 1.5
E/V

Figura 2.38. Voltagramas cíclicos de HPC 1·10–3 M a pH=7.0 y v= 0.1 V·s–1 en presencia de
ácido ascórbico (AA) a las concentraciones indicadas en la figura.

Como puede verse, la oxidación del AA ocurre a potenciales más bajos que los del HPC,
lo cual significa que el efecto de la presencia del antioxidante sobre el voltagrama del
HPC es muy difícil (si no imposible) de cuantificar. Para resolver este problema se ha
utilizado la voltametría de pulso diferencial [10] aprovechando que los potenciales de
oxidación de AA y HPC están muy alejados (en torno a 0.8 V a pH 7). Esto se muestra
en la Figura 2.39.

7 HPC
HPC + AA 5mM
HPC + AA 7.5mM
6 HPC + AA 10mM
HPC + AA 12.5mM
5 HPC + AA 15mM
I/A

1
0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 1.2
E/V

Figura 2.39. Voltagramas de pulso diferencial de HPC 1·10–3 M a pH=7.0 y v= 0.1 V·s–1 en
presencia de ácido ascórbico (AA) a las concentraciones indicadas en la figura.

89
Capítulo 2

En este caso, las intensidades de los picos en VPD en presencia de AA ocurre a

potenciales más bajos que los del HPC, disminuyen a medida que aumenta la
concentración del antioxidante, con respecto al volotagrama registrado en ausencia de
AA. Esta disminución debe estar directamente relacionada con la actividad antioxidante
del ácido ascórbico originada en la reacción de éste con los radicales (peroxilo y/o
fenoxilo) que se forman en las primeras etapas de la oxidación electroquímica del HPC,
disminuyendo sus concentraciones y, consecuentemente, disminuyendo la intensidad de
la señal [11]. Cuanto mayor es la actividad antioxidante, mayor es esta disminución. En
el caso de AA, la intensidad de pico del voltagrama de pulso diferencial disminuye un
10% cuando la concentración de AA está en torno a 7.9·10–3 mol·L–1.

Para confirmar estos resultados se ha utilizado otro antioxidante, el ácido gálico, AG.
La Figura 2.40 muestra los resultados obtenidos para la adición de AG a una disolución
de HPC.

5
I/A

4 HPC
HPC + AG 5mM
HPC + AG 7.5mM
3 HPC + AG 10mM
HPC + AG 12.5 mM
2

1
0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 1.2
E/V

Figura 2.40. Voltagramas de pulso diferencial de HPC 1·10–3 M a pH=7.0 y v= 0.1 V·s–1 en
presencia de ácido gálico (AG) a las concentraciones indicadas en la figura.

De nuevo se observa una disminución de la intensidad del pico en VPD, más acusada a
mayores concentraciones de AG. En este caso, la disminución del 10% de intensidad se
alcanza a una concentración en torno a 10.5·10–3 mol·L–1, lo cual indica que la actividad
antioxidante del AG es menor que la del AA [10].

90
 Capítulo 2

2.5. Bibliografía
[1] J. M. C. Gutteridge, B. Halliwell, Free radicals and antioxidants in the year 2000. A
historical look to the future. 899 (2000) 136-147.

[2] A. Albert, E.P. Serjeant, The Determination of Ionization Constants, Third Edition, Ed.
Chapman and Hall (1984) London.

[3] John Wiley and Sons, Ullmann's Encyclopedia of industrial chemistry, Ed. Advisory Board
(2005) 38.

[4] J. Vodnár, React. Kinet. Catal. Lett. 10 (3) (1979) 237-241.

[5] R. J. Lewis, Hawley’s Condensed Chemical Dictionary, New York: Van Nostrand Reinhold
Co. (1993) 329.

[6] D. H. R. Barton, N. C. Delanghe, Tetrahedron Lett 38 (1997) 6351-6354.

[7] M. Gattrell, D.W. Kirk, Can. J. Chem. Eng. 68 (1990) 997-1003.

[8] R. Estévez Brito, J.M. Rodríguez Mellado, P. Maldonado, M. Ruiz Montoya, A. Palma, E.
Morales, J. Electrochem. Soc. 161 (2014) G27-G32.

[9] S. Fukuzumi, Y. Ono, J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2 (1977) 622-625.

[10] A. J. Blasco, A. González Crevillén, M. C. González, A. Escarpa, Electroanalysis 19 (22)

(2007) 2275-2286.

[11] A. Palma, M. Ruiz Montoya, J.F. Arteaga, J.M. Rodríguez Mellado, J. Agric. Food. Chem.
62 (2014) 582-589.

91
Capítulo 2

Summary:
The goals intended in this chapter deal with developing electrochemical methods to
measure global antioxidant activity.
The first objective of this chapter was to assess the damage caused by ROS on
nucleoside molecules, which mimic the genetic structure (DNA), and how an
antioxidant can protect the nucleosides from this damage by the interaction with the
oxidants. To do this, it was performed the electrochemical immobilization of purines,
specifically Adenosine and Guanosine nucleosides, on carbon electrodes for developing
bio-recognition layers stable enough for the voltammetric detection of the antioxidant
capacity, which was tested with several compounds. The carbon electrodes used were
Glassy Carbon Electrode (GCE) and Carbon Paste Electrode (CPE). Special attention
to the study of the influence of experimental conditions on the immobilized layer,
besides purine electrooxidation is provided. Such variables are: the concentration of the
immobilized compound, deposition time, pH and potential applied for deposition of the
purine in the carbon electrode. The biggest difference in the optimized variables for both
electrodes, is the optimal concentration of nucleoside in the electrochemical cell, which
is much higher for CPE than for GCE, due to the difference in active surface between
the two electrodes. The GCE has a much smaller surface than the CPE.
To validate the sensor, consisting in an Adenosine or Guanosine layer covering the
corresponding carbon electrode, it was used one source of OH radicals (one of the most
ROS common in the nature) to oxidize nucleosides, namely a Fenton-type reaction.
As a second objective, after verifying the effectiveness of the sensor, it was used
Cumene Hydroperoxide (a synthetic hydroperoxide) to generate electrochemically
aromatic radicals, instead of OH radicals, in order to develop an electrochemical
method for the measurement of antioxidant activity, different to those proposed in the
literature. There is no information in the literature about the HPC electrooxidation
process, and thus in this work it has been done an electrochemical characterization of
such process. The experimental results show that the process is irreversible, the
voltammogram consisting of a single oxidation peak, which shifts to more negative
potentials as the pH increases. Taking into account that the acidic HPC dissociation
constant is 12.6, it can be concluded that the HPC remains undissociated until fairly
basic pH values. This means that the reaction responsible for the pH dependence of the
oxidation potential must be the loss of an H+ ion. The peak potential is independent of
the concentration of HPC at constant pH, the peak intensity being independent of pH
and proportional to the concentration of HPC at concentrations below 2·10–3 M. All
these results indicate that the process is first order with respect to the concentration of
HPC, and that the one-electron transfer would be irreversible. The end products of the
acid catalyzed decomposition of HPC are Phenol and Acetone. Acetone is inert
electrochemically under the experimental conditions of this work, and Phenol is

92
 Capítulo 2

oxidized on carbon electrodes to form p-benzoquinone (mainly) and o-benzoquinone,

which can interact with molecules of antioxidants. This has been tested with Ascorbic
Acid and Gallic Acid by differential pulse voltammetry (VPD), observing that the HPC
peak decreased when the antioxidant concentration was increased. It was also confirmed
that the decreasing of the HPC voltammetric peak is more pronounced when Ascorbic
Acid is used instead of Gallic Acid, which indicates that the first has a higher antioxidant
capacity than the second.

93
Capítulo 2

94
 CAPÍTULO III

MECANISMOS DE
OXIDACIÓN
ELECTROQUÍMICA DE
ANTIOXIDANTES
 Capítulo 3

3.1. Introducción

Uno de los sistemas más estudiados para la investigación de los procesos de

transferencia electrón-electrón, es el sistema quinona-hidroquinona, ya que se
corresponde con una estructura muy común para muchos antioxidantes empleados
actualmente [1]. El potencial redox de las quinonas depende de los sustituyentes que
presenten, sus constantes de disociación, la concentración de protones y los efectos que
pueden ejercer los disolventes. De esta forma a pH 7, las semiquinonas que tienen
constantes de disociación entre 4 y 5, están en su forma aniónica y por tanto, participan
en las reacciones de transferencia electrónica dando estabilidad a la hidroquinona. Sin
embargo, el hecho de que estén protonadas a ese pH hace que se ralentice el proceso de
transferencia de electrones [1, 2].

La capacidad antioxidante de un compuesto – especialmente los fenoles [3] –, puede

deberse a la captura de los radicales libres y de las ROS, producidos normalmente por
el metabolismo celular o como respuesta a factores externos que se inactivan [4],
evitando o previniendo enfermedades degenerativas en el ser humano causadas por la
oxidación de los ácidos nucleicos, proteínas o lípidos [5, 6].

Actualmente, los métodos utilizados para la evaluación de la capacidad antioxidante

siguen el principio básico de que un antioxidante inhibe la oxidación de un sustrato,
manteniendo las características principales de ese sustrato y haciendo una medida
apropiada del punto final. Entre los diferentes ensayos que se emplean para medir la
capacidad antioxidante de un compuesto, se encuentran, entre otros, el ensayo de
estabilidad acelerado [7, 8], el uso de especies radicales como ABTS [2,2'-azino-
bis(ácido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico)] [9] y DPPH (radical 2,2-difenil-1-
picrilhidracilo) [9], espectrometría de resonancia del spin electrónico (ESR), o la
medida del consumo de oxígeno en una emulsión agua/lípido con oxidación lipídica
iniciada por la metamioglobina [10]. El sustrato se oxida en condiciones estándar,
pudiendo medirse el grado de oxidación (punto final) a un tiempo fijo o sobre la base
de una característica generada por los radicales libres, mediante medidas ópticas [11].
Algunos ejemplos de esta metodología son: FRAP (poder antioxidante para reducir el
ión férrico), TEAC (capacidad antioxidante equivalente al Trolox), ORAC (capacidad
de absorción de radicales de oxígeno), CUPRAC (CUPric Reducing Antioxidant
Capacity) y TRAP (parámetro de captura total de radicales antioxidantes). Cada método
tiene sus propias características, y existen diferencias en los sistemas de generación de
radicales libres, diana molecular, punto final, tiempo de espera en el medio de reacción,
etc. [12]. La interpretación y la comparación de sus resultados, es por lo tanto compleja.
A todo esto, hay que añadir que estos métodos presentan una serie de inconvenientes,

97
Capítulo 3

como el empleo de reactivos específicos y difíciles de sintetizar, una larga y tediosa

preparación de la muestra y/o análisis lentos.

La Electroquímica es una rama de la Química, que nos permite, entre otras muchas
aplicaciones, estudiar la capacidad antioxidante [13] que presentan determinadas
sustancias. Los potenciales de oxidación medidos por voltametría cíclica, se han
empleado para comparar la fuerza antioxidante de compuestos como ácidos fenólicos,
flavonoides, ácidos cinámicos, etc… [13-17], siendo el electrodo de carbón vítreo
(Glassy-Carbon Electrode, GCE) el más empleado. Los bajos potenciales de oxidación
están relacionados con una mayor facilidad para la donación de electrones y por tanto
para que un compuesto sea antioxidante (se oxida fácilmente este compuesto, y reduce
a los otros, impidiendo que estos últimos se oxiden).

3.2. Objetivos del capítulo

Los objetivos de este capítulo son:

– Establecer los mecanismos de oxidación de los antioxidantes sesamol y 2,5-

dihidroxibenzaldehído para contribuir a una mejor comprensión de la actividad
antioxidante de estas moléculas, sobre todo en lo que se refiere a su capacidad de
atrapamiento de radicales (radical scavenging). Para ello se utilizarán técnicas
electroquímicas relacionadas con la cinética electródica así como la identificación,
directa o indirecta, de los productos de oxidación.

– Mostrar que el estado de disociación de los grupos hidroxilo de 2,4- y 2,5-dihidroxi-

benzaldehídos y el ácido gálico es un factor relevante a tener en cuenta en la
interpretación de las actividades antioxidantes. Además, a partir de los espectros
moleculares UV-Vis, obtenidos en un amplio rango de pH, se determinarán las
constantes de disociación de ambos aldehídos. Se determinan las actividades
antioxidantes a diferentes valores de pH y se comparan a la luz de los valores de las
constantes de disociación.

3.3. Experimental

3.3.1. Instrumental

Para las pesadas de los reactivos y otras sustancias empleadas se utilizó una balanza
Sartorius, que proporciona una precisión de ±0.00001 g y una balanza analítica de
precisión Mettler Toledo AB104, con una sensibilidad de 0.1 mg.

98
 Capítulo 3

Para los registros espectrofotométricos de las experiencias en UV se ha empleado un

espectrofotómetro Perkin Elmer, modelo Lambda 750S, con cubetas de cuarzo Hellma
de 1 cm de paso óptico.

Las medidas de pH se realizaron con un pH metro Crison GLP 21, con una precisión
de ±0.01 unidades de pH, calibrado previamente con disoluciones tampón.

Los registros electroquímicos, tanto en voltametría cíclica, voltametría de pulso

diferencial como en cronoamperometría se llevaron a cabo con un sistema Autolab
PGSTAT302N con NOVA 1.6 como software del mismo.

Los registros electroquímicos en voltametría de pulso diferencial para la determinación

de actividad antioxidante se llevaron a cabo con un sistema IJ Cambria, CH Instruments,
CHI650A Electrochemical Workstation conectado a un PC con el software adecuado
proporcionado por la casa. Dicho sistema se acopló a un electrodo de mercurio de
tamaño de gota controlado EF-1400 de la casa BAS en modo HDME. El área de la gota
de mercurio fue 6.70·10–3 cm2. El electrodo de referencia fue un electrodo de plata-
cloruro de plata BAS MF-2052 y el contraelectrodo fue de platino BAS MW-1034. Los
parámetros de la voltametría de pulso diferencial fueron ampltud de pulso 0.050V,
anchura de pulso 0.05 s y duración del pulso 0.2 s.

Para los análisis de los productos de electrolisis se utilizó un cromatógrafo de gases

Shimadzu GC-2010 con una columna capilar de 30 m de longitud y 0.25 mm de
diámetro HP-5MS (J&W Scientific, Folsom, CA, USA) acoplado con un espectrómetro
de masas de la misma casa operando en modo IE a 70 eV.

El cromatógrafo de gases estaba equipado con un sistema de inyección split/splitless y

se trabajó en modo Splitless.

3.3.2. Células y electrodos

Todas las medidas se llevaron a cabo en células de 25 ml de capacidad provistas de

camisas termostáticas. Las células poseen entrada para los electrodos, el termómetro y
el nitrógeno.

 Electrodos de trabajo:

o Electrodo de carbón vitrificado de CH Instruments Inc modelo CHI104.

o Electrodo de pasta de carbón (de síntesis en el laboratorio) de la casa Metrohm.

 Electrodo de referencia: Ag/AgCl/3M KCl de Metrohm modelo 6.0733.100

99
Capítulo 3

 Electrodo auxiliar: Pt de Metrohm modelo 6.0301.100

 Para los experimentos de electrolisis a potencial constante, el electrodo de trabajo

fue una barra de grafito de alta densidad de Aldrich (CAS: 7782-42-5 C) protegido
con un tubo de silicona, lo que permitió el uso de un área de 75.4 mm2. El
contraelectrodo fue un cilindro de acero inoxidable.

3.3.3. Reactivos y disoluciones

Los reactivos empleados fueron: 3,4-metilendioxifenol (sesamol), de Aldrich; ácido

acético (HAc), ácido fosfórico (H3PO4), bicarbonato sódico (NaHCO3), hidróxido
sódico (NaOH) y cloruro de sodio (NaCl), de Merk; 4-piridincarboxinamida
(isonicotinamida), de Sigma. Ácido Gálico (AG), 2,4-Dihidroxibenzaldehído y 2,5-
Dihidroxibenzaldehído, de calidad analítica de Sigma-Aldrich.

En el intervalo comprendido entre pH = 1.5 y pH = 8 se utilizó una disolución

reguladora de HAc y H3PO4 0.1 M en ambos componentes mientras que para pH>8 se
empleó una disolución reguladora de H3PO4 y NaHCO3 en ambos componentes de 0.05
M. A continuación, se le ajustó con NaCl la fuerza iónica, a 0.2 M para el tampón ácido
y 0.3 M para el tampón básico.

Para la determinación dela actividad antioxidante, se empleó Peróxido de Hidrógeno

(H2O2) y Etanol (EtOH) con calidad analítica, de Merck.

3.3.4. Condiciones de trabajo

La temperatura de trabajo se mantuvo constante a 25 ± 0.1ºC.

Para la limpieza del electrodo de carbón vitrificado, se realizaron etapas sucesivas de

pulido mecánico; en primer lugar con pasta de diamante (Lam Plan 0.25 micras) en un
paño suave, en segundo lugar, empleando un paño más grueso al anterior (Microcloth
de Buehler en ambos casos) con una suspensión de alúmina de 0.3 µm (alúmina A) y,
por último, una tercera etapa empleando el mismo tipo de paño que la etapa anterior
pero usando una alúmina de 0.05 µm (alúmina B). A continuación, se colocó en un baño
de ultrasonidos durante diez minutos, eliminando así los posibles residuos que pudieran
persistir de la etapa anterior. Finalmente, se procedió a una limpieza electroquímica,
mediante voltametría cíclica de barrido lineal con una disolución saturada de NaCl (–
0.4 hasta 1.4 V, 100 mV/s, 5 ciclos).

100
 Capítulo 3

Para los experimentos de electrolisis a potencial controlado se utilizaron como

electrodos de trabajo barras de grafito de 6 mm de diámetro y de 99.995% de pureza de
Sigma-Aldrich.

La concentración de trabajo para las medidas en el espectrofotómetro fue de 10-4 M y

para el estudio electroquímico de 10-3 M a excepción de aquellos casos en que se estudió
la influencia de esta variable sobre el proceso electródico. Debido a que el sesamol es
muy insoluble en agua, se partió de una disolución madre a 0.1 M de sesamol en etanol
puro.

Las disoluciones de los reactivos se realizaron con agua ultrapura, empleando un

sistema Millipore MILLI Q, y se almacenaron a temperatura ambiente. Se comprobó
que las disoluciones no se alteraban con el tiempo al menos durante todo el tiempo que
fueron utilizadas, siendo reproducibles los experimentos realizados a lo largo de varios
días.

La velocidad de barrido que se empleó fue de 100 mV/s a excepción de los casos en lo
que se estudiaba la influencia de esta variable. Para la voltametría de pulso diferencial
la velocidad fue de 10 mV/s.

Las medidas se llevaron a cabo después de eliminar la interferencia del oxígeno, para lo
cual se pasó una corriente de nitrógeno durante 10 minutos.

Las medidas se realizaron en estado no estacionario en todo el proceso a excepción de

la cronoamperometría que se llevó a cabo con agitación (estado estacionario).

Para la medida de la capacidad antioxidante por el método VPD sobre electrodo de

mercurio, la concentración de peróxido de hidrógeno en célula fue de 5·10–4 M y el
porcentaje final de etanol en célula, un 30%. Debido a que el cambio del contenido de
etanol modifica el área del pico VPD [18], las disoluciones se prepararon con una
cantidad fija de electrolito soporte, 6.9 mL, 100 μL de H2O2 0.05 M, volúmenes
variables de disolución madre de antioxidante en etanol, VAO, y completando el volumen
total con con (3 – VAO) mL de etanol puro. De esta forma, se hizo necesario preparar
una disolución diferente para cada concentración de antioxidante. Los 100 μL de H2O2
se añadieron después del resto de los componentes de la disolución y tras haberla
purgado con nitrógeno de alta pureza.

En los experimentos de electrolisis a potencial controlado, el electrodo de grafito se

pulió con papel de sílice y a continuación con alúmina de 0.3 µm. El residuo del pulido
se eliminó por sonicación en agua ultrapura durante 20 min en un baño de ultrasonidos.
Las electrolisis se realizaron con muestras de 5 mL de reactivo 1.2 a 1.5 mM, y
registrando la carga que pasa a lo largo del experimento. Para seguir el curso de la

101
Capítulo 3

electrolisis se tomaron muestras de 200 µL tras el paso de diferentes carga, se añadieron

a 1.5 mL de agua ultrapura y se registraron los espectros UV-Vis.

Las disoluciones electrolizadas se analizaron usando el método de microextracción en

fase sólida mediante fibras recubiertas por un espesor de 65 µm de polidimetilsiloxano/
divinilbenceno (Supelco) que se insertaron en viales con 3 mL de la disolución
electrolizada durante 30 min. Las fibras con los productos adsorbidos se insertaron en
el cromatógrafo de gases a 230 ºC, dejándolas 3 min antes de la inyección para la
desorción de los compuestos adsorbidos. La línea de transferencia entre el cromatógrafo
de gases y el espectrómetro de masas se mantuvo a 280 ºC. El programa de temperaturas
fue: temperatura inicial 35 ºC (5 min), aumento hasta 220 ºC a 15 ºC/min, y posterior
aumento hasta 270 ºC a 50 ºC/min, temperatura que se mantuvo durante 2 min. El
espectrómetro de masas se operó en el rango de masas m/z = 33-350. La identificación
de los productos se realizó utilizando la librería NIST 08. Cuando fue necesario se
derivatizó con anhídrido trifluoroacético [19].

3.4. Resultados y Discusión

3.4.1. Oxidación electroquímica del sesamol

[Link]. Determinación de la constante de disociación

Las reacciones de protonación/disociación ácido-base son especialmente importantes en

la electroquímica orgánica. Por ello, es esencial conocer las constantes de disociación
de las sustancias a estudiar, así como su estado de protonación en los diferentes medios.
En la bibliografía no se encontró información sobre el sesamol, aunque en Scifinder
Scholar se puede encontrar el valor de pKa de 10.08 ± 0.20 calculado mediante un
software científico [20]. En este trabajo se ha procedido a la determinación experimental
de dicha constante. En la Figura 3.1 se presentan los espectros de absorción UV-Vis
en función del pH del medio. Se aprecia que en las curvas se presentan dos bandas en
todo el intervalo de pH, con máximos de intensidades y posiciones variables alrededor
de 241 y 311 nm.

102
 Capítulo 3

Figura 3.1. Espectros de absorción UV-Vis a distintos valores de pH. Csesamol: 10-4 mol/L.
Blanco: tampón a pH dado en cada caso.

El hecho de que los espectros UV-Vis se modifiquen con el pH indica que dependen de
la acidez del medio y, por tanto, la aparición de puntos isosbésticos significa que hay
especies químicas que están involucradas en reacciones ácido-base. El átomo de
oxigeno del anillo bencénico se desprotona en medios básicos tal y como se presenta en
el Esquema 3.1:

Esquema 3.1. Disociación del sesamol.

Los valores de pK de disociación pueden obtenerse a partir de la dependencia con el

pH de las absorbancias máximas de las bandas, a 241 y 311 nm en este caso. Esta
dependencia se muestra en la Figura 3.2:

103
Capítulo 3

Figura 3.2. Variación de las absorbancias de las bandas espectrales con el pH.

En general, la variación de la absorbancia con el pH responde a la siguiente ecuación:

A − Amín
log = pH − pK a (3.1)
Amáx − A

donde A, Amáx y Amín son los valores de absorbancia independiente del pH que aparecen
cuando pH<<pKa y pH>>pKa respectivamente. A partir de esta ecuación puede
observarse que cuando la función del logaritmo sea cero nos encontraremos a un valor
de pH que será el pKa. Si representamos esta ecuación obtenemos una gráfica lineal,
como se muestra en la figura 3.3.

104
 Capítulo 3

Figura 3.3. Representación de log [(A- Amín)/ (Amáx-A)] frente al pH para λ de 241 y 311 nm.

Como la pendiente de la recta que aparece en la figura es muy próxima a la unidad, se

puede concluir que sólo existe un pKa cuyo valor corresponde a 10.1±0.1, lo que
confirma la validez del pKa calculado [20]. Las especies en disolución serán las
siguientes:

Esquema 3.2. Distribución de especies del sesamol en función del pH.

[Link]. Mecanismo de oxidación sobre electrodo de carbón vitrificado

En voltametría cíclica de barrido lineal de potencial sobre GCE, el sesamol presenta

hasta tres picos de oxidación y uno de reducción dependiendo del número de ciclos
registrado como se muestra en la figura 3.4.

105
Capítulo 3

Figura 3.4. Voltagramas cíclicos de los primeros dos ciclos a distintos valores de pH. Sesamol
1·10–3 mol/L, v: 0.1 V/s. Negro: primer ciclo. Rojo: segundo ciclo

Como puede apreciarse en la figura 3.5, resumen de las anteriores, el primer ciclo del
voltagrama muestra dos picos de oxidación, Pico1 y Pico 2, el segundo a potenciales
más positivos que el primero, y un pico de reducción, Pico 3’, a potenciales menos
positivos que el pico 1. En el segundo ciclo aparece un pico adicional de oxidación, Pico
3, a potenciales algo más positivos que el pico 3’.

106
 Capítulo 3
40
Pico 1
30
Primer ciclo Pico 2
Segundo ciclo
20

I(A)
10 Pico 3

Pico 3'
-10
-0.6 -0.3 0.0 0.3 0.6 0.9 1.2 1.5
E(V) vs. Ag/AgCl

Figura 3.5. Voltagramas cíclicos de los primeros dos ciclos a de sesamol 1·10–3 mol/L, pH =
1.74, v= 0.1 V/s.

Los picos 1 y 2 aparecen en todo el rango de pH estudiado, mientras que los picos 3 y
3’ no se observan en medios muy básicos a pH > 10.

Se registraron dos barridos en voltametría cíclica, en la secuencia oxidación-reducción,

invirtiendo el barrido a un potencial localizado después del pico 1 y antes del comienzo
del pico 2. En estas condiciones, el voltagrama correspondiente al sistema 3-3’ en el
segundo barrido es idéntico al obtenido cuando el barrido se invierte a un potencial
posterior al pico 2, como en las figuras 3.4 y 3.5. Esto quiere decir que el sistema rédox
formado por los picos 3 y 3’ está relacionado con el proceso que ocurre a los potenciales
del pico 1 y no con los procesos que tienen lugar a los potenciales en que aparece el
pico 2.

La especie que se oxida al potencial del pico 3, esto es, el producto de la reducción en
el barrido de vuelta a los potenciales del pico 3’, debe ser diferente al sesamol, puesto
que aparece a un potencial más bajo que éste. Si fuese sesamol, no aparecería un nuevo
pico. Para comprobar esta suposición se ha aplicado un potencial constante a un valor
posterior al pico 1, durante tiempos de deposición td. A continuación, se han registrado
voltagramas en la ventana de potenciales correspondientes al sistema 3-3’, en el sentido
reducción-oxidación. En la figura 3.6, se muestran resultados a diferentes tiempos de
deposición.

107
Capítulo 3

1 20
20 2 30
5 60
10 10

I/A
0

-10

-20

-0.2 0.0 0.2 0.4 0.6

E/V

Figura 3.6. Voltagramas cíclicos del sistema 3-3’ de sesamol 1·10–3 mol/L tras la deposición a
0.900 V y tiempos de deposición (en segundos) dados en la figura. Potencial de
inicio del barrido 0.600 V. La flecha indica el sentido inicial del barrido. pH = 1.80,
v= 0.1 V/s.

En otro conjunto de experimentos se obtuvieron voltagramas en las mismas

condiciones, pero en la secuencia oxidación-reducción. En la figura 3.7, se muestran
algunos resultados en función del tiempo de deposición.

1 20
20 2 30
5 60
10
10
I/A

-10

-20

-0.2 0.0 0.2 0.4 0.6

E/V

Figura 3.7. Voltagramas cíclicos del sistema 3-3’ de sesamol 1·10–3 mol/L tras la deposición a
0.900 V y tiempos de deposición (en segundos) dados en la figura. Potencial de
inicio del barrido –0.200 V. La flecha indica el sentido inicial del barrido. pH = 1.80,
v= 0.1 V/s.

108
 Capítulo 3

Los dos conjuntos de experimentos mostraron resultados muy similares: las

intensidades de los picos permanecen constantes a td ≥ 20 s, con la diferencia de que el
cociente de intensidades de pico entre los picos 3 y 3’ está próximo a la unidad en la
secuencia de barrido reducción-oxidación, y es algo menor en la secuencia inversa.

Considérese ahora la estructura del sesamol. La reacción de oxidación más plausible

que tiene lugar a los potenciales del pico 1 debe implicar la ruptura del anillo de cinco
miembros para dar, o bien 1,3-benzoquinona, o bien 1,4-benzoquinona. Pero la 1,3-
benzoquinona no existe, debido a que su estructura no sería plana y estaría altamente
impedida estéricamente, por lo que la reacción global para el pico uno propuesta es:
HO O O OCH2 OH

H O, OH
- +2e +
+
2H , H
+
CH2 + 2
O O

Esquema 3.3. Reacción global en el pico 1

La 1,4-benzoquinona sustituida formada permanece en las proximidades del electrodo

y puede reducirse en el barrido inverso a los potenciales correspondientes al pico 3’, y
la 1,4-dihidroquinona resultante se oxida en el ciclo siguiente a los potenciales del pico
3, menos positivos que el potencial de oxidación del sesamol:
O O CH2OH HO O CH2OH
+
+ 2H + 2e
O OH

Esquema 3.4. Reacción global en los picos 3’-3

Hay otras evidencias que apoyan los esquemas anteriores. En primer lugar, la
dependencia de los potenciales de pico con el pH correspondiente al sistema 3-3’ es
compatible con el proceso rédox mostrado en el esquema 3.4. Se registraron
voltagramas correspondientes al sistema 3-3’ a diferentes valores de pH con td=20 s.
Como puede verse en la Figura 3.8, los potenciales de pico de los picos de oxidación y
de reducción se desplazaron en torno a –0.059 V por unidad de pH, valor que se
corresponde con la intervención de dos iones H+ para un proceso bielectrónico
reversible, o cuasi-reversible, como es el caso de la 1,4-benzoquinona [21].

109
Capítulo 3

1.4

1.2

1.0
Pico 1
Pico 2
0.8 Pico 3
Pico 3'
EP/V

0.6

0.4

0.2

0.0

2 4 6 8 10 12
pH

Figura 3.8. Dependencias de los potenciales de pico de los picos voltamétricos con el pH de la
disolución para sesamol 1·10–3 M. v= 0.1 V/s. Para el sistema 3-3’: td=20 s.

El número de electrones que intervienen en el proceso que ocurre a los potenciales del
pico 1 puede obtenerse a partir de la comparación de los voltagramas con la señal
obtenida para la 1,4-benzoquinona. Esto se muestra en la Figura 3.9.

110
 Capítulo 3

1,4-didhidrobenzoquinona Sesamol
40
30
20

I(A)
10
0
-10
-20
-30

-0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8

E/V

Figura 3.9. Voltagramas cíclicos de 1,4-dihidroquinona y sesamol, ambos 1·10–3 M, a pH=2.5

y v=0.1 V/s.

Los picos de oxidación del sesamol y la 1,4-benzoquinona tienen intensidades muy

similares. No obstante, la intensidad de pico en voltametría depende del mecanismo de
la reacción rédox que se da sobre el electrodo y no puede utilizarse directamente para
evaluar el número de electrones que intervienen, a menos que se tenga la certeza de que
los mecanismos de los procesos comparados son idénticos.

Se ha utilizado la voltametría de convolución [22-27] para analizar los barridos de

oxidación de los voltagramas calculando la integral:

I ( )
t
J   1/ 2  d
0
(t   )1/ 2

donde I es la corriente, J la intensidad convolucionada, ν una variable de integración y

t el tiempo, que se relaciona con el potencial a través de la velocidad de barrido. De esta
manera se obtienen curvas en forma de S, con valores límite JL, independientes del
mecanismo de la reacción electródica y que vienen dados por:

JL = nFAD1/2c0

donde n es el número de electrones implicados en el proceso, A el área del electrodo y

D y c0 son el coeficiente de difusión y la concentración del reactivo en la disolución,
respectivamente.

La Figura 3.10 muestra que las corrientes límite de los voltagramas convolucionados
correspondientes al sesamol y a la 1,4-benzoquinona son muy parecidas. La pequeña

111
Capítulo 3

diferencia entre ambas es debida a la diferencia de coeficientes de difusión. En

conclusión, a los potenciales del pico 1 se intercambian dos electrones en el proceso
global.

50
Sesamol
40 1,4-dihidrobenzoquinona

J(A·s1/2)
30

20

10

0
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
E/V

Figura 3.10. Voltagramas convolucionados de los picos de oxidación de sesamol y 1,4-

dihidroquinona , ambos 1·10–3 M, a pH=2.5 y v=0.1 V/s.

Para reforzar esta conclusión, se han realizado electrolisis a potenciales más positivos
que el pico 1, pero antes de que comience el pico 2. En esos casos el color de la
disolución cambia de prácticamente incoloro a naranja. La Figura 3.11 muestra
espectros obtenidos a lo largo de la electrolisis.

1.2
Producto

1.0 0s
A 600 s
0.8 1200 s
1800 s
3000 s
0.6
Sesamol 3600 s
4800 s
0.4 6000 s

0.2

0.0
200 250 300 350 400 450 500 550 600
/nm

Figura 3.11. Espectros UV-Vis de la disolución de Sesamol 1.5·10–3 M electrolizada a diferentes

tiempos a pH 2.0. Eelectrolisis=0.900 V.

112
 Capítulo 3

El espectro UV-Vis al final de la electrolisis es muy diferente del registrado para el

sesamol, y muestra las tres bandas características del anillo de 1,4-benzoquinona [28],
centradas a 380 nm, 290 nm y 250 nm, en este caso.

El número de electrones que intervienen en el proceso de oxidación se obtuvo de la

pendiente de la representación de la carga que pasa durante la electrolisis vs. los moles
de sesamol oxidado. Esto se muestra en la Figura 3.12, para la cual la pendiente de la
recta es de 2.02, por lo que se confirma que el proceso global es bielectrónico.

12

10

8
q/F

0
0 1 2 3 4 5 6
mol electrolizados

Figura 3.12. Dependencia de la carga con la cantidad de sesamol convertida en la electrolisis de

sesamol 1.5·10–3 M a pH 2.0. Eelectrolisis=0.900 V.

Dado que son necesarios dos faradays por mol de sesamol electrolizado para obtener el
producto de la oxidación, se realizó una electrolisis total de una disolución de sesamol,
pasando la cantidad de carga correspondiente. La disolución resultante se analizó con
microextracción en fase sólida y un sistema de cromatografía de gases-espectrometría
de masas (ver materiales y métodos) y tras varios intentos cambiando las condiciones
experimentales se llegó a la conclusión de que el punto de ebullición del producto
sobrepasa la temperatura operativa del cromatógrafo. Por lo tanto, se llevó a cabo una
derivatización con anhídrido trifluoroacético y se identificó un derivado fluorado de
(hidroximetoxi)-1,4-benzoquinona.

En la figura 3.9 se observa también que el pico de oxidación de la 1,4-dihidroquinona

aparece a potenciales más positivos que el pico 1, esto es, la 1,4-dihidroquinona se
oxida a potenciales menores que el sesamol. Además, el proceso rédox del sistema 3-3’

113
Capítulo 3

es muy parecido al correspondiente a la 1,4-dihidroquinona, como se aprecia en la

Figura 3.13.

1,4-dihidrobenzoquinona
1.0
Sistema 3-3' del
sesamol tras la
deposición
0.5
I/IP
0.0

-0.5

-1.0
-0.1 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
E/V

Figura 3.13. Voltagramas cíclicos normalizados de 1,4-dihidroquinona y el sistema 3-3’ del

sesamol tras la deposición a un potencial de 0.900 V, a pH=2.5 y v=0.1 V/s.

Los menores potenciales encontrados para el sistema 3-3’ pueden atribuirse a la

presencia del sustituyente en posición 3. El grupo hidroximetoxilo es fuertemente
activante debido al efecto resonante del átomo de oxígeno unido al anillo, y la carga
negativa originada sobre el anillo facilita la oxidación con respecto al compuesto no
sustituido.

Todos estos hechos y conclusiones indican que el mecanismo del proceso mostrado en
el esquema 3.4 debe ser muy similar, si no el mismo, al de la oxidación-reducción de
la 1,4-dihidroquinona.

Se trata a continuación de caracterizar el mecanismo de oxidación del sesamol, a los

potenciales del pico 1.

En la Figura 3.14 se presentan los voltagramas de sesamol a diferentes velocidades de

barrido.

114
 Capítulo 3

60 50 mV/s
70 mV/s
100 mV/s
40 150 mV/s
200 mV/s

Ip/A
250 mV/s
20 300 mV/s
400 mV/s

-20

-0.5 0.0 0.5 1.0 1.5

E/V

Figura 3.14. Voltagramas cíclicos del primer ciclo a diferentes velocidades de barrido. csesamol:
10-3 mol/L, pH: 2.50.

En la Figura 3.15 se presenta la dependencia de las intensidades de pico (pico 1) con la

velocidad de barrido.

1.6

1.5
log (Ip/A)

1.4

1.3

1.2
1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6
-1
log (v/mV·s )

Figura 3.14. Voltametría cíclica (primer ciclo) de sesamol 10-3 M a pH: 2.50. Representación
de log Ip frente a log v.

115
Capítulo 3

La pendiente de la recta es 0.48, próxima al valor de 0.5 que caracteriza los procesos
controlados por difusión, lo cual sugiere que la adsorción sobre el electrodo, de haberla,
es débil.

Por otro lado, en la Figura 3.15 se presenta la dependencia del potencial de pico con la
velocidad de barrido. Las pendientes de las representaciones del potencial de pico frente
al logaritmo de la velocidad de barrido son de 13 y 15 mV, para los picos 1 y 2
respectivamente.

1.40
1.35
1.30 Pico 2

1.25
EP/V

1.20

0.75
Pico 1
0.70
0.65
0.60
1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6
-1/2
log(v/V·s )

Figura 3.15. Voltametría cíclica (primer ciclo) de sesamol 10-3 M a pH: 2.50. Representación
de Ep frente a log v.

Las intensidades de pico son independientes del pH del medio, salvo en medios
fuertemente ácidos, donde aumenta muy ligeramente, lo que quiere decir que no hay en
principio cambios de mecanismo al modificarse la acidez del medio.

En la Figura 3.16 se presentan voltagramas cíclicos a pH 1.30 y diferentes valores de

concentración.

116
 Capítulo 3

50
-4
2.0·10 M
-4
40 4.0·10 M
-4
8.0·10 M
30 -3
1.2·10 M
-3

I/A
1.6·10 M
20

10

-10

-0.5 0.0 0.5 1.0 1.5

E/V

Figura 3.16. Voltagramas cíclicos del primer ciclo a diferentes concentraciones de sesamol a
pH 1.30 y 0.1 V/s.

A concentraciones bajas se aprecia solamente el pico 1 de oxidación del sesamol

mientras que a concentraciones más altas va apareciendo un pico cuya morfología puede
verse de manera más detallada en la Figura 3.17.

40 Primera vuelta
Segunda vuelta
I/A

20

-0.5 0.0 0.5 1.0 1.5

E/V

Figura 3.17. Voltagramas cíclicos del primer y segundo ciclos de sesamol 1.6·10–3 M a pH
1.30 y 0.1 V/s.

117
Capítulo 3

Este pico no se observa a bajas concentraciones, pero crece a medida que se aumenta la
concentración. Además, su forma es simétrica, no asimétrica como cabría esperar para
un voltagrama correspondiente a un proceso de oxidación donde el transporte de las
especies que participan en la reacción redox se realiza fundamentalmente por difusión.
Además, este pico aparece en el primer ciclo, pero desaparece en el segundo y
siguientes. Todo ello indica que este pico corresponde a un proceso de adsorción sobre
el electrodo [29].

La representación la intensidad de pico frente a la concentración es lineal, mientras que

no hay variación en el potencial de pico con esta variable.

En la Figura 3.18 se muestran voltagramas convolucionados en diferentes condiciones

experimentales.

50 50
50 mV/s pH = 2.00 pH=10.25
150 mV/s pH = 4.50 pH=12.00
40 200 mV/s 40 pH = 7.00
600 mV/s
30 900 mV/s 30
1/2
1/2

I/A·s
I/A·s

A B
20
20

10
10

0
0
450 600 750 900 1050 -200 0 200 400 600 800 1000
E/mV E/V

-4
2.0·10 M
60 -4 C
4.0·10 M
-4
8.0·10 M
-3
1.2·10 M
1/2

40 -3
1.6·10 M
I/A·s

20

400 500 600 700 800 900

E/mV

Figura 3.18. Voltagramas convolucionados del primer pico de oxidación del sesamol.
A) pH= 2.00; c= 1·10–3 M. B) c= 1·10–3 M; v = 0.1 V/s. C) pH = 2.00; v = 0.1 V/s.

118
 Capítulo 3

Como puede observarse, la intensidad límite convolucionada es independiente de la

velocidad de barrido, como cabe esperar si los procesos están controlados por difusión,
lo cual sugiere, como ya se ha apuntado, que la adsorción sobre el electrodo, de haberla,
es débil.

Además, la intensidad límite convolucionada varía linealmente con la concentración de

sesamol como se aprecia en la Figura 3.19.

60
1/2

40
JLA·s

20

0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0
3 -1
c·10 /mol·L

Figura 3.19. Dependencia de la la intensidad límite convolucionada con la concentración de

sesamol. pH = 2.00; v = 0.1 V/s.

Todos estos datos indican que el proceso de oxidación debe ser de primer orden con
respecto a la concentración de sesamol.

Se pueden establecer criterios de diagnóstico para los diferentes procesos

electroquímicos utilizando análisis logarítmicos basados en la ecuación [22-27]:

E = E1/2 + b ln[f(I, J)]

donde f(I, J), E1/2 y b dependen del mecanismo concreto de la reacción electródica,
como se muestra en la Tabla 3.1.

119
Capítulo 3

Proceso f(I, J) E1/2 b

J RT
Reversible (Er) JL  J E '0
nF
I RT k0 RT
Irreversible (Ei) E'0  ln 1/f 2
JL  J nF D  nF
Reacción química I RT RT
tras un proceso Er E '0  lnk
JL  J 2nF nF
(ErCi)

Tabla 3.1. Valores de los parámetros del análisis de convolución para diferentes mecanismos.

Los barridos directos de los voltagramas se analizaron utilizando la función

correspondiente a un proceso reversible y los resultados se muestran en la Figura 3.20.
Los análisis logarítmicos del pico 3 son muy parecidos a los correspondientes al pico
de oxidación de la 1,4-dihidroquinona.

2
2
Pico 3 del
sesamol tras la
deposición
1 1
log[f(I,J)]

log[f(i,I)]

0 0

-1 -1
1,4-dihidro-
benzoquinona

-2 -2

0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 0.50 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 0.50
E/V E/V

Figura 3.20. Análisis de convolución de los barridos de oxidación con la función para procesos
Ei/ErCi a v = 0.1 V/s, c= 1·10–3 M. Izquierda: pH = 2.50. Derecha pH= 7.00

Los análisis logarítmicos del pico 3 son muy parecidos a los correspondientes a la
oxidación de la 1,4-dihidroquinona, lo cual reafirma la conclusión de que los
mecanismos en ambos casos deben ser los mismos.

120
 Capítulo 3

Sin embargo, para el pico 1 estos análisis no fueron lineales, probablemente debido a
procesos de adsorción débil, aunque los tramos a menores sobrepotenciales presentaron
pendientes en todos los casos del orden de 45 mV a pH<pKa, lo que indica que la
segunda transferencia electrónica irreversible es la etapa determinante de la velocidad
(e.d.v.) del proceso de oxidación [30, 31]. En medios básicos los análisis de convolución
resultaron aún menos lineales que a pH<10, lo que plantea una cierta incertidumbre a la
hora de establecer el mecanismo de oxidación.

Por ello se han analizado también las curvas intensidad-potencial a los potenciales
correspondientes a los pies de las ondas, en los cuales la contribución del transporte es
mínima y se pueden obtener las curvas de Tafel y los órdenes electroquímicos de
reacción.

La Figura 3.21 muestra algunas representaciones de Tafel en función del pH en las dos
zonas de pH observadas. Las pendientes de los tramos lineales a pH<pKa fueron de
43-45 mV, mientras que a pH>pKa fueron más bajas, cercanas a 32 mV. Para pH<pKa
los valores de pendiente coinciden con los correspondientes a los análisis logarítmicos
de convolución, lo que confirma que la e.d.v. del proceso de oxidación debe ser la
segunda transferencia electrónica, irreversible. Sin embargo, a pH>pKa, la pendiente
próxima a 30 mV es compatible con dos transferencias electrónicas reversibles. Puesto
que no hay un pico de reducción a potenciales muy próximos al de oxidación (menos
de 60 mV), en este rango de pH el proceso debe ser EC, siendo la e.d.v. una etapa
química posterior a las transferencias electrónicas.

-5.0 pH 2 pH 5.80
pH 4.50 pH 7
-5.0
pH 4.78 pH 8.25 pH 10.25
pH 10.50
pH 11.25
-5.5 -5.5 pH 12.01
log (I/A)
log (I/A)

-6.0 -6.0

-6.5 -6.5

-7.0 -7.0
0.2 0.3 0.4 0.5 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14
E/V E/V

Figura 3.21. Representaciones log I vs. E a los potenciales correspondientes al pie del
voltagrama convolucionado del primer pico de oxidación del sesamol a v = 0.1 V/s
y c= 1·10–3 M.

121
Capítulo 3

Utilizando estas representaciones se pueden obtener los órdenes electroquímicos de

reacción con respecto al ion H+ a partir de la pendiente de log I vs. pH a potencial
constante. En el caso de pH<pKa, el desplazamiento de las curvas es grande y el orden
puede obtenerse de la pendiente de E vs. pH, a intensidad constante, dividida por el
valor de la pendiente de Tafel. Las representaciones correspondientes se muestran en la
Figura 3.22.

E = 0.090 V
0.5 -5 E = 0.080 V
logI = -6.0
logI = -6.5
0.4 -6

log(I/A)
E/V

0.3 -7

0.2 -8

2 3 4 5 6 7 8 9 10.0 10.5 11.0 11.5 12.0 12.5

pH pH

Figura 3.22. Representaciones de E vs. pH a intensidad constante (izquierda) y de log I vs. pH,
a potencial constante (derecha) para los potenciales correspondientes al pie del
voltagrama convolucionado del primer pico de oxidación del sesamol a v = 0.1 V/s
y c= 1·10–3 M.

A partir de estas representaciones, los órdenes electroquímicos de reacción con respecto

al ion H+ fueron –1.1 y 0 en las zonas de pH comentadas.

Aunque hay una fuerte evidencia de que el proceso de oxidación es de orden unidad con
respecto al sesamol, ya que la ecuación empleada en el análisis de convolución
corresponde a procesos de primer orden, esto se ha comprobado obteniendo las
pendientes de Tafel y el orden de reacción variando la concentración de sesamol a pH
constante, como se muestra en la Figura 3.23.

122
 Capítulo 3

-5.0 -5.5
E = 0.580 V
E = 0.590 V
-5.5
log(i/A) -6.0

log(I/A)
-6.0
1.2·10-3
1.6·10-3 -6.5
-6.5
8.0·10-4
4.0·10-4
-7.0 2.0·10-4 -7.0

0.56 0.58 0.60 0.62 0.64 0.66 -3.8 -3.6 -3.4 -3.2 -3.0 -2.8
E/V log(c/mol·L-1)

Figura 3.22. Izquierda: representación de logI vs. E a pH 2.00 y a las concentraciones de

sesamol indicadas en la figura. Derecha: representación de logI vs. log csesamol a los
potenciales indicados en la figura.

Las pendientes de las representaciones de log I vs. log csesamol son muy próximas a la
unidad, lo que confirma el orden de reacción con respecto al reactivo.

Estas conclusiones se confirman también cuando se utiliza la voltametría de pulso

diferencial, VPD. Los análisis de los voltagramas DP se realizaron utilizando la
ecuación correspondiente a procesos de primero orden [32]:

L
I  4I P
(1  L)2

donde L = exp[–(E–EP)/b], IP y EP son la intensidad y el potencial de pico,

respectivamente, y b un parámetro que tiene el mismo significado que la pendiente de
Tafel o la del análisis logarítmico de convolución [32, 33].

La ecuación anterior corresponde a un pico simétrico cuya área es proporcional a la

concentración de la especie que se oxida (y también a b·IP) y al número de electrones
intercambiados en el proceso global. Los picos VPD del sesamol se ajustan bien a la
ecuación hasta los potenciales anteriores al potencial de pico y, en muchos casos, hasta
potenciales mayores que éste. No obstante, la proximidad de la descarga del electrolito
soporte origina una distorsión a altos sobrepotenciales y las curvas se distorsionan. Por
esta razón, el parámetro b se obtuvo del ajuste entre los resultados experimentales y
teóricos a potenciales por debajo del potencial de pico.

A pH<pKa los valores de b experimentales fueron de 41-43 mV, correspondientes a un

proceso bielectrónico en el cual la segunda transferencia es irreversible, siendo ésta la

123
Capítulo 3

e.d.v. [32, 33]. A pH>pKa los valores de b experimentales fueron de 32-33 mV,
correspondientes a un proceso bielectrónico en el cual ambas transferencias son
reversibles.

Así pues, se puede concluir que la molécula de sesamol para oxidarse debe primero
disociarse, siendo esta la primera etapa del proceso a valores menores que el pKa, y no
existiendo esta etapa a pH>pKa. Además, a pH<pKa la e.d.v. es la segunda transferencia
electrónica irreversible, el proceso global involucra el intercambio de dos electrones por
molécula de sesamol, los órdenes de reacción son la unidad, tanto respecto al sesamol y
al ion H+ y que el proceso global viene dado por el esquema 3.5. Con todos estos datos
se puede proponer el siguiente esquema para la oxidación a potenciales
correspondientes al pico 1:

(1)

(2)

(3)

(4)

Esquema 3.5. Primer pico. Mecanismo de oxidación del sesamol a pH<pKa.

La reacción (1) corresponde a la disociación del sesamol; la reacción (2) es la primera

transferencia electrónica que transcurre con la apertura del anillo. La reacción (4) es la
adición de OH– al catión obtenido tras la e.d.v. y contempla la posibilidad de reacción
con los propios iones hidroxilo o con el agua, según el pH sea básico o ácido,
respectivamente.

Todos los parámetros electroquímicos y cinéticos obtenidos para este pico se pueden
explicar completamente con este esquema.

Las relaciones I-E-t para este proceso pueden obtenerse utilizando la aproximación de
difusión convectiva y las condiciones de estado estacionario. Además, las ecuaciones

124
 Capítulo 3

diferenciales correspondientes a la aproximación de la capa de difusión de Nernst

pueden resolverse utilizando el método de las variables adimensionales como se hace
en la bibliografía [34-39]. Con estas aproximaciones se obtiene la siguiente ecuación
aplicable a bajos sobrepotenciales:

 (1  ) FE 
i  2FK1K 2 k 3K 'c H1cS exp 
 RT 
donde K1 y K2 son la constantes de equilibrio de las reacciones 1 y 2, k3 la constante de
velocidad de la reacción 3 a potencial cero, F la constante de Faraday y
K’=exp[(1+β)FΔφref/RT], siendo Δφref el potencial del electrodo de referencia.

De esta ecuación se deduce que los órdenes electroquímicos de reacción con respecto al
ion H+ y al sesamol deben ser –1 y 1, respectivamente, lo cual concuerda con los datos
experimentales, y que la pendiente de Tafel, con β=0.5, debe valer unos 40 mV. Todos
estos datos concuerdan con los experimentales.

A medida que aumenta el pH, el potencial de pico se hace más bajo, de manera que la
oxidación es más fácil, esto es, las transferencias electrónicas (reacciones 2 y 3) son más
rápidas y por tanto se hacen más reversibles. Por eso, a pH>pKa las pendientes de Tafel
disminuyen y la reacción (3) es cuasi-reversible. Además, a estos valores de pH la
reacción (1) no se da, ya que la forma aniónica del sesamol es la especie en disolución.

En este caso, el mecanismo anterior queda reducido a las reacciones (2)-(4), siendo la
etapa (3) cuasi-reversible y a bajos sobrepotenciales, la relación intensidad-potencial
queda:

 2 FE 
i  2FK 2 K 3k 4 K 'cS exp 
 RT 
donde todos los símbolos tienen el significado ya comentado. En este caso,
K’=exp[2FΔφref/RT].

De esta ecuación se deduce que los órdenes electroquímicos de reacción con respecto al
ion H+ y al sesamol deben ser 0 y 1, respectivamente, lo cual concuerda con los datos
experimentales, y que la pendiente de Tafel, debe valer unos 30 mV. Todos estos datos
concuerdan con los experimentales.

El análisis del pico 2 es difícil debido a la proximidad de la descarga del electrolito

soporte. Como se muestra en la figura 3.8, los potenciales de pico no cambian con el
pH, excepto en medios muy básicos. Además, por debajo de pH 9, la corriente límite
convolucionada tiene el mismo valor que la correspondiente al pico 1, pero aumenta

125
Capítulo 3

hasta hacerse el doble a pH>10. Esto significa que el proceso que tiene lugar en medios
ácidos, neutro y básico es bielectrónico, mientras que en medios muy básicos es
tetraelectrónico.

El reactivo para el proceso de oxidación que tiene lugar a estos potenciales debe ser la
1,4-benzoquinona sustituida obtenida en la oxidación anterior. Dado que el potencial de
pico no depende del pH, los iones H+ u OH– no toman parte en el proceso, al menos
antes de la e.d.v. Por tanto, puede postularse que la 1,4-benzoquinona sustituida se
hidroliza por una molécula de agua para dar formaldehído y 3-hidroxi-1,4-
benzoquinona, la cual se oxida a continuación al correspondiente peróxido con la
participación de otra molécula de agua, como se muestra en el Esquema 3.6.

Esquema 3.6. Mecanismo propuesto para el pico 2 del sesamol.

En disoluciones muy básicas la hidrólisis tiene lugar por iones OH–, lo cual explica el
desplazamiento de los potenciales de pico, y el proceso de oxidación progresa más allá
del peróxido.

La actividad antioxidante del sesamol medida por las técnicas del DPPH y voltametría
cíclica es media-alta [40]. La capacidad de atrapamiento de radicales frente a ROS
medida por voltametría de pulso diferencial utilizando la oxidación de peróxido de
hidrógeno es media-baja [41]. Este carácter antioxidante del sesamol puede atribuirse a
la relativa labilidad del anillo de cinco miembros que da lugar a la quinona. La
formación de esta molécula es responsable de la actividad antioxidante del sesamol, más
que la presencia del –OH fenólico en la molécula, como se postula en la bibliografía
[42]. Además, la formación de radicales en la ruptura del anillo puede explicar
parcialmente la capacidad del sesamol para interaccionar con ROS.

126
 Capítulo 3

3.4.2. Constantes de disociación de los grupos fenólicos de ácido gálico y 2,4- y 2,5-
dihidroxibenzaldehídos en relación con sus actividades antioxidantes

En primer lugar, se determinaron las actividades antioxidantes a partir de la medida de

la disminución del voltagrama de pulso diferencial de la señal de oxidación del peróxido
de hidrógeno sobre un electrodo de mercurio en presencia de cantidades crecientes del
antioxidante [43]. Este experimento mide la interacción con los radicales producidos en
la oxidación del H2O2, la cual es una medida de la capacidad del antioxidante para el
atrapamiento de radicales y ROS. Puesto que el volumen añadido es proporcional a la
concentración, el volumen V10 que disminuye el área del pico de oxidación del peróxido
de hidrógeno en un 10% se relaciona con la actividad antioxidante, de manera que bajos
valores de V10 implican altos valores de actividad. El inverso de V10, µ10, se seleccionó
para expresar la actividad antioxidante debido a que altos valores de µ10 implican altos
valores de actividad del compuesto investigado.

Las Figuras 3.23 a 3.25 muestran los voltagramas DP de la oxidación del peróxido de
hidrógeno tras la adición de cantidades crecientes de los antioxidantes estudiados.
6 8

5 H2O2 H2O2
25 6 500
4 50 1500
75 2000
I/A
I/A

1000
3 100 4 2500

2
2
1

0 0
-0.25 -0.20 -0.15 -0.10 -0.05 0.00 0.05 -0.30 -0.25 -0.20 -0.15 -0.10 -0.05
E/V E/V

Figura 3.23. Voltagramas de pulso diferencial sobre electrodo de mercurio de H2O2 5·10–4 M en
presencia de 2,4-dihidroxibenzaldehído (2,4DHB) 5·10–3 M. Los números en la
figura indican µL en 10 mL de disolución. Izquierda: pH=10.5 Derecha: pH=12.5

127
Capítulo 3
6 8 H2O2
H2O2 100
5 50 500
75 6 1000
4 100 2000

i/A
i/A
125 2500
3 150 4

2
2
1

0 0
-0.25 -0.20 -0.15 -0.10 -0.05 0.00 0.05 -0.30 -0.25 -0.20 -0.15 -0.10 -0.05
E/V E/V

Figura 3.24. Voltagramas de pulso diferencial sobre electrodo de mercurio de H2O2 5·10–4 M en
presencia de 2,5-dihidroxibenzaldehído (2,5DHB) 5·10–3 M. Los números en la
figura indican µL en 10 mL de disolución. Izquierda: pH=10.5 Derecha: pH=12.5

6 8 H2O2
H2O2
5 10 50
20 6 100
4 30 150
200
I/A

40
I/A

3 50 4 300
60 400
2 500
2
1

0 0
-0.25 -0.20 -0.15 -0.10 -0.05 0.00 0.05 -0.30 -0.25 -0.20 -0.15 -0.10 -0.05
E/V E/V

Figura 3.25. Voltagramas de pulso diferencial sobre electrodo de mercurio de H2O2 5·10–4 M en
presencia de ácido gálico (AG) 5·10–3 M. Los números en la figura indican µL en
10 mL de disolución. Izquierda: pH=10.5 Derecha: pH=12.5

Estos resultados muestran claramente que el pico de oxidación del peróxido de

hidrógeno disminuye de intensidad a medida que aumenta la concentración de
antioxidante. Esto sucede a ambos valores de pH, pero en el medio más básico son
necesarios mayores volúmenes de antioxidante para producir la disminución. Esto es
cierto para los tres compuestos investigados.

Las Figuras 3.26 y 3.27 muestran los porcentajes de disminución del área del pico en
función de los volúmenes de antioxidante.

128
 Capítulo 3

50
2,4DHB
2,5DHB
40 AG

% disminución
30

20

10

0
0 20 40 60 80 100 120 140 160
L

Figura 3.26. Porcentaje de disminución del área del pico VPD de H2O2 5·10–4 M para los
antioxidantes a c=5·10–3 M vs. µL en 10 mL de disolución a pH 10.5.

15
2,4DHB
2,5DHB
AG
% disminución

10

0
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
L

Figura 3.27. Porcentaje de disminución del área del pico VPD de H2O2 5·10–4 M para los
antioxidantes a c=5·10–3 M vs. µL en 10 mL de disolución a pH 12.5.

El análisis de los resultados obtenidos a pH 10.5 lleva a la conclusión de que la actividad

antioxidante, reflejada en el valor de V10, para el isómero 2,4- (≈ 60 μL) es
aproximadamente el doble que el medido para el isómero 2,5- (≈ 110 μL). En cambio,
a pH 12.5 las actividades antioxidantes de ambos compuestos son similares (≈ 1800-
2000 μL), aunque ligeramente menor en el caso del gentisaldehído (2,5DHB). Es
conocido que la acción disociación de los grupos –OH es importante para comprender

129
Capítulo 3

la relación estructura-actividad de los derivados del ácido gálico con su actividad

antioxidante [44]. Por lo tanto, los cambios en las actividades antioxidantes, tanto
absolutos como relativos, podrían discutirse a la luz de la extensión de la disociación de
los grupos hidroxilo de las moléculas.

Para confirmar esta hipótesis es esencial el conocimiento de los valores de pK de estos

compuestos. Los valores de pK del ácido gálico son [45]: 4.0 (grupo carboxílico) y 8.7,
11.4 y > 13 (grupos hidroxilo), pero los valores de pK completos de los
dihidroxibenzaldehídos no se encuentran en la bibliografía y solamente hay una
referencia sobre el valor del primer pK de disociación del 2,5DHB [46]. Además, el
conocimiento de estos valores de pK será también esencial a la hora de discutir los
mecanismos de oxidación electroquímica.

Por lo tanto, se hace necesario establecer los valores de las constantes de disociación de
los dihidroxibenzaldehídos.

Las Figuras 3.28 y 3.29 muestran los espectros de absorción UV-Vis como función de
la acidez para ambos compuestos.

1.6
11.10
1.4 10.70
10.41
1.2 9.80
9.59
8.90
1.0 8.50
8.12
A 0.8 7.62
7.15
7.01
0.6 6.90
6.60
0.4 6.30
6.10
5.30
0.2

0.0
200 250 300 350 400 450
/nm

Figura 3.28. Espectros UV-Vis de 2,4DHB 1·10–5 M en función de la acidez del medio.
Los valores de pH se muestran en la figura.

130
 Capítulo 3

2.5 4.00 9.61

5.01 10.00
6.00 10.56
7.00 11.00
2.0
7.31 11.21
7.60 11.43
7.91 11.70
8.21 12.00
1.5
8.52 12.35
A 8.80 12.70
9.20 13.00
1.0

0.5

0.0
200 250 300 350 400 450 500 550 600

/nm

Figura 3.29. Espectros UV-Vis de 2,5DHB 1·10–5 M en función de la acidez del medio.
Los valores de pH se muestran en la figura.

Los espectros muestran varias bandas principales cuyas intensidades y, en menor grado,
posiciones, dependen del pH del medio.

Los puntos isosbésticos que aparecen en las figuras 3.28 y 3.29 indican que los reactivos
están involucrados en reacciones ácido-base, las cuales deben corresponder a la
disociación de los grupos hidroxilo de las moléculas (Esquema 3.7):

Esquema 3.7. Disociación de los dihidroxibenzaldehídos.

131
Capítulo 3

En el esquema anterior se ha tenido en cuenta que el grupo hidroxilo en posición 2 puede

formar un enlace de hidrógeno intramolecular con el grupo carbonilo adyacente [47]
que estabiliza el –OH. Por esta razón las secuencias de disociación más plausibles son
las que se muestran en el esquema.

Los espectros de absorción se han analizado utilizando un programa informático

desarrollado en Microsoft Visual Basic 2013, basado en otros programas desarrollados
en el Grupo Electroquímica Molecular de la UCO y utilizados previamente para
determinar las constantes de disociación de otras moléculas [48, 49]. En este programa
se supone que las bandas se pueden describir mediante la ecuación de distribución log-
normal, más que por una gaussiana o una lorenziana, la cual viene descrita por la
ecuación [50]:

  ln 1  2b(  0 ) / 1/ 2   
2

A  A0 exp  ln 2   
  b  


Donde A es la absorbancia a la frecuencia , A0 y 0 son las coordenadas del máximo,

1/2 la semianchura de la banda (anchura a la mitad de la intensidad máxima) y b es un
parámetro que determina la asimetría de la curva. Cuando b tiende a cero, la ecuación
se reduce a una curva gaussiana, es decir, la curva es simétrica.

Los espectros se han descompuesto en conjuntos de bandas integrados por el mínimo

número de bandas posible, con la condición de que los parámetros que describen dichas
bandas sean independientes tanto del pH como de la concentración, con la excepción
obvia de la absorbancia máxima. Las Figuras 3.30 y 3.31 muestran la comparación
entre los resultados teóricos y los experimentales para ambos compuestos a valores de
pH bajos y altos.

132
 Capítulo 3

1.25
A Experimental 1.5 Experimental
1.00 Total A Total
0.75 1.0
0.50
0.5
0.25
0.00 0.0
250 300 350 400 250 300 350 400 450
/nm /nm

Figura 3.30. Espectros UV-Vis de 2,4DHB 1·10–5 M. Ajuste entre los datos
experimentales y los valores teóricos generados con la función log-normal a
pH: 1.51 (izquierda) y 12.01 (derecha). Las líneas discontinuas son las
bandas individuales teóricas.

1.5 1.5

Experimental A Experimental
A 1.0 1.0
Total total

0.5 0.5

0.0 0.0
200 250 300 350 400 450 250 300 350 400 450 500 550 600
/nm /nm

Figura 3.31. Espectros UV-Vis de 2,5DHB 1·10–5 M. Ajuste entre los datos
experimentales y los valores teóricos generados con la función log-normal a
pH: 5.81 (izquierda) y 13 (derecha). Las líneas discontinuas son las bandas
individuales teóricas.

Las intensidades de las bandas obtenidas de los ajustes de los datos mostrados en las
figuras 3.30 y 3.31 presentan variaciones con el pH que, o bien comienzan en cero y
aumentan hasta alcanzar un valor máximo, o bien comienzan en un valor máximo y
disminuyen hasta hacerse cero, o bien presentan un valor máximo a valores intermedios
de pH, siendo cero a valores de pH mucho mayores y mucho menores. Los parámetros
característicos de las principales bandas se muestran en la Tabla 3.2.

133
Capítulo 3

Compuesto λ/nm Δν1/2/kK b

276.5 3.8 0.1
2,4DHB 313.3 3.8 0.15
248.0 3.0 0.0
327.0 3.3 0.16
357.0 3.0 0.0
258.0 3.3 0.15
2,5DHB 361.0 3.4 –0.05
420.0 3.4 –0.1
452.0 4.4 0.22

Tabla 3.2. Valores de los parámetros característicos de las bandas principales obtenidas de los
ajustes.

Los parámetros mostrados en la tabla 3.2 permanecen prácticamente constantes en el

rango de pH estudiado. Obviamente todas las bandas no aparecen simultáneamente a
cualquier valor de pH. Las Figuras 3.32 y 3.33 muestran las dependencias de las
absorbancias máximas con el pH.

276.5
1.4
313.3
248
1.2
329
327
1.0 357
A
0.8

0.6

0.4

0.2

0.0
2 4 6 8 10 12
pH
Figura 3.32. Espectroscopía UV-Vis de 2,4DHB 1·10–5 M. Dependencia de las
absorbancias máximas con el pH. Las longitudes de onda máximas (en nm) se
muestran en la figura.

134
 Capítulo 3

1.2
258
361
1.0
420
452
0.8
A
0.6

0.4

0.2

0.0
5 6 7 8 9 10 11 12 13
pH

Figura 3.33. Espectroscopía UV-Vis de 2,5DHB 1·10–5 M. Dependencia de las

absorbancias máximas con el pH. Las longitudes de onda máximas (en nm) se
muestran en la figura.

Si las variaciones con el pH de las absorbancias máximas de las bandas individuales son
debidas a los equilibrios ácido-base mencionados anteriormente, se debe cumplir la
siguiente expresión:

Amax  A
pH = pK + log
A - Amin

Donde Amin y Amax son los valores mínimo y máximo de las absorbancias máximas,
respectivamente, medidos a los valores de pH máximos y mínimos a los que aparece la
curva. Las representaciones de log[(Amax–A)/(A–Amin)] vs. pH deben ser líneas rectas
cuyas ordenadas corresponden al pK. Cuando las bandas aumentan con el pH, la
pendiente de la línea recta obtenida debe ser +1, mientras que en el caso contrario
(intensidades decrecientes) dicha pendiente debe ser –1. Las Figuras 3.34 y 3.35
muestran las representaciones para ambos compuestos en los rangos de pH ácido-neutro
y neutro-básico.

135
Capítulo 3

log[A/(Amax-A)]
0 276.5
313.3
248
-1
327
357
-2
5 6 7 8 9 10 11 12
pH

Figura 3.34. Espectroscopía UV-Vis de 2,4DHB 1·10–5 M. Dependencia de la log[(Amax–

A)/(A–Amin)] con el pH a las longitudes de onda máximas (en nm) mostradas en
la figura.

2
258
1 361
log[A/(Amax-A)]

452

-1

-2
7 8 9 10 11 12 13
pH

Figura 3.35. Espectroscopía UV-Vis de 2,5DHB 1·10–5 M. Dependencia de la log[(Amax–

A)/(A–Amin)] con el pH a las longitudes de onda máximas (en nm) mostradas en
la figura.

136
 Capítulo 3

Los valores de pK obtenidos de estas gráficas fueron 6.94±0.03 y 9.28±0.03, para

2,4DHB, y 8.42±0.03 y 10.93±0.03, para 2,5DHB.

El conocimiento de los valores de pK permite calcular el porcentaje de las diferentes

especies en disolución a los dos valores de pH estudiados. La existencia de grupos
hidroxilo disociados está relacionada con una mayor capacidad antioxidante, a igualdad
de número de grupos hidroxilo en la molécula. A pH 10.5 el grupo hidroxilo en posición
4- del 2,4DHB se encuentra completamente disociado (esto ocurre a pH>9, ya que el
primer pK de disociación está próximo a 7) y el grado de disociación del grupo hidroxilo
en posición 2- es aproximadamente un 94%. En el caso del 2,5DHB, el grupo hidroxilo
en posición 5- se encuentra completamente disociado a dicho pH, pero el grado de
disociación del grupo hidroxilo en posición 2- es ahora de un 37% aproximadamente.
Esto quiere decir que a pH 10.5 la forma dianiónica del 2,4DHB es unas dos veces más
abundante que la correspondiente forma dianiónica del 2,5DHB. Hay que recordar que
a este pH la actividad antioxidante del isómero 2,4- es unas dos veces la que se mide
para el isómero 2,5-.

En medios más básicos, a pH 12.5, los dos grupos hidroxilo del 2,4DHB se encuentran
completamente disociados y alrededor de un 97.5% del isómero 2,5- se encuentra en
forma dianiónica. La actividad antioxidante de este último compuesto a este pH es sólo
ligeramente menor que la correspondiente al isómero 2,4-. Por tanto, en el caso de estos
dos isómeros, es el grado de disociación de los grupos hidroxilo el factor más importante
en los valores relativos de actividad antioxidante, siendo la posición de los –OH en la
molécula un factor secundario.

En lo que concierne al ácido gálico, el hidroxilo del grupo carboxílico se encuentra

disociado a ambos valores de pH, uno de los –OH fenólicos no está disociado en
absoluto y los grados de disociación de los otros dos hidroxilos fenólicos son muy
parecidos a los del 2,5DHB. El ácido gálico es mucho más antioxidante que los
dihidroxibenzaldehídos a ambos valores de pH estudiados, lo cual se encuentra
probablemente ligado, además de a la presencia de tres grupos hidroxilo disociados, al
grupo –OH adicional unido al anillo comparado con los dihidroxibenzaldehídos.

En resumen, los resultados muestran que el pH al que se realizan los ensayos de

capacidad antioxidante es muy importante desde la perspectiva de la disociación de los
grupos hidroxilo, debido a las diferencias en los valores de las constantes de disociación
de los diferentes isómeros. Por esta razón, si se quiere conocer la posible acción
antioxidante de una molécula (o alimento, extracto, bebida, etc.) en un organismo vivo,
el ensayo debe realizarse en las condiciones más próximas posible al medio fisiológico,
esto es, en medio acuoso de fuerza iónica media-alta y a pH 7-7.5, como en el ensayo

137
Capítulo 3

CUPRAC-AOA [29]. El ensayo DPPH se realiza en metanol, un medio no acuoso, y los

ensayos voltamétricos sobre mercurio utilizando oxígeno o peróxido de hidrógeno, en
todas sus variantes, se realizan a pH básico y en el caso de las medidas por DPV a un
30% de etanol [18, 41]. Estos ensayos, aunque dan una perspectiva de las diferencias de
la capacidad antioxidante entre moléculas muy distintas, pueden llevar a conclusiones
erróneas para moléculas de la misma familia.

En esta línea, se puede concluir que la capacidad antioxidante de los derivados fenólicos
parece estar relacionada intrínsecamente con el número de hidroxilos en la molécula.
Así, cuando el número de grupos –OH en las moléculas es el mismo, la extensión de la
disociación de cada grupo en unas condiciones determinadas es esencial, mientras que
las posiciones de estos grupos en el anillo aparece como un factor secundario.

3.4.3. Mecanismo de oxidación del 2,5-dihidroxibenzaldehído sobre GCE

En voltametría cíclica de barrido lineal de potencial sobre GCE, el 2,5DHB a la

concentración 1·10–3 M presenta hasta tres picos de oxidación y uno de reducción
dependiendo del número de ciclos registrado como se muestra en la Figura 3.36.

El primer ciclo del voltagrama muestra uno o dos picos de oxidación, Pico1 y Pico 2,
el segundo a potenciales más positivos que el primero (esto solamente en medios
básicos), y un pico de reducción, Pico 3’, a potenciales menos positivos que el pico 1.
En el segundo ciclo aparece un pico adicional de oxidación, Pico 3, a potenciales más
positivos que el pico 3’.

Los picos 1 y 3’ aparecen en todo el rango de pH estudiado; el pico 2 lo hace a partir de

pH 8; finalmente el pico 3 no aparece a pH<1.5 ni a pH>10.

Como puede verse en la figura 3.36, las intensidades del pico 3 dependen del pH de
forma aparentemente aleatoria. Se podría pensar que el pico 3 y el 3’ forman un sistema
similar al que se vio para el sesamol. Para comprobar esta suposición, se realizaron
experimentos de voltametría cíclica en la zona de potenciales del sistema 3-3’, previa
preelectrolisis durante un corto tiempo (del orden de segundos) a un potencial posterior
al pico 1.

138
 Capítulo 3

Primer ciclo Primer ciclo

30 30
Segundo ciclo Segundo ciclo

20 20
pH=0.5
I/A
pH=3.0
10 10

I/A
0 0

-10 -10

-0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 -0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
E/V E/V

Primer ciclo
Primer ciclo 30
30 Segundo ciclo
Segundo ciclo

20 20 pH=6.5
pH=5.0

I/A
I/A

10 10

0 0

-10 -10

-0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 -0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
E/V E/V

Primer ciclo Primer ciclo

30 Segundo ciclo 30 Segundo ciclo
pH=9.5
20 pH=8.0 20
I/A

I/A

10 10

0 0

-10 -10

-0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 -0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
E/V E/V

Figura 3.36. Voltagramas cíclicos de los dos primeros ciclos a distintos valores de pH. 2,5DHB
1·10–3 mol/L, v: 0.1 V/s.

El proceso de oxidación al potencial del pico 3 debe ser diferente al del 2,5DHB del
pico 1, puesto que aparece a un potencial más bajo que éste. Si fuese 2,5DHB, no
aparecería un nuevo pico. Para investigar el posible proceso que ocurre a estos
potenciales, se ha aplicado un potencial constante a un valor posterior al pico 1, durante
tiempos de deposición td. A continuación, se han registrado voltagramas en la ventana

139
Capítulo 3

de potenciales correspondientes a los picos 3-3’, en el sentido reducción-oxidación. En

la figura 3.37, se muestran resultados a diferentes velocidades de barrido.

20 0.1
0.2
10 0.3
0.5
0

-10
I/A
-20

-30

-40

-50
-0.3 -0.2 -0.1 0.0 0.1 0.2 0.3
E/V

Figura 3.37. Voltagramas cíclicos del sistema 3-3’ de 2,5DHB 1·10–3 mol/L tras la deposición
a 0.600 V y un tiempo de deposición de 10 s. Las velocidades de barrido (en V/s) se
dan en la figura. Potencial de inicio del barrido 0.350 V. pH = 3.80.

En otro conjunto de experimentos se obtuvieron voltagramas en las mismas

condiciones, pero en la secuencia oxidación-reducción. En la figura 3.38, se muestran
algunos resultados en función de la velocidad de barrido.

20 0.1
15 0.2
10 0.3
0.5
5
I/A

0
-5
-10
-15
-20
-25
-0.3 -0.2 -0.1 0.0 0.1 0.2 0.3
E/V

Figura 3.38. Voltagramas cíclicos del sistema 3-3’ de 2,5DHB 1·10–3 mol/L tras la deposición
a 0.600 V y un tiempo de deposición de 10 s. Las velocidades de barrido (en V/s) se
dan en la figura. Potencial de inicio del barrido –0.300 V. pH = 3.80.

140
 Capítulo 3

Los dos conjuntos de experimentos mostraron resultados diferentes. En la Figura 3.39

se muestra la comparación a baja velocidad de barrido para ambas situaciones.

I/A -5

-10
Barrido directo
-15 Barrido inverso 1er ciclo
Barrido inverso 2º ciclo
-20
-0.3 -0.2 -0.1 0.0 0.1 0.2 0.3
E/V

Figura 3.38. Voltagramas cíclicos del sistema 3-3’ de 2,5DHB 1·10–3 mol/L tras la deposición
a 0.600 V y un tiempo de deposición de 10 s a 0.1 V/s. pH = 3.80.

El barrido directo presenta el pico 3 de oxidación y ninguno de reducción, aun cuando

se ha acumulado el producto de oxidación del pico 1 sobre el electrodo. El barrido
inverso, en su primer ciclo, presenta el pico 3’, hacia intensidades negativas, debido a
la reducción del producto de oxidación del pico 1, el cual cae prácticamente a cero en
el segundo ciclo. El pico 3 que aparece en ambos ciclos es prácticamente idéntico al que
se obtiene en el barrido directo.

Además, se han realizado experimentos cambiando el tiempo de deposición. Los

potenciales de pico permanecieron prácticamente independientes de este tiempo. En la
Figura 3.39 se presenta la dependencia de las intensidades de pico con el tiempo de
deposición a pH 2, aunque los resultados fueron similares a otros valores de pH.

La intensidad de pico del pico 1 disminuye ligeramente con el tiempo de deposición,

mientras que el pico 3 incrementa claramente su intensidad al aumentar este tiempo,
señal inequívoca de que se acumula material en la superficie del electrodo conforme se
lleva a cabo la electrolisis parcial del 2,5DHB. Esta acumulación disminuye el área
efectiva del electrodo y es la responsable de la ligera disminución de intensidad del pico
1. Por otro lado, el pico de reducción aumenta ligeramente de intensidad, lo cual es
compatible con la reducción del producto de oxidación que hay en la capa de difusión
y el acumulado en la superficie del electrodo.

141
Capítulo 3

Pico 1
35 Pico 3
30

IP/A
6
25 Pico 3
5

IP/A
20 4
3 A
15 2
1
10 0
0 25 50 75 100 125 150
td/s
5

0
0 20 40 60 80 100 120 140 160

td/s
20

16
IP/A

12
Primer ciclo
Segundo ciclo
8 B
4

0
0 20 40 60 80 100 120 140 160
td/s

Figura 3.39. Voltametría cíclica del sistema 3-3’ de 2,5DHB 1·10–3 mol/L tras la deposición a
0.600 V, pH=2.00, y v= 0.1 V/s. Dependencia de las intensidades de pico con el
tiempo de deposición. A) Picos de oxidación 1 y 3. B) Pico de reducción 3’.

Estos resultados indican que los picos 3 y 3’ no forman un par rédox, como sucedía en
el caso del sesamol. La única opción posible es que el pico 3 esté originado por procesos
de adsorción sobre el electrodo debido a la acumulación de material sobre el mismo al
potencial de deposición.

En apoyo de esta hipótesis, para el pico 3, las intensidades de pico varían de forma lineal
con la velocidad de barrido, lo que indica que el voltagrama es debido a un proceso

142
 Capítulo 3

completamente heterogéneo [29] probablemente originado por el producto de la

oxidación obtenido a los potenciales del pico 1.

Se trata a continuación de establecer el proceso global de oxidación que tiene lugar a

los potenciales del pico 1. Para ello se necesita conocer el producto de oxidación y el
número de electrones implicados en el proceso global, que debe ser compatible con
dicho producto.

Dada la estructura del 2,5DHB, las reacciones de oxidación más simples que pueden
darse en medio acuoso son las que se muestran en el Esquema 3.8.

Esquema 3.8. Posibles productos de oxidación del 2,5DHB en medios acuosos.

Es decir, se puede oxidar el grupo aldehído al correspondiente ácido carboxílico, o bien

el anillo a la correspondiente quinona, como en el caso del sesamol.

Se han realizado experimentos para comprobar si el producto de la oxidación es el ácido.

Se han registrado voltagramas cíclicos del 2,5DHB y del correspondiente ácido
carboxílico, así como de su mezcla, en las mismas condiciones experimentales. Los
resultados se muestran en la Figura 3.40.

143
Capítulo 3

75 2,5DHB
60 ácido
aldehido+ácido
45
30

I/A
15
0
-15
-30

-0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8

E/V

Figura 3.40. Voltagramas cíclicos de 2,5DHB y el correspondiente ácido carboxílico, ambos

1·10–3 mol/L, así como una disolución conjunta de los dos, a pH 2.00. v = 0.1 V/s.

El ácido 2,5-dihidroxibenzoico es electroactivo y su oxidación se da a potenciales

menores que los del 2,5DHB. Esto quiere decir que, si el aldehído se oxidase al ácido,
a los potenciales del pico el proceso de oxidación proseguiría y el pico del aldehído sería
sensiblemente mayor que el del ácido (aproximadamente el doble, si el número de
electrones implicados en la oxidación del ácido fuese de 2), contrariamente a lo que se
observa.

Además, el pico de reducción del aldehído aparece a potenciales diferentes que el ácido,
además de tener diferente intensidad. Si el ácido fuese el producto de oxidación, en el
registro de la disolución que contiene ambos componentes el pico de reducción
simplemente incrementaría su intensidad, lo que es contrario a lo encontrado
experimentalmente.

Por tanto, se puede descartar que la oxidación del 25DHB implique al grupo aldehído,
por lo que se pasa a continuación a explorar la segunda posibilidad, esto es, que la
oxidación ocurra sobre el anillo para dar una quinona.

Se han registrado voltagramas cíclicos del 2,5DHB y de la 1,4-dihidroquinona, en las

mismas condiciones experimentales. Los resultados se muestran en la Figura 3.41.

144
 Capítulo 3

1,4-dihidrobenzoquinona
30
2,5DHB

20

IP/A
10

-10

-20

-0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2

E/V

Figura 3.41. Voltagramas cíclicos de 2,5DHB y la 1,4-dihidroquinona , ambos 1·10–3 mol/L a

pH 1.30. v = 0.1 V/s.

La oxidación del 2,5DHB es muy similar a la de la dihidroquinona, tanto en los

potenciales como en las intensidades y morfología de los picos de oxidación y
reducción.

Aunque los picos de oxidación tienen intensidades muy similares, como ya se ha dicho
anteriormente, la intensidad de pico depende del mecanismo de la reacción rédox, por
lo que de nuevo se utilizará la voltamentría de convolución para la comparación.

La Figura 3.42 muestra que las corrientes límite de los voltagramas convolucionados
correspondientes al sesamol, al 2,5DHB, y a la 1,4-dihidroquinona son muy parecidas.
Las pequeñas diferencias se deben a las diferencias de coeficientes de difusión. Como
se ha visto que para el sesamol y el sistema quinona-hidroquinona se intercambian dos
electrones, a los potenciales del pico 1 se intercambian dos electrones en el proceso
global.

145
Capítulo 3

50 1,4-dihidrobenzoquinona
2,5DHB
40 Sesamol

30
J
20

10

0
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4
E/V

Figura 3.42. Voltagramas convolucionados de los picos de oxidación de sesamol, 2,5DHB, y

1,4-dihidroquinona , todos 1·10–3 M, a pH=1.30 y v=0.1 V/s.

Para reforzar esta conclusión, se han realizado electrolisis a potenciales más positivos
que el pico 1. La Figura 3.43 muestra espectros obtenidos a lo largo de la electrolisis.

3.5 2,5-DHB
100 s
3.0 200 s
500 s
2.5 700 s
1000 s
2.0
A 1300 s
1.5 1600 s
2200 s
1.0 Producto final

0.5

0.0
200 250 300 350 400 450 500
nm

Figura 3.43. Espectros UV-Vis de 2,5DHB 1.0·10–3 M electrolizada a diferentes tiempos (en la
figura) a pH 1.52 Eelectrolisis=0.700 V.

146
 Capítulo 3

El espectro UV-Vis al final de la electrolisis semejante al registrado para el producto de

electrolisis del sesamol, muy diferente del obtenido para el 2,5DHB, y muestra las tres
bandas características del anillo de 1,4-benzoquinona [28], centradas a 360 nm, 290 nm
y 260 nm, en este caso. Además, se ha comparado el espectro del producto final con el
del ácido 2,5-dihidroxibenzoico, como se muestra en la Figura 3.44.

3.5

3.0

2.5 2,5DHB
Producto final
2.0 ácido 2,5-dihidroxibenzoico
A
1.5

1.0

0.5

0.0
200 250 300 350 400 450 500
nm

Figura 3.44. Comparación de los espectros UV-Vis del 2,5DHB, el producto de electrolisis y el
ácido 2,5-dihidroxibenzoico a pH 1.52 Eelectrolisis=0.700 V.

Como puede verse, el espectro del producto final es muy diferente del obtenido en las
mismas condiciones para el ácido, lo que reafirma las conclusiones anteriores.

El número de electrones que intervienen en el proceso de oxidación se obtuvo de la

pendiente de la representación de la carga que pasa durante la electrolisis vs. los moles
de 2,5DHB oxidado. Esto se muestra en la Figura 3.45, para la cual la pendiente de la
recta es de 2.05, por lo que se confirma que el proceso global es bielectrónico.

147
Capítulo 3

25
357 nm
20 287 nm

15

q/F
10

0
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5
mol electrolizados

Figura 3.45. Dependencia de la carga con la cantidad de 2,5DHB convertida en la electrolisis

de una disolución 1.0·10–3 M a pH 1.52. Eelectrolisis=0.700 V.

Todos estos hechos y conclusiones indican que el proceso global de oxidación a los
potenciales del pico 1 corresponde a la opción de la parte inferior del esquema 3.8 (ver
página 143). Se trata a continuación de caracterizar el mecanismo de oxidación a dichos
potenciales.

La Figura 3.46 muestra algunos voltagramas a diferentes valores de pH. Como puede
observarse, en medio básico el pico de oxidación que aparece a potenciales menos
positivos (pico 1) se desdobla en dos picos que tiene aproximadamente la misma
intensidad a valor de pH suficientemente altos.

148
 Capítulo 3

1
2
25 5 4 3
7 6
20 9 8
15
11 10

I/A
10 12
5
0
-5
-10

-0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8

E/V

Figura 3.46. Voltagramas cíclicos del primer ciclo en función del pH (indicado en la figura).
2,5DHB 1·10–3 mol/L, v: 0.1 V/s.

En la Figura 3.47 se muestran las dependencias de los potenciales de pico con el pH.
Para el pico 1 se observan dos tramos lineales, el primero con una pendiente de –59
mV/pH a valores de pH<11, mientras que en medios más básicos el potencial de pico
es independiente del pH. Lo mismo sucede para el pico 2, aunque en este caso la
pendiente del primer tramo lineal es de –63 mV/pH.

Pico 1
0.6 Pico 2
Pico 3'
Pico 1 E1/2
0.4
E/V

0.2

0.0

-0.2
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
pH

Figura 3.47. Dependencia de los potenciales de pico y del potencial de onda media (voltametría
de convolución) en función del pH. 2,5DHB 1·10–3 mol/L, v: 0.1 V/s.

149
Capítulo 3

En cuanto al pico de reducción 3’, las pendientes fueron –58 mV/pH y –30 mV/pH, para
valores de pH menores y mayores que 8.2, respectivamente.

Recuérdese que los valores de pK para los grupos –OH del 2,5DHB que se han obtenido
por medidas espectrofotométricas son de 8.4 y 10.9. Los puntos de corte de las rectas
mostradas en la Figura 3.47 parecen estar relacionados con estos valores.

En la Figura 3.48 se muestran las dependencias de las intensidades de pico con el pH.
Por debajo de pH 7, las intensidades de los picos 1 y 3’ (oxidación y reducción,
respectivamente) son independientes del pH, mientras que en medios básicos hay una
disminución de intensidad con el pH asociada a las reacciones de disociación. El pico 2
tiene siempre una intensidad muy similar a la del pico 1.

Pico 1
25 Pico 2
Pico 3
Pico 3'
20
IP/A

15

10

0
0 2 4 6 8 10 12
pH

Figura 3.48. Intensidades (voltametría cíclica) en función del pH. 2,5DHB 1·10–3 mol/L.
v= 0.1 V/s.

Cuando, a la concentración de 2,5DHB 1·10–3 y a pH < 8, se aumenta la velocidad de

barrido aparece un nuevo pico de reducción, 1’ como se puede observar en la Figura
3.49.

150
 Capítulo 3

80 1 80 1

60 pH=2.03 60 pH=6.00

40 40
I/A

I/A
20 20

0 0

-20 -20

-40 3' 1' -40 3' 1'

-0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 -0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6
E/V E/V
80

0.05 V/s 60 pH=10.01

2
0.1 V/s
40 1
0.2 V/s
I/A

0.5 V/s 20
0.7 V/s
1.0 V/s 0

-20

-40 3'

-0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6

E/V

Figura 3.49. Voltagramas cíclicos del primer ciclo en función de la velocidad de barrido
(indicada en la figura). 2,5DHB 1·10–3 mol/L.

Este pico está claramente asociado a un proceso puramente heterogéneo, como lo indica
la dependencia lineal de su intensidad de pico con la velocidad de barrido reflejada en
la Figura 3.50. En realidad, este pico debe ser el complementario del pico 3’.

151
Capítulo 3

30
pH 2.03
25
pH 6.00
20

IP/A
15

10

0
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
-1
v/V·s

Figura 3.50. Voltametría cíclica (primer ciclo) de 2,5DHB 1·10–3 mol/L Pico de reducción 1’.
Representación de la intensidad de pico frente a la velocidad de barrido.

Por otro lado, la función de corriente (razón entre la intensidad de pico y la raíz cuadrada
de la velocidad de barrido) es aproximadamente independiente de la velocidad de
barrido para los picos de oxidación 1 y 2, y disminuye con esta variable para el pico de
reducción a pH < 7, como se muestra en la Figura 3.51.

Pico 1 pH 2
120 Pico 1 pH 6 Pico 3' pH 2
Pico 1 pH 10 Pico 3' pH 6
100 Pico 2 pH 10 Pico 3' pH 10

80
IP/v1/2

60

40

20

0
0.0 0.5 1.0 1.5
1/2
v

Figura 3.51. Voltametría cíclica (primer ciclo) de 2,5DHB 1·10–3 mol/L. Representación de la
función de corriente frente a la raíz cuadrada de la velocidad de barrido.

152
 Capítulo 3

Estos resultados son compatibles con que los procesos de oxidación a los potenciales de
los picos 1 y 2 se encuentran controlados principalmente por difusión, así como para el
pico de reducción en medios básicos, mientras que para la reducción a pH < 7 hay
alguna reacción química previa a las transferencias electrónicas.

Por otro lado, en la Figura 3.52 se presentan las dependencias de los potenciales de pico
con la velocidad de barrido. Las pendientes de las representaciones del potencial de pico
frente al logaritmo de la velocidad de barrido se dan en la Tabla 3.3.

Pico 1 pH 2 Pico 3' pH 2

Pico 1 pH 6 Pico 3' pH 6
Pico 1 pH 10 Pico 3' pH 10
Pico 2 pH 10
0.6

0.4
Ep/V

0.2

0.0

-0.2
-1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5
log(v/V·s-1)

Figura 3.52. Voltametría cíclica (primer ciclo) de 2,5DHB 1·10–3 mol/L Representación de los
potenciales de pico intensidad de pico frente al logaritmo de la velocidad de barrido.

pH Pico 1 Pico 2 Pico 3’

2.03 30.0 - –20.4
6.00 32.2 - –15.2
10.01 20.3 16.5 –8.3

Tabla 3.3. Valores de las pendientes (en mV) de las rectas mostradas en la figura 3.51.

En la Figura 3.53 se presentan voltagramas cíclicos a pH 2.0 y diferentes valores de

concentración.

153
Capítulo 3

50 50
5.0·10-5 M
1.0·10-4 M
I/A
40 40

I/A
2.5·10-4 M
30 5.0·10-4 M 30
7.5·10-4 M
20 1.0·10-3 M 20

10 10

0 0

-10 -10

-20 -20
-0.25 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 -0.25 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00
E/V E/V

Figura 3.53. Voltagramas cíclicos a diferentes concentraciones de 2,5DHB a pH 2.0 y 0.1 V/s.
Izquierda: primer ciclo. Derecha: segundo ciclo.

En la Figura 3.54 se muestran las dependencias de las intensidades de pico con la

concentración a pH 2.0. Estas variaciones fueron similares en el resto de los valores de
pH investigados (pH 6 y pH 10).

50
Pico 1
Pico 3
40 Pico 3'

30
IP/A

20

10

0
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
3 -1
c·10 /mol·L

Figura 3.54. Dependencia de las intensidades de pico con la concentración para 2,5DHB a pH
2.0 y 0.1 V/s.

Los potenciales de pico en todos los casos fueron prácticamente independientes de la

concentración de 2,5DHB o, en todo caso, presentaron variaciones muy escasas, del
orden de pocos mV por década de concentración.

154
 Capítulo 3

Al igual que en el caso del sesamol, se ha procedido al análisis de los voltagramas

convolucionados utilizando las funciones de la tabla 3.1. Como se puede observar en la
Figura 3.55, a bajas velocidades de barrido el análisis del pico 1 como proceso
reversible dio lugar a análisis lineales con pendientes próximas a 2.303RT/F (esto es,
unos 0.059 V), mientras que los análisis con la función para procesos irreversibles
fueron curvas.
2 2

1 1
0.2 V/s

log[F(I,J)]
log[F(I,J)]

0.1 V/s
0 0

Reversible
-1 -1
Irreversible

-2 -2
0.40 0.45 0.50 0.55 0.60 0.40 0.45 0.50 0.55 0.60 0.65
2 2
E/V E/V

1 0.5 V/s 1 0.7 V/s

log[F(I,J)]

log[F(I,J)]
0 0

-1 -1

-2 -2
0.40 0.45 0.50 0.55 0.60 0.65 0.40 0.45 0.50 0.55 0.60 0.65
2 2
E/V E/V
1 1.0 V/s 1 2.0 V/s
log[F(I,J)]

log[F(I,J)]

0 0

-1 -1

-2 -2
0.40 0.45 0.50 0.55 0.60 0.65 0.40 0.45 0.50 0.55 0.60 0.65
A A

Figura 3.55. Análisis de convolución del primer ciclo del pico 1 de 2,5DHB 1·10–3 M a pH=2.03.

Sin embargo, conforme aumenta la velocidad de barrido sucede lo contrario, esto es, se
hacen más lineales los análisis como proceso irreversible. Esto es debido a que el pico
1 debe corresponder a un proceso cuasi-reversible, como ya se había deducido del hecho
de que el pico de reducción es de menor intensidad y su potencial de pico se encuentra
relativamente separado del pico de oxidación.

Lo expuesto anteriormente sucede a valores de pH por debajo de 7-7.5. En medios más

básicos, los análisis del pico 2 fueron lineales con pendientes muy próximas a 0.059 V,
utilizando la función correspondiente a procesos irreversibles o EC, como se muestra
en la Figura 3.56.

155
Capítulo 3

9.5
10.0
1 10.5
11.0
11.5

log[f(I,J)]
0

-1

-0.15 -0.10 -0.05 0.00 0.05 0.10

E/V

Figura 3.56. Análisis de convolución del primer ciclo del pico 1 de 2,5DHB 1·10–3 M a pH=2.03,
utilizando la función correspondiente a procesos Ei/EC.

En la Figura 3.57 se muestran voltagramas convolucionados en diferentes condiciones

experimentales.

40 40 pH 2
0.05 pH 3
0.10 pH 4
30 30
0.20 pH 5
0.50 pH 6
J 0.70 J pH 7
20 20
1.0 pH 8
2.0 pH 9
10 10 pH 10
pH 11
pH 12
0 0
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
E/V E/V

Figura 3.57. Voltagramas convolucionados del barrido de oxidación de 2,5DHB 1·10–3 M.

Izquierda: pH= 2.03, velocidades de barrido indicadas en V/s. Derecha: v= 0.1 V/s.

Como puede observarse, la intensidad límite convolucionada es independiente de la

velocidad de barrido, como cabe esperar si los procesos están controlados por difusión,
lo cual sugiere, como ya se ha apuntado, que la adsorción sobre el electrodo, de haberla,
es débil.

156
 Capítulo 3

En cuanto a la evolución con el pH, las intensidades límites de los voltagramas

convolucionados permanecen constantes hasta pH 8, disminuyendo a partir de este
valor, a medida que aparece una segunda onda correspondiente al pico 2. En medios
básicos la intensidad límite del voltagrama convolucionado correspondiente al pico 1 es
aproximadamente la mitad que la obtenida para el mismo pico a pH < 7.

Además, las intensidades límites convolucionadas varían linealmente con la

concentración de 2,5DHB.

Con todos estos datos se puede proponer el siguiente esquema para la oxidación a
potenciales correspondientes al pico 1 y a valores de pH por debajo del primer pK de
disociación:

(5)

(6)

(7)

(8)

Esquema 3.9. Primer pico. Mecanismo de oxidación a pH<pK1.

157
Capítulo 3

La transferencia electrónica mostrada en la etapa 6 es reversible o cuasi-reversible,

siendo la e.d.v. la etapa 7. Esta secuencia de reacciones corresponde a un proceso total
bielectrónico de primer orden con respecto a la concentración de 2,5DHB, y también de
primer orden (en realidad orden –1) con respecto a la concentración de H+, por lo que
la dependencia del potencial de pico con el pH (o del E1/2 de los voltagramas
convolucionados como puede verse en la Figura 3.47) debe ser de –2.303RT/F ≈ –0.059
V por unidad de pH (a 25 ºC). Los resultados experimentales están de acuerdo con los
que se deducen de este esquema.

A valores de pH más altos que el pK1, pero más bajos que el pK2 (esto es entre pH 8.4
y 10.9) la reacción 5 no tiene lugar y, si el esquema de reacción se mantiene, el potencial
de pico del pico 1 debería ser independiente del pH y además sólo habría un pico de
oxidación. Sin embargo, hay una disminución de la intensidad de pico en este intervalo
de pH, lo cual debe estar asociado a la reacción 5. Por otro lado, la variación del
potencial de pico con el pH indica que hay el intercambio de un ion H+ antes de la e.d.v.
del proceso, y los análisis del pico 1 indican que hay una transferencia monoelectrónica
reversible o cuasi-reversible. Esto solamente es posible si en este intervalo de pH cambia
la especie electroactiva, con pérdida previa de un ion H+, como se muestra en el
Esquema 3.10.

(9)

(10)

(11)

Esquema 3.10. Primer pico. Mecanismo de oxidación a pK1<pH<pK2.

158
 Capítulo 3

La oxidación del dianión se daría a potenciales muy parecidos a los del monoanión, por
lo que no se observaría una discontinuidad en la dependencia del potencial de pico con
el pH. El proceso sería ahora tipo CEE, esto es, dos transferencias monoelectrónicas
(etapas 10 y 11) que ocurren a potenciales diferentes, precedidas por una etapa química
rápida. En este caso, las etapas 9 y 10 corresponden al pico 1 y la etapa 11 al pico 2.

A pH>pK2, esto es, en medios muy básicos, el proceso pasa a ser del tipo EE, desaparece
la reacción 9, y no interviene ningún ion H+ en el proceso, por lo que los potenciales de
pico no dependen del pH.

El proceso correspondiente al pico de reducción debe partir del producto (la 1,4-quinona
sustituida) y dar la correspondiente 1,4-dihidroquinona sustituida, esto es, el 2,5DHB,
por lo que el proceso debe ser bielectrónico. El punto de inflexión en la representación
del potencial de pico con el pH se corresponde aproximadamente con el primer pK de
disociación. Como la pendiente del potencial de pico con el pH es de –30 mV a pH>pK1,
–60 mV por debajo de este valor y, además, en el proceso global están implicados dos
iones H+, el mecanismo debe ser parecido al inverso del esquema 5-8, con diferencias
en la e.d.v. o en la secuencia de las reacciones. Desafortunadamente no se dispone de
datos suficientes para proponer un mecanismo de reducción.

159
Capítulo 3

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162
 Capítulo 3

Summary:
In this chapter, the oxidation mechanisms of different antioxidants are investigated to
explore their behaviors as antioxidants: sesamol, gallic acid, 2,4-dihydroxy-
benzaldehyde (2,4DHB) and 2,5-dihydroxybenzaldehyde (2,5DHB ). These compounds
act catching free radicals through the process named radical scavening.
First, it was determined the dissociation constant of sesamol by the technique of UV-
Visible (UV-Vis) spectroscopy, because it is very important to know the state of
protonation of the molecules, both for its role in the reaction mechanism, and its
behavior under physiological conditions. The facts that the UV-Vis spectra are modified
with pH and the presence of isosbestic points imply that there are chemical species
involved in acid-base reactions. The pKa value obtained from the analysis of the
dependence of the UV-Vis spectra of sesamol with the acidity of the medium was
10.1±0.1, corresponding to the dissociation of the hydroxyl group of the aromatic ring.
In the study of the oxidation of sesamol on Glassy Carbon Electrodes (GCE), two peaks
in the oxidation sweep and a peak in the reduction, were observed. In the second sweep
a new oxidation peak was obtained, related to the reduction and corresponding to a
reversible peak system of the type of 1,4-benzoquinone. Based on these data, it can be
confirmed that the process involves the transfer of two electrons.
At pH values below the pKa (as physiological pH close to 7), the first step of the
oxidation mechanism of sesamol consists the formation of an anion by the dissociation
of the hydroxyl group of the aromatic ring. In the second step, the anion is stabilized by
the breakdown of the dioxolane ring, adopting a structure of p-benzoquinone substituted
by a methoxy radical. Then, this radical loses a second electron to generate a cation, this
beig the rate determining sep, r.d.s. Finally, a OH– is added to the obtained cation,
coming from the hydroxyl ions present in the solution or from the water molecule as the
pH is basic or neutral-acid, respectively.
At pH values above the pKa, the dissociation of hydroxyl group of the aromatic ring
does not occur, since the sesamol molecule is dissociated. As the pH increases, the
oxidation peak potential shifts to less positive values, which means that the oxidation is
easier and the electronic transfers are faster. So, the process becomes more reversible.
Therefore, at pH>pKa the oxidation mechanism is quasi-reversible.
At very basic pH values the process becomes four-electron, and it can be proposed that
the mono-substituted 1,4-benzoquinone, obtained as final product at not very basic pH
values, is hydrolyzed by the action of a water molecule to give formaldehyde and 3-
hydroxy-1,4-benzoquinone, which is then oxidized to the corresponding peroxide with
the participation of another water molecule.

163
Capítulo 3

The antioxidant activity of sesamol measured by both the DPPH technique and cyclic
voltammetry is medium-high. The radical scavening capacity against ROS measured by
differential pulse voltammetric oxidation of hydrogen peroxide is medium-low. This
antioxidant character of sesamol can be attributed to the relative ease of break of the
dioxolane ring, to originate the quinone. This last molecule is responsible for the
antioxidant activity of sesamol.
The antioxidant activities of the dihydroxybenzaldehydes are determined by the
measurement of the decrease in the differential pulse voltammetry, of the oxidation
signal of hydrogen peroxide on a mercury electrode in the presence of increasing
amounts of antioxidant. This experiment measures the interaction with radicals
produced in the oxidation of H2O2, which is a measure of antioxidant capacity for
trapping radicals and ROS. The added volume is proportional to the concentration; the
volume that decreases the peak area of oxidation of hydrogen peroxide an amount of
10% (V10), is related to antioxidant activity, so that low values of V 10 involve high
antioxidant activity values. To express antioxidant activity, it was used the μ10
parameter, which is the inverse of V10. Thus, high values of parameter μ10 imply high
values antioxidant activity of the studied compound.
The results indicated that at higher pH values, a greater amount of antioxidant is
required to achieve V10. By this method, it was found that the compound with the highest
antioxidant activity is Gallic Acid, and at value of pH = 10.5 the antioxidant capacity
for 2,4DHB is about twice that for 2,5DHB. However, at pH 12.5 the antioxidant
activities of both dihydroxybenzaldehydes are very similar (slightly less in the case of
2,5DHB). Thus it can be said that the pH at which the testing of antioxidant capacity is
made is very important because it significantly affects dissociation of the hydroxyl
groups, hence the importance of knowing the values of the dissociation constants of
different isomers.
The pKa values for Gallic Acid were found in the literature, whereas the corresponding
values for the dihydroxybenzaldehydes were not found there, so they were
experimentally determined by UV-Vis spectroscopy measurements. For 2,4DHB the
pKa values obtained were 6.94 ± 0.03 and 9.28 ± 0.03, corresponding respectively to the
dissociations of the hydroxyl groups at positions 4 and 2. For 2,5DHB the values of pKa
were 8.42 ± 0.03 and 10.93 ± 0.03 for the loss of H+ ions of the hydroxyl groups at
positions 5 and 2, respectively. For both dihydroxybenzaldehydes, the hydroxyl group
in position 2 is dissociated at higher pH values. This can be explained by the formation
of an intramolecular hydrogen bond with the adjacent carbonyl group, that stabilizes
this –OH group with respect to those found in positions 4 or 5.
These results confirm that at pH = 10.5 the hydroxyl group at the 4- position for 2,4DHB
is completely dissociated and the degree of dissociation of hydroxyl group at 2-position
is approximately 94%. For the 2,5-DHB the hydroxyl group at 5- position is completely

164
 Capítulo 3

dissociated, but the degree of dissociation of hydroxyl group at 2-position is

approximately 37%. That is, at pH = 10.5 the dianionic form of 2,4DHB is about twice
more abundant than the dianionic form of 2,5DHB, and at this pH value, the antioxidant
activity of the former is about twice that the one of the second. However, in more basic
conditions, like at pH = 12.5 the two hydroxyl groups are completely dissociated for
2,4-DHB, and for 2,5-DHB the amount of dianion is about 97.5%, but the antioxidant
activities of both are very similar. This indicates that the most important factor in the
relative values of antioxidant activity is the dissociation degree of the hydroxyl groups,
being secondary their position in the molecule.
Concerning the Gallic acid, the pKa values are 4.0 (carboxyl group) and 8.7, 11.4 and
>13 (hydroxyl groups). This compound is much more antioxidant than the
dihydroxybenzaldehydes at the pH values studied, due to the presence of more hydroxyl
groups in its structure, which can be oxidized, and at least one of them remains
undissociated at these pH values.
In conclusion, the pH influences significantly on the value of the antioxidant capacity
of a given compound. For molecules in food that are ingested by a living organism, the
measures must be carried out in conditions as close as possible to the physiological
medium (aqueous medium, pH7-7.5 and medium-high ionic strength).
It was also studied the oxidation mechanism of 2,5-DHB on GCE. The voltammograms
of this compound showed up three oxidation peaks and one reduction peak, depending
on the number of cycles recorded. The possible oxidation products of this molecule
could be the 2,5-dihydroxybenzoic acid (due to oxidation of the aldehyde group) or
formyl-p-benzoquinone (due to oxidation of biphenolic ring).
2,5-dihydroxybenzoic acid is also an electroactive compound, being its oxidation
potential on GCE lower than the obtained for 2,5-DHB. So, if the aldehyde is oxidized
to the acid at potentials corresponding to the main oxidation peak, the oxidation process
must continue and the aldehyde peak would be significantly higher than the acid peak,
which does not occur at all. In addition, the reduction peak of the aldehyde on the reverse
sweep appears at different potential than that obtained for the acid and with a different
intensity. If the oxidation product of 2,5 DHB were the acid, in the tests performed with
a mixture of both compounds, the reduction peak must increase in intensity, contrary to
that was obtained experimentally. In addition, the oxidation product of 2,5DHB and 2,5-
dihydroxybenzoic acid were compared by UV-Vis spectrometry, concluding that the
spectra were very different. Therefore, it can be ruled out that the oxidation of 2,5-DHB
does not involve the aldehyde group.
With respect to the option in question of the formyl-p-benzoquinone, there has been
observed a great similarity between the oxidation product of 2,5DHB with p-
benzoquinone and the oxidation product of (potentials, intensities and morphology of

165
Capítulo 3

oxidation and reduction peaks) using the convolution voltammetry to compare the
results. Small variations were observed, due only to differences in the diffusion
coefficients and the low influence of the non hydroxylic substituents in the ring, being
as in the case of sesamol and hydroquinone, a process in which two electrons are
exchanged. The UV-Vis spectrum of the final product of electrolysis of 2,5-DHB shows
the three characteristic bands of 1,4-benzoquinone ring, located at 360 nm, 290 nm and
260 nm. This way it can confirm that the oxidation product for 2,5-DHB is the formyl-
p-benzoquinone.
Based on the electrochemical results and values of the dissociation constants it is
concluded that at pH <pK1 the mechanism involves a first step corresponding to the loss
of a H+ ion from the –OH group in position 5, followed by a first quasi-reversible
electronic transfer to give a radical, which losses a proton in a third step, corresponding
to the r.d.s. Then, it takes place the second electron transfer to give the substituted 1,4-
benzoquinone. At pH values higher than pK1 but lower than pK2 (pH 8.4-10.9), the
electroactive species changes to the anion, which losses an ion H+ to give the dianion.
The process is now of CEE type, that is, two electron transfers occur at different
potentials, preceded by a fast chemical step. A pH> pK2 the process becomes of the EE
type, and no H+ ions are involved in the process.

166
 CAPÍTULO IV

COMPOSICIÓN DE
EXTRACTOS ALIMENTARIOS
EN RELACIÓN CON LA
CAPACIDAD ANTIOXIDANTE
 Capítulo 4

4.1. Introducción
El Té es la tercera bebida más consumida en el mundo, después del agua y el café, de
ahí que sea de especial interés conocer su composición y sus propiedades. Se elabora
con hojas de la planta “Camellia Sinensis Sinensis” estribando la diferencia entre cada
tipo de té en el proceso que se aplica después de la cosecha. Es originaria de China,
aunque hoy se cultiva en todo el mundo: China, Japón, India, Sri Lanka y Taiwán, e
incluso hay países africanos productores, como Kenia.

Canasta de hojas de té en una plantación

de “Camellia Sinensis Sinensis”

El Té Blanco está considerado como el más exquisito y refinado. En lugar de hojas

enteras, se recogen a mano sólo los brotes más tiernos y jóvenes durante pocos días cada
primavera. El vello blanco que recubre la hoja nada más nacer da nombre a esta
variedad. Los brotes se extienden sobre grandes filtros donde se marchitan bajo
ventilación controlada, y se secan con la ayuda de esta ventilación. Finalmente se secan
a baja temperatura evitando romperlos, para no afectar su color o aroma.
El Té Negro es el más famoso y consumido en Reino Unido. Se elabora enrollando hojas
cosechadas después de marchitarse, rompiendo las paredes celulares y ocasionando la
pérdida del líquido celular. Se fermenta a 35-40 °C y el color verde original de las hojas
pasa a tonos que van del marrón rojizo, hasta el negro intenso, cuando la oxidación es
completa. Este té conserva su sabor y aromas con el tiempo, llegando por esto a ser
empleado como moneda de cambio en la antigüedad.
El Té Rojo o “té de los emperadores” (durante muchos años su consumo estuvo
prohibido al resto de la población), tiene un sabor muy característico, fuerte y terroso,
y la infusión es de color rojizo oscuro. Es un té postfermentado que, a diferencia del Té
Negro, requiere de un proceso de maduración en bodegas que puede llegar a durar varios
años.
El Té Verde es, posiblemente, el más consumido de todos. Su principal característica es
que no está fermentado, lo que hace que mantenga sus componentes naturales
prácticamente igual que en su estado natural.
Con el término “Manzanilla” se denomina popularmente en España a un conjunto de 54
especies diferentes, siendo las más comunes: “Chamaemelum nobile” (Manzanilla

169
Capítulo 4

común o romana), “Matricaria recutita” (Manzanilla de Castilla, alemana, dulce o

cimarrona), “Matricaria aurea”, “Helichrysum stoechas” (perpetua o siempreviva) y
“Santolina chamaecyparissus” (abrótano hembra).
Son plantas con propiedades medicinales: digestiva, carminativa, sedante, tónica,
vasodilatadora y antiespasmódica. Se utiliza fresca o seca para preparar infusiones, así
como su aceite esencial en aromaterapia.

Detalle de flores de Manzanilla, y su aceite esencial

La Menta-Poleo es una hierba muy usada desde la antigüedad por griegos y romanos
para cocinar, aunque poco a poco ha ido cayendo en desuso como hierba culinaria,
pasando a utilizarse actualmente como infusión por sus propiedades carminativas,
expectorantes y antitusivas, relajantes e incluso como emenagoga (favorece la aparición
de la menstruación). Su nombre, deriva del “pulex” (pulga), en referencia a la antigua
costumbre de quemar Menta-Poleo en las casas para repeler a estos insectos.

Plantas y flores de Menta-Poleo salvajes

El Rooibos es un arbusto de origen sudafricano, cuyo nombre significa en afrikáans
“arbusto rojo”. Las infusiones se elaboran a partir de las finas hojas en forma de aguja
que crecen en las ramas más delgadas de este arbusto. La intensidad con que brilla el
tono rojo se asocia con una mayor calidad del producto.

170
 Capítulo 4

Recolección de Rooibos “Aspalathus Linearis”

La Salvia es una planta lamiácea que recibe su nombre del latín “salvare”, que significa
“curar”, en referencia a sus propiedades curativas, en especial cicatrizantes y
bactericidas. Sirve también para suavizar los síntomas de la menopausia, en especial los
sofocos, paliar los dolores antes y durante la menstruación, etc. Se emplea también como
condimento, especialmente en Italia y en recetas de influencia italiana. En España, se
emplea también en la maceración del Orujo de hierbas gallego.

Plantas de Salvia con las características flores

La Tila es una infusión que se prepara con el fruto en forma de flor de algunas de las
especies del género tilia (tilos). Es muy usada por sus propiedades antiespasmódicas,
somníferas y ansiolíticas.

Hojas y frutos de Tila secos

La Albahaca se cultiva en la India desde hace más de 5.000 años. Dependiendo de la

especie y variedad, las hojas pueden tener un sabor con un toque anisado, y un
penetrante olor fuerte, a menudo dulce. Existen muchas variedades e incluso híbridos
también llamados Albahaca. Además de las hojas se utilizan los capullos florales.

171
Capítulo 4

Planta de Albahaca

Los tipos más populares que se cultivan son: Albahaca azul africana, Albahaca anís o
persa (conocida también como Albahaca regaliz), Albahaca alcanfor o africana,
Albahaca canela, Albahaca ópalo oscuro (Albahaca “Dark Opal”), Albahaca globe,
Albahaca enana o francesa, Albahaca canosa, Albahaca morada, Albahaca spice o santa,
Albahaca limón, Albahaca de hoja de lechuga, Albahaca púrpura y Albahaca reina de
Siam o Rubin.
La Canela se extrae de la corteza interna del árbol de la Canela. La variedad
Cinamomum la componen unas doce especies de árboles. Aparte del Cinnamomum
Zeylanicum o Verum (Canela de Ceilán, la de más calidad), también se explotan el
Cinamomum Aromaticum o Cinamomum Cassia (Canela china), Cinamomum Loureioi
(Canela de Saigón) y el Cinamomum Burmanii (Canela de Vietnam).

Canela en polvo (izq.) y en rama (der.)

El Clavo que se utiliza en la cocina, son botones (flores que aún no se han abierto),
procedentes del árbol del Clavo o clavero (Syzygium aromaticum), de la familia
Myrtaceae, nativo de Indonesia. Su nombre procede de su similitud con los Clavos
metálicos. Los Clavos se cosechan principalmente en Indonesia y Madagascar,
Zanzíbar, India y Sri Lanka. Debido a su contenido en eugenol, es un buen remedio
casero para el dolor de muelas. Es muy tradicional en la India.

172
 Capítulo 4

Clavo en grano (izq.) y molido (der.)

El Comino es la semilla de la planta herbácea Cuminum Cyminum, originaria de la
cuenca del Mediterráneo y, por tanto, muy popular en la dieta mediterránea. Sus
principales usos, fuera de la gastronomía, son: tónico estomacal, estimulante intestinal
(para tratar la inapetencia, estreñimiento, aerofagia o digestiones pesadas) y en
tratamiento de afecciones broncopulmonares (poder analgésico y antimicrobiano).

Comino en grano (izq.) y Comino molido (der.)

La Cúrcuma se obtiene del extracto de la planta (tallos y raíces) que le da nombre

(Curcuma Longa). Se utiliza como Cúrcuma (extracto crudo) y como curcumina (estado
purificado o refinado). Es muy poco estable en presencia de la luz, pero su estabilidad
mejora añadiendo zumos cítricos. En algunos países de Sudamérica se conoce como
“palillo de azafrán”, “yuquilla” o “azafrán de raíz”. Tiene potentes propiedades
antiinflamatorias, antioxidantes y anticancerígenas.

Raíces de Cúrcuma y Cúrcuma en polvo

El Jengibre o quion (Zingiber officinale) es una planta de la familia de las zingiberáceas,

de cuyos rizomas se extrae la especia.
En el este de Estados Unidos existe la especie Asarum canadense, o Jengibre silvestre,
que no está emparentada con el verdadero Jengibre, pero tiene propiedades aromáticas
parecidas; sin embargo, no se debe utilizar como sustituto del Jengibre, ya que contiene
ácido aristolóquico (también llamado aristoloquina), un agente cancerígeno.

173
Capítulo 4

Entre sus numerosas propiedades, aparte de las gastronómicas, es digestivo,

antiemético, antibiótico, bueno para el aparato respiratorio (mitigando los síntomas de
la sinusitis, resfriado, fiebre y gripe), relajante muscular y articular, etc.

Raíz de Jengibre seca (izq.) y Jengibre en polvo (der.)

El Orégano como especia son hojas del Origanum vulgare (Orégano común), tanto
secas como frescas, es muy utilizado en la dieta mediterránea. Entre sus muchos
beneficios es antibacteriano, antioxidante, antifúngico, antiinflamatorio,
antihistamínico, alivia enfermedades de la piel, combate enfermedades respiratorias,
descongestivo nasal y pulmonar, alivia dolores musculares y articulares, disminuye los
cólicos menstruales, alivia malestar estomacal, estimulante inmunológico, etc.

Hojas de Orégano frescas (izq.) y secas (der.)

La Nuez Moscada se obtiene de la endosperma de la semilla del árbol mirística o árbol

de la Nuez Moscada (Myristica), que es un género de árboles perennifolios de la familia
de las Myristicaceae procedentes de las Islas de las Especias (islas Molucas, Indonesia).
A concentraciones altas se ha utilizado como un fuerte alucinógeno y psicodélico.

Nuez Moscada entera (izq.) y rallada (der.) Detalle del fruto de la Nuez Moscada

174
 Capítulo 4

El Romero se obtiene de las hojas de la planta Rosmarinus officinalis, procedente de la

región mediterránea. Presenta muy buenas propiedades culinarias y debido a sus efectos
estimulantes y tónicos favorece la recuperación de las enfermedades respiratorias y del
aparato digestivo. Es rico en antioxidantes, y por sus propiedades bactericidas puede
servir como complemento de un tratamiento con antibióticos y algunos casos de
enfermedades de transmisión sexual. En uso externo sirve para mitigar dolores
musculares y calambres producidos por el esfuerzo físico, así como para desinflamar o
relajar los pies, tratar la alopecia, fortalecer uñas frágiles y quebradizas, combatir el mal
aliento, aliviar las llagas y las inflamaciones bucales, etc. También se emplea como
ambientador y como purificador de agua contaminada con bacterias (hervir el agua
contaminada con planta seca de Romero, elimina completamente las bacterias).

Romero

El género Thymus lo forman unas 1500 especies de plantas aromáticas herbáceas y

perennes, conocidas comúnmente como Tomillo, siendo el más habitual el Thymus
Vulgaris. Son especies ampliamente distribuidas por Europa, África del Norte y Asia.
El Tomillo es muy habitual en la cocina mediterránea. Tiene propiedades, carminativas,
antipútridas, es estimulante digestivo, antibiótico natural, emenagogo, antirreumático,
tranquilizante, evita los síntomas del mal de altura, alivia dolores de cabeza, antifúngico
en las uñas de las manos, combate problemas bucales como llagas, caries y mal aliento,
también es repelente de mosquitos junto con la Albahaca, etc.

Ramas de Tomillo (a los lados) y Tomillo seco

Estas infusiones y especias se usan extensamente y contienen, entre otros componentes,

diferentes tipos y proporciones de antioxidantes. El conocimiento de su composición,

175
Capítulo 4

sobre todo de los extractos en agua, aunque también de los extractos alcohólicos, es
indudablemente importante a la hora de explicar su actividad como antioxidantes. Por
esta razón se han seleccionado para este trabajo.

176
 Capítulo 4

4.2. Objetivos del capítulo

En este capítulo, nos centramos en determinar la composición de los extractos acuosos
y metanólicos en diferentes muestras de té, infusiones y especias. Los tés analizados
han sido: Té Blanco con un toque de Vainilla y Té Negro de la marca Hornimans, Té
Rojo, Té Verde y Mezcla de tres tés de la marca Hacendado. Las infusiones analizadas
han sido: Manzanilla, Menta-Poleo, Rooibos sabor Ciruela, Salvia y Tila de la marca
Hacendado. Las especias analizadas han sido: Albahaca, Canela en polvo, Canela en
rama, Clavo, Comino, Cúrcuma, Jengibre, Nuez Moscada, Orégano, Romero y Tomillo,
todos de la marca Hacendado.
Los tés son bebidas que se toman siempre con agua, de manera que los extractos en
disolventes apolares o alcohólicos, no aportan una información real de lo que se ingiere.
En algunos artículos científicos sí se llevan a cabo extractos en agua, pero se centran
principalmente en los contenidos de polifenoles en su conjunto, sin hacer distinciones,
o simplemente evaluando la capacidad antioxidante conjunta del extracto, sin identificar
las posibles especies antioxidantes.
Las infusiones, al igual que los tés, se consumen en agua, siendo interesante estudiar su
composición y su relación con el carácter antioxidante en la forma en que se consumen.
Aunque hay trabajos sobre aceites esenciales de algunas de las plantas utilizadas en las
infusiones, su composición no es la misma que en el extracto acuoso.
Las especias, al contrario de las muestras anteriores, se ingieren con una base acuosa,
pero dependiendo de cómo se cocinen, se puede extraer también la fracción no acuosa,
bien por uso de alcoholes (vinos, coñacs, whiskies, etc.), con grasas procedentes del
propio alimento (animales o vegetales) o añadidas en el proceso de elaboración (aceites,
mantecas, mantequillas, etc.). La mayor parte de los artículos científicos publicados
hasta el momento, se centran en la composición y los antioxidantes presentes en los
aceites esenciales de las especias, sin tener en cuenta la composición de los extractos
acuosos y/o hidroalcohólicos.

4.3. Materiales y Métodos

Tanto para cromatografía de gases como para HPLC, los ensayos realizados se llevaron
a cabo por triplicado. Los resultados que se muestran en las tablas de los apartados 4.4.
y 4.5. son los valores medios obtenidos para esos compuestos, siendo la variación de
los resultados en todos los casos, menor al 5% del valor medio.

177
Capítulo 4

4.3.1. Cromatografía de Gases – Espectrometría de Masas (CG-EM)

[Link]. Preparación de las Muestras/Extractos
La preparación de muestra se llevó a cabo pesando 0.4 gramos en una balanza de
precisión Sartorius, de cada uno de los tipos de tés, infusiones y especias pasando cada
alícuota a un vaso de precipitado de 25 mL donde se le añadían 10 mL de agua ultrapura
a 100ºC que previamente se calentaban con la ayuda de un calentador de agua tipo
Kettle. Para preparar el extracto se dejaban agitando durante 3 minutos a 300 r.p.m.
Después se tomaron 4 mL de cada uno de estos extractos, y se filtraron con filtros de
0.45 µm de tamaño de poro, poniendo este filtrado en viales color topacio de 4 mL para
la concentración de la muestra. Estos viales se llevaron a un desecador, donde se
calentaron y se les pasó una corriente de nitrógeno para eliminar el disolvente. Una vez
llevados a sequedad, se añadieron 100 µL de metanol y se sonicaron. De ahí, se sacó el
contenido y se pasó a los viales para muestras concentradas de CG-EM.
Para los extractos hechos en metanol, se procedió de igual forma a la descrita
anteriormente, pero en lugar de utilizar 10 mL de agua ultrapura a 100ºC para hacer el
extracto, se añadió metanol a 60ºC.

[Link]. Método utilizado en CG-EM

Los análisis en CG-EM se realizaron con un Cromatógrafo de Gases-Espectrómetro de
Masas “Gas Chromatography-Mass Spectrum Perkin-Elmer Clarus 500” provisto de
un autoinyector para 100 viales. Las características más importantes se detallan a
continuación.
El método empleado en CG-EM consistió en una rampa de temperatura, hasta alcanzar
una temperatura máxima, la cual se mantenía durante un tiempo determinado para
asegurar que todos los componentes de las muestras pasaban por la columna y el
espectrómetro de masas. La interfase entre el cromatógrafo de gases y el espectrómetro
de masas debía estar a la misma temperatura máxima para evitar condensaciones de los
compuestos en ella.
Gas portador: Helio
Flujo de Gas portador: 0.5 mL/min
Volumen de inyección: 0.5 µL
Programa de Temperatura: rampa de 100ºC a 300ºC con un incremento de
50ºC/min, manteniendo posteriormente la temperatura de 300ºC durante 5.95 min

178
 Capítulo 4

o o o
100 C 300 C 300 C
t = 0 min t = 4.0 min t = 9.95 min

Duración total del método: 9.95 min

Tipo de columna del cromatógrafo de gases: SLB-5ms (10 m x 0.1 mm x 0.1 µm)
Temperatura del Puerto Inyector (interfase entre el CG y el MS): 300ºC
Analizador: Cuadrupolo con prefiltro (131 mm x 12 mm barras circulares / 16 mm
x 12 mm barras prefiltro)
Detector: Fotomultiplicador sellado de larga vida
Modos de Ionización: Ionización de Electrón (por defecto). Ionización Química
Positiva/Negativa (opcional).
Rango de iones seleccionado (relación masa/carga): de 50 a 500 g·mol-1·carga-1
Iones seleccionados: Positivos
Tiempo de medida del MS: de 0 a 9.95 min
Tiempo de escaneo: 0.4 segundos
Retraso interescaneo: 0.01 segundos

4.3.2. Cromatografía Líquida de Alta Eficacia (HPLC)

[Link]. Preparación de las muestras/extractos
La preparación de muestra se llevó a cabo pesando 1 g en una balanza de precisión
Sartorius, de cada uno de los tés, infusiones y especias, pasando cada alícuota a un vaso
de precipitados de 25 mL donde se le añadían 10 mL de agua ultrapura a 100ºC,
previamente calentada con la ayuda de un calentador de agua tipo Kettle, el cual para
automáticamente la calefacción cuando el agua llega a ebullición (muy utilizada en
Reino Unido). A continuación se dejaban agitando durante 3 minutos a 300 r.p.m.
Después, una parte de cada uno de estos extractos se pasó por filtros de 0.45 µm de
tamaño para eliminar los posos, restos de hojas y partículas en suspensión. El líquido
resultante se trasvasó a los viales de 1.5 mL utilizados en HPLC.

179
Capítulo 4

Para los extractos en metanol, se procedió de igual forma, pero en lugar de utilizar 10
mL de agua ultrapura a 100ºC para obtener el extracto, se añadió metanol a 60ºC.

[Link]. Método utilizado en HPLC

Los análisis en HPLC se realizaron con un High Performance Liquid Chromatography
Perkin-Elmer Flexar cuyas características más importantes se detallan a continuación.
El método utilizado en HPLC se estableció buscando la separación de las especies
existentes en las muestras en base a su polaridad, utilizando disolventes baratos y
fácilmente accesibles. Desde un principio se descartó el empleo de una fase móvil
monocomponente, ya que el análisis podría implicar más tiempo, y el uso de reactivos
más caros. Se diseñó un método que utiliza una fase móvil con dos componentes, uno
acuoso y otro alcohólico, empleándose un gradiente que iba desde un 90% de fase móvil
acuosa a un 98 % de fase móvil alcohólica. En la mayoría de las muestras no era
necesario alcanzar la máxima fracción de metanol en la fase móvil para que los
componentes saliesen de la columna y del sistema, utilizándose sobre todo esta
proporción para llevar a cabo la limpieza del sistema, en especial la columna, después
de cada medida.
En un principio, se empezó utilizando como fase móvil acuosa simplemente agua
ultrapura, pero al estar el pH muy cercano al primer pK a del ácido gálico (pKa ≈ 4.41)
[1-3], el pico de absorción se desdoblaba en dos, incluso a bajas concentraciones. El
ácido gálico es un antioxidante de gran interés y su señal a determinadas longitudes de
onda se puede relacionar con el contenido de polifenoles totales. Así pues, era de gran
interés obtener una señal más limpia y resuelta. En primer lugar, se optó por una fase
móvil de composición: agua ultrapura/acetonitrilo/metanol/acetato de etilo/ácido
acético glacial (89/6/1/3/1 en relación de volúmenes), utilizada previamente en la
bibliografía para conseguir una buena separación de picos entre la cafeína, catequina,
epicatequina y galato de epigalocatequina [4]. Esta fase móvil estaba especialmente
diseñada para discriminar estos compuestos, pero no era especialmente útil para otros
como el ácido gálico, cuya señal se mantenía como en la primera fase móvil, agua
ultrapura sola. Esto, unido a que, se buscaba un método simple, sencillo y barato para
discriminar los analitos presentes en las muestras, hizo que se descartase la segunda fase
móvil acuosa sustituyéndola por una fase móvil más sencilla y económica, que
simplemente disminuyera el pH para que compuestos como el ácido gálico se
encontraran en su forma protonada (al menos en su mayor parte), presentando picos con
una mayor resolución, sin poner en peligro el equipo por disminuir mucho el pH. Por
esta razón, se preparó la denominada Fase Móvil Ácida (F.M.A.) constituida por una
disolución acuosa de ácido clorhídrico 44·10–3 Molar (HCl) y glicina 50·10–3 M, cuyo
pH final era ≈ 2.01.

180
 Capítulo 4

Para preparar la F.M.A. se tomó agua ultrapura y se filtró con una bomba de vacío y
filtros de 0.45 µm. A continuación, se disolvieron el HCl y la glicina en el volumen
adecuado de agua ultrapura y se sometió a un baño de ultrasonidos durante 15 minutos
para asegurar la ausencia de partículas en suspensión que pudieran obstruir los
conductos del equipo de HPLC. Con esto se evitó filtrar la fase móvil una vez añadido
el HCl, que podría atacar al filtro.
La preparación de la fase móvil alcohólica, el metanol, consistió simplemente en un
filtrado tal y como se hacía para el agua ultrapura de la fase móvil acuosa.
Antes de cada serie de medidas se purgó la bomba del equipo de HPLC, durante 6
minutos con cada una de las disoluciones que componen la fase móvil (la alcohólica y
la acuosa). A continuación, se llevó a cabo el acondicionamiento de la columna (en
todos los casos una tipo C-18 de 25 cm de longitud y 5 µm de diámetro interno), para
lo cual se pasó una fase móvil al 50% en fase acuosa y 50% fase alcohólica durante 60
minutos.
Durante este tiempo se cargaba el método y se preparaban las muestras.
Datos comunes a todos los métodos desarrollados fueron:
Velocidad de muestreo: 5 pts/s
Volumen de inyección: 10 µL. La optimización del método se llevó a cabo haciendo
medidas donde se inyectaba sólo 1.0 µL para evitar obstrucciones o cualquier otro tipo
de problemas en el equipo. Posteriormente, se comprobó que al inyectar un volumen
mayor (10 µL), las señales se intensificaban, eran más fáciles de distinguir y dicho
volumen no implicaba riesgo para el equipo, por lo que se fijó como volumen de
inyección óptimo.
Velocidad de inyección: Alta (inyección completa en menos de 3 segundos).
Temperatura del Horno: ≈25±5ºC. Se fijó esta temperatura para estar en torno a la
temperatura a la que se ingieren los alimentos y/o temperatura ambiente.
Detector empleado: Detector de matriz de Diodos
Paso óptico del detector: 0.0025 inch (6.35·10–3 cm)
Lámpara: Lámpara Ultravioleta
Longitudes de Onda de medida: 254 nm, 260 nm, 275 nm, 280 nm, 325 nm, 340
nm, 355 nm, 370 nm, 385 nm y 395 nm, medidas simultáneamente.

181
Capítulo 4

Para los análisis, se emplearon varios métodos, que se fueron adaptando para cada
muestra, teniendo en cuenta el tiempo de retención de los componentes y tiempo de
limpieza que se requería tras pasar la muestra.
Los métodos puestos a punto y utilizados fueron los siguientes:

Flujo
Paso Tipo de Paso Tiempo (min) % de F.M.A. % metanol
(mL/min)
0 Equilibrado 5.0 1.0 60.0 40.0
1 Medida 6.0 1.0 90.0 10.0
2 Medida 6.0 1.0 80.0 20.0
3 Medida 6.0 1.0 70.0 30.0
4 Medida 6.0 1.0 60.0 40.0
5 Medida 6.0 1.0 50.0 50.0
6 Medida 6.0 1.0 40.0 60.0
7 Medida 6.0 1.0 30.0 70.0
8 Medida 3.0 1.0 20.0 80.0
9 Lavado 15.0 1.5 10.0 90.0

Tabla 4.1. Método empleado para el análisis en HPLC de muestras de té.

182
 Capítulo 4

Flujo
Paso Tipo de Paso Tiempo (min) % de F.M.A. % metanol
(mL/min)
0 Equilibrado 5.0 1.0 60.0 40.0
1 Medida 6.0 1.0 90.0 10.0
2 Medida 6.0 1.0 80.0 20.0
3 Medida 6.0 1.0 70.0 30.0
4 Medida 6.0 1.0 60.0 40.0
5 Medida 6.0 1.0 50.0 50.0
6 Medida 6.0 1.0 40.0 60.0
7 Medida 6.0 1.0 30.0 70.0
8 Medida 6.0 1.0 20.0 80.0
9 Medida 6.0 1.0 10.0 90.0
10 Medida 6.0 1.0 2.0 98.0
11 Lavado 15.0 1.5 2.0 98.0

Tabla 4.2. Método empleado para el análisis en HPLC de muestras de infusiones y especias.

Flujo
Paso Tipo de Paso Tiempo (min) % de F.M.A. % metanol
(mL/min)
0 Equilibrado 5.0 1.0 60.0 40.0
1 Medida 6.0 1.0 90.0 10.0
2 Medida 6.0 1.0 80.0 20.0

Tabla 4.3. Método Reference 1, empleado para los estándares: ácido gálico, cafeína,
teobromina y vainillina.

Flujo
Paso Tipo de Paso Tiempo (min) % de F.M.A. % metanol
(mL/min)
0 Equilibrado 5.0 1.0 60.0 40.0
1 Medida 6.0 1.0 90.0 10.0
2 Medida 6.0 1.0 80.0 20.0
3 Medida 6.0 1.0 70.0 30.0
4 Medida 6.0 1.0 60.0 40.0
5 Medida 6.0 1.0 50.0 50.0
6 Medida 6.0 1.0 40.0 60.0
7 Medida 6.0 1.0 30.0 70.0

Tabla 4.4. Método Reference 2, empleado para el estándar: cinamaldehído.

En todos los métodos se mantuvo el flujo constante durante las medidas (sólo se varió
en las etapas de limpieza), debido a que, si se variaba entre las etapas de “Medida”, se
observaba una fluctuación de la medida de Absorbancia, probablemente debida a la
caída o incremento de la presión en el sistema.

183
Capítulo 4

4.4. Resultados de CG-EM

La cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas, es una técnica que
permite obtener gran cantidad de información, aunque se ve limitada por la
descomposición térmica de los componentes de la muestra. Esto fue lo que ocurrió con
uno de los antioxidantes más importantes y extendidos en este estudio: el ácido gálico.
Como contrapartida, pudieron monitorizarse otros muchos compuestos realmente
interesantes y que presentan actividad antioxidante [5] como, por ejemplo: Resorcinol,
3-metoxi-1,2-bencenodiol, 1,2,3-bencenotriol, Vainillina, Eugenol, Gingerol,
Carvacrol, Timol, Hidroquinona, etc. También, compuestos característicos de
determinadas muestras: Tumerona, Eucaliptol, Mentol, Ácido Oléico, Cinamaldehído,
Ácido Cinámico, Indol, etc. Y otros compuestos que se utilizaron como factores
comunes y comparativos para la composición de las diferentes muestras de té: 2-
metilBenzaldehído + 4-metilBenzaldehído, Sacarosa, Cafeína, Teobromina…
Una vez preparada la muestra como se ha indicado anteriormente (punto [Link].), se
somete al método optimizado para estos ensayos (punto [Link].), obteniéndose como
resultados para cada muestra un cromatograma de gases y su espectro de masas, que se
estudiaron con el programa AMDIS 32 y su biblioteca (TurboMass versión V.O. 5.4.2).
Se seleccionaron los picos más característicos del cromatograma, a los cuáles el
software les atribuye varios posibles compuestos, seleccionándose aquellos que
presentan una coincidencia mayor o igual al 75% con el espectro de la biblioteca. Para
la cuantificación se ha utilizado el método del estándar externo, pero ante la
imposibilidad de tener estándares para todos los compuestos obtenidos, se relacionaron
con un estándar de cafeína pesado exactamente en balanza de precisión, y teniendo en
cuenta que la señal de base no presentaba ninguna deriva ni picos que pudiesen interferir
en las medidas. Además, como referencia adicional, tanto por el tiempo de retención
como por su cantidad, en el cromatograma, aparece siempre el pico del metanol a 0.35-
0.40 minutos, que se puso siempre en la misma cantidad y concentración como
disolvente de la muestra seca, y del que en cada caso, el equipo inyectó un volumen fijo.
Como ejemplos, se muestran algunas comparativas de los espectros de los compuestos
estudiados en los tés; en la parte superior puede verse el espectro obtenido, y abajo el
espectro del compuesto seleccionado de la biblioteca:

184
 Capítulo 4

Figura 4.1. Comparativa del espectro de masas correspondiente al Resorcinol obtenido en la

muestra de Té Blanco en agua. Arriba, espectro obtenido. Abajo, espectro de la biblioteca.

Figura 4.2. Comparativa del espectro de masas correspondiente al 1,2,3-Bencenotriol obtenido

en la muestra de Té Verde en agua. Arriba, espectro obtenido. Abajo, espectro de la biblioteca.

185
Capítulo 4

Figura 4.3. Comparativa del espectro de masas correspondiente al 1,2,4-Bencenotriol obtenido

en la muestra de Tila. Arriba, espectro obtenido. Abajo, espectro de la biblioteca.

Figura 4.4. Comparativa del espectro de masas correspondiente al 3-metoxi-1,2-Bencenodiol

obtenido en la muestra de Té Verde en agua. Arriba, espectro obtenido. Abajo, espectro de la
biblioteca.

186
 Capítulo 4

Figura 4.5. Comparativa del espectro de masas correspondiente a la Vainillina obtenido en la

muestra de Té Blanco en agua. Arriba, espectro obtenido. Abajo, espectro de la biblioteca.

Figura 4.6. Comparativa del espectro de masas correspondiente al 2 metil-Benzaldehído

obtenido en la muestra de Té Verde en agua. Arriba, espectro obtenido. Abajo, espectro de la
biblioteca.

187
Capítulo 4

Figura 4.7. Comparativa del espectro de masas correspondiente a la Cafeína obtenido en la

muestra de Mezcla de 3 Tés en agua. Arriba, espectro obtenido. Abajo, espectro de la biblioteca.

Figura 4.8. Comparativa del espectro de masas correspondiente a la Sacarosa obtenido en la

muestra de Té Blanco en metanol. Arriba, espectro obtenido. Abajo, espectro de la biblioteca.

188
 Capítulo 4

Figura 4.9. Comparativa del espectro de masas correspondiente a la Teobromina obtenido en

la muestra de Té Blanco en metanol. Arriba, espectro obtenido. Abajo, espectro de la biblioteca.

189
Capítulo 4

4.4.1. Tés
En los extractos de tés (acuosos y alcohólicos) el principal componente es la cafeína,
siendo su contenido, en el menor de los casos, superior al 69 %. Aunque cabría esperar
la detección de cantidades significativas de teobromina, esta sustancia tiene un punto de
inflamabilidad de 293 ºC [6], y carece de punto de ebullición, por lo que la mayor parte
de ella se descompone y no se detecta. Con la vainillina, lo que ocurre es que tiene un
punto de inflamabilidad de 153ºC [7], mucho menor que su punto de ebullición, cercano
a 285 ºC [7], por lo que se descompone térmicamente antes de pasar a estado gaseoso.
Los resultados de los análisis de CG-EM para las diferentes muestras de té se muestran
a continuación, haciendo especial hincapié en los compuestos característicos de cada té,
y los antioxidantes. Las tablas indican el compuesto identificado correspondiente a cada
pico significativo, su tiempo de retención, la abundancia inyectada (en %), y las partes
por millón con respecto al té seco de la muestra.

[Link]. Té Blanco

Figura 4.10. Cromatograma de gases correspondiente a la muestra de Té Blanco en agua.

Tiempo de
Compuesto Identificado Abundancia (%) p.p.m.
Retención
Resorcinol 1.0369 0.219 4.55
2-metil-Benzaldehído + 4-metil-
1.0756 0.049 1.01
Benzaldehído
3-metoxi-1,2-Bencenodiol 1.1875 0.097 2.09
1,2,3-Bencenotriol 1.499 1.973 40.48
Vainillina 1.5092 19.626 402.91
1.6439;
Sacarosa 9.937 204.02
2.1604-2.1817
Cafeína 2.538 67.880 1393.50
Teobromina 2.589 0.218 4.47

190
 Capítulo 4

Figura 4.11. Cromatograma de gases correspondiente a la muestra de Té Blanco en metanol.

Tiempo de
Compuesto Identificado Abundancia (%) p.p.m
Retención
1,2,3-Bencenotriol 1.41 2.745 31.88
Vainillina 1.4693 22.978 267.03
Sacarosa 1.695 2.203 25.64
1H-Pyrrolo[2,3-b]pyridine, 2-fenil- 2.4769 9.957 115.71
Cafeína 2.4776-2.5245 60.034 697.60
Teobromina 2.5245 0.473 5.52

En este té, hay que destacar, además de la abundante cafeína, la presencia de vainillina
(añadida), la cual, también presenta actividad antioxidante [8].

Vainillina
En la composición del extracto en metanol del Té Blanco se obtuvo Vitamina E (1.45
p.p.m.), el mayor en contenido de las 5 muestras de té. También es el té que presenta
más alto contenido en Resorcinol.

191
Capítulo 4

[Link]. Té Negro

Figura 4.12. Cromatograma de gases correspondiente a la muestra de Té Negro en agua.

Tiempo de
Compuesto Identificado Abundancia (%) p.p.m.
Retención
Resorcinol 1.0376 0.101 2.42
2-metil-Benzaldehído + 4-metil-
1.077 0.325 7.84
Benzaldehído
3-metoxi-1,2-Bencenodiol 1.1896 0.039 0.94
1,2,3-Bencenotriol 1.4623 1.906 45.82
1.6727; 2.0573-
Sacarosa 4.548 109.30
2.1918
Ácido 4-hidroxi-benzoico 1.7783-1.88308 5.102 1.23
Cafeína 2.5413 86.105 2069.05
Teobromina 2.5993 1.569 37.71

192
 Capítulo 4

Figura 4.13. Cromatograma de gases correspondiente a la muestra de Té Negro en metanol.

Tiempo de
Compuesto Identificado Abundancia (%) p.p.m.
Retención
1,2,3-Bencenotriol 1.3815 0.522 3.54
Sacarosa 1.868 1.761 11.85
Cafeína 2.4498 97.149 650.92
Teobromina 2.4919 0.224 1.53

En este té, también se obtuvo el pico más intenso de los cromatogramas para la
teína/cafeína. Hay que destacar la Mezcla de 2-metil-Benzaldehído + 4-metil-
Benzaldehído, en el extracto acuoso, que en este té representa un contenido mayor que
el resto.

2-metil-Benzaldehído 4-metil-Benzaldehído

Estos compuestos provienen de la degradación de sustancias polifenólicas encontradas

en abundancia en los brotes de té, y en menor medida en las hojas [9].

193
Capítulo 4

[Link]. Té Rojo

Figura 4.14. Cromatograma de gases correspondiente a la muestra de Té Rojo en agua.

Tiempo de Abundancia
Compuesto Identificado p.p.m.
Retención (%)
Resorcinol 1.0375 0.067 0.91
2-metil-Benzaldehído + 4-metil-
1.0768 0.266 3.63
Benzaldehído
3-metoxi-1,2-Bencenodiol 1.1886 0.024 0.32
1,2,3-Bencenotriol 1.4628 0.816 11.11
Ácido 4-hidroxi-benzoico 1.8031 0.011 0.15
Cafeína 2.5438 98.110 1734.34
Teobromina 2.5804 0.478 6.45

Figura 4.15. Cromatograma de gases correspondiente a la muestra de Té Rojo en metanol.

194
 Capítulo 4

Compuesto Identificado Tiempo de Retención Abundancia (%) p.p.m.

Cafeína 2.4497 99.978 467.52

Teobromina 2.4925 0.017 0.08

En este té también se obtuvo el pico más intenso para la teína/cafeína, sin embargo, es
el té con los valores más bajos en contenidos de los compuestos monitorizados de todos
los estudiados, a excepción de la cafeína en el extracto en metanol, que es algo mayor
que el de la Mezcla de Tres Tés.

[Link]. Té Verde

Figura 4.16. Cromatograma de gases correspondiente a la muestra de Té Verde en agua.

Tiempo de Abundancia
Compuesto Identificado p.p.m.
Retención (%)
2-metil-Benzaldehído + 4-metil-Benzaldehído 1.077 0.322 5.47
3-metoxi-1,2-Bencenodiol 1.19 0.129 2.21
1,2,3-Bencenotriol 1.564 2.175 37.25
1.744; 2.1819-
Sacarosa 10.454 178.82
2.2661
Ácido 4-hidroxi-3-metoxi-Bencenoacético 2.057 0.035 0.60
Cafeína 2.544-2.546 86.038 1471.51
Teobromina 2.6015 0.152 2.57

195
Capítulo 4

Figura 4.17. Cromatograma de gases correspondiente a la muestra de Té Verde en metanol.

Tiempo de
Compuesto Identificado Abundancia (%) p.p.m.
Retención
2-metoxi-1,4-Bencenodiol 1.126 0.071 0.82
1,2,3-Bencenotriol 1.375-1.427 2.928 33.89
Sacarosa 1.601-1.606 1.944 22.50
4-propil-1,3-Bencenodiol 1.9239 0.057 0.663
(1α,2β,3α,5β)-1,2,3,5-Ciclohexanotetrol 1.981-1.987 3.256 37.69
Cafeína 2.451-2.454 87.475 1012.53
Teobromina 2.496 0.071 0.82

El Té Verde también presenta el pico de mayor intensidad para la teína/cafeína. Presenta

una gran variedad de compuestos aromáticos con sustituyentes hidroxilo (OH–),
susceptibles de oxidarse y, por tanto, presentar un marcado carácter antioxidante. La
Vitamina E forma parte de la composición de los extractos en metanol del Té Blanco y
del Verde (0.35 p.p.m.).

196
 Capítulo 4

[Link]. Mezcla de 3 Tés

Figura 4.18. Cromatograma de gases correspondiente a la muestra de Mezcla de 3 Tés en agua.

Tiempo de
Compuesto Identificado Abundancia (%) p.p.m.
Retención
Resorcinol 1.0415 0.205 4.24
3-metoxi-1.2-Bencenodiol 1.1942 0.191 3.88
1.2.3-Bencenotriol 1.491-1.5014 2.293 46.93
Vainillina 1.5042 0.308 6.25
1.7196-1.7236;
Sacarosa 10.020 204.87
2.1842-2.2078
4-propil-1.3-Bencenodiol 2.0248 0.006 0.12
Cafeína 2.548-2.551 85.399 1746.37
Teobromina 2.595-2.600 1.482 30.33

Figura 4.19. Cromatograma de gases correspondiente a la muestra de Mezcla de 3 Tés en

metanol.

197
Capítulo 4

Tiempo de
Compuesto Identificado Abundancia (%) p.p.m.
Retención
1,2,3-Bencenotriol 1.3869 1.524 7.45
Sacarosa 1.5581 4.898 24.05
Cafeína 2.451 93.333 459.22
Teobromina 2.4986 0.075 0.37

Esta Mezcla se compone de Té Verde, Rojo y Blanco. Se podría haber determinado el

porcentaje de cada uno de los tipos de té presentes en la Mezcla si los tres hubieran sido
del mismo fabricante, pero al ser el Té Blanco estudiado, de la casa comercial
“Hornimans” en lugar de “Hacendado”, esto no se ha podido hacer. Sin embargo, se
han obtenido datos muy interesantes para este producto, como por ejemplo, que es el té
que presenta los valores más altos en compuestos como el 1, 2, 3-Bencenotriol y el 3-
metoxi-1,2-Bencenodiol, compuestos que presentan una estructura con carácter
claramente antioxidante:

1, 2, 3-Bencenotriol 3-metoxi-1,2-Bencenodiol

A continuación se muestran las tablas resumen comparativas entre los compuestos

considerados más significativos de cada uno de los tés, en extracto en agua y en metanol.

Muestras de té - Extracto en agua

Blanco Negro Rojo Verde Mezcla
Resorcinol 4.55 2.42 0.91 - 4.24
2-metil-Benzaldehído +
1.01 7.84 3.63 5.47 -
4-metil-Benzaldehído
3-metoxi-1,2-Bencenodiol 2.09 0.94 0.32 2.21 3.88
Compuesto
1,2,3-Bencenotriol 40.48 45.82 11.11 37.25 46.93
(p.p.m./g)
Vainillina 402.91 - - - 6.25
Sacarosa 204.02 109.30 - 178.82 204.87
Cafeína 1393.50 2069.05 1734.34 1471.51 1746.37
Teobromina 4.47 37.71 6.45 2.57 30.33

Muestras de té - Extracto en metanol

Blanco Negro Rojo Verde Mezcla
1,2,3-Bencenotriol 31.88 3.54 - 33.89 7.45
Vainillina 267.03 - - - -
Compuesto
Sacarosa 25.64 11.85 - 22.50 24.05
(p.p.m./g)
Cafeína 697.60 650.92 467.52 1012.53 459.22
Teobromina 5.52 1.53 0.08 0.82 0.37

198
 Capítulo 4

4.4.2. Infusiones

[Link]. Manzanilla

Figura 4.20. Cromatograma de gases correspondiente a la muestra de Manzanilla en agua.

Tiempo de Abundancia
Compuesto Identificado p.p.m.
Retención (%)
DL-Norvalina 0.4030 0.663 2.81
Butirolactona 0.5845 0.368 1.56
Glicerina 0.6466 2.937 12.42
2,4-Dihidroxi-2,5-dimetil-3(2H)-furan-3-ona 0.6550 0.364 1.54
Bencenoacetaldehído 0.7586 0.251 1.06
Timina 0.7937 0.752 3.18
1,2-Bencenodiol 1.0368 0.492 2.08
Indol 1.2764 0.137 0.58
3-Metil-p-anisaldehído 1.4931 - 1.4966 19.378 81.96
3-hidroxi-4-metoxi-Benzaldehído 1.5042 0.392 1.66
Megastigmatrienona 2.0226 0.228 0.96
4-hidroxi-3,5-dimetoxi-Benzaldehído 2.0777 0.125 0.53
7-metoxi-1-Benzopiran-2-ona 2.2649 - 2.2698 46.894 198.34
2-metil-5-Pirimidinol 2.2912 1.136 4.81

199
Capítulo 4

Figura 4.21. Cromatograma de gases correspondiente a la muestra de Manzanilla en metanol.

Tiempo de Abundancia
Compuesto Identificado p.p.m.
Retención (%)
Isoxazol 0.3995 0.465 0.44
Glicerina 0.5873 1.045 0.98
Timina 0.725 - 0.746 0.240 0.23
2,6-Dimetil-4-hidroxibenzaldehído 1.4438 5.009 4.71
7-metoxi-1-Benzopiran-2-ona 2.2148 23.130 21.76
Óxido de Bisabolol A 2.2501 4.944 4.65
1,6-Dioxaspiro[4.4]non-3-ene,2-(2,4-hexadiinilidene)- 2.512 - 2.530 28.475 26.79
ácido n-Hexadecanoico 2.6228 5.052 4.75
Etenil-Ciclooctano 2.9459 6.344 5.97
Clindamicina 3.2815 0.769 0.72
Heptacosano 3.5412 6.524 6.14
Nonadecano 3.838 2.903 2.73

En ambos extractos uno de los compuestos mayoritarios es la 7-metoxi-1-Benzopiran-

2-ona, o 7-metoxi-Cumarina. Las cumarinas son compuestos muy abundantes en las
plantas herbáceas, funcionando como sistema de defensa, ya que poseen propiedades
supresoras del apetito (contra los depredadores). También tienen propiedades
antimicrobianas, captadoras de radiación UV e inhibidoras de la germinación.

7-metoxi-Cumarina

Hay que destacar también la presencia de óxido de Bisabolol A en el extracto en

metanol. El bisabolol es uno de los componentes mayoritarios del aceite esencial de
Manzanilla [10].

200
 Capítulo 4

Óxido de Bisabolol A

El bisabolol se usa en cosmética por sus propiedades calmantes, cicatrizantes y

antiinflamatorias. Su cantidad, varía dependiendo de la Manzanilla de la que se extraiga.

[Link]. Menta-Poleo

Figura 4.22. Cromatograma de gases correspondiente a la muestra de Menta-Poleo en agua.

Tiempo de Abundancia
Compuesto Identificado p.p.m.
Retención (%)
Glicerina 0.6378 3.730 5.70
Bencenoacetaldehído 0.7587 0.809 1.24
Timina 0.7939 2.981 4.55
Ácido benzoico 0.9547 1.607 2.46
1,2-Bencenodiol + Resorcinol + Hidroquinona 1.0375 6.446 9.85
4-metil-Benzaldehído 1.0776 2.329 3.56
2-isopropil-5-metil-3-Ciclohexen-1-ona 1.1812 5.394 8.24
4-Hidroxi-2-metilacetofenona 1.304 - 1.311 5.386 8.23
2-hidroxi-6-metil-Benzaldehído 1.5919 15.688 23.97
1,2,3-Bencenotriol 1.982 0.532 0.81
(1α,2β,3α,5β)-1,2,3,5-Ciclohexanotetrol 2.0255 10.533 16.09
α-D-Glucopiranósido, α-D-Glucopiranosilo 2.9409 2.494 3.81
Crotonic acid, menthyl éster 3.3201 2.666 4.07
Ácido Propanoico, 2-(Acetiloxy)-, 5-metil-2-(1-
3.472 3.478 5.31
metiletil)ciclohexyl éster

201
Capítulo 4

Figura 4.23. Cromatograma de gases correspondiente a la muestra de Menta-Poleo en metanol.

Tiempo de Abundancia
Compuesto Identificado p.p.m.
Retención (%)
Ácido benzoico 0.9037 0.166 0.51
trans-5-metil-2-(1-metiletil)-Ciclohexanona 0.9175 1.526 4.68
2R-trans-5-metil-2-(1-metiletil)-Ciclohexanona 0.9382 0.493 1.51
Ciclohexanol, 5-metil-2-(1-metiletil)-, [1R-(1α,2β,5α)]-
0.9589; 2.9 24.034 73.65
(MENTOL)
1,2-Bencenodiol + Resorcinol 0.9817 1.072 3.29
4-metil-Benzaldehído 1.0286 0.343 1.05
Mercaptofenol 1.0452 0.693 2.12
2-isopropil-5-metil-3-Ciclohexen-1-ona 1.1315 3.857 11.82
Salicilaldehído hidrazona 1.5334 4.087 12.52
Sacarosa 1.578-1.581 6.150 18.85
Óxido de Cariofileno 1.898 0.865 2.65
Veridiflorol 1.9257 0.761 2.33
3,7,11,15-Tetrametil-2-hexadecen-1-ol 2.375-2.464 6.105 18.71
α-D-Glucopiranosa 2.6245 3.671 11.25
11,14,17-Eicosatrienoic acid, metil éster 2.967 19.345 59.28
Geranilgeraniol 4.0054 1.237 3.79
γ-Sitosterol 5.0881 4.074 12.48

En el extracto en agua se obtuvieron compuestos con actividad antioxidante, ninguno

de ellos mayoritario, pero en proporciones nada despreciables: 1,2-Bencenodiol,
Resorcinol, Hidroquinona, 4-Hidroxi-2-metilacetofenona y 2-hidroxi-6-metil-
Benzaldehído, entre otros.
En el extracto en metanol, hay que destacar la presencia del Mentol, que es un
compuesto muy representativo de esta planta [11], pero muy poco soluble en agua.

202
 Capítulo 4

Además, esta molécula presenta un punto de inflamación de aproximadamente 93ºC

[12], lo que disminuye la cantidad que puede ser cuantificada, debido a las temperaturas
empleadas en la técnica de cromatografía de gases.

Mentol

[Link]. Rooibos

Figura 4.24. Cromatograma de gases correspondiente a la muestra de Rooibos en agua.

Tiempo de Abundancia
Compuesto Identificado p.p.m.
Retención (%)
Gliceraldehído 0.51 1.699 0.82
1,2-Bencenodiol + Resorcinol 1.0355 2.938 1.41
2-metil-Benzaldehído + 4-metil-Benzaldehído + 4-
1.0831 0.275 0.13
metil-Benzaldehído
Ácido Bencenoacético 1.1322 0.436 0.21
Timol 1.3041 3.719 1.79
2,4-dihidroxi-6-metil-Benzaldehído 1.5064 1.061 0.51
2-C-metil-Myo-Inositol 2.167-2.180 62.635 30.06

203
Capítulo 4

Figura 4.25. Cromatograma de gases correspondiente a la muestra de Rooibos en metanol.

Tiempo de Abundancia
Compuesto Identificado p.p.m.
Retención (%)
3,6-dietil-1,2,4,5-Tetrazina 0.3582 13.723 1.72
Bencenoacetaldehído 0.8347 1.320 0.17
2,4-dihidroxi-6-metil-Benzaldehído 1.4499 0.821 0.10
Ácido 4-butoxi-Butanoic acid 2.0597 25.074 3.15
ácido n-Hexadecanoico 2.6161 10.333 1.30
Isomentol 2.8993 1.614 0.20
etenil-Ciclohexano 2.9407 3.564 0.45
Farnesol isómero a 4.0038 2.314 0.29
3,3-dimetil-Hexano 4.4396 2.392 0.30

Como puede observarse, los extractos fueron muy poco concentrados debido,
probablemente, al carácter leñoso de la muestra, siendo uno de los picos más
significativos el correspondiente al metanol (a 0.3853 minutos en el extracto en agua y
a 0.3513 minutos en el extracto en metanol).

204
 Capítulo 4

[Link]. Salvia

Figura 4.26. Cromatograma de gases correspondiente a la muestra de Salvia en agua.

Tiempo de Abundancia
Compuesto Identificado p.p.m.
Retención (%)
Glicerina 0.6350 1.932 5.57
2,3-dihidro-3,5-dihidroxi-6-metil-4H-Piran-4-ona 0.6551 0.396 1.14
Maltol 0.7930 0.919 2.65
1,2-Bencenodiol 1.0415 1.376 3.96
2-metil-Benzaldehído + 4-metil-Benzaldehído 1.0760 3.650 10.51
1,3,3-trimetil-2-Oxabiciclo[2.2.2]octan-6-ol 1.097- 1.111 1.551 4.47
trans-p-Mentha-2,8-dienol 1.1154 0.206 0.59
2-Metoxi-4-vinil-Fenol 1.2977 5.090 14.66
trans-p-Mentha-2,8-dienol 1.4628 1.790 5.16
Bencenoethanol, 4-Hidroxi- 1.5587 1.249 3.60
3-hidroxi-2-metil-Benzaldehído + 4-metil-
1.5884 19.209 55.33
Benzaldehído + 2-hidroxi-6-metil-Benzaldehído
3,5-Dimetilanisole 1.5946 4.121 11.87
1-(4-hidroxi-3-metoxifenil)-Etanona 1.6996 1.660 4.78
Ácido 4-hidroxi-3-metoxi-benzoico 1.8693 1.858 5.35
2-Hidroximetil-5-(1-hidroxi-1-isopropil)-2-
2.0220 20.931 60.29
ciclohexen-1-ona
1-(4-hidroxi-3,5-dimetoxifenil)-Etanona 2.2292 1.892 5.45
7-Acetil-2-hidroxi-2-metil-5-
2.2643 1.309 3.77
isopropilbiciclo[4.3.0]nonano
Óxido de Cariofileno 2.2699 5.368 15.46
Ácido 4-hidroxi-3,5-dimetoxi-benzoico 2.3893 0.245 0.71
6-Isopropenil-4,8a-dimetil-1,2,3,5,6,7,8,8a-
2.4577 2.338 6.73
octahidro-naftalen-2-ol
exo-2-Hidroxicineol 3.5123 3.445 9.92
5-Sec-butilpirogalol 3.7422 2.990 8.61
2-metoxi-4-(1-propenil)-Fenol 3.7524 0.709 2.04

205
Capítulo 4

Figura 4.27. Cromatograma de gases correspondiente a la muestra de Salvia en metanol.

Tiempo de Abundancia
Compuesto Identificado p.p.m.
Retención (%)
Eucaliptol 0.6964 5.968 6.29
α-Pineno 0.7516-0.8828 4.063 4.28
Tujona 0.9111– 0.9167 32.339 34.07
Borneol 0.9588 18.175 19.15
(S)-α,α,4-trimetil-3-Ciclohexen-1-metanol 0.9933 0.716 0.76
Bornyl Acetato 1.1867 2.340 2.47
1-metoxi-4-(1-propenil)-Benceno 1.1935 0.928 0.98
p-Menta-1(7),8(10)-dien-9-ol 1.5242 4.201 4.42
Óxido de Cariofileno 1.8978; 1.9599 8.586 9.05
Veridiflorol 1.9254 3.289 3.46
Ciclopropanecarboxilic acid, 2,2-dimetil-3-(2-metil-1-
propenil)-,2-metil-4oxo-3-(2,4-pentadienil)-2- 3.6799 2.102 2.21
ciclopenten-1-yl éster, [1R-[1α[S*(Z)],3β]]-
Pectolinaringenina 4.8523 0.195 0.21
4-metil-Benzaldehído 5.254 0.085 0.089

En el extracto en agua hay una gran variedad de compuestos en cantidades moderadas,

considerándose mayoritarios los que tienen abundancias en torno al 20%. De ellos, el
que presenta un mayor carácter oxidante es, probablemente, la Mezcla de 3-hidroxi-2-
metil-benzaldehído + 2-hidroxi-6-metil-benzaldehído, ya que tienen grupos hidroxilo
en un anillo aromático, fácilmente oxidables.

Tujona
En el extracto en metanol, hay que destacar el pico de la Tujona, que representa más de
un 32 % del extracto. Este compuesto es el más abundante en el aceite esencial de Salvia

206
 Capítulo 4

[13], presenta un olor similar a la Menta, y puede encontrarse en diversas especies de

plantas, como el Ciprés de Nootka, algunos enebros, artemisa, tanaceto, ajenjo, algunas
especies de Menta y por supuesto, en la Salvia común.
Aunque uno de los componentes más abundantes en el aceite esencial de Salvia es el
alcanfor (véase capítulo 1), este compuesto tiene un punto de inflamabilidad muy bajo,
por lo que no aparece en ninguno de los dos cromatogramas.
[Link]. Tila

Figura 4.28. Cromatograma de gases correspondiente a la muestra de Tila en agua.

Tiempo de Abundancia
Compuesto Identificado p.p.m.
Retención (%)
Sacarosa + Xilitol 0.7227 17.082 111.89
Phtalano 0.7585 0.749 4.91
2-metoxi-Fenol 0.8365 0.333 2.18
2,3-dihidro-3,5-dihidroxi-6-metil-4H-Piran-4-
0.945 2.009 13.16
ona
Ácido benzoico 0.9532 0.453 2.97
1,2-Bencenodiol 1.0374 2.990 19.59
2-metil-Benzaldehído + 4-metil-Benzaldehído +
1.0768 8.436 55.26
3-metil Benzaldehído + 4-metil-Benzaldehído
1,2,4-Bencenotriol + 1,3,5-Bencenotriol 1.1003 0.931 6.10
Hidroquinona 1.2218 0.344 2.25
1-(2-hidroxi-5-metilfenil)-Etanona 1.2978 1.941 12.71
3-hidroxi-4-metoxi-Benzaldehído 1.5043 0.107 0.70
Ácido 4-(1-metiletil)-benzoico 1.5387 0.304 1.99
2-hidroxi-6-metil-Benzaldehído 1.5947 0.778 5.10
Ácido 4-hidroxi-benzoico 1.7237 0.550 3.60
Ácido 4-hidroxi-3-metoxi-Bencenoacético 2.0574 0.290 1.90
(1α,2β,3α,5β)-1,2,3,5-Ciclohexanotetrol 2.085-2.132 47.245 309.47
Cafeína 2.487-2.491 1.126 7.37
Desaspidinol 2.7473 0.095 0.62

207
Capítulo 4

Figura 4.29. Cromatograma de gases correspondiente a la muestra de Tila en metanol.

Compuesto Identificado Tiempo de Retención Abundancia (%) p.p.m.

Timina 0.7445 0.095 0.27
Mentol 0.9523 0.557 1.58
1,2-Bencenodiol 0.9751 0.752 2.13
4-metil-Benzaldehído 1.0214 0.750 2.12
Eugenol 1.374-1.559 2.390 6.77
Hexilresorcinol 1.9059 0.250 0.71
2-Hidroxi-5-metilisoftalaldehído 2.3519 0.742 2.10
Cafeína 2.4376 0.389 1.10
Isomentol 2.8989 1.548 4.39
Mirtenol 2.9540 2.814 7.97
Inositol 3.1309 2.769 7.85
Bencenoacetaldehído 3.1744 0.068 0.19
α-D-Glucosa 3.6383 0.101 0.29
Lauroil peróxido 3.9353 0.533 1.51
Farnesol 4.0036 4.040 11.45
Vitamina E 4.5424 0.878 2.49
γ-Sitosterol 5.0824 3.238 9.18
β-Amirina 5.5525 40.783 115.53

El pico más intenso para el extracto en agua corresponde a una Mezcla de metil-
benzaldehídos. La mayor señal es una banda ancha del 1,2,3,5-Ciclohexanotetrol:

1,2,3,5-ciclohexanotetrol Eugenol

En el extracto en metanol destaca la presencia de benzaldehídos y alcoholes policíclicos,

así como antioxidantes en pequeñas cantidades, como la vitamina E y el Eugenol [14].

208
 Capítulo 4

Vitamina E

4.4.3. Especias
[Link]. Albahaca

Figura 4.30. Cromatograma de gases correspondiente a la muestra de Albahaca en agua.

Compuesto Identificado Tiempo de Retención Abundancia(%) p.p.m.

Glicerina 0.6558 5.465 22.82
β-Pineno 0.6628 1.500 6.26
3,4-Dimetildihidrofuran-2,5-diona 0.7083 1.160 4.84
α-Pineno 0.7256 – 0.745 2.456 10.26
Bencenoacetaldehído 0.765 1.703 7.11
2(1H)- 6-hidroxi-Piridinona 0.8636 - 0.9195 12.256 51.18
2,3-dihidro-3,5-dihidroxi-6-metil-
0.9457 2.149 8.97
4H-Piran-4-ona
BenzoylÁcido Formico 0.9671 0.600 2.51
1,2-Bencenodiol + Resorcinol 1.0438 – 1.0562 2.154 8.99
3-metil-Benzaldehído 1.0838 1.905 7.96
4-(2-propenil)-Fenol// 4-(2-
1.1598 1.498 6.25
propenil)-Fenol acetato
Hidroquinona 1.224 0.065 0.27
Indol 1.2828 0.408 1.70
1-(2-hidroxi-5-metilfenil)-Etanona 1.3048 2.542 10.61
Ácido Cinámico 1.4291 0.133 0.56
Ácido trans-Cinámico 1.5658 1.193 4.98

209
Capítulo 4

Tiempo de
Compuesto Identificado Abundancia(%) p.p.m.
Retención
2-hidroxi-6-metil-Benzaldehído + 2-
hidroxi-5-metil-Benzaldehído+ 2- 1.5956 - 1.7197 22.441 93.70
hidroxi-4-metil-Benzaldehído
Ácido 3-Hidroxi-4-metoxibenzoico 1.8709 0.326 1.36
Ácido 4-Hidroxi-3metoxibencenoacético 2.0635 0.312 1.30
Ácido 4-hidroxi-3,5-dimetoxi-Benzoico 2.4019 0.499 2.08
β-Mirceno 3.2096 0.178 0.74
Benzyl β-d-glucoside 3.2441 - 3.396 4.063 16.96
4-(2-propenil)-Fenol 3.6012 - 3.7212 3.169 13.23
2-metoxi-4-(2-propenil)- Fenol acetato +
3.762 - 3.9346 3.821 15.96
2-metoxi-4-(1-propenil)-Fenol

Figura 4.31. Cromatograma de gases correspondiente a la muestra de Albahaca en metanol.

Tiempo de
Compuesto Identificado Abundancia (%) p.p.m.
Retención
β-Pineno 0.8326 0.430 0.54
Indol 1.2779 0.177 0.22
Eugenol 1.3878 1.429 1.79
Ácido 4-etenil-benzoico, metil éster 1.4706 2.033 2.55
Cadinol 2.0574 3.077 3.86
Bergamoteno 2.0615 4.806 6.03
3,7,11,15-Tetrametil-2-hexadecen-1-ol 2.4164 - 2.464 7.546 9.47
ácido n-Hexadecanoico 2.6637 8.117 10.18
Fitol 2.9399 5.3939 6.77
cis,cis,cis-7,10,13-Hexadecatrienal 2.9965 10.956 13.74
Ácido 3-fenil-2-Propenoico, metil éster 3.2817 - 3.319 5.705 7.16
Acetil eugenol 3.7408 0.814 1.02
Eicosano 3.8658 4.501 5.65
2-metilen-Ciclododecanona 3.8728 3.637 4.56

210
 Capítulo 4

Tiempo de
Compuesto Identificado Abundancia (%) p.p.m.
Retención
Escualeno 4.0384 5.274 6.62
2-metil-Octadecano 4.1489 4.786 6.00
Eicosano 4.4804 5.098 6.39
2-metil-Dodecano 4.9546 2.456 3.08
β-Sitosterol 5.1549 3.458 4.34
Ácido (+)-3-oxo-Urs-12-en-24-oico, metil éster 5.5179 2.471 3.10

En el extracto en agua, el pico principal correspondió a la Mezcla de tres compuestos

con carácter antioxidante [15], los cuáles representaban más del 22% del extracto:

2-hidroxi-4-metil- 2-hidroxi-5-metil- 2-hidroxi-6-metil-

Benzaldehído Benzaldehído Benzaldehído

Además de éstos, también se pudo confirmar la presencia (aunque en menor cantidad

que los anteriores compuestos), de antioxidantes naturales de gran importancia:

1,2-Bencenodiol Resorcinol Hidroquinona

En el extracto en metanol, se obtuvo gran cantidad de compuestos aromáticos, entre los

que cabe destacar un compuesto típico (aunque en pequeñas cantidades) de la Albahaca
como es el α-Bergamoteno y el Eugenol [15], uno de los antioxidantes naturales más
extendidos.

Escualeno β-Sitosterol

También hay que tener en cuenta la presencia de Escualeno (descubierto en el aceite de

hígado de tiburón) que no solo presenta actividad antioxidante [16], sino que es parte
vital de la síntesis de los esteroles, incluyendo el colesterol, las hormonas ésteroides, y
la vitamina D. La capacidad antioxidante del escualeno, se ve favorecida si se combina
con algún alimento rico en α-Tocoferol o “vitamina E” (como espinacas, brócoli, huevo,

211
Capítulo 4

nueces, levadura de cerveza,…), ya que al combinar dichos compuestos, se produce un

efecto sinérgico en sus capacidades antioxidantes [17], aun así, la cantidad real de
vitamina E presente en una muestra es difícil de cuantificar por cromatografía de gases
según nuestro método de trabajo establecido, debido a que presenta un punto de
inflamación en torno a 110-115ºC [18]. También presenta en su composición β-
Sitosterol, que es un pro-oxidante [17].

[Link]. Canela en polvo

Figura 4.32. Cromatograma de gases correspondiente a la muestra de Canela en polvo en agua.

Compuesto Identificado Tiempo de Retención Abundancia (%) p.p.m.

2-Amino-1,3-propanodiol 0.4072 - 0.4203 7.545 43.63
2-Furanmetanol 0.526 2.741 15.85
Glicerina 0.6289 - 1.028 17.925 103.66
1,2-Bencenodiol + Resorcinol 1.037 - 1.0778 1.609 9.30
trans-tetrahidro-3,4-Furanodiol 1.1482 - 1.2028 2.886 16.69
Hidroquinona 1.2028 0.102 0.59
(E)-Cinamaldehído 1.2222 2.072 11.99
3-fenil-2-Propen-1-ol 1.2836 - 1.2905 2.377 13.74
1-Hidroxi,1-fenil-2-propanona 1.4374 0.052 0.30
3,4-dihidro-1-Benzopiran-2-ona 1.4913 - 1.5307 2.644 15.29
Ácido trans-Cinámico 1.5727 - 1.5782 5.915 34.21
1-Benzopiran-2-ona 1.6279 - 1.67 32.068 185.46
trans-4-Metoxi-Cinamaldehído 1.802 0.092 0.53
4-propil-1,3-Bencenodiol 1.976 - 2.0285 3.075 17.79

212
 Capítulo 4

Figura 4.33. Cromatograma de gases correspondiente a la muestra de Canela en polvo en

metanol.

Compuesto Identificado Tiempo de Retención Abundancia (%) p.p.m.

1,2-Bencenodiol, mono(metilcarbamato) 1.0822 0.104 0.29
(E)-Cinamaldehído 1.0974 - 1.2831 73.349 205.55
Ácido trans-Cinámico 1.4834 - 1.5449 5.357 15.01
1-Benzopiran-2-ona 1.6146 11.844 33.19

En el extracto acuoso para la Canela en polvo, se obtuvieron compuestos antioxidantes

vistos anteriormente, como el 1,2-Bencenodiol, Resorcinol e Hidroquinona, además de
los característicos de esta especia [5, 15], lo que proporciona a esta especia una alta
capacidad antioxidante [19].

Cinamaldehído Ácido Cinámico Benzopiran-2-ona ó Cumarina

Debido a la baja solubilidad del Cinamaldehído en agua sólo una pequeña fracción de
éste forma parte del extracto acuoso. El grupo carboxilo del ácido Cinámico, le confiere
una mayor polaridad a la molécula, permitiendo una mejor extracción con agua que con
metanol. El compuesto extraído en agua, de forma mayoritaria fue la Benzopiran-2-ona
o Cumarina. Es una benzopirona presente en gran cantidad de plantas, entre ellas, la
Cinnamomum cassia. Al contrario que ésta, la Cinnamomum zeylanicum, contiene muy
bajas concentraciones de Cumarina [20-21].
En el extracto en metanol las proporciones de Cumarina y ácido Cinámico son menores
y la del Cinamaldehído, mayor, por la menor polaridad del metanol respecto al agua.

213
Capítulo 4

[Link]. Canela en rama

Figura 4.34. Cromatograma de gases correspondiente a la muestra de Canela en rama en agua.

Compuesto Identificado Tiempo de Retención Abundancia (%) p.p.m.

ácido 2-Propenoico, 2-Hidroxietil éster 0.4688 5.025 3.87
dl-Gliceraldehído 0.5095 8.863 6.83
Glicerina 0.642-0.655; 0.926 20.809 16.04
1,2-Bencenodiol + Resorcinol 1.0370-1.0777 2.107 1.62
Hidroquinona 1.1302 0.277 0.21
Cinamaldehído 1.2227 7.149 5.51
4-propil-1,3-Bencenodiol 1.962 1.355 1.04
(1α,2β,3α,5β)-1,2,3,5-Ciclohexanotetrol 2.0076 24.650 19.00

Figura 4.35. Cromatograma de gases correspondiente a la muestra de Canela en rama en

metanol.

214
 Capítulo 4

Compuesto Identificado Tiempo de Retención Abundancia (%) p.p.m.

dl-Gliceraldehído 0.4687 - 0.8684 3.275 2.02
(E)-Cinamaldehído 1.1791; 1.4483 56.240 34.74
Eugenol 1.3454 0.839 0.52
(Z,Z)-α-Farneseno 1.525 0.982 0.61
3-fenil-2-Propen-1-ol, acetato 1.5525 11.235 6.94
Bencil Benzoato 2.285 4.450 2.75
ácido n-Hexadecanoico 2.6226 3.320 2.05
Etenil-Ciclooctano 2.947 3.554 2.20

Los extractos de Canela en rama, fueron mucho menos concentrados que los de Canela
en polvo, lo que se hace evidente al comparar el pico del metanol en los cromatogramas.
Para el extracto acuoso, se obtuvieron de nuevo 1,2-Bencenodiol, Resorcinol e
Hidroquinona, pero no ácido Cinámico, el cual proviene posiblemente de la oxidación
del Cinamaldehído, por ruptura celular de la Canela en la molienda, proceso que no se
da en la Canela en rama.
De nuevo, en esta muestra se obtiene una mayor cantidad de Cinamaldehído en el
extracto en metanol; además, en este caso se obtuvo una pequeña cantidad de Eugenol.

[Link]. Clavo

Figura 4.36. Cromatograma de gases correspondiente a la muestra de Clavo en agua.

Tiempo de
Compuesto Identificado Abundancia (%) p.p.m.
Retención
Trimetilamina + Ácido Fórmico hidrazida 0.4079 – 0.4348 12.033 1.59
ácido 2-Propenoico, 2-Hidroxietil éster 0.4686 5.815 0.77
dl-Gliceraldehído 0.51 12.170 1.60
2-Amino-3-metil-1-butanol 0.5631 6.085 0.80
2-metil-Benzaldehído + 4-metil-Benzaldehído 1.088 2.346 0.31
3-hidroxi-4-metoxi-Benzaldehído 1.5118 2.226 0.29

215
Capítulo 4

Figura 4.37. Cromatograma de gases correspondiente a la muestra de Clavo en metanol.

Compuesto Identificado Tiempo de Retención Abundancia (%) p.p.m.

Eugenol 1.3478-1.4079; 1.6979 90.905 1056.39
Cariofileno 1.519 1.568 18.22
α-Cariofileno 1.6012 0.695 8.08
α-Farneseno 1.6634 0.051 0.59
Óxido de Cariofileno 1.898; 078 1.173 13.63

El Clavo es de carácter leñoso (como la Canela en rama y la infusión de Rooibos) y el

cromatograma del extracto en agua es especialmente pobre, ya que el componente
mayoritario es el Eugenol [19]. Por el contrario, en el extracto en metanol, se obtuvieron
dos picos correspondientes a este antioxidante natural [5], cuya abundancia fue superior
al 90%.

[Link]. Comino

Figura 4.38. Cromatograma de gases correspondiente a la muestra de Comino en agua.

216
 Capítulo 4

Tiempo de Abundancia
Compuesto Identificado p.p.m.
Retención (%)
Bencenoacetaldehído 0.7605 0.277 0.80
Timina 0.7943 1.418 4.11
Mirtenol 1.1457 0.705 2.04
4-(1-metiletil)-Benzaldehído 1.158; 1.621-1.632 19.741 57.23
4-(1-metiletil)-Bencenometanol 1.2556 0.972 2.82
Alotreonina 1.2963 21.202 61.47
Trans-2-metil-5-(1-metiletil)-Ciclohexanona 1.3384 2.139 6.20
2,6-dimetil-Fenol 1.4081 0.608 1.76
Ácido 4-(1-metiletil)-benzoico 1.5454 - 1.5509 4.690 13.60
4-etil-2-metoxi-Fenol 1.5882 0.214 0.62
o-Metoxi-α,α-dimetilbenzyl alcohol 1.649 0.927 2.69
Fenol, 2-(1,1-dimetiletil)-6-metil- 1.8215 0.469 1.36
4-Metil-2,5-dimetoxiBenzaldehído 1.8636 0.528 1.53
3-Fenil-3-pentanol 1.8705 2.324 6.74
(1α,2β,3α,5β)-1,2,3,5-Ciclohexanotetrol 2.0707 - 2.0845 4.995 14.48
4-((1E)-3-Hidroxi-1-propenil)-2-metoxiFenol 2.2571 0.092 0.27
2,5-O-Metilen-D-manitol 2.5739 - 2.5823 2.205 6.39
Inositol 2.8909 - 2.9813 6.727 19.50
4-(3,3-Dimetil-but-1-inil)-4-Hidroxi-2,6,6-
3.2713 4.819 13.97
trimetilciclohex-2-enona
cis-Pinen-3-ol 3.4223 0.388 1.12

Figura 4.39. Cromatograma de gases correspondiente a la muestra de Comino en metanol.

Tiempo de Abundancia
Compuesto Identificado p.p.m.
Retención (%)
β-Pineno 0.6682 0.047 0.51
4-(1-metiletil)-Benzaldehído 1.159;1.545 38.816 416.43
1,2,4-Butanotriol 1.193 2.708 29.05
trans-Shisool 1.2005 0.489 5.25
4-(1-metiletil)-Bencenometanol 1.256-1.259 5.221 56.01

217
Capítulo 4

Tiempo de Abundancia
Compuesto Identificado p.p.m.
Retención (%)
2-Caren-10-al 1.2619 12.650 135.72
4-(1-metiletil)-1,4-Ciclohexadieno-1-metanol 1.3386 1.815 19.48
Ácido 4-metil-benzoico, 2-hidroxi-2-fenilpropil éster 1.4911 0.251 2.70
Mequinol 1.5526 0.035 0.37
Ácido 3,4-diHidroxi-Bencenoacético 1.6272 1.285 13.79
2-(1,1-dimetiletil)-6-metil-Fenol 1.8219 0.361 3.90
Carotol 1.9883 0.124 1.33
2,4,6-trimetil-Fenol + 2,3,6-trimetil-Fenol 2.299-2.318 0.633 6.79
4-Hidroxi-2-metil-Benzaldehído + 4-metil-Benzaldehído+
2.4634 0.030 0.33
4-Hidroxi-3-metil-Benzaldehído
Fitol 2.9404 0.107 1.15
Ácido Oleico 2.992-3.355 10.811 115.98
(Z)-9,17-Octadecadienal 3.8849 5.322 57.09
dl-α-Tocoferol 4.5932 0.068 0.73
Vitamina E 4.895-4.901 0.672 7.21
Estigmasterol 4.9714 0.967 10.37
β-Sitosterol 5.1578 0.721 7.74

Para el extracto de Comino, se cuantificaron una gran cantidad de compuestos

aromáticos, siendo el principal, en el extracto en metanol donde es soluble, el 4-(1-
metiletil)-Benzaldehído o Cuminaldehído, típico del Comino, y con carácter
antioxidante [22, 23]:

4-(1-metiletil)-Benzaldehído o Cuminaldehído

[Link]. Cúrcuma

Figura 4.40. Cromatograma de gases correspondiente a la muestra de Cúrcuma en agua.

218
 Capítulo 4

Tiempo de Abundancia
Compuesto Identificado p.p.m.
Retención (%)
(S)-1,3-Butanodiol + Ácido Propanoico, butil éster 0.4751 23.764 52.81
Fenol 0.6504 0.736 1.64
Ácido Málico 0.786-0.807 0.561 1.25
2-metoxi-Fenol 0.8361 1.366 3.04
2-metil-Benzaldehído + 4-metil-Benzaldehído 1.0763 5.821 12.94
2-Metoxi-4-vinil-Fenol + Timol 1.298 - 1.3042 8.340 18.53
Eugenol 1.3946 0.141 0.31
(E)-3(10)-Caren-4-ol 1.49 3.434 7.63
2,4-dihidroxi-6-metil-Benzaldehído + 2-Hidroxi-4-
1.5052 - 1.5114 1.179 2.62
metoxi-Benzaldehído
4-propil-2-metoxi-Fenol 1.6295 0.233 0.52
Biciclo[2.2.1]heptan-2-ol 1.9672 0.099 0.22
Inositol (varios tipos) + Glucosa 2.0362 0.239 0.53
4-(4-Hidroxi-3-metoxifenil)-2-Butanona + 4-(3-
2.0507 0.768 1.71
Hidroxi-2-metoxifenil)-2-Butanona
2.086-2.091;
Ar-tumerona 2.397; 2.416- 27.812 61.81
2.511; 2.660- 2.948
Ácido 4-Hidroxi-3-metoxi-Bencenoacético, metil éster 2.1059 1.424 3.16
Ar Tumerona + Tumerona 2.4021 2.918 6.49
(Ar-Tumerona) + 1,7-bis(4-Hidroxi-3-metoxifenil)-
2.4096 0.535 1.19
1,6-Heptadien-3,5-diona
2,5-dimetil-Bencenometanol 2.5478 3.219 7.15

Figura 4.41. Cromatograma de gases correspondiente a la muestra de Cúrcuma en metanol.

219
Capítulo 4

Compuesto Identificado Tiempo de Retención Abundancia (%) p.p.m.

2-metoxi-Fenol 0.842 - 1.021 1.577 188.64
Mequinol 1.0279 0.030 3.60
2-metil-Benzaldehído + 4-metil-
1.078 - 1.152 0.016 1.87
Benzaldehído
Timol 1.241 - 1.263 0.055 6.54
2-Metoxi-4-vinil-Fenol + Timol 1.3075- 1.332 2.253 269.54
4-Hidroxi-Benzaldehído 1.4442 0.021 2.45
3-hidroxi-4-metoxi-Benzaldehído 1.5119 0.065 7.79
Z-α-trans-Bergamotol 1.787-1.850 0.784 93.75
o-(3-metilbut-2-enoil)-1,2-Bencenodiol 1.944; 2.322 0.099 11.88
8-Cedren-13-ol 1.954 - 1.972 2.204 263.67
Cedreno 1.9876 0.182 21.82
5-metil-2-(1-metil-1-feniletil)-Ciclohexanol 2.008 - 2.015 0.461 55.13
Curlona 2.0422 0.713 85.30
trans-Longipinocarveol 2.0725 0.251 30.00
2.1042-2.1263; 2.1463-
Ar-tumerona 48.269 5775.72
2.1587; 2.2092-2.2575
2.1305; 2.188-2.200;
Ar-tumerona + Tumerona 34.300 4104.17
2.284-2.305
1-[3-(2,6,6-Trimetil-ciclohex-2-enil)-4,5-
2.339 2.255 269.77
dihidro-3H-pirazol-4-il]-etanonea
1,7-bis(4-Hidroxi-3-metoxifenil)-1,6-
2.4232- 2.4273 1.023 122.38
Heptadieno-3,5-diona
Benzestrol 2.5254 0.017 1.99
Vitamina E 4.598 0.007 0.89
Estigmasterol 4.977 0.068 8.08
β-Sitosterol 5.1655 0.292 34.96
γ-Sitosterol 5.1676 0.291 34.76

En los extractos de Cúrcuma se identifican antioxidantes como Eugenol, 2,4-dihidroxi-

6-metil-Benzaldehído, 2-hidroxi-4-metoxi-Benzaldehído, Timol, 3-hidroxi-4-metoxi-
Benzaldehído, Vitamina E, etc, aunque los principales compuestos extraídos fueron la
Ar-Tumerona (o Ar-Turmerona); la Tumerona (o Turmerona) y la 1,7-bis(4-hidroxi-3-
metoxifenil)-1,6-Heptadieno-3,5-diona (o Curcumina), siendo los tres capaces de
desarrollar una actividad antioxidante en el organismo [24-26].

Tumerona Ar-Turmerona

Curcumina) (forma ceto)

220
 Capítulo 4

Los compuestos curcuminoides actúan como eliminadores de radicales superóxido así

como desactivadores del oxígeno molecular, de ahí que presenten actividad antioxidante
[26]. Son también los responsables del color amarillo de la Cúrcuma [27].

[Link]. Jengibre

Figura 4.42. Cromatograma de gases correspondiente a la muestra de Jengibre en agua.

Compuesto Identificado Tiempo de Retención Abundancia (%) p.p.m.

Hexanal 0.4886 7.334 41.56
Glicerina 0.6288-0.6432 4.126 23.38
2-metil-Benzaldehído + 4-metil-
Benzaldehído+ 3-metil-Benzaldehído + 4- 1.076 0.235 1.33
metil-Benzaldehído
Ácido BencenoPropanoico, α-Hidroxi- 1.1258 0.047 0.27
Vainillina 1.4978 0.518 2.94
3-metoxi-2,5,6-trimetil-Fenol 1.7111 0.399 2.26
α-Bisabolol 1.7733 1.342 7.60
Etil α-d-Glucopiranósido 2.0149 2.087 11.83
2.0494-2.055; 2.1254-
Gingerol 2.1586; 2.9131-3.1484; 59.749 338.57
3.2775-3.9201
3,7,11-trimetil-6,10-Dodecadien-1-in-3-ol 2.3933 4.456 25.25
6-(p-Tolil)-2-metil-2-heptenol 2.5051 2.561 14.51
(-)-Nortraquelogenina 3.153; 4.534-5.276 2.110 11.96

221
Capítulo 4

Figura 4.43. Cromatograma de gases correspondiente a la muestra de Jengibre en metanol.

Compuesto Identificado Tiempo de Retención Abundancia (%) p.p.m.

2-metoxi-Fenol + Mequinol 0.8367 0.031 1.92
Borneol 1.0073 0.100 6.26
α,α,4-trimetil-Bencenometanol 1.0211 0.008 0.48
2-metil-5-(1-metiletil)- Fenol +
1.234 - 1.256 0.248 15.50
2-etil-4,5-dimetil- Fenol
4-Hidroxi-2-metilacetofenona + 4-Hidroxi-
1.3 - 1.319 0.300 18.77
3-metilacetofenona
2-metoxi-4-(1-propenil)-Fenol + 2-metoxi-
3-(2-propenil)-Fenol +2-metoxi-6-(2- 1.3869 0.057 3.58
propenil)-Fenol
3-hidroxi-4-metoxi-Benzaldehído + 4-
1.5029 0.078 4.90
Hidroxi-2-metoxibenaldehído
1-(1,5-dimetil-4-hexenil)-4-metil- Benceno 1.6769 3.356 209.63
2,6-dimetil-6-(4-metil-3-pentenil)-
1.699 - 1.711 7.905 493.81
Biciclo[3.1.1]hept-2-eno
(S)-1-metil-4-(5-metil-1-Metilen-4-hexenil)-
1.739 2.529 157.98
Ciclohexeno
[S-(R*,S*)]-3-(1,5-dimetil-4-hexenil)-6-
1.775 - 1.780 6.284 392.56
Metilen- Ciclohexeno
Hinesol 1.8432 0.507 31.70
4-(3-Hidroxi-1-propenil)-2-metoxi- Fenol 1.892 - 1.896 0.646 40.38
2.0421;
Gingerona / Zingerona 2.0504-2.0779; 2.0842 - 8.316 519.50
2.0911
Ácido 4-Hidroxi-3-metoxi-Bencenoacético,
2.2368 0.092 5.72
metil éster
α-Bisabolol 2.5668 0.261 16.28
Z-α-trans-Bergamotol 2.7124 0.118 7.39
Ácido cis-13-Octadecenoico 3.0148 3.878 242.24
3.0783 - 3.1404; 3.2026 -
Gingerol 40.772 2547.14
4.0841

222
 Capítulo 4

Compuesto Identificado Tiempo de Retención Abundancia (%) p.p.m.

3-(3-Hidroxi-4-metoxifenil)-l-alanina 3.1612 - 3.1749 2.053 128.25
Piperina 4.2589 0.100 6.27
γ-Tocoferol 4.4342 0.023 1.41
γ-Sitosterol 5.1633 0.749 46.79

En los extractos de Jengibre, tanto en agua como en metanol, se han determinado una
gran cantidad de compuestos aromáticos, principalmente fenólicos, siendo el compuesto
mayoritario un antioxidante natural, el gingerol [5, 19, 28-29]:

Gingerol

Es el componente activo del Jengibre fresco. Tiene una estructura similar a la de la

capsaicina y la piperina, compuestos que dan el grado de picor a los chiles y a la
pimienta negra. Puro en estado natural, es un aceite de color amarillo penetrante, aunque
también pueden presentarse en forma sólida cristalina de bajo punto de fusión (30ºC).
En el extracto en metanol, además de gingerol, también se obtuvo gingerona (o
zingerona), que se produce a partir del gingerol al cocinar el Jengibre [30].

Gingerona / Zingerona

El Jengibre fresco no contiene zingerona; es en la cocción cuando el gingerol presente

se transforma en zingerona a través de una reacción retro-aldólica. La zingerona, es
menos picante y tiene un aroma dulce picante. Es un sólido cristalino escasamente
soluble en agua, y soluble en disolventes apolares. Su estructura química es similar a las
de otros compuestos que dan sabor, como la vainillina y el eugenol. Se utiliza como
aditivo de sabor en los aceites de especias y para producir aromas picantes en perfumería
[30].
Cuando se seca el Jengibre, el gingerol se deshidrata formando shogaoles, que son
aproximadamente el doble de picantes que el gingerol [30]. Esto explica por qué el
Jengibre seco es más picante que el Jengibre fresco.

223
Capítulo 4

[Link]. Nuez Moscada

Figura 4.44. Cromatograma de gases correspondiente a la muestra de Nuez Moscada en agua.

Compuesto Identificado Tiempo de Retención Abundancia (%) p.p.m.

Gliceraldehído 0.5101 4.725 9.91
Glicerina 0.6288 - 0.6834 21.113 44.26
1,2-Bencenodiol 1.0294 1.353 2.84
2-metoxi-4-(1-propenil)-Fenol 1.3875; 1.6078 7.712 16.17
Vainillina 1.498 0.947 1.98
1,5-Anhidro-d-manitol 1.8405 3.414 7.16
1.9323; 2.154; 4.066 -
2,6-dimetoxi-4-(2-propenil)- Fenol 32.303 61.71
4.2324
α-D-Glucopiranósido + β-D-Glucopiranósido 2.0229 - 2.038 2.052 4.30
4-hidroxi-3,5-dimetoxi-Benzaldehído 2.0712; 2.7133 1.266 2.65
Vinbarbital 2.2851 0.114 0.24

Figura 4.45. Cromatograma de gases correspondiente a la muestra de Nuez Moscada en metanol.

224
 Capítulo 4

Compuesto Identificado Tiempo de Retención Abundancia (%) p.p.m.

α-Felandreno 0.552 - 0.786 2.248 2.12
1S-α-Pineno 0.8014 0.137 0.13
β-Pineno 0.814 - 0.842 0.736 0.69
4-metil-1-(1-metiletil)-3-Ciclohexen-1-ol 0.9727 8.159 7.69
Eugenol 1.346; 1.567 0.907 0.86
β-Mirceno 1.3733 0.285 0.27
α-Cubebeno 1.4147 1.167 1.10
1,2-dimetoxi-4-(2-propenil)-Benceno 1.4354 4.920 4.64
4-Metilen-1-(1-metiletil)-Biciclo[3,1,0]hexano 1.5286 0.256 0.24
4-metoxi-6-(2-propenil)-1,3-Benzodioxol 1.7323 57.663 54.36
1,2,3-trimetoxi-5-(2-propenil)-Benceno 1.7675 3.669 3.46
Ácido Tridecanoico 2.2281 4.715 4.45
Ácido Benzo[1,2,5]oxadiazol-5-carboxílico-1-
4.032- 4.199 4.903 4.62
óxido, metil éster

En el extracto en agua de la Nuez Moscada, el componente mayoritario es:

2,6-dimetoxi-4-(2-propenil)-Fenol

Este compuesto es la forma reducida del componente mayoritario del extracto en

metanol, la Miristicina (4-metoxi-6-(2-propenil)- 1,3-Benzodioxol):

4-metoxi-6-(2-propenil)-1,3-Benzodioxol / Miristicina

La miristicina actúa como un insecticida [31] y acaricida natural [32], como el eugenol.
Es capaz de provocar efectos psicoactivos, en dosis más altas que las culinarias [33, 34].
Otro de los compuestos característicos de la Nuez Moscada [35], obtenidos en el
extracto en metanol, es la Elemicina (1,2,3-trimetoxi-5-(2-propenil)-Benceno), cuya
estructura similar a otros compuestos como 1,2,3-bencenotriol o ácido gálico, asegura
su actividad antioxidante.

1,2,3-trimetoxi-5-(2-propenil)- Benceno / Elemicina

225
Capítulo 4

[Link]. Orégano

Figura 4.46. Cromatograma de gases correspondiente a la muestra de Orégano en agua.

Compuesto Identificado Tiempo de Retención Abundancia (%) p.p.m.

2,5-Norbornadieno 0.622 0.055 0.37
Bencenoacetaldehído 0.7587 0.083 0.56
1,3,8-p-Mentatrieno 0.8767 - 0.9251 0.757 5.09
1,2-Bencenodiol + Resorcinol 1.0349 - 1.0694 28.531 192.12
1.1896 - 1.1937;
Hidroquinona 22.219 149.62
1.6778 - 1.9885
Indol 1.2751 0.726 4.89
Carvacrol 1.2986-1.3256 0.966 9.49
4-Hidroxi-Bencenometanol 1.3671 1.256 8.46
2-hidroxi-6-metil-Benzaldehído 1.5873 4.488 30.22
Cariofileno 2.0161 1.050 7.07
1,2-Bencenodiol + Resorcinol + Hidroquinona 3.3861 24.557 165.36

226
 Capítulo 4

Figura 4.47. Cromatograma de gases correspondiente a la muestra de Orégano en metanol.

Compuesto Identificado Tiempo de Retención Abundancia (%) p.p.m.

α-Felandreno 0.655-0.731 0.685 1.81
β-Felandreno 0.6965 0.365 0.97
(1α,2β,5α)-2-metil-5-(1-metiletil)-
0.807 3.316 8.76
Biciclo[3.1.0]hexan-2-ol
(1α,2 α,5α)-2-metil-5-(1-metiletil)-
0.8554 0.430 1.14
Biciclo[3.1.0]hexan-2-ol
4-metil-1-(1-metiletil)-3-Ciclohexen-1-ol 0.9672 2.160 5.71
1,2-Bencenodiol 0.9748 3.850 10.18
α-Pineno 1.0763 0.531 1.40
Resorcinol 1.1328 2.902 7.67
Carvacrol 1.181 -1.207 8.921 23.58
2-Hidroxi-5-metil-Benzaldehído 1.5327 1.804 4.77
Fitol 2.8992 0.392 1.04
Ácido (Z,Z,Z)-9,12,15-Octadecatrienoico 2.9544 2.849 7.53
1,2-Bencenodiol + Resorcinol + Hidroquinona 3.729- 4.128 61.521 162.61
Vitamina E 4.544; 4.591 0.349 0.92

Los extractos de Orégano se caracterizan por sus propiedades antioxidantes,

antifúngicas, antibacterianas y antimicrobianas [36]. En este trabajo hay que destacar el
elevado contenido (relativo), en 1,2-Bencenodiol, Resorcinol e Hidroquinona. Además
se encontraron también Carvacrol (característico en extractos de Orégano) [19, 37] y
Vitamina E [38, 39] aunque en menores cantidades, ambos compuestos de elevada
capacidad antioxidante [5, 40]. El Carvacrol es muy poco soluble en agua por lo que se
obtuvo una proporción mucho mayor en el extracto en metanol.

Carvacrol

227
Capítulo 4

[Link]. Romero

Figura 4.48. Cromatograma de gases correspondiente a la muestra de Romero en agua.

Compuesto Identificado Tiempo de Retención Abundancia (%) p.p.m.

2-Amino-1,3-propanodiol 0.4278 7.015 2.08
N-Nitrosodimetilamina 0.4478 3.379 1.00
2-Hidroxi-2-Ciclopenten-1-ona 0.6081 2.496 0.74
Ácido Formico, 2-propenil éster 0.6861 5.056 1.50
Resorcinol + Hidroquinona 1.0423 - 1.4573 4.588 1.36
2-hidroxi-6-metil-Benzaldehído + 3-Hidroxi-
1.5885 10.000 2.96
2-metil-Benzaldehído + 4-metil-Benzaldehído
(1α,2β,3α,5β)-1,2,3,5-Ciclohexanotetrol 2.0078 59.309 17.58

Figura 4.49. Cromatograma de gases correspondiente a la muestra de Romero en metanol.

228
 Capítulo 4

Tiempo de Abundancia
Compuesto Identificado p.p.m.
Retención (%)
β-Pineno 0.6551 0.047 1.07
Eucaliptol 0.7442 10.491 236.99
Alcanfor 0.9596 4.908 110.87
Borneol 1.0073 3.597 81.25
α,α-4-trimetil-3-Ciclohexeno-1-metanol 1.0418 3.764 85.03
4-(1-metiletil)-Benzaldehído 1.1523 0.022 0.50
2-metil-5-(1-metiletil)- Fenol 1.208; 1.256 0.141 3.20
3-(4-metoxiphenoxy)-Benzaldehído 3.4605 0.067 1.51
2-Phenanthrenol, 4b,5,6,7,8,8a,9,10-octahidro-
4b,8,8-trimetil-1-(1-metiletil)-, (4bS-trans)- // 3.494-3.548 12.953 292.60
Totarol
5-Hidroxi-7-metoxi-2-(4-metoxifenil)-1-
4.299-4.313 2.241 50.62
Benzopiran-4-ona
Vitamina E 4.5909 0.160 3.62
4,4,6a,6b,8a,11,11,14b-Octametil-1,4,4a,5,6,
5.242-5.276;
6a,6b,7,8,8a,9,10,11,12,12a,14,14a,14b- 31.601 713.85
5.415-5.418
octadecahidro-2H-picen-3-ona // α-Amirina
3,5,6,7,8,8a-hexahidro-4,8a-dimetil-6-(1-
5.448 2.285 51.62
metilethenil)- 2(1H)Naftalenona
Betulina 5.612-6.340 11.770 265.89

Mientras que el extracto en agua fue algo escaso en compuestos, el extracto en metanol
fue mucho más rico. El Romero tiene un aroma dulce y fresco, levemente parecido al
del eucalipto y alcanforado, debido a la presencia de Eucaliptol y Alcanfor. Entre los
compuestos que forman los aromas y características organolépticas del Romero, se
obtuvo también β-Pineno, responsable de matices semejantes a los que se encuentran en
los pinos.

Eucaliptol Alcanfor β-Pineno

Los principales antioxidantes presentes en el Romero son carnosol, ácido carnósico,

rosmarinol y ácido rosmarínico [19, 41]:

Ácido Rosmarínico Rosmarinol Ácido Carnósico Carnosol

229
Capítulo 4

Éstos, no pudieron determinarse en estos ensayos debido a que sus puntos de ebullición
son superiores a la temperatura de trabajo. Por esta razón no se ha podido estudiar la
mayor parte de los antioxidantes presentes en los extractos de Romero con esta técnica.
También se obtuvo totarol [41]:

Totarol
[Link]. Tomillo

Figura 4.50. Cromatograma de gases correspondiente a la muestra de Tomillo en agua.

Compuesto Identificado Tiempo de Retención Abundancia (%) p.p.m.

DL-Norvalina 0.4057 0.956 2.39
Glicerina 0.641 3.296 8.24
Timina 0.7936 0.948 2.37
Mequinol 0.8364 0.725 1.81
1,2-Bencenodiol 1.0373 2.827 7.06
Indol 1.2762 2.306 5.76
Timol 1.3038 - 1.3245 6.527 16.31
2,6-dimetoxi-Fenol 1.3805 5.887 14.71
2,4-dihidroxi-6-metil-Benzaldehído 1.5048 0.565 1.41
2-hidroxi-6-metil-Benzaldehído + 2-
1.5938 16.467 41.15
Hidroxi-4-metil-Benzaldehído
4-(1,1-dimetiletil)-1,2-Bencenodiol +
1.7042 1.259 3.15
2-(1,1-dimetiletil)-1,4-Bencenodiol
4-(1-metiletil)-Benzaldehído 2.0224 0.947 2.37
(1α,2β,3α,5β)-1,2,3,5-Ciclohexanotetrol 2.0286 7.942 19.85
3-Hidroxi-4-metil-Benzaldehído 2.0548 0.141 0.35
Megastigmatrienona 2.2496 3.431 8.57
Cariofileno 2.4435 – 2.4497 15.924 39.80
[2R-(2α,4aα,8aβ)]-decahidro-α,α,4a-
2.4497 9.493 23.72
trimetil-8-Metilen-2-Naftalenmetanol

230
 Capítulo 4

Figura 4.51. Cromatograma de gases correspondiente a la muestra de Tomillo en metanol.

Tiempo de
Compuesto Identificado Abundancia (%) p.p.m.
Retención
Eucaliptol 0.6964 3.837 4.55
β-Pineno 0.7517 0.384 0.46
Alcanfor 0.9106 6.259 7.43
Borneol 0.944-0.959 9.122 10.83
α,α-4-trimetil-3-Ciclohexeno-1-metanol 0.9934 4.631 5.50
Timol 1.1798-1.2012 41.724 70.93
Camfeno 1.319;1.691 1.482 1.76
Cariofileno 1.5181 2.621 3.11
α,α,4,8-tetrametil-[s-(Z,Z)]-3,7-
1.7943 2.851 3.38
Ciclodecadieno-1-metanol
[1ar-(1aα,4aα,7β,7aβ,7bα)]-decahidro-1,1,7-
1.8771 6.306 7.48
trimetil-4-Metilen-1H-Cicloprop[e]azulen-7-ol
Óxido de Cariofileno 1.8979 2.830 3.36
(2R-cis)-1,2,3,4,4a,5,6,7-octahidro-α,α,4a,8-
1.9952 1.448 1.72
tetrametil-2-Naftalenmetanol
[2R-(2α,4aα,8aβ)]-1,2,3,4,4a,5,6,8a-octahidro-
2.0504 2.569 3.05
α,α,4a,8-tetrametil-2-Naftalenmetanol,
Carotol 2.1402 5.018 5.96
ácido n-Hexadecanoico 2.6159 2.264 2.69
Fitol 2.8982 0.427 0.51
Triciclo[[Link](2,5)]decano 2.9526 3.221 3.82
2-etil-2-metil-Tridecanol 4.114 2.268 2.69

231
Capítulo 4

Los principales antioxidantes que se encuentran en el Tomillo, son el Carvacrol (visto

anteriormente en el Orégano) y el Timol [5], característicos del Tomillo [19, 29]:

Timol

En el extracto acuoso se obtuvo un grupo de compuestos antioxidantes formado

principalmente por hidroxi-benzaldehídos, y en torno al 6,5 % del extracto, de timol,
siendo esta cantidad mucho menor a la obtenida en el extracto en metanol, debido a que
el timol es menos soluble en agua. Es un compuesto con propiedades antisépticas [42]
e insecticidas [43] y es el que proporciona el distintivo sabor fuerte del Tomillo
(“Thymus Vulgaris”). Debido a la similitud estructural y puntos de ebullición, es difícil
diferenciar entre el Timol (punto de ebullición 231-233ºC) y el Carvacrol (234-238ºC),
siendo identificado por el programa el Carvacrol (casi en la misma probabilidad que el
Timol) para el Orégano, y el Timol para el Tomillo (estando este, también dentro del
mismo grupo de compuestos probables que el Carvacrol).

232
 Capítulo 4

4.5. Resultados de HPLC

A continuación se exponen los resultados obtenidos mediante el análisis de muestras de
tés, infusiones y especias.
En primer lugar se establecieron los tiempos de retención de una serie de estándares, a
valores de concentración que proporcionaron picos bien visibles. Estas concentraciones
oscilaron entre 5·10–3 M y 100·10–3 M, dependiendo del compuesto. De esta manera, se
identificaron los picos correspondientes a los estándares:

Compuesto Tiempo de Retención (min)

ácido gálico 1,222-1,403 (hombro)
Ácido Vanílico 1,59
Teobromina 2,816
Teofilina 3,646
Cafeína 5,146
Vainillina 6,962
Cinamaldehído 36,966
Eugenol 41,232
β-Cariofileno 44,571
β-Pineno 45,872
Timol 47,149
Carvacrol 47,272
Miristicina 49,419
Linalol 51,781
Ρ-Cimeno 56,595
α-Pineno 57,637

Tabla 4.5. Tiempos de retención para estándares utilizados en HPLC.

De todos los compuestos descritos anteriormente, se pudieron identificar y cuantificar:

ácido gálico, Cafeína, Teobromina y Vainillina en tés y Cinamaldehído en Canela. Esto
es debido a que el resto de estándares utilizados, eran compuestos minoritarios y no
presentaban picos bien definidos a esos tiempos de retención, solapando con otros
compuestos y/o proporcionando intensidades bajas y poco representativas.
Éstos, fueron identificados en función de su tiempo de retención. Para confirmar su
presencia en las muestras, se prepararon unas alícuotas dopadas con estándares. En los
casos en que los picos correspondieron al compuesto buscado, hubo una intensificación
evidente en el pico de absorbancia correspondiente, mientras que si no era así, se
observó el pico correspondiente al estándar separado del pico que presentaba la alícuota.

233
Capítulo 4

De esta manera, una vez identificados algunos de los compuestos presentes en las
muestras a analizar, y teniendo estándares de éstos, se procedió a preparar las rectas de
calibrado para cada uno de ellos a 254 nm, por ser una longitud de onda a la cual se
obtenía una absorbancia suficientemente alta y monitorizable.
En varios casos, las rectas de calibrado no pasan por el origen de coordenadas porque
existe una contribución a la absorbancia, de la propia fase móvil.
En todos los casos la relación entre absorbancia y concentración del estándar fue lineal,
excepto en el caso de la vainillina, para la cual se obtuvo una relación polinómica:

15
14
Área de pico Ácido Gálico a 254 nm
Ajuste Lineal
13
12
11
Área de pico (·106) (Uds)

10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Concentración Ácido Gálico (·103) M

Figura 4.52. Recta de calibrado del ácido gálico y ecuación donde “y” es el Área del pico del
estándar y “x” es la concentración.
22 32
Área de pico Cafeína a 254 nm Área de pico Cafeína a 260 nm
20 Ajuste Lineal Ajuste Lineal
28
18
24
Área de pico (·106) (Uds)

16
Área de pico (·106) (Uds)

14 20

12
16
10

8 12

6 8
4
4
2

0 0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26
-3
Concentración Cafeína (·10 M) Concentración Cafeína (·10-3 M)

Figura 4.53. Rectas de calibrado de la Cafeína y ecuaciones donde “y” es el Área del pico del
estándar y “x” es la concentración.

234
 Capítulo 4
0,60
Área de pico Teobromina a 254 nm
0,55 Ajuste Lineal
0,50
0,45

Área de pico (·106) (Uds)

0,40
0,35
0,30
0,25
0,20
0,15
0,10
0,05
0,00
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4
Concentración Teobromina (·10-3 M)

Figura 4.54. Recta de calibrado de la Teobromina y ecuación donde “y” es el Área del pico
del estándar y “x” es la concentración.
3,25
Área de pico Vainillina a 325 nm
3,00 Ajuste Polinomial
2,75
2,50
Área de pico (·106) (Uds)

2,25
2,00
1,75
1,50
1,25
1,00
0,75
0,50
0,25
0,00
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Concentración Vainillina (·10-3 M)

Figura 4.55. Curva de calibrado de la Vainillina, y ecuación donde “y” es el Área del pico del
estándar y “x” es la concentración.
10
Área de pico Cinamaldehído a 254 nm
9 Ajuste Lineal

8
Área de pico (·106) (Uds)

0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110

Concentración Cinamaldehído (·10-3 M)

Figura 4.56. Recta de calibrado del Cinamaldehído y ecuación donde “y” es el Área del pico
del estándar y “x” es la concentración.

235
Capítulo 4

Se comprobó que haciendo los extractos en agua ultrapura a 100ºC, se obtenía una
composición diferente a la obtenida al hacer los extractos en metanol a 60ºC, ya que en
el extracto acuoso era mayor la concentración de compuestos polares (obtenidos al
principio de los cromatogramas, y entre ellos, los compuestos monitorizados), que en
los extractos alcohólicos. En el caso de las infusiones y extractos de especias no se han
detectado polifenoles en ninguno de los dos medios de extracción.
En algunas de las gráficas que se presentan a continuación (4.84, 4.93, 4.94 y 4.96), se
observan bandas de absorbancias negativas correspondientes a fenómenos de emisión.
Esto es debido a que el detector utilizado, como se indica en la parte experimental de
este capítulo, es una matriz de diodos que iluminan la muestra simultáneamente con un
conjunto de longitudes de onda. Esto provoca en algunas moléculas la fluorescencia,
cuya emisión es detectada a una longitud de onda diferente de la de excitación, siendo
este fenómeno por tanto responsable de las bandas de intensidad negativa. En algunos
casos esto es una ventaja (por ejemplo, en la muestra de Cúrcuma, con la Curcumina)
ya que permite una identificación inequívoca de un analito concreto.

4.5.1. Tés
A continuación se muestran los cromatogramas para los tés a las distintas longitudes de
onda de trabajo, para el extracto acuoso, el extracto alcohólico y la alícuota dopada,
donde se identificaron los picos de ácido gálico, teobromina, cafeína y vainillina. Esto
permite la cuantificación de los compuestos de los que se dispone estándares. En todos
los casos, la composición del extracto dopado consistió en 500 µL del extracto de té (en
agua ultrapura o metanol), 300 µL de ácido gálico 20·10-3 M, 300 µL de Teobromina
1·10-3 M, 300 µL de Cafeína de 20·10-3 M, 300 µL de Vainillina 80·10-3 M y 300 µL de
H2O ultrapura.
Además, teniendo en cuenta que ninguno de los compuestos estándares utilizados en
esta experiencia presentaban señales de absorbancia después de los 8 minutos de
análisis, se ha optado por hacer un zoom en la zona t<8 min para apreciar mejor los
picos, aunque se dispone de los cromatogramas completos. Los estándares utilizados en
el dopado se indican con los siguientes números, en las figuras: ácido gálico (1),
Teobromina (2), Cafeína (3) y Vainillina (4).

[Link]. Té Blanco
El Té Blanco es el único té estudiado con vainillina en su composición, puesto que el
formato de venta incluye vainilla. El inconveniente para determinar la vainillina en el
Té Blanco es que su pico de absorbancia solapa con el de la cafeína. Para discriminar

236
 Capítulo 4

las señales de los dos compuestos, se recurrió a la colección de longitudes de onda que
se hacía para cada medida, observándose que a 325 nm la señal obtenida para la cafeína,
era constante y casi nula (1,5·10–4 veces la señal correspondiente a la vainillina)
mientras que para la vainillina la señal obtenida a esta longitud de onda era igual a la
obtenida a 260 nm, de manera que tomando la integral de la señal de la vainillina a 325
nm y restándola de la obtenida a 260 nm para la cafeína y la vainillina juntas, se obtiene
la señal correspondiente a la cafeína a 260 nm, y así, su concentración en la muestra. La
concentración de vainillina se calcula de la absorbancia obtenida a 325nm.

1375
254 nm
1250 260 nm
275 nm
1125
280 nm
Absorbancia (mU)

1000 325 nm
900 340 nm
875 800 355 nm
260 nm

Absorbancia (mU)
750 700 325 nm 370 nm
600 385 nm
625 500
395 nm
400
500 300
375 200
100
250 0
5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5
125 Tiempo (min)
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Tiempo (min)

Figura 4.57. Cromatograma del extracto de Té Blanco en agua a diferentes longitudes de onda.
Interior: detalle de la discriminación de la señal producida por la cafeína y la vainillina a las
longitudes de onda de 260 nm y 325 nm.

45
254 nm
40 260 nm
275 nm
35 280 nm
325 nm
Absorbancia (mU)

30 340 nm
355 nm
25 370 nm
385 nm
20 395 nm
15
10
5
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Tiempo (min)

Figura 4.58. Cromatograma del extracto de Té Blanco en metanol a diferentes longitudes de

onda.

237
Capítulo 4

1000
Té Blanco Dopado
900
Té Blanco en H2O
800 1 2

Absorbancia (mU)
Té Blanco en MetOH
700
600 3
500
4
400
300
200
100
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Tiempo (min)

Figura 4.59. Comparativa de los cromatogramas a la longitud de onda de 254nm, para las
muestras de: extracto de Té Blanco en agua, extracto de Té Blanco en metanol y extracto de Té
Blanco dopado. Ácido Gálico (1), Teobromina (2), Cafeína (3) y Vainillina (4).

[Link]. Té Negro

2000
254 nm
1800 260 nm
275 nm
1600 280 nm
Absorbancia (mU)

325 nm
1400
340 nm
1200 355 nm
370 nm
1000 385 nm
800 395 nm

600
400
200
0

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Tiempo (min)

Figura 4.60. Cromatograma del extracto de Té Negro en agua a diferentes longitudes de onda.

238
 Capítulo 4

200
254 nm
180 260 nm
275 nm
160 280 nm

Absorbancia (mU)
140 325 nm
340 nm
120 355 nm
370 nm
100 385 nm
80 395 nm

60
40
20
0

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Tiempo (min)

Figura 4.61. Cromatograma del extracto de Té Negro en metanol a diferentes longitudes de

onda.

1800
Té Negro Dopado
1600
Té Negro en Agua
Absorbancia (mU)

1400 Té Negro en Metanol

1200
1
1000
800 3
2
600 4
400
200
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Tiempo (min)

Figura 4.62. Comparativa de los cromatogramas a longitud de onda=254nm, para las muestras
de: extracto de Té Negro en agua, extracto de Té Negro en metanol y extracto de Té Negro
dopado. Ácido Gálico (1), Teobromina (2), Cafeína (3) y Vainillina (4).

239
Capítulo 4

[Link]. Té Rojo

1300
254 nm
1200 260 nm
1100 275 nm
280 nm

Absorbancia (mU)
1000
325 nm
900
340 nm
800 355 nm
700 370 nm
600 385 nm
395 nm
500
400
300
200
100
0

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Tiempo (min)

Figura 4.63. Cromatograma del extracto de Té Rojo en agua a diferentes longitudes de onda.

10
254 nm
260 nm
8 275 nm
Absorbancia (mU)

280 nm
325 nm
340 nm
6 355 nm
370 nm
385 nm
395 nm
4

0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Tiempo (min)

Figura 4.64. Cromatograma del extracto de Té Rojo en metanol a diferentes longitudes de onda.

240
 Capítulo 4
1000
Té Rojo Dopado
900 Té Rojo en Agua
Té Rojo en Metanol
800 1

Absorbancia (mU)
700

600
3

500
4
400

300
2

200

100

0
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Time (s)

Figura 4.65. Comparativa de los cromatogramas a longitud de onda=254nm, para las muestras
de: extracto de Té Rojo en agua, extracto de Té Rojo en metanol y extracto de Té Rojo dopado.
Ácido Gálico (1), Teobromina (2), Cafeína (3) y Vainillina (4).

[Link]. Té Verde

2000
254 nm
1800 260 nm
275 nm
1600 280 nm
Absorbancia (mU)

325 nm
1400 340 nm
1200 355 nm
370 nm
1000 385 nm
395 nm
800
600
400
200
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Tiempo (min)

Figura 4.66. Cromatograma del extracto de Té Verde en agua a diferentes longitudes de onda.

241
Capítulo 4

1000
254 nm
900 260 nm
275 nm
800 280 nm

Absorbancia (mU)
325 nm
700 340 nm
600 355 nm
370 nm
500 385 nm
395 nm
400
300
200
100
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Tiempo (min)

Figura 4.67. Cromatograma del extracto de Té Verde en metanol a diferentes longitudes de onda.

1000 2
Té Verde Dopado
900 Té Verde en agua
1
800 Té Verde en Metanol

700
Absorbancia

600
3
500 4
400

300

200

100

0
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Tiempo (min)

Figura 4.68. Comparativa de los cromatogramas a longitud de onda=254nm, para las muestras
de: extracto de Té Verde en agua, extracto de Té Verde en metanol y extracto de Té Verde
dopado. Ácido Gálico (1), Teobromina (2), Cafeína (3) y Vainillina (4).

242
 Capítulo 4

[Link]. Mezcla de 3 Tés

1800
254 nm
1650 260 nm
1500 275 nm
280 nm

Absorbancia (mU)
1350 325 nm
1200 340 nm
355 nm
1050
370 nm
900 385 nm
750 395 nm

600
450
300
150
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Tiempo (min)

Figura 4.69. Cromatograma del extracto de Mezcla de 3 Tés en agua a diferentes longitudes de
onda.

10
254 nm
260 nm
275 nm
8
Absorbancia (mU)

280 nm
325 nm
340 nm
6 355 nm
370 nm
385 nm
395 nm
4

0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Tiempo (min)

Figura 4.70. Cromatograma del extracto de Mezcla de 3 Tés en metanol a diferentes longitudes
de onda.

243
Capítulo 4
900 2
Mezcla de 3 tés Dopado
800 1 Mezcla de 3 tés en Agua
Mezcla de 3 tés en Metanol
700

Absorbancia (mU)
600 3

500
4
400

300

200

100

0
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Tiempo (min)

Figura 4.71. Comparativa de los cromatogramas a longitud de onda=254nm, para las muestras
de: extracto de Mezcla de 3 Tés en agua, extracto de Mezcla de 3 Tés en metanol y extracto de
Mezcla de 3 Tés dopado. Ácido Gálico (1), Teobromina (2), Cafeína (3) y Vainillina (4).

A continuación se muestran las tablas resumen comparativas entre los compuestos

considerados más significativos de cada uno de los tés, en extracto en agua y en metanol.

Muestras de té - Extracto en agua

Blanco Negro Rojo Verde Mezcla
Ácido Gálico 590.78 503.56 692.49 279.67 494.51

Compuesto Teobromina 1676.75 2047.64 881.32 2614.93 2594.96

(p.p.m.) Cafeína 1343.96 1999.76 1719.18 1459.62 1723.88
Vainillina 10837.64 - - - -

Muestras de té - Extracto en metanol

Blanco Negro Rojo Verde Mezcla
Ácido Gálico 13.07 84.65 12.69 179.85 10.84

Compuesto Teobromina 35.89 139.10 - 1670.76 82.90

(p.p.m.) Cafeína 683.10 648.56 451.59 1105.10 444.54
Vainillina 9222.57 - - - -

En las muestras de HPLC de los tés, se identificaron más compuestos mayoritarios que
en los ensayos con cromatografía de gases. Por una parte, el ácido gálico por debajo de

244
 Capítulo 4

su punto de ebullición presenta un punto de inflamabilidad (271ºC) [44], por lo que no

aparece en los cromatogramas de gases. Por otra parte, como ya se dijo anteriormente,
las cantidades de Teobromina y la Vainillina en CG-EM son tan solo una fracción de la
cantidad real, debido a sus puntos de inflamabilidad.
La limitación en HPLC se presentó en la falta de estándares para identificar el resto de
picos. Sin embargo, pudieron asignarse los picos de los compuestos utilizados como
estándares externos, vistos en el apartado 4.5.
Para el contenido en polifenoles totales, se ha utilizado una variante del método descrito
por J. González et al. [45], utilizando el área del pico de máxima absorbancia a λ=280
nm, y relacionándola con un estándar de ácido gálico.
30,0
Área de pico Ácido Gálico a 280 nm
27,5 Ajuste Lineal
25,0
22,5
Área de pico (·106)

20,0
17,5
15,0
12,5
10,0
7,5
5,0
2,5
0,0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Concentración Ácido Gálico (·103) M

Figura 4.72. Recta de calibrado del ácido gálico a 280 nm para obtener el contenido en
polifenoles totales, y ecuación donde “y” es el Área del pico del estándar y “x” es la
concentración.

Los resultados obtenidos se presentan en la tabla siguiente.

Muestras de té

Blanco Negro Rojo Verde Mezcla

Extracto en
1041.62 1520.07 1419.68 876.73 763.27
Contenido en Polifenoles Totales agua
(p.p.m. de Ác. Gálico) Extracto en
23.18 97.63 16.99 160.90 17.17
metanol

Puede observarse que en el extracto en agua, el té que presenta un mayor contenido en

polifenoles totales es el Té Negro, mientras que en el extracto en metanol, es el Té
Verde.

245
Capítulo 4

4.5.2. Infusiones
[Link]. Manzanilla

275
254 nm
250 260 nm
275 nm
225 280 nm

Absorbancia (mU)
200 325 nm
340 nm
175 355 nm
150 370 nm
385 nm
125 395 nm
100
75
50
25
0
0 10 20 30 40 50 60
Tiempo (min)

Figura 4.73. Cromatograma del extracto de Manzanilla en agua a diferentes longitudes de onda.

12
254 nm
11 260 nm
10 275 nm
280 nm
Absorbancia (mU)

9 325 nm
8 340 nm
355 nm
7 370 nm
6 385 nm
395 nm
5
4
3
2
1
0
0 10 20 30 40 50 60
Tiempo (min)

Figura 4.74. Cromatograma del extracto de Manzanilla en metanol a diferentes longitudes de

onda.

Sobre la base de los resultados obtenidos en CG-EM, se deduce que el pico observado
en el cromatograma del extracto en agua en HPLC a tiempo aproximadamente 4
minutos, se corresponde con la 7-metoxi-1-Benzopiran-2-ona, ya que es el compuesto
mayoritario en el extracto en agua, y uno de los más abundantes en el extracto en
metanol, aunque en mucha menor proporción en este caso. Utilizando las características
del equipo y los coeficientes de extinción molar obtenidos en la bibliografía [46] se
obtiene un contenido en esta especie de 208 p.p.m., muy similar al encontrado con CG-
EM.

246
 Capítulo 4

[Link]. Menta-Poleo

650
254 nm
600 260 nm
550 275 nm
280 nm

Absorbancia (mU)
500
325 nm
450 340 nm
400 355 nm
350 370 nm
385 nm
300 395 nm
250
200
150
100
50
0
0 10 20 30 40 50 60
Tiempo (min)

Figura 4.75. Cromatograma del extracto de Menta-Poleo en agua a diferentes longitudes de

onda.

16
254 nm
260 nm
14 275 nm
280 nm
Absorbancia (mU)

12 325 nm
340 nm
10 355 nm
370 nm
8 385 nm
395 nm
6

0
0 10 20 30 40 50 60
Tiempo (min)

Figura 4.76. Cromatograma del extracto de Menta-Poleo en metanol a diferentes longitudes de

onda.

Sobre la base de los datos obtenidos para la Menta-Poleo en CG-EM, y teniendo en

cuenta que el Mentol se obtiene sólo en el extracto en metanol, se deduce que se
corresponde con las señales obtenidas en el correspondiente cromatograma de HPLC,
entre 30 y 35 minutos de tiempo de retención, ya que estas señales se asemejan mucho
a las obtenidas en el extracto en metanol para la Tila, donde también se obtiene este
compuesto.

247
Capítulo 4

[Link]. Rooibos

400
254 nm
260 nm
350 275 nm
280 nm

Absorbancia (mU)
300 325 nm
340 nm
250 355 nm
370 nm
200 385 nm
395 nm
150

100

50

0
0 10 20 30 40 50 60
Tiempo (min)

Figura 4.77. Cromatograma del extracto de Rooibos en agua a diferentes longitudes de onda.

25
254 nm
260 nm
275 nm
20 280 nm
Absorbancia (mU)

325 nm
340 nm
355 nm
15
370 nm
385 nm
395 nm
10

0
0 10 20 30 40 50 60
Tiempo (min)

Figura 4.78. Cromatograma del extracto de Rooibos en metanol a diferentes longitudes de onda.

En el extracto de Rooibos, tanto para HPLC como para GC-EM, debido al carácter
leñoso de la muestra. Presenta como pico común con otras muestras estudiadas, el pico
correspondiente al Timol, pero debido a que es un compuesto presente en poca
proporción en esta muestra, no ha podido estimarse su posición.

248
 Capítulo 4

[Link]. Salvia
650
254 nm
600 260 nm
550 275 nm
280 nm

Absorbancia (mU)
500
325 nm
450 340 nm
400 355 nm
350 370 nm
385 nm
300 395 nm
250
200
150
100
50
0
0 10 20 30 40 50 60
Tiempo (min)

Figura 4.79. Cromatograma del extracto de Salvia en agua a diferentes longitudes de onda.

110
254 nm
100 260 nm
275 nm
90
280 nm
Absorbancia (mU)

80 325 nm
340 nm
70 355 nm
60 370 nm
385 nm
50 395 nm
40
30
20
10
0

0 10 20 30 40 50 60
Tiempo (min)

Figura 4.80. Cromatograma del extracto de Salvia en metanol a diferentes longitudes de onda.

En el caso de la Salvia, se observó una posible coincidencia, obteniéndose en ambos

cromatogramas de HPLC el pico más intenso entre 31 y 33 minutos de tiempo de
retención. No se encontró coincidencia en los cromatogramas de CG-EM, por lo que es
posible que se trate del alcanfor, o uno de sus derivados hidroxilados, ya que todos ellos
son termolábiles.

249
Capítulo 4

[Link]. Tila

175
254 nm
260 nm
150 275 nm
280 nm

Absorbancia (mU)
125 325 nm
340 nm
355 nm
100 370 nm
385 nm
75 395 nm

50

25

0
0 10 20 30 40 50 60
Tiempo (min)

Figura 4.81. Cromatograma del extracto de Tila en agua a diferentes longitudes de onda.

160
254 nm
260 nm
140 275 nm
280 nm
Absorbancia (mU)

120 325 nm
340 nm
100 355 nm
370 nm
80 385 nm
395 nm
60

40

20

0
0 10 20 30 40 50 60
Tiempo (min)

Figura 4.82. Cromatograma del extracto de Tila en metanol a diferentes longitudes de onda.

Sobre la base de los resultados obtenidos en CG-EM, y como se ha indicado

anteriormente en el punto [Link] Menta-Poleo, las señales obtenidas entre 31 y 35
minutos del tiempo de retención del cromatograma del extracto en metanol en HPLC,
es muy posible que alberguen la señal correspondiente al Mentol. También, en la Tila
se encuentran antioxidantes como en 1,2-Bencenodiol que, por su alta solubilidad en
agua y su presencia en el extracto en metanol (aunque en mucha menor proporción),
debe corresponderse con las señales obtenidas en ambos cromatogramas de HPLC, entre
3 y 5 minutos del tiempo de retención.

250
 Capítulo 4

4.5.3. Especias
[Link]. Albahaca

450
254 nm
400 260 nm
275 nm
280 nm

Absorbancia (mU)
350
325 nm
300 340 nm
355 nm
250 370 nm
385 nm
200 395 nm

150
100
50
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
Tiempo (min)

Figura 4.83. Cromatograma del extracto de Albahaca en agua a diferentes longitudes de onda.
Tiempo (min)
75 60 62 64 66 68 70 72 74 76
254 nm
70 0

-1 260 nm
65 275 nm
Absorbancia (mU)

-2
60
Absorbancia (mU)

-3
280 nm
55 -4
325 nm
50 -5
340 nm
45 -6
355 nm
40 370 nm
-7
35 385 nm
-8
395 nm
30 -9

25
20
15
10
5
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80
Tiempo (min)

Figura 4.84. Cromatograma del extracto de Albahaca en metanol a diferentes longitudes de

onda. Interior: detalle de picos de intensidad negativa.

Sobre la base de los datos obtenidos en CG-EM, se comprueba que, como se ha dicho
anteriormente en el punto [Link]. Tila, es muy probable que compuestos como el 1,2-
Bencenodiol, la Hidroquinona y el Resorcinol, presenten picos en el extracto en agua
entre 2 y 5 minutos del tiempo de retención. No se han podido identificar los compuestos
responsables del resto de picos presentes en los cromatogramas de HPLC, puesto que
las composiciones de los extractos en agua y en metanol, obtenidos en CG-EM, son muy
diferentes.

251
Capítulo 4

[Link]. Canela en polvo

650
254 nm
600 260 nm
550 275 nm
280 nm

Absorbancia (mU)
500
325 nm
450 340 nm
400 355 nm
350 370 nm
385 nm
300 395 nm
250
200
150
100
50
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
Tiempo (min)

Figura 4.85. Cromatograma del extracto de Canela en Polvo en agua a diferentes longitudes de
onda.

1800 254 nm
1650 260 nm
275 nm
1500 280 nm
Absorbancia (mU)

1350 325 nm
340 nm
1200 355 nm
1050 370 nm
385 nm
900 395 nm
750
600
450
300
150
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
Tiempo (min)

Figura 4.86. Cromatograma del extracto de Canela en Polvo en metanol a diferentes longitudes
de onda.

252
 Capítulo 4
1200 Canela en Polvo Dopada
1100 Canela en Polvo en Agua
Canela en Polvo en Metanol
1000
900

Absorbancia (mU)
800
700
600
500 Cinamaldehído
400
300
200
100
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Tiempo (min)

Comparativa de los cromatogramas a longitud de onda=254nm, para las muestras de: extracto
de Canela en polvo en agua, extracto de Canela en polvo en metanol y extracto de Canela en
polvo dopada. La composición del extracto dopado consistió en 500 µL del extracto de Canela
en agua ultrapura, 500 µL de Cinamaldehído en agua 15·10 -3M y 1000 µL de H2O ultrapura.
Teniendo en cuenta que el Cinamaldehído es mucho más soluble en metanol, se obtuvo un pico
más intenso para el extracto de Canela en polvo en metanol.

En la muestra de la Canela en Polvo se ha podido identificar el pico correspondiente al

Cinamaldehído, obteniéndose para este 2372.72 p.p.m. en el extracto en agua y
12682.73 p.p.m. en el extracto en metanol.
Como puede observarse, el extracto en metanol de la Canela en polvo, es mucho más
rico en Cinamaldehído, lo que es lógico, debido a que este compuesto es mucho más
soluble en metanol que en agua, también por eso aparece cuando la Mezcla que
compone la fase móvil es más rica en metanol.

253
Capítulo 4

[Link]. Canela en rama

250
254 nm
225 260 nm
275 nm
200 280 nm

Absorbancia (mU)
325 nm
175 340 nm
150 355 nm
370 nm
125 385 nm
395 nm
100
75
50
25
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
Tiempo (min)

Figura 4.87. Cromatograma del extracto de Canela en Rama en agua a diferentes longitudes de
onda.

120
254 nm
110 260 nm
100 275 nm
280 nm
Absorbancia (mU)

90 325 nm
80 340 nm
355 nm
70
370 nm
60 385 nm
50 395 nm
40
30
20
10
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
Tiempo (min)

Figura 4.88. Cromatograma del extracto de Canela en Rama en metanol a diferentes longitudes
de onda.

Hay 496.85 p.p.m. en el extracto en agua y 599.51 p.p.m. en el de metanol. Como se

puede observar sobre la base de los resultados para las dos muestras de Canela (una en
polvo y otra en rama), hay mucha diferencia en la cantidad de Cinamaldehído obtenida
en el extracto acuoso y en el extracto en metanol para la muestra de Canela en polvo,
mientras que para la de Canela en rama, ambas cantidades son prácticamente iguales, y
también menores que en la muestra en polvo. Por tanto, se puede afirmar que el proceso

254
 Capítulo 4

de pulverización de la Canela, favorece la extracción de sus compuestos, entre ellos, los

antioxidantes.
En este caso, al igual que con las muestras de té y los compuestos Teobromina y
Vainillina, el que aparezca mayor cantidad de Cinamaldehído en HPLC que en CG-EM,
se debe a que el punto de inflamabilidad de este compuesto (131ºC) se encuentra por
debajo de su punto de ebullición (246-252ºC) [47].

[Link]. Clavo
180
254 nm
160 260 nm
275 nm
140 280 nm
Absorbancia (mU)

325 nm
120 340 nm
355 nm
100 370 nm
385 nm
80 395 nm

60
40
20
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
Tiempo (min)

Figura 4.89. Cromatograma del extracto de Clavo en agua a diferentes longitudes de onda.

400
254 nm
260 nm
350 275 nm
280 nm
Absorbancia (mU)

300 325 nm
340 nm
250 355 nm
370 nm
200 385 nm
395 nm
150

100

50

0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
Tiempo (min)

Figura 4.90. Cromatograma del extracto de Clavo en metanol a diferentes longitudes de onda.

Sobre la base de los datos obtenidos en CG-EM, se puede afirmar que el compuesto
mayoritario en el Clavo, el Eugenol, se corresponde con el pico más intenso obtenido
en cromatogramas de HPLC, siendo como era de esperar, mucho más intenso en el
extracto en metanol. En CG-EM, este compuesto se pierde (o disminuye mucho su

255
Capítulo 4

concentración) en la muestra del extracto en agua, probablemente en el paso de secado.

Señales similares a estas pero en menor proporción, pueden observarse en las muestras
de Nuez Moscada y de Canela, especias que también presentan Eugenol en su
composición, pero en menor proporción que el Clavo.
La cuantificación a partir de su coeficiente de extinción molar encontrado en la
bibliografía indica que hay 541.23 p.p.m. en el extracto en agua y 1210.41 p.p.m. en el
de metanol.

[Link]. Comino

175
254 nm
260 nm
150 275 nm
280 nm
Absorbancia (mU)

125 325 nm
340 nm
355 nm
100 370 nm
385 nm
75 395 nm

50

25

0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
Tiempo (min)

Figura 4.91. Cromatograma del extracto de Comino en agua a diferentes longitudes de onda.

700
254 nm
650 260 nm
600 275 nm
550 280 nm
Absorbancia (mU)

500 325 nm
340 nm
450
355 nm
400 370 nm
350 385 nm
300 395 nm
250
200
150
100
50
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
Tiempo (min)

Figura 4.92. Cromatograma del extracto de Comino en metanol a diferentes longitudes de onda.

256
 Capítulo 4

Los resultados obtenidos en CG-EM permiten asegurar que entre los picos obtenidos
antes de los 10 minutos de tiempo de retención se encuentra el pico del 4-(1-metiletil)-
Benzaldehído o Cuminaldehído, zona en la que también aparecen otros aldehídos
aromáticos, y cuyo contenido es mucho mayor en la muestra del extracto acuoso que en
la del extracto en metanol. En cuanto al resto del cromatograma no se han obtenido
puntos comunes ni especialmente significativos, lo que dificulta la asignación de picos.

[Link]. Cúrcuma
75 Tiempo (min) 254 nm
70 48 49 50 51 52 260 nm
65 3
275 nm
60 280 nm
Absorbancia (mU)

2
55
Absorbancia (mU)
325 nm
1
50 340 nm
45 0
355 nm
40 370 nm
-1 385 nm
35
395 nm
30 -2

25 -3
20
-4
15
10
5
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
Tiempo (min)

Figura 4.93. Cromatograma del extracto de Cúrcuma en agua a diferentes longitudes de onda.
Interior: detalle de picos de intensidad negativa.

1000 Tiempo (min)

48 49 50 51 52
900 0
Absorbancia (mU)

800 -250
Absorbancia (mU)

-500
700
-750 254 nm
600 260 nm
-1000
275 nm
500 -1250 280 nm
400 -1500 325 nm
340 nm
300 -1750 355 nm
-2000 370 nm
200 385 nm
-2250
100 395 nm
-2500
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
Tiempo (min)

Figura 4.94. Cromatograma del extracto de Cúrcuma en metanol a diferentes longitudes de

onda. Interior: detalle de picos de intensidad negativa.

Sobre la base de los datos obtenidos en CG-EM se puede identificar el pico obtenido a
49.7 minutos, el cual es inverso porque se debe a un fenómeno de fluorescencia (se

257
Capítulo 4

emite radiación en lugar de absorberla). El único compuesto que presenta esta propiedad
en la Cúrcuma y los derivados de esta, es la Curcumina [27].
En el extracto en metanol de HPLC, se puede observar que como hay una muy pequeña
proporción de aldehídos y alcoholes aromáticos, apenas hay señales antes de los 10
minutos de tiempo de retención.

[Link]. Jengibre
110
254 nm
100 260 nm
275 nm
90
280 nm
Absorbancia (mU)

80 325 nm
340 nm
70
355 nm
60 370 nm
385 nm
50 395 nm
40
30
20
10
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
Tiempo (min)

Figura 4.95. Cromatograma del extracto de Jengibre en agua a diferentes longitudes de onda.

180 Tiempo (min)

54,00 54,25 54,50 54,75 55,00 254 nm
165 260 nm
4 275 nm
150
280 nm
Absorbancia (mU)

135 2
Absorbancia (mU)

325 nm
120 0 340 nm
105 -2 355 nm
370 nm
90 -4
385 nm
75 -6 395 nm
60 -8
45 -10
30
15
0

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
Tiempo (min)

Figura 4.96. Cromatograma del extracto de Jengibre en metanol a diferentes longitudes de onda.
Interior: detalle de picos de intensidad negativa.

Sobre la base de los datos de CG-EM podemos asignar en los cromatogramas de HPLC,
el sistema de picos situado entre 44 y 47 minutos al Gingerol, que aparece en CG-EM

258
 Capítulo 4

para ambos extractos, aunque se extrae mayor cantidad en metanol que en agua. Los
picos situados entre 49 y 55 minutos en HPLC para el extracto en metanol pueden ser
debidos a la Gingerona (al menos uno de ellos), la cual aparece en CG-EM sólo en el
extracto en metanol, siendo un pico bastante significativo. Es ligeramente más apolar
que el Gingerol, por lo que necesita algo más de metanol en la fase móvil para eluirse
en la columna de HPLC, y tarda más en salir del sistema y ser detectado.

[Link]. Nuez Moscada

80
254 nm
260 nm
70
275 nm
280 nm
Absorbancia (mU)

60 325 nm
340 nm
50 355 nm
370 nm
40 385 nm
395 nm
30

20

10

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
Tiempo (min)

Figura 4.97. Cromatograma del extracto de Nuez Moscada en agua a diferentes longitudes de
onda.

80
254 nm
260 nm
70 275 nm
280 nm
Absorbancia (mU)

60 325 nm
340 nm
50 355 nm
370 nm
40 385 nm
395 nm
30

20

10

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
Tiempo (min)

Figura 4.98. Cromatograma del extracto de Nuez Moscada en metanol a diferentes longitudes
de onda.

259
Capítulo 4

Sobre la base de los datos obtenidos en CG-EM, y como se ha comentado anteriormente

para el Clavo, se confirma la presencia de una pequeña cantidad de Eugenol, pero no se
pueden asignar más picos debido al gran número de compuestos que aparecen en la
muestra, y que hay pocos en común entre los extractos y las demás muestras.

[Link]. Orégano

1200
254 nm
1100 260 nm
1000 275 nm
280 nm
Absorbancia (mU)

900 325 nm
800 340 nm
355 nm
700 370 nm
600 385 nm
395 nm
500
400
300
200
100
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
Tiempo (min)

Figura 4.99. Cromatograma del extracto de Orégano en agua a diferentes longitudes de onda.

240
254 nm
220 260 nm
200 275 nm
280 nm
Absorbancia (mU)

180 325 nm
160 340 nm
355 nm
140
370 nm
120 385 nm
100 395 nm

80
60
40
20
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
Tiempo (min)

Figura 4.100. Cromatograma del extracto de Orégano en metanol a diferentes longitudes de

onda.

Los resultados obtenidos en CG-EM indican que los compuestos más significativos en
los extractos de Orégano son los antioxidantes Hidroquinona, Resorcinol y 1,2-
Bencenodiol, difíciles de distinguir. Teniendo en cuenta la proporción obtenida en CG-

260
 Capítulo 4

EM, la banda obtenida entre 17.8 y 26.5 minutos de tiempo de retención en el extracto
en agua y la obtenida entre 21 y 27.8 minutos de tiempo de retención en el extracto en
metanol en HPLC, se pueden asignar a este grupo de tres compuestos muy similares.
Dado que en sus estructuras sólo varían las posiciones de los sustituyentes, cabe esperar
la aparición de una banda ancha debida a la elución simultánea de los tres compuestos,
durante un periodo de tiempo mayor al correspondiente a un pico bien definido, que se
corresponde con un solo compuesto.

[Link]. Romero

130
254 nm
120 260 nm
110 275 nm
280 nm
Absorbancia (mU)

100
325 nm
90 340 nm
80 355 nm
70 370 nm
385 nm
60
395 nm
50
40
30
20
10
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
Tiempo (min)

Figura 4.101. Cromatograma del extracto de Romero en agua a diferentes longitudes de onda.

80
254 nm
260 nm
70 275 nm
Absorbancia (mU)

280 nm
60 325 nm
340 nm
50 355 nm
370 nm
40 385 nm
395 nm
30

20

10

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
Tiempo (min)

Figura 4.102. Cromatograma del extracto de Romero en metanol a diferentes longitudes de

onda.

261
Capítulo 4

El eucaliptol es uno de los componentes obtenidos en mayor proporción para la muestra

de Romero en CG-EM, y aparece también en la Salvia (aunque en menor proporción).
De este modo, sobre la base de los resultados obtenidos en CG-EM se concluye que el
eucaliptol es el pico obtenido en el extracto en metanol de HPLC a tiempo de retención
entre 50 y 55 minutos, ya que es el único pico del cromatograma del extracto de Romero,
que guarda la relación con las cantidades obtenidas en CG-EM, respecto de su
correspondiente análogo en el cromatograma de la Salvia.

[Link]. Tomillo

480
254 nm
440 260 nm
400 275 nm
280 nm
Absorbancia (mU)

360 325 nm
320 340 nm
355 nm
280 370 nm
240 385 nm
200 395 nm

160
120
80
40
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
Tiempo (min)

Figura 4.103. Cromatograma del extracto de Tomillo en agua a diferentes longitudes de onda.
140
254 nm
130 260 nm
120 275 nm
110 280 nm
100 325 nm
340 nm
Absorbancia (mU)

90
355 nm
80 370 nm
70 385 nm
60 395 nm
50
40
30
20
10
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
Tiempo (min)

Figura 4.104. Cromatograma del extracto de Tomillo en metanol a diferentes longitudes de

onda.

262
 Capítulo 4

Sobre la base de los resultados obtenidos en CG-EM, se deduce, que tanto en carvacrol
como el timol, presentes ambos en el Orégano y en el Tomillo, presentan picos muy
similares (incluso bandas donde ambos pueden solapar), entre 45 y 50 minutos de
tiempo de retención, estando limitada la cantidad obtenida en el extracto en agua, por
su solubilidad, mientras que como en metanol son mucho más solubles, dan picos
mayores, especialmente en el cromatograma correspondiente al Tomillo. Se ha
observado que se mantiene la relación entre las cantidades obtenidas en CG-EM y las
integrales de los picos entre 45 y 50 minutos de tiempo de retención, de los
cromatogramas en HPLC para el Tomillo y el Orégano.

263
Capítulo 4

4.6. Comparativa de los extractos en agua y en metanol obtenidos en CG-EM

4.6.1. Tés
[Link]. Té Blanco

1200 Agua Compuesto químico Número

Metanol
900 Resorcinol 1
600 2-metil-Benzaldehído + 4-
400 2
300
metil-Benzaldehído
200 3-metoxi-1,2-Bencenodiol 3
p.p.m.

100 1,2,3-Bencenotriol 4
40 Vainillina 5
30 Cafeína 6
20
10 Teobromina 7
5,0 Sacarosa 8
2,5 2-fenil-1H-Pirrolo[2,3-
9
0,0 b]piridina
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Compuestos Químicos

[Link]. Té Negro

2000 Agua Compuesto químico Número

1600 Metanol
1200 Resorcinol 1
800 2-metil-Benzaldehído +
2
140
4-metil-Benzaldehído
120 3-metoxi-1,2-
3
p.p.m.

100 Bencenodiol
48 1,2,3-Bencenotriol 4
44 Sacarosa 5
40
36 Ácido 4-hidroxi-benzoico 6
12 Cafeína 7
8 Teobromina 8
4
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Compuestos Químicos

264
 Capítulo 4

[Link]. Té Rojo
1800
1500 Agua
1200 Metanol
Compuesto químico Número
400
300 Resorcinol 1
200 2-metil-Benzaldehído + 4-
2
metil-Benzaldehído
p.p.m.

12
3-metoxi-1,2-Bencenodiol 3
9 1,2,3-Bencenotriol 4
6 Ácido 4-hidroxi-benzoico 5
Cafeína 6
3 Teobromina 7
0
0 1 2 3 4 5 6 7
Compuestos Químicos

[Link]. Té Verde
Compuesto químico Número
1400
2-metil-Benzaldehído + 4-
Agua 1
1200 Metanol metil-Benzaldehído
1000
3-metoxi-1,2-Bencenodiol 2
180
160 1,2,3-Bencenotriol 3
140
30 Sacarosa 4
p.p.m.

20
10 Ácido 4-hidroxi-3-metoxi-
5
5 Bencenoacético
4 Cafeína 6
3 Teobromina 7
2 2-metoxi-1,4-Bencenodiol 8
1 4-propil-1,3-Bencenodiol 9
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 (1α,2β,3α,5β)-1,2,3,5-
10
Compuestos Químicos Ciclohexanotetrol

[Link]. Mezcla de 3 Tés

1750 Agua
1500
1250 Metanol
1000 Compuesto químico Número
400 Resorcinol 1
300
200 3-metoxi-1,2-Bencenodiol 2
60
40 1,2,3-Bencenotriol 3
p.p.m.

20
Vainillina 4
Sacarosa 5
6
4-propil-1,3-Bencenodiol 6
4 Cafeína 7
2 Teobromina 8
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Compuestos Químicos

265
Capítulo 4

4.6.2. Infusiones Compuesto químico Número

DL-Norvalina 1
[Link]. Manzanilla Butirolactona 2
Glicerina 3
200
Agua
2,4-dihidroxi-2,5-dimetil-3(2H)-
180
160 Metanol furan-3-ona 4
140
120
Bencenoacetaldehído 5
100 Timina 6
80
60
1,2-Bencenodiol 7
40 Indol 8
p.p.m.

20
7 3-Metil-p-anisaldehído 9
6 3-hidroxi-4-metoxi-Benzaldehído 10
5
Megastigmatrienona 11
4
3 4-hidroxi-3,5-dimetoxi-
2 Benzaldehído 12
1
7-metoxi-1-Benzopiran-2-ona 13
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 2-metil-5-Pirimidinol 14
Compuestos Químicos Isoxazol 15
2,6-Dimetil-4-hidroxibenzaldehído 16
tetrahidro-2,2,6-trimetil-6-(4-
metil-3-ciclohexen-2H-Piran-3-ol 17
2-(2,4-hexadiinilideno)-1,6-
Dioxaspiro[4.4]non-3-eno 18
ácido n-Hexadecanoico 19
Etenil-Ciclooctano 20
Clindamicina 21
Heptacosano 22
Nonadecano 23

[Link]. Menta-Poleo
80 Compuesto químico Número
Agua
70 Metanol 1,2-Bencenodiol + Resorcinol 5
60 4-metil-Benzaldehído 6
50 2-isopropil-5-metil-3-Ciclohexen-1-
7
ona
20
4-Hidroxi-2-metilacetofenona 8
p.p.m.

15 2-hidroxi-6-metil-Benzaldehído 9
1,2,3-Bencenotriol 10
10 (1α,2β,3α,5β)-1,2,3,5-
11
Ciclohexanotetrol
5
α-D-Glucopiranósido, α-D-
12
0 Glucopiranosilo
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 Crotonic acid, menthyl éster 13
Compuestos Químicos Ácido 2-(acetiloxi)-propanoico, 5-
14
Compuesto químico Número metil-2-(1-metiletil)-ciclohexil éster
Glicerina 1 Ciclohexanona, 5-metil-2-(1-
15
Bencenoacetaldehído 2 metiletil)-, trans-
Timina 3 Ciclohexanol, 5-metil-2-(1-
Ácido benzoico 4 metiletil)-, [1R-(1α,2β,5α)]- 16
(MENTOL)

266
 Capítulo 4

Compuesto químico Número Compuesto químico Número

Mercaptofenol 17 α-D-Glucopiranosa 23
Salicilaldehído hidrazona 18 Ácido 11,14,17-Eicosatrienoico,
24
Sacarosa 19 metil éster
Óxido de Cariofileno 20 Geranilgeraniol 25
Veridiflorol 21 γ-Sitosterol 26
3,7,11,15-Tetrametil-2-hexadecen-1-ol 22

Compuesto químico Número

[Link]. Rooibos Gliceraldehído 1
1,2-Bencenodiol + Resorcinol 2
30,0
28,5 Agua 2-metil-Benzaldehído + 4-metil-
Metanol
27,0 Benzaldehído+ 4-metil- 3
25,5
Benzaldehído
3,0 Ácido Bencenoacético 4
Timol 5
p.p.m.

2,5
2,4-dihidroxi-6-metil-
2,0 6
Benzaldehído
1,5 2-C-metil-Myo-Inositol 7
1,0 3,6-dietil-1,2,4,5-Tetrazina 8
0,5
Bencenoacetaldehído 9
Ácido 4-butoxi-Butanoic acid 10
0,0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Ácido n-Hexadecanoico 11
Compuestos Químicos Isomentol 12
Etenil-Ciclohexano 13
Farnesol isómero a 14
3,3-dimetil-Hexano 15
[Link]. Salvia
Compuesto químico Número
60 Agua Glicerina 1
40 Metanol
2,3-dihidro-3,5-dihidroxi-6-metil-
2
18 4H-Piran-4-ona
16 Maltol 3
1,2-Bencenodiol 4
p.p.m.

14
12 2-metil-Benzaldehído + 4-metil-
5
10 Benzaldehído
8 1,3,3-trimetil-2-
6
6 Oxabiciclo[2.2.2]octan-6-ol
4 trans-p-Menta-2,8-dienol 7
2 2-Metoxi-4-vinil-Fenol 8
0 trans-p-Menta-2,8-dienol 9
0 2 4 6 8 1012141618202224262830323436
4-Hidroxi-Bencenoetanol 10
Compuestos Químicos
3-Hidroxi-2-metil-Benzaldehído +
4-metil-Benzaldehído + 2-hidroxi- 11
6-metil-Benzaldehído
3,5-Dimetilanisol 12

267
Capítulo 4

Compuesto químico Número Compuesto químico Número

1-(4-hidroxi-3-metoxifenil)- 2-metoxi-4-(1-propenil)-Fenol 23
13
Etanona Eucaliptol 24
Ácido 4-hidroxi-3-metoxi- α-Pineno 25
14
benzoico Tujona 26
2-Hidroximetil-5-(1-hidroxi-1- Borneol 27
15
isopropil)-2-ciclohexen-1-ona (S)-α,α,4-trimetil-3-Ciclohexen-1-
1-(4-hidroxi-3,5-dimetoxifenil)- 28
16 metanol
Etanona Bornyl Acetato 29
7-Acetil-2-hidroxi-2-metil-5- 1-metoxi-4-(1-propenil)-Benceno 30
17
isopropilbiciclo[4.3.0]nonano p-Menta-1(7),8(10)-dien-9-ol 31
Óxido de Cariofileno 18 Veridiflorol 32
Ácido 4-hidroxi-3,5-dimetoxi- Ciclopropanecarboxilic acid, 2,2-
19
benzoico dimetil-3-(2-metil-1-propenil)-,2-
6-Isopropenil-4,8a-dimetil- metil-4oxo-3-(2,4-pentadienil)-2- 33
1,2,3,5,6,7,8,8a-octahidro- 20 ciclopenten-1-il éster, [1R-
naftalen-2-ol [1α[S*(Z)],3β]]-
exo-2-Hidroxicineol 21 Pectolinaringenina 34
5-Sec-butilpirogalol 22 4-metil-Benzaldehído 35

Compuesto químico Número

[Link]. Tila
2-metil-Benzaldehído + 4-metil-
Benzaldehído+ 3-metil-
310 Agua 7
305 Metanol
Benzaldehído + 4-metil-
Benzaldehído
100
1,2,4-Bencenotriol + 1,3,5-
8
75 Bencenotriol
50 Hidroquinona 9
p.p.m.

1-(2-hidroxi-5-metilfenil)-Etanona 10
12
10 3-hidroxi-4-metoxi-Benzaldehído 11
8 Ácido 4-(1-metiletil)-benzoico 12
6 2-hidroxi-6-metil-Benzaldehído 13
4 Ácido 4-hidroxi-benzoico 14
2
Ácido 4-hidroxi-3-metoxi-
0 15
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 Bencenoacético
Compuestos Químicos (1α,2β,3α,5β)-1,2,3,5-
16
Ciclohexanotetrol
Cafeína 17
Compuesto químico Número Desaspidinol 18
Timina 19
Sacarosa + Xilitol 1
Mentol 20
Ftalano 2
4-metil-Benzaldehído 21
2-metoxi-Fenol 3
Eugenol 22
2,3-dihidro-3,5-dihidroxi-6-
4 Hexilresorcinol 23
metil-4H-Piran-4-ona
2-Hidroxi-5-metilisoftalaldehído 24
Ácido benzoico 5
Isomentol 25
1,2-Bencenodiol 6
Mirtenol 26

268
 Capítulo 4
Compuesto químico Número Compuesto químico Número
Inositol 27 Farnesol 31
Bencenoacetaldehído 28 Vitamina E 32
α-D-Glucosa 29 γ-Sitosterol 33
Lauroil peróxido 30 β-Amirina 34

4.6.3. Especias Compuesto químico Número

2-hidroxi-6-metil-Benzaldehído +
[Link]. Albahaca 2-Hidroxi-5-metil-Benzaldehído+ 17
2-Hidroxi-4-metil-Benzaldehído
100 Ácido 3-Hidroxi-4-metoxi-
Agua
75 Metanol 18
benzoico
50
Ácido 4-hidroxi-3,5-dimetoxi-
22 19
benzoico
20 Ácido 4-hidroxi-3,5-dimetoxi-
18 20
benzoico
p.p.m.

16
14 β-Mirceno 21
12 Benzyl β-d-glucoside 22
10 4-(2-propenil)-Fenol 23
8
6
2-metoxi-4-(2-propenil)-Fenol,
4 acetato + 2-metoxi-4-(1-propenil)- 24
2 Fenol
0 Eugenol 25
0 5 10 15 20 25 30 35 40 Ácido benzoico, 4-etenil, metil
Compuestos Químicos 26
éster
Cadinol 27
Compuesto químico Número Bergamoteno 28
Glicerina 1 3,7,11,15-Tetrametil-2-hexadecen-
β-Pineno 2 1-ol
29
3,4-Dimetildihidrofuran-2,5-diona 3 ácido n-Hexadecanoico 30
α-Pineno 4 Fitol 31
Bencenoacetaldehído 5 cis,cis,cis-7,10,13-Hexadecatrienal 32
2(1H)- 6-hidroxi-Piridinona 6 Ácido 3-fenil-2-Propenoico, metil
2,3-dihidro-3,5-dihidroxi-6-metil- 33
7 éster
4H-Piran-4-ona Acetil eugenol 34
BenzoylÁcido Formico 8 Eicosano 35
1,2-Bencenodiol + Resorcinol 9 2-metilen-Ciclododecanona 36
3-metil-Benzaldehído 10 Escualeno 37
4-(2-propenil)- Fenol // 4-(2- 2-metil-Octadecano 38
11
propenil)- Fenol, acetato HenEicosano 39
Hidroquinona 12 2-metil-Dodecano 40
Indol 13 β-Sitosterol 41
Ethanone, 1-(2-hydrxy-5- Ácido (+)-3-oxo-Urs-12-en-24-
14 42
metilfenil)- oico, metil éster
Ácido Cinámico 15
Ácido trans-Cinámico 16

269
Capítulo 4

[Link]. Canela en Polvo

210 Agua Compuesto químico Número

180 Metanol
2-Amino-1,3-propanodiol 1
150
120 2-Furanmetanol 2
90 Glicerina 3
40 1,2-Bencenodiol + Resorcinol 4
p.p.m.

30 trans-tetrahidro-3,4-Furanodiol 5
20 Hidroquinona 6
10 (E)-Cinamaldehído 7
0,8 3-fenil-2-Propen-1-ol 8
0,6
0,4 1-Hidroxi,1-fenil-2-propanona 9
0,2 3,4-dihidro-1-Benzopiran-2-ona 10
0,0 Ácido trans-Cinámico 11
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Compuestos Químicos 1-Benzopiran-2-ona 12
trans-4-Metoxi-Cinamaldehído 13
4-propil-1,3-Bencenodiol 14

[Link]. Canela en Rama

35
30
Agua Compuesto químico Número
Metanol
25 ácido 2-Propenoico, 2-Hidroxietil
20 1
15 éster
7 dl-Gliceraldehído 2
6 Glicerina 3
p.p.m.

5 1,2-Bencenodiol + Resorcinol 4
4
Hidroquinona 5
Cinamaldehído 6
3
4-propil-1,3-Bencenodiol 7
2
(1α,2β,3α,5β)-1,2,3,5-
1 8
Ciclohexanotetrol
0 Eugenol 9
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Compuestos Químicos
(Z,Z)-α-Farneseno 10
3-fenil-2-Propen-1-ol, acetato 11
Bencil Benzoato 12
ácido n-Hexadecanoico 13
Etenil-Ciclooctano 14

270
 Capítulo 4

[Link]. Clavo
Compuesto químico Número
Trimetilamina + Ácido Fórmico
1100
Agua 1
1050 hidrazida
Metanol
1000 Ácido 2-Propenoico, 2-Hidroxietil
15
2
éster
10
5 dl-Gliceraldehído 3
1,6 2-Amino-3-metil-1-butanol 4
p.p.m.

2-metil-Benzaldehído + 4-metil-
1,2 5
Benzaldehído
0,8 3-Hidroxi-4-metoxi-Benzaldehído 6
Eugenol 7
0,4 Cariofileno 8
α-Cariofileno 9
0,0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 α-Farneseno 10
Compuestos Químicos Óxido de Cariofileno 11

[Link]. Comino Compuesto químico Número

420 3-Fenil-3-pentanol 11
Agua
Metanol (1α,2β,3α,5β)-1,2,3,5-
415 12
Ciclohexanotetrol
110
55 4-((1E)-3-Hidroxi-1-propenil)-2-
13
metoxi-Fenol
25 2,5-O-Metilen-D-manitol 14
p.p.m.

Inositol 15
20
4-(3,3-Dimetil-but-1-inil)-4-
15 Hidroxi-2,6,6-trimetilciclohex-2- 16
10 enona
cis-Pinen-3-ol 17
5
4-(1-metiletil)-Benzaldehído 18
0 4-(1-metiletil)-Bencenometanol 19
0 2 4 6 8 101214161820222426283032343638
2-(1,1-dimetiletil)-6-metil-Fenol 20
Compuestos Químicos
β-Pineno 21
1,2,4-Butanotriol 22
trans-Shisool 23
2-Caren-10-al 24
Compuesto químico Número 4-(1-metiletil)-1,4-
25
Bencenoacetaldehído 1 Ciclohexadieno-1-metanol
Timina 2 Ácido 4-metil-benzoico, 2-
26
Hidroxi-2-fenilpropil éster
Mirtenol 3
Alotreonina 4 Mequinol 27
Ácido 3,4-diHidroxi-
Trans-2-metil-5-(1-metiletil)- 28
5 Bencenoacético
Ciclohexanona
Carotol 29
2,6-dimetil-Fenol 6
2,4,6-trimetil-Fenol + 2,3,6-
Ácido 4-(1-metiletil)-benzoico 7 30
trimetil-Fenol
4-etil-2-metoxi-Fenol 8
4-Hidroxi-2-metil-Benzaldehído +
o-Metoxi-α,α-dimetilbenzil alcohol 9
4-metil-Benzaldehído+ 4-Hidroxi- 31
4-Metil-2,5-dimetoxi-Benzaldehído 10
3-metil-Benzaldehído
Fitol 32
271
Capítulo 4
Compuesto químico Número Compuesto químico Número
Ácidos Oleicos 33 Vitamina E 36
(Z)-9,17-Octadecadienal 34 Estigmasterol 37
dl-α-Tocoferol 35 β-Sitosterol 38

[Link]. Cúrcuma
6000
4000 Agua
2000 Metanol
Compuesto químico Número
250 Ar-tumerona 14
200 Ácido 4-Hidroxi-3-metoxi-
15
150 Bencenoacético, metil éster
p.p.m.

100 Ar-tumerona + Tumerona 16

50 (Ar-Tumerona) + (1,6-Heptadieno-
3,5-diona, 1,7-bis(4-Hidroxi-3- 17
15 metoxifenil)-)
10
2,5-dimetil-Bencenometanol 18
5
2-metoxi-Fenol 19
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 Mequinol 20
Compuestos Químicos Timol 21
4-Hidroxi-Benzaldehído 22
3-hidroxi-4-metoxi-Benzaldehído 23
Compuesto químico Número Z-α-trans-Bergamotol 24
(S)-1,3-Butanodiol+ Ácido o-(3-metilbut-2-enoil)-1,2-
1
Propanoico, butil éster 25
Bencenodiol
Fenol 2 8-Cedren-13-ol 26
Ácido Málico 3
Cedreno 27
2-metoxi-Fenol 4
5-metil-2-(1-metil-1-feniletil)-
2-metil-Benzaldehído + 4-metil- 28
5 Ciclohexanol
Benzaldehído
Curlona 29
2-Metoxi-4-vinil-Fenol + Timol 6 trans-Longipinocarveol 30
Eugenol 7 1-[3-(2,6,6-Trimetil-ciclohex-2-
(E)-3(10)-Caren-4-ol 8 enil)-4,5-dihidro-3H-pyrazol-4-yl]- 31
2,4-dihidroxi-6-metil- etanona
Benzaldehído + 2-Hidroxi-4- 9 1,7-bis(4-Hidroxi-3-metoxifenil)-
metoxi-Benzaldehído 32
1,6-Heptadieno-3,5-diona
4-propil-2-metoxi-Fenol 10 Benzestrol 33
Biciclo[2.2.1]heptan-2-ol 11 Vitamina E 34
Inositol (varios tipos) + Glucosa 12 Estigmasterol 35
4-(4-Hidroxi-3-metoxifenil)-2- β-Sitosterol 36
Butanona + 4-(3-Hidroxi-2- 13
γ-Sitosterol 37
metoxifenil)-2-Butanona

272
 Capítulo 4

[Link]. Jengibre

2500
Compuesto químico Número
Agua
2000 Metanol
(-)-Nortraquelogenina 12
1500 2-metoxi-Fenol + Mequinol 13
1000
500 Borneol 14
200 α,α,4-trimetil-Bencenometanol 15
150 2-metil-5-(1-metiletil)-Fenol + 2-
16
p.p.m.

100 etil-4,5-dimetil-Fenol
40 4-Hidroxi-2-metilacetofenona + 4-
17
30 Hidroxi-3-metilacetofenona
20 2-metoxi-4-(1-propenil)-Fenol + 2-
metoxi-3-(2-propenil)-Fenol +2- 18
10
metoxi-6-(2-propenil)-Fenol
0 3-hidroxi-4-metoxi-Benzaldehído +
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 19
4-Hidroxi-2-metoxibenaldehído
Compuestos Químicos 1-(1,5-dimetil-4-hexenil)-4-metil-
20
Benceno
2,6-dimetil-6-(4-metil-3-pentenil)-
21
Biciclo[3.1.1]hept-2-eno
Compuesto químico Número
(S)-1-metil-4-(5-metil-1-Metilen-4-
Hexanal 1 22
hexenil)- Ciclohexeno
Glicerina 2
[S-(R*,S*)]-3-(1,5-dimetil-4-
2-metil-Benzaldehído + 4-metil- 23
hexenil)-6-Metilen- Ciclohexeno
Benzaldehído+ 3-metil-
3 Hinesol 24
Benzaldehído + 4-metil-
4-(3-Hidroxi-1-propenil)-2-metoxi-
Benzaldehído 25
Fenol
Ácido α-Hidroxi-
4 Gingerona / Zingerona 26
Bencenopropanoico,
Ácido 4-Hidroxi-3-metoxi-
Vainillina 5 27
Bencenoacético, metil éster
3-metoxi-2,5,6-trimetil-Fenol 6
Z-α-trans-Bergamotol 28
α-Bisabolol 7
Ácido cis-13-Octadecenoico 29
Etil α-d-Glucopiranósido 8
3-(3-Hidroxi-4-metoxifenil)-l-
Gingerol 9 30
alanina
3,7,11-trimetil-6,10-Dodecadien-1-
10 Piperina 31
yn-3-ol
γ-Tocoferol 32
6-(p-Tolil)-2-metil-2-heptenol 11
γ-Sitosterol 33

273
Capítulo 4

[Link]. Nuez Moscada

Compuesto químico Número
62,5 Agua α-D-Glucopiranósido + β-D-
50,0 Metanol Glucopiranósido 8
37,5
17 4-hidroxi-3,5-dimetoxi-
16 Benzaldehído 9
15
Vinbarbital 10
9
α-Felandreno 11
p.p.m.

8
7 1S-α-Pineno 12
6
5
β-Pineno 13
4 4-metil-1-(1-metiletil)-3-
3 Ciclohexen-1-ol 14
2
1 Eugenol 15
0 β-Mirceno 16
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 α-Cubebeno 17
Compuestos Químicos
1,2-dimetoxi-4-(2-propenil)-
Benceno 18
Compuesto químico Número 4-Metilen-1-(1-metiletil)-
Gliceraldehído 1 Biciclo[3,1,0]hexano 19
Glicerina 2 4-metoxi-6-(2-propenil)-1,3-
1,2-Bencenodiol 3 Benzodioxol 20
2-metoxi-4-(1-propenil)-Fenol 4 1,2,3-trimetoxi-5-(2-propenil)-
Vainillina 5 Benceno 21
1,5-Anhidro-d-manitol 6 Ácido Tridecanoico 22
2,6-dimetoxi-4-(2-propenil)-Fenol 7 Ácido Benzo[1,2,5]oxadiazol-5-
carboxílico-1-óxido, metil éster 23

[Link]. Orégano Compuesto químico Número

Indol 6
190 Agua Carvacrol 7
180 Metanol 4-Hidroxi-Bencenometanol 8
170 2-hidroxi-6-metil-Benzaldehído 9
160 Cariofileno 10
150 1,2-Bencenodiol+Resorcinol +
11
p.p.m.

140 Hidroquinona
α-Felandreno 12
30
β-Felandreno 13
20 (1α,2β,5α)-2-metil-5-(1-metiletil)-
14
10 Biciclo [3.1.0]hexan-2-ol
(1α,2α,5α)-2-metil-5-(1-metiletil)-
0 15
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Biciclo [3.1.0]hexan-2-ol
Compuestos Químicos 4-metil-1-(1-metiletil)-3-
16
Ciclohexen-1-ol
α-Pineno 17
Compuesto químico Número
2-Hidroxi-5-metil-Benzaldehído 18
2,5-Norbornadieno 1
Bencenoacetaldehído 2
Fitol 19
1,3,8-p-Mentatrieno 3 Ácido (Z,Z,Z)-9,12,15-
20
[Link]. Romero
1,2-Bencenodiol + Resorcinol 4 Octadecatrienoico
Hidroquinona 5 Vitamina E

274
 Capítulo 4

[Link]. Romero

700 Agua
Metanol Compuesto químico Número
600 (1α,2β,3α,5β)-1,2,3,5-
250 7
Ciclohexanotetrol
200
150
β-Pineno 8
100 Eucaliptol 9
p.p.m.

50 Alcanfor 10
16 Borneol 11
12 α,α,4-trimetil-3-Ciclohexeno-1-
12
8 metanol
4 4-(1-metiletil)-Benzaldehído 13
0 2-metil-5-(1-metiletil)-Fenol 14
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 3-(4-metoxifenoxi)-Benzaldehído 15
Compuestos Químicos 2-Fenantrenol, 4b,5,6,7,8,8a,9,10-
octahidro-4b,8,8-trimetil-1-(1- 16
metiletil)-, (4bS-trans)- // Totarol
Compuesto químico Número 5-Hidroxi-7-metoxi-2-(4-
17
metoxifenil)-1-Benzopiran-4-ona
2-Amino-1,3-propanodiol 1
Vitamina E 18
N-Nitrosodimetilamina 2
4,4,6a,6b,8a,11,11,14b-Octametil-
2-Hidroxi-2-Ciclopenten-1-ona 3
1,4,4a,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,12,
Ácido Formico, 2-propenil éster 4 19
12a,14,14a,14b-octadecahidro-2H-
Resorcinol + Hidroquinona 5
picen-3-one // α-Amirina
2-hidroxi-6-metil-Benzaldehído +
3,5,6,7,8,8a-hexahidro-4,8a-dimetil-
3-Hidroxi-2-metil-Benzaldehído + 6 20
6-(1-metiletenil)- 2(1H)Naftalenona
4-metil-Benzaldehído
Betulina 21

275
Capítulo 4

[Link]. Tomillo

Agua
Compuesto químico Número
70
Metanol (1α,2β,3α,5β)-1,2,3,5-
60
13
Ciclohexanotetrol
50 3-Hidroxi-4-metil-Benzaldehído 14
Megastigmatrienona 15
40
p.p.m.

Cariofileno 16
20
[2R-(2α,4aα,8aβ)]-decahidro-
α,α,4a-trimetil-8-Metilen-2- 17
15
Naftalenmetanol
10 Eucaliptol 18
5 β-Pineno 19
0 Alcanfor 20
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34
Borneol 21
Compuestos Químicos
3-Ciclohexene-1-metanol,α,α4-
22
trimetil-
Camphene 23
Compuesto químico Número 3,7-Ciclodecadieno-1-metanol,
24
α,α,4,8-tetrametil-, [s-(Z,Z)]
DL-Norvaline 1
[1ar-(1aα,4aα,7β,7aβ,7bα)]-
Glicerina 2
decahidro-1,1,7-trimetil-4-
Timina 3 25
Metilen-1H-Cicloprop[e]azulen-
Mequinol 4
7-ol
1,2-Bencenodiol 5
Óxido de Cariofileno 26
Indol 6
(2R-cis)-1,2,3,4,4a,5,6,7-
Timol 7 octahidro-α,α,4a,8-tetrametil-2- 27
Fenol, 2,6-dimetoxi- 8 Naftalenmetanol
2,4-dihidroxi-6-metil- [2R-(2α,4aα,8aβ)]-
9
Benzaldehído 1,2,3,4,4a,5,6,8a-octahidro-
2-hidroxi-6-metil-Benzaldehído 28
α,α,4a,8-tetrametil-2-
+ 2-Hidroxi-4-metil- 10 Naftalenmetanol
Benzaldehído Carotol 29
4-(1,1-dimetiletil)-1,2- ácido n-Hexadecanoico 30
Bencenodiol + 2-(1,1- 11 Fitol 31
dimetiletil)-1,4-Bencenodiol
Triciclo[[Link](2,5)]decano 32
4-(1-metiletil)-Benzaldehído 12
2-etil-2-metil-Tridecanol 33

276
 Capítulo 4

4.6.4. Comentarios sobre los resultados obtenidos en CG-EM y HPLC

A pesar de que la técnica de CG-EM proporciona gran cantidad de información, se ve
limitada por la descomposición térmica y por las temperaturas de ebullición de los
componentes de la muestra. Esto fue lo que ocurrió con algunos de los antioxidantes
más extendidos en la naturaleza y presentes en algunas de las muestras, como el ácido
gálico y la vainillina de los tés, el mentol de la menta poleo, el cinamaldehído de la
canela y la vitamina E presente en gran cantidad de muestras (té blanco, té verde, tila,
comino, cúrcuma, orégano y romero), así como otros compuestos característicos como
la teobromina y el epigalocatequin-galato de los tés, y el alcanfor de la salvia y el
romero. Como contrapartida, pudieron monitorizarse otros muchos compuestos
realmente interesantes y que presentan actividad antioxidante así como compuestos
característicos de determinadas muestras y otros que se utilizaron como factores
comunes y comparativos para la composición de las diferentes muestras de té.
En los extractos de tés, tanto acuosos como alcohólicos, el principal componente es la
cafeína, siendo su contenido, en el menor de los casos, superior al 69 %. Hay que
destacar la similitud en la composición de los diferentes tipos de té, aunque la cantidad
de los compuestos varía en función del té. También hay que tener en cuenta, como ya
se ha comentado, que algunos de los compuestos que más interesan, no solo no alcanzan
el punto de ebullición en el rango de temperaturas que permite el equipo, sino que
muchos de ellos, antes de alcanzar ese punto, se inflaman, provocando un error por
defecto, si es que se obtiene parte de la señal correspondiente a ellos. Los tés son las
únicas muestras estudiadas en esta tesis que presentaban mayor número de compuestos
comunes en los dos tipos de extractos realizados, aun así la mayor de compuestos
antioxidantes se extrajeron en agua.
Las infusiones presentan una gran variedad en su composición y entre ellas, siendo esta
mucho más compleja que la de los tés. Abundan los compuestos relativos a hierbas y
plantas aromáticas, así como algunos presentes en la madera. Los extractos que se
obtienen son muy diferentes, dependiendo de si el extractante es agua o metanol.
Algunos de los compuestos más característicos de las plantas utilizadas en las infusiones
y presentes en sus aceites esenciales, se pueden extraer sólo en metanol, y por tanto se
encuentran en cantidades muy pequeñas (si se extraen) en las infusiones que se
consumen como bebida, donde el extractante utilizado es el agua. En cuanto a la
cantidad de polifenoles, se ha comprobado que es muy baja o nula, sin ser una parte
significativa de los extractos. Los compuestos antioxidantes extraídos de las infusiones,
varían en función de la infusión que se trate.
Para las especias se ha comprobado que los extractos son muy diferentes en función de
si se realizan en agua o en metanol, siendo muy pocos los compuestos comunes a ambos
extractos, y si los hay, aparecen en cantidades muy dispares. La cantidad de compuestos
antioxidantes extraídos de las especias varía mucho en función de la especia de la que

277
Capítulo 4

se trate, presentando un contenido mayor en el extracto acuoso aquellas especias de hoja

verde, como la Albahaca, el Orégano y el Tomillo, y un mayor contenido en
antioxidantes en el extracto en metanol el resto de especias.
Debido a la termolabilidad y/o la dificultad para llegar al punto de ebullición de algunos
de los componentes de la muestra, se optó por utilizar la técnica de HPLC. Esta técnica
es mucho menos agresiva y la temperatura de trabajo es baja, por lo que no afecta la
termolabilidad, siendo además independiente del punto de ebullición, ya que los factores
determinantes son la solubilidad y la polaridad de los diferentes compuestos.
Gracias a esta técnica se ha determinado el contenido en algunos antioxidantes de alto
interés como ácido gálico, vainillina y cinamaldehído mediante el método del patrón
externo. También se cuantificaron los polifenoles mediante una variante del método
descrito por J. González-Rodríguez et al. [45]. De esta forma, se pudo llevar a cabo la
cuantificación de compuestos con carácter antioxidante de cada muestra. Además, esto
permitió obtener valores más exactos para la teobromina, ya que en HPLC no se altera
por acción de la temperatura. Los resultados obtenidos para la cafeína son consistentes
con los obtenidos en CG-EM. No obstante, la carencia de estándares dificultó la
identificación de algunos compuestos, algo que se pudo compensar en parte, con los
resultados obtenidos en CG-EM, ya que las proporciones y características de estos
permitieron asignar picos en HPLC.
Las composiciones de las infusiones son muy variadas, mucho más complejas que las
de los tés. Abundan los componentes habituales de hierbas y de plantas aromáticas, así
como algunos integrantes de fracciones solubles de la madera. Los extractos que se
obtienen son muy diferentes dependiendo de si la extracción se realiza en agua o en
metanol. Algunos de los compuestos más característicos de las plantas utilizadas en las
infusiones y presentes en sus aceites esenciales, se pueden extraer sólo en metanol, y
por tanto se encuentran en cantidades muy pequeñas, si es que llegan a extraerse, en las
infusiones que se consumen como bebida, donde la extracción se realiza en agua. En
cuanto a la cantidad de polifenoles, se ha comprobado que es muy baja o nula, sin ser
una parte significativa de los extractos. Los compuestos antioxidantes extraídos de las
infusiones, varían en función de la infusión que se trate. Al igual que ocurre con las
infusiones, en las muestras de especias tampoco se ha encontrado ácido gálico ni
polifenoles.
Hay que destacar que los extractos de rooibos fueron menos ricos en compuestos
extraídos en general, y en antioxidantes en particular, debido al carácter leñoso de la
muestra, que dificulta la extracción de los compuestos.

278
 Capítulo 4

4.7. Comparativa del Contenido en Antioxidantes de los extractos en agua y en

metanol
En esta sección se discuten los contenidos en antioxidantes determinados por CG-EM,
fundamentalmente, a los que se ha añadido los obtenidos e identificados en HPLC.

4.7.1. Tés
12000 Agua
9000 Metanol

2500

2250
p.p.m. de Antioxidantes

2000

1750

1500

1250

1000

750

500

250

0
Bla Neg Roj Ver M3T
Té

En la gráfica de barras puede observarse la comparativa entre el contenido total en

antioxidantes, expresado en p.p.m. de antioxidantes totales para cada tipo de té: Blanco
(Bla), Negro (Neg), Rojo (Roj), Verde (Ver) y Mezcla de 3 Tés (M3T). En estos datos
se han incluido los antioxidantes volátiles y los polifenoles totales, la vainillina y el
ácido gálico obtenidos en HPLC.
En primer lugar, se observa que el té con mayor contenido en antioxidantes es el Té
Blanco, debido a la vainillina añadida artificialmente a este té. El segundo té más rico
en antioxidantes totales es el Té Negro, debido al elevado contenido que presenta este
té en polifenoles, así como antioxidantes volátiles.
El Té Verde es el que presenta mayor contenido en antioxidantes en el extracto en
metanol (sin contar el Té Blanco que cuenta con la vainillina añadida).
La Mezcla de 3 Tés, cuya composición contiene Té Blanco, Té Rojo y Té Verde,
presenta una composición más o menos media entre el Té Rojo y el Té Verde, sin poder
llegar a determinarse el contenido relativo a cada uno, ya que no se disponía del Té
Blanco utilizado para preparar esta Mezcla.
Se puede apreciar que, a excepción del Té Verde donde el contenido en antioxidantes
de ambos extractos es parecido, en el resto de tés, hay una mayor cantidad de

279
Capítulo 4

antioxidantes en el extracto en agua que en el extracto en metanol. Esto es debido a que

los principales polifenoles que encontramos en los tés son las epicatequinas, los
epicatequin-galatos, las epigalocatequinas y los epigalocatequin-galatos [48, 49]. El té
que presenta un mayor contenido en estos compuestos, especialmente en
epigalocatequin-galato, es el Té Verde, y teniendo en cuenta las solubilidades de estos
[50, 52-55], podemos apreciar que el epigalocatequin-galato es entre 4 y 10 veces más
soluble en alcohol que en agua [54, 55], por lo que se extraerá más con ese disolvente y
más aún en el Té Verde. En CG-EM, no aparece ninguno de estos polifenoles, ya que
sus puntos de ebullición son muy altos (499ºC para la epicatequina [51] y 909.1 para el
epigalocatequin-galato [54, 55]), teniendo algunos como el epigalocatequin-galato un
punto de inflamabilidad a 320ºC [54], de manera que no pasa a estado gaseoso sino que
se inflama antes (aunque en nuestro método no hemos alcanzado dicha temperatura).
La cantidad total de antioxidantes, no implica necesariamente, que ese extracto tenga
una mayor capacidad antioxidante, ya que hay que considerar también la naturaleza de
los antioxidantes propiamente dicha.
La secuencia en el ensayo de DPPH para los extractos acuosos es [57]:
Blanco > Verde ≈ Negro > Rojo
Mientras que en el ensayo de VPD con H2O2 es:
Verde >Blanco > Negro > Rojo
En cuanto al contenido total en antioxidantes, la secuencia es:
Blanco > Negro > Rojo > Verde
Todas las secuencias son diferentes. Esto es debido a que los dos ensayos miden distinta
reactividad de los antioxidantes, siendo el VPD más específico para antioxidantes
secundarios, esto es, para evaluar la capacidad de atrapamiento de radicales (ensayo tipo
HAT), mientras que el DPPH evalúa otras reacciones (ensayo tipo HAT y tipo SET).
En cualquier caso, los contenidos totales de antioxidantes tampoco dan cuenta
completamente de la capacidad antioxidante de los mismos, de lo cual se puede concluir
que, independientemente del tipo de ensayo empleado, la naturaleza de las moléculas
contenidas en los extractos es un factor determinante.

280
 Capítulo 4

4.7.2. Infusiones

130
Agua
120 Metanol

110

100
p.p.m. de Antioxidantes

90

80
52,5
45,0
37,5
9,0
7,5
6,0
4,5
3,0
1,5
0,0
Man P-Me Roo Sal Til
Infusión

En la gráfica de barras puede observarse la comparativa entre el contenido total en

antioxidantes, expresado en p.p.m. de antioxidante por gramo, de diferentes infusiones:
Manzanilla (Man), Menta-Poleo (P-Me), Rooibos (Roo), Salvia (Sal) y Tila (Til).
Hay que indicar que en ningún caso se han encontrado ácido gálico ni polifenoles en la
composición de las infusiones.
En el caso de las infusiones, se observa que el extracto de Salvia en agua es el que
presenta un mayor contenido en antioxidantes. En el caso de la Menta-Poleo, es mayor
el contenido del extracto en metanol, debido a que el mentol (su principal antioxidante),
es mucho más soluble en medios orgánicos.
Hay que destacar que, como ya se ha dicho, los extractos de Rooibos fueron menos ricos
en compuestos extraídos en general, y en antioxidantes totales en particular, debido al
carácter leñoso de la muestra.
En cuanto a la actividad antioxidante de los extractos acuosos, las secuencias son [57]:
Salvia > Menta-Poleo > Rooibos > Tila > Manzanilla (Ensayo DPPH)
Tila > Menta-Poleo > Rooibos > Salvia > Manzanilla (Ensayo VPD)
En ambos casos, las secuencias son muy diferentes de las obtenidas para los contenidos
totales de antioxidantes, lo que indica que en este caso la naturaleza de los antioxidantes
también es muy importante.

281
Capítulo 4

4.7.3. Especias

10000
Agua
9750
Metanol
9500
3400
3200
3000
1200
p.p.m. de Antioxidantes

1000
700
600
500

350

300

250

200

150

100

50

0
Alb Ca-P Ca-R Cla Com Cur Jen NMo Oré Rom Tom
Especia

En la gráfica de barras puede observarse la comparativa entre el contenido total en

antioxidantes, expresado en p.p.m. de antioxidante por gramo de las especias: Albahaca
(Alb), Canela en Polvo (Ca-P), Canela en Rama (Ca-R), Clavo (Cla), Comino (Com),
Cúrcuma (Cúr), Jengibre (Jen), Nuez Moscada (NMo), Orégano (Oré), Romero (Rom)
y Tomillo (Tom).
Al igual que para las infusiones, en ningún caso se han encontrado ácido gálico ni
polifenoles en la composición de los extractos de las especias.
Como se puede observar en la gráfica, el contenido total en antioxidantes es muy
diferente entre las especias, obteniéndose datos de lo más dispares:
- En algunos casos, el contenido total en antioxidantes es mucho mayor en el extracto
en metanol, simplemente debido a que los compuestos de estas muestras que presentan
actividad antioxidante, son muy poco solubles o insolubles en agua. Este es el caso del
Clavo (el más extremo), donde el principal antioxidante es el Eugenol; la Cúrcuma, con
la Tumerona, la Ar-Tumerona y la Curcumina y el Jengibre con el Gingerol y la
Gingerona.
También es el caso de la Canela, tanto en polvo como en rama. Esto es debido a que el
Cinamaldehído es mucho más soluble en el metanol que en agua. La cantidad de
Cinamaldehído que se ha tenido en cuenta, es la obtenida en HPLC, ya que como se ha
dicho previamente, este compuesto se descompone con la temperatura. En las muestras
de Canela podemos encontrar otro compuesto antioxidante muy característico, el Ácido
Cinámico, que es más soluble en agua, pero se encuentra en mucha menor proporción

282
 Capítulo 4

que el Cinamaldehído. También hay que destacar, que el hecho de que la muestra esté
pulverizada, facilita mucho la extracción de sus componentes.
En el caso del Romero, ocurre lo mismo que en los anteriores: el extracto en metanol es
más rico en antioxidantes. Aun así, como se ha explicado en el punto [Link]., algunos
compuestos con cualidades antioxidantes que se obtienen en el extracto en metanol, no
han podido determinarse debido a que sus puntos de ebullición son muy altos. El
carnosol además presenta un punto de inflamabilidad en torno a 187ºC [56], muy por
debajo de su punto de ebullición, lo que implica que se descompone mucho antes de que
pase a estado gaseoso.
- Al contrario de lo que se ha expuesto para las muestras anteriores, en otros casos, el
contenido total en antioxidantes es mucho mayor en el extracto en agua, como cabe
esperar, debido a la solubilidad de los compuestos antioxidantes y a que esta vez son
más polares. En este grupo, podrían incluirse la Albahaca, el Orégano y el Tomillo,
curiosamente todos ellos, especias de hoja verde. Estas tres especias presentan una gran
cantidad de compuestos aromáticos hidroxi-sustituídos y solubles en agua, en su
composición. La Albahaca es el caso más extremo, siendo casi siete veces mayor el
contenido en antioxidantes del extracto acuoso respecto del extracto en metanol. El
Orégano, presenta el mayor contenido en antioxidantes del extracto acuoso de las
especias estudiadas, siendo aproximadamente 2,5 veces mayor con respecto de su
extracto en metanol. El Tomillo, por su parte, presenta poca diferencia entre las
cantidades de antioxidantes obtenidas en ambos extractos, diferenciándose tan solo
alrededor de un 20%.
- Por último, encontramos las especias cuyo contenido total en antioxidantes es bajo,
tanto en el extracto en agua como en metanol. Estas especias poseen un bajo contenido
en antioxidantes, sirviendo perfectamente para aderezar guisos y comidas, dando unas
notas sensoriales de olor y sabor características, pero sin actuar especialmente como
fuente de antioxidantes. Entre estas, encontramos al Comino y a la Nuez Moscada. El
Comino, dentro de los bajos valores que proporciona, tiene como predominante la
fracción extraída en metanol, mientras que para la Nuez Moscada es la acuosa. El hecho
de tener una pequeña cantidad de antioxidantes no significa necesariamente que tengan
poca capacidad antioxidante.

De esta forma, se puede afirmar que para especias como el Clavo, la Cúrcuma, el
Jengibre, la Canela, el Romero y el Comino, se aconseja utilizar fracciones lipídicas
(como aceites) y/o alcohólicas (vinos, whisky, etc.) para la preparación de platos donde
se quiera aprovechar al máximo su contenido en antioxidantes. Mientras que para
especias como la Albahaca, el Orégano, el Tomillo y la Nuez Moscada, es suficiente
con añadir agua cuando se cocine con ellos, para extraer la mayor parte de su contenido
en antioxidantes.

283
Capítulo 4

4.8. Bibliografía
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[54] Epigalocatequin-Galato: [Link]
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[55] Epigalocatequin-Galato: [Link]
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[57] A. Palma, Tesis Doctoral, Universidad de Huelva (2015).

286
 Capítulo 4

Summary:
This chapter focuses on the determination of the composition of the aqueous and
methanol extracts of different samples of tea, infusions and spices. The most common
way for preparing tea and herbal infusions is by using hot water (approximately at its
boiling point). In the case of spices, it is also interesting to study the aqueous fraction
because it is usually the basis for many foods. Methanol was also used as extractant to
compare the results, due to its polarity, slightly lower than that of the water, and for this
reason, there are many organic compounds more soluble in methanol than in water.
Furthermore, spices in foods are frequently used together alcoholic beverages as
seasoning or as relevant ingredients, which influence the extraction of the nutrients. The
solubility of the components of the samples in the solvent used as extractant determines
the composition of the extract and, therefore, gives an idea about the compounds
ingested. The difference in antioxidant activity of these extracts depends precisely of
such compositions.

The analysed teas were: White Tea with a touch of vanilla and Black Tea, both from
Hornimans brand, Red Tea, Green Tea and Teas Mix 3 from Hacendado brand.
Infusions analyzed were: Camomile, Pennyroyal Mint, Rooibos with Plum taste, Sage
and Lime Blossom Tea from Hacendado brand. Spices analyzed were: Basil, Cinnamon
powder, Cinnamon sticks, Clove, Cumin, Turmeric, Ginger, Nutmeg, Oregano,
Rosemary and Thyme, all from Hacendado brand. Two techniques were used for this
investigation: Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS) and High
Performance Liquid Chromatography (HPLC).

The GC-MS analyses were performed with a Gas Chromatograph-Mass Spectrometer

“Gas Chromatography-Mass Spectrum Perkin-Elmer Clarus 500” equipped with an
automatic injector for 100 samples. The method consisted of a temperature ramp from
100 ºC to a 300 ºC (in 4 minutes). This last temperature was constant during 5.95
minutes to ensure that all the components of the samples passed through both the column
and the mass spectrometer, using helium as carrier. The sample preparation was done
by weighing 0.4 g of each type of tea, infusion or spice, which were added to 10 mL of
ultrapure water previously heated to 100ºC in a Kettle type heater, or 10 mL of methanol
at 60ºC, depending on the type of extract. Samples were stirred during 3 minutes at 300
r.p.m. Then a drying step was performed by taking 4 mL of each extract, filtered and,
finally, transferred to vials where the solvent was removed by passing a nitrogen stream
while gently heating. Next, the solid residue obtained was dissolved in 100 μL of
methanol with the aid of an ultrasonic bath.

GC-MS technique provides lots of information but it is limited by the thermal

decomposition of the sample components. This happened with some of the antioxidants

287
Capítulo 4

most widespread in nature, and present in some of the samples, such as Gallic Acid and
Vanillin in teas, Menthol in Pennyroyal Mint, Cinnamaldehyde in Cinnamon, Vitamin
E in many samples (White Tea, Green Tea, Lime Blossom Tea, Cumin, Turmeric,
Oregano and Rosemary) and other characteristic compounds such as Theobromine and
Epigallocatechin Gallate in teas, or Camphor in Sage and Rosemary. In return, many
others and really interesting antioxidant compounds were monitored.

The components found in the teas were the same (with the exception of the vanillin of
White tea, which in reality was externally added) but the proportion of the different
components was different. In addition, some of the most interesting compounds not only
do not reach the boiling point in the temperature range allowed by the equipment, but
many of them decomposed before reaching that point, causing errors by default. The
compositions of the extract of the infusions are much more complex than those of the
teas, and lower proportions of antioxidant compounds than in teas or spices were
obtained. For spices, the compositions obtained depended strongly of the extractant,
water or methanol. Just a few compounds are common in both extracts, appearing in
very different quantities.

The thermal lability and/or the difficulty to reach the boiling point of some of the
components of the sample led us use HPLC. This technique is much less aggressive and
is independent of the boiling and flash points, being the determinant factors solubility
and polarity of the compounds.

HPLC analyses were performed using a High Performance Liquid Chromatography

Perkin-Elmer Flexar. The method used to improve the separation of the substances
present in the samples, was based mainly on their polarity. A fast method avoiding
expensive and not easily accessible solvents was used, consisting of a mobile phase in
two-component gradient formed by aqueous and methanolic parts. The stationary apolar
phase was a C-18 column. The aqueous portion of the mobile phase, Acid Mobile Phase
(AMP), was optimized according to pH, peak resolution and simplicity in composition,
and consisted of a hydrochloric acid aqueous solution of 44·10–3 mol·L–1 and glycine
50·10–3 mol·L–1, being the final pH=2.01. Four methods were designed, depending on
whether the samples were tea (measuring time, tm, 45 min), infusions or spices (tm = 60
min), standards that showed a signal in less than 12 min (Gallic Acid, Caffeine,
Theobromine and Vanillin), or standards that showed a signal before 42 min
(Cinnamaldehyde). All methods needed a 5 min equilibration step previous to the run,
with a composition of the mobile phase of a 60% AMP and 40% methanol. After this
step the instrument automatically injected 10 μl of sample and the run steps began, the
mobile phase gradually changing from a majority percentage in AMP to a majority
percentaje in methanol.

288
 Capítulo 4

The sample preparation for HPLC, was performed by weighing 1.0 g of each tea,
infusion and spice, passing each aliquot to a beaker containing 10 mL of ultrapure water
at 100ºC, preheated with the help of a Kettle type water heater, or 10 mL of methanol
at 60°C, depending on the type of extract, and stirring at 300 r.p.m. for 3 minutes. Then,
a part of each of the extract was filtered to remove the sludge, leaf debris and suspended
particles. The resulting liquid was transferred to sample vials.

Using this technique, the contents of Gallic Acid, Vanillin, and Cinnamaldehyde were
determined by the external standard method. Total polyphenols were determined with a
modification of the method described by J. Gonzalez-Rodriguez et al. (see
bibliography). HPLC permitted the quantification of compounds with antioxidant
character. Furthermore, more accurate values of theobromine were obtained because
this compound is not thermally altered as in GC-MS. On the other hand, the results
obtained for caffeine were very similar to those obtained in GC-MS. However, the lack
of standards difficult the identification of some compounds.

The White tea contained the higher quantity of antioxidants due to the presence of
Vanillin. In the second place in water is found the Black tea, due to its content in low-
molecular weight polyphenols, soluble in water, whereas in methanol the second place
is for the green tea, due to the epigallocatechin gallate and similar polyphenols, soluble
in methanol but not in water (or slightly soluble). It must be noted the low content in
antioxidants of the alcoholic extract of the red tea in contrast with the aqueous extract.
The sequence obtained from the total amount of antioxidant does not match the
antioxidant capacity obtained either with DPPH or VPD-H2O2 assays. This is due to the
influence of the type of antioxidants, not just quantity.

The compositions of the infusions are much more complex than those of the teas. There
are many compounds related to herbs and aromatic plants, as well as some present in
wood. There are significant differences between the aqueous and methanolic extracts,
both in the compositions and in the total antioxidant contents. The more characteristic
compounds present in the essential oils of the plants are extracted almost exclusively in
methanol and, therefore, in very low quantities in water. In all cases, the polyphenol
content was null or very low. Antioxidants extracted from infusions vary depending on
the infusion analysed.

The aqueous extract of Sage presented the higher antioxidant content, followed by
Pennyroyal-Mint and Linden. The methanolic extract of Pennyroyal-Mint presented the
higher antioxidant content due to the presence of Menthol in significant quantities, much
more soluble in the alcoholic medium than in water. Finally, the Rooibos extracts were

289
Capítulo 4

poor in antioxidants, in comparison with the rest on infusions, due to the woody
character of the samples, which prevents in part the extraction.

For infusions, as for teas, the sequence based on the total antioxidant content, does not
match with those obtained for the antioxidant capacity by DPPH and VPD-H2O2
methods, this confirming again that the antioxidant capacity depends on the type of
antioxidants rather than on its quantity.

Gallic Acid or polyphenols were not found in the samples of spices, as occurred for the
infusions. The total antioxidant contents are very different depending on the type of
spice, ranging from very high values for Cinnamon, Clove, Turmeric and Ginger, to
lower values for Cumin and Nutmeg.

In some cases, the total antioxidant content is much higher in the methanol extract,
simply because the antioxidant compounds of these samples are either poorly soluble or
insoluble in water: Clove (the most extreme), which main antioxidant is Eugenol,
Turmeric, with Tumerone, Ar-tumerone and Curcumin, and Ginger with Gingerol and
Gingerone. It is also the case of Cinnamon, both powder and sticks, because the
Cinnamaldehyde is more soluble in methanol than in water. The amount of
Cinnamaldehyde taken into account was obtained from the HPLC measurements,
because this compound decomposes at the working GC-MS temperature. Cinnamic
Acid, another characteristic antioxidant, found in Cinnamon, is more soluble in water
than in methanol, but is less abundant than Cinnamaldehyde. When the sample is
powdered, the extraction of components is greatly facilitated. The methanol extract of
Rosemary is also rich in antioxidants, but the major antioxidants (Carnosol, Carnosic
Acid, Rosmarinol and Rosmarinic Acid) could not be determined because their boiling
points, much greater than the working temperature, or their flash points, below the
boiling points.

For Basil, Oregano and Thyme, green leafy spices, the total antioxidant content is much
higher in the water extracts due to the solubility of the more polar antioxidants that they
contain. The compositions of these spices present a large amount of water soluble
hydroxy-substituted aromatic compounds. Basil is the most extreme case, being the
antioxidant content of the aqueous extract nearly seven times that of the methanol
extract. The aqueous extract of Oregano presents the highest antioxidant content of the
spices, being c.a. 2.5 times greater than that of the methanol extract. For Thyme
difference between the amounts of antioxidants obtained in both extracts is low,
differing only around a 20%.

Finally, Cumin and Nutmeg are spices whose total antioxidant contents are low both in
water and in methanol; so they are useful to flavour food and meals, giving a sensory

290
 Capítulo 4

odour notes and taste characteristics, but without acting especially as sources of
antioxidants. For Cumin predominates the fraction extracted with methanol, whereas
for Nutmeg is that aqueous. But a small amount of antioxidants does not necessarily
imply a low antioxidant capacity.

For spices like Clove, Turmeric, Ginger, Cinnamon, Rosemary and Cumin it is
recommended the use of lipid (such as oils) and/or alcoholic (wine, whisky, etc.)
fractions for the food preparation, if one want to take advantage of their antioxidant
contents. For spices such as Basil, Oregano, Thyme and Nutmeg, only water must be
added in the food cooking to extract most of their antioxidant content.

The total amount of antioxidants, does not necessarily imply that the extract has a higher
antioxidant capacity, because the nature of the antioxidants must be also considered.

291
Capítulo 4

292
CAPÍTULO IV

CONCLUSIONS
 Capítulo 5

CONCLUSIONS:
1- The electrochemical immobilization of purines on carbon electrodes, specifically the
adenosine and guanosine nucleosides, allows the development of a bio-recognition
sensor, based on the formation of stable layers, for the voltammetric detection of
antioxidant capacity of different compounds.
2- The optimal variables for the immobilization of adenosine and guanosine on GCE
and CPE were:
• adenosine on GCE: Eoptimal = 1.2 V; pHoptimal = 5.0; toptimal = 180 seconds; [Adenosine]
= 0.056 mM
• guanosine on GCE: Eoptimal = 0.4 V; pHoptimal = 5.0; toptimal = 180 seconds; [Adenosine]
= 0.035 mM
• guanosine FPC: Eoptimal = 0.4 V; pHoptimal = 5.0; toptimal = 150 seconds; [Adenosine] =
1.0 mM
• adenosine on the CPE: Eoptimal = 1.2 V; pHoptimal = 5.0; toptimal = 180 seconds;
[Adenosine] = 0.8 mM
3- Fenton's reagent (oxidant) acts on the immobilized nucleosides on the surface of
carbon electrodes. When the concentration of added Fe2+ increases (keeping the
concentration of H2O2 constant and in large excess) the reduction signal of the
nucleoside decreases, because more OH–radicals are generated, which attack the
nucleoside immobilized on the electrode surface. The addition of an antioxidant as
ascorbic or gallic acids causes an increase in the signal because the OH– reacts faster
with the antioxidant than with the nucleoside. The signal recovery is related to the
protective effect of the antioxidant.
4- CPE sensitivity to the presence of antioxidant is much less than the sensitivity of the
GCE.
5- Oxidation of cumene hydroperoxide on GCE involves an irreversible one-electron
transfer originating peroxyl and/or phenoxyl radicals, being the main final products
hydroquinone and acetone. The general mechanism of the oxidation occurs in two steps:
the formation of acetone and a phenoxyl radical, and reaction of the phenoxyl radical
with water, to originate hydroquinone, which is finally oxidized to ortho- and para-
benzoquinone.
6- The interaction of the radicals with antioxidants such as ascorbic and gallic acids,
causes a decrease in the oxidation signal of cumene hydroperoxide in differential pulse
voltammetry. This decrease is due to the scavenging of radicals formed after the electron
transfer, which is related to the antioxidant activity of these compounds. In the case of
ascorbic acid, the peak intensity in differential pulse voltammogram decreases in a 10%
for a concentration around 7.9 · 10–3 mol L–1. For gallic acid, the decrease in a 10% is

295
Capítulo 5

achieved at a concentration of about 10.5 · 10–3 mol L–1, indicating that the antioxidant
activity of gallic acid is less than that of ascorbic acid.
7- It can be used the oxidation of cumene hydroperoxide in GCE to determine the
antioxidant capacity related to the radical scavenging capacity of different compounds
and mixtures. This is an alternative to the hydrogen peroxide oxidation, which requires
the use of mercury electrodes.
8- The pKa value of sesamol, corresponding to the dissociation of the hydroxyl group in
position 5, was 10.1 ± 0.1, obtained from the dependence of the UV-visible spectra with
the acidity of the medium.
9- Sesamol oxidation on glassy carbon electrodes at potential corresponding to the peak
1 implies the transfer of two electrons per molecule though a very similar mechanism
to the oxidation of 1,4-dihydroquinone. A pH values lower than this pKa the first step
corresponds to the dissociation of sesamol to give an anion which undergoes a first
electron transfer, with the ring opening, followed by a second electron transfer, this
being the rate-determining step, r.d.s. The fourth step is the addition of the radical cation
obtained after the r.d.s. and contemplates the possibility of reaction with other hydroxyl
ions or water, depending on whether the pH is basic or acidic, respectively. The
oxidation product is 1,4-benzoquinone substituted at the position 3. At pH values higher
than pKa the first dissociation step does not occur.
10- At potentials corresponding to the peak 2 the reagent for the oxidation process must
be the substituted 1,4-benzoquinone. The H+ or OH– ions do not take part in the process,
at least before the r.d.s. It can be postulated that the substituted 1,4-benzoquinone is
hydrolyzed by one molecule of water to give formaldehyde and 3-hydroxy-1,4-
benzoquinone, which is then oxidized to the corresponding peroxide involving another
water molecule.
11- For sesamol, the radical scavenging capacity against ROS measured by differential
pulse voltammetry using hydrogen peroxide oxidation is medium-low. The radical
formation occurring in the break of the ring may partially explain the ability of ROS to
interact with sesamol.
12- The pKa obtained for 2,4-DHB by UV-visible spectroscopy were 6.94 ± 0.03 and
9.28 ± 0.03, corresponding to the loss of H+ ions of the hydroxyl groups in positions 4
and 2, respectively. The 2,5-DHB pKa values were 8.42 ± 0.03 and 10.93 ± 0.03 for the
dissociation of H+ ions of the hydroxyl groups in positions 5 and 2, respectively.
13- The analysis of the antioxidant activity obtained by the measurement of the radical
scavenging capacity against ROS, indicates that at pH 10.5 the antioxidant capacity of
the 2,4- isomer is approximately twice of that obtained for the 2,5- isomer. However, at
pH 12.5 the antioxidant activities of both compounds are similar, although slightly

296
 Capítulo 5

lower in the case of 2,5DHB. The pH at which the assays of antioxidant capacity are
performed is therefore very important from the perspective of the dissociation of
hydroxyl groups, due to the differences in the values of the dissociation constants of the
different isomers.
14- Oxidation of 2,5-DHB on glassy carbon electrodes corresponds to the transfer two
electrons per molecule, being the final oxidation product 1,4-benzoquinone substituted
in position 1.
15- At potentials corresponding to peak 1 and at pH values below the first pKa, the
mechanism involves a first step corresponding to the output of an H+ ion from the -OH
group in position 5, followed by a first electron transfer, which is quasi-reversible, to
give a radical who losses an H+ ion in a third step, corresponding to the r.d.s. Then, it
takes place the second electron transfer resulting the substituted 1,4-benzoquinone.
16- At pH values higher than pK1 but lower than pK2, the electroactive species changes
to the anion, which loses an H+ ion to give the dianion. The process is now of CEE type,
that is, two electron transfers occur at different potentials, preceded by a fast chemical
step. A pH> pK2 the process becomes of EE type, and no H+ ions are involved in the
process.
17- The main antioxidants obtained for the aqueous extracts of tea analysed by GC-MS,
are Resorcinol, 2-methyl and 4-methyl-Benzaldehyde, 3-methoxy-1,2-Benzenediol and
1,2,3-Benzenetriol (more abundant than the rest), in varying amounts depending on the
type of tea. In the extracts in methanol the 1,2,3-Benzenetriol was the only antioxidant
obtained. The water extracts were much richer in quantity and types of compounds than
those obtained in methanol. The most significant peak in GC-MS corresponds to
Caffeine. The White Tea presents the highest antioxidant content by the Vanillin
artificially added.
18- The compounds with low flash points, lower than both the boiling point and the
working temperature in GC-MS analysis, are deteriorated before evaporating, and are
not detected (or only a fraction of them is detected). Theobromine, and antioxidants
such as Gallic Acid and Vanillin are some examples.
19- The compounds with high boiling points, as the most characteristic tea polyphenols,
Epicatechin, Epicatechin-Gallate, Epigallocatechin and Epigallocatechin-Gallate, are
not detected in the GC-MS analysis.
20- In HPLC, for tea samples were determined and quantified Gallic Acid,
Theobromine, Caffeine and Vanillin. The water extracts are much richer in antioxidants,
and compounds in general, than those obtained in methanol. It was quantified the
polyphenol fraction of the samples, which contributes significantly to the antioxidant
capacity. In this case, the White Tea also had the higher total antioxidant content due to

297
Capítulo 5

the added Vanillin. Water extract of Black Tea presented the highest total polyphenols
value. This is the case of the methanol extracts of Green Tea, probably due to the
presence of high amounts of Epigallocatechin-Gallate, much more soluble in methanol
than in water.
21- From the combining data from HPLC with GC-MS, it was obtained the total
antioxidant content for each tea, so that the sequence was: White Tea> Black Tea> Red
Tea> Mix 3 Teas> Green Tea. This sequence does not match with the reported of
antioxidant capacity, determined with DPPH or VPD with H2O2 assays. This is due to
the influence of the type of antioxidant, not just quantity.
22- The composition of the infusions (obtained by GC-MS) was more varied than in the
case of teas, although the proportion of antioxidant compounds was lower. Also for
these samples were problems with flashpoints, as with Menthol for Pennyroyal-Mint
and Camphor for Sage. There are great differences between the extracts obtained in
water and in methanol, because there are few common compounds or their proportions
are very different. There are many compounds related to herbs and aromatic plants, as
well as some on the wood.
23- In HPLC, for infusions, very different chromatograms were again obtained for
extracts in water and methanol, presenting many peaks. Some of them, together with
the results of GC-MS, have led to the identification and quantification of some
compounds, as for example 7-methoxy-1-benzopyran-2-one for the Camomile water
extract, Menthol in the methanol extract of Pennyroyal-Mint, Camphor for water extract
and Camphor and Eucalyptol for methanol extract in the case of Sage, and 1,2-
Benzenediol for Lime Blossoms extracts.
24- The total polyphenols in infusions is very low or zero. The extracted antioxidants
greatly vary on the infusion. The Sage extract in water has a higher antioxidant content,
while for the extracts in methanol, the Pennyroyal-Mint is that contains a greater amount
of these compounds because Menthol (its major antioxidant) is much more soluble in
alcoholic media than in aqueous media. Rooibos extracts were less rich in compounds
extracted in general, and in particular in antioxidants, because the woody character of
the sample complicates the extraction.
25- For infusions, like with the teas, the sequence of the total antioxidant content, does
not match that obtained to determine the antioxidant capacity by methods as DPPH and
VPD-H2O2, this confirming again that the antioxidant capacity depends on the type of
antioxidants rather than quantity.
26- The total antioxidant content of spices is very different depending on the sample,
ranging from very high values (Cinnamon, Clove, Turmeric and Ginger) to very low
(Cumin and Nutmeg). We distinguish three groups: one group (1) where the methanol

298
 Capítulo 5

extract is rich in antioxidants; another group (2) where the extract rich in antioxidants
is aqueous and, finally, a group (3) where the antioxidant content is very low.
In the group (1) compounds with antioxidant activity are poorly soluble or insoluble in
water. This is the case of the Clove (the most extreme), where the main antioxidant is
Eugenol; Turmeric, with Tumerona, the Ar-tumerona and Curcumin; Ginger with
Gingerol and Gingerone; Cinnamon with Cinnamaldehyde; Rosemary, where some of
the main antioxidants which can be obtained in the methanol extract (Carnosol, carnosic
acid, Rosmarinol and Rosmarinic Acid) have not been determined due to their high
boiling points or low flash point.
In group (2), the antioxidants are more polar and therefore more soluble in water: Basil,
Oregano and Thyme, all green leafy spices. It was obtained many hydroxy-substituted
aromatic compounds soluble in water. For Basil the antioxidant content of the aqueous
extract is almost seven times greater than the methanol extract. The higher content of
antioxidants is the Oregano aqueous extract, which is about 2.5 times the methanol
extract, this presents Carvacrol, one of the most characteristic antioxidants of this
sample, insoluble in water. For the extracts of Thyme, the difference obtained is only
around a 20%, and one of the most important antioxidants of these sample is the
Thymol, soluble in methanol.
Spices of group (3) are used to flavor stews and meals, giving odor and flavor, but
without acting especially as a source of antioxidants: Cumin and Nutmeg. Cumin is
predominantly methanol extracted fraction due to the antioxidant cuminaldehyde. While
the Nutmeg presents a higher amount of antioxidant in its aqueous extract, due to the
main component of this extract, 2,6-dimethoxy-4- (2-propenyl) -phenol, which is the
reduced myristicin form. The Myristicin is the major component in the methanol extract,
where it can be found Elemicine too, another of its characteristic constituents.
27- In HPLC, using GC-MS, we have identified some of the most characteristic peaks
of spices like Eugenol in the methanol extract of Clove, Cuminaldehyde in the aqueous
extract of Cumin, Curcumin in the methanolic extract of Turmeric (reverse peak due to
the fluorescence of this compound), Gingerol and Gingerone for Ginger, Eugenol in the
Nutmeg (from the data obtained for the Clove), Eucalyptol for Rosemary and the
comparison with Sage, and Thymol-Carvacrol system for Thyme. This technique has
been used to quantify the Cinnamaldehyde present in the two samples of Cinnamon,
which has a low flash point, and therefore the amount obtained by GC-MS does not
correspond to its real value.
28- For spices of group (1) and Cumin, we recommend to use lipid fractions (such as
oils or butter) and/or alcohol (wine, whiskey, etc.) for the food preparation where one
wants to take advantage of the most of their antioxidant content. Spices of group (2) and

299
Capítulo 5

Nutmeg, need only the addition of water during cooking to extract the major part of
their antioxidant content.

300
 ANEXO

ARTÍCULOS Y
COMUNICACIONES A
CONGRESOS
Capítulo 6

303
Capítulo 6

304
Capítulo 6

305
Capítulo 6

306
Capítulo 6

307
Capítulo 6

308
Capítulo 6

309
Capítulo 6

310
Capítulo 6

311
Capítulo 6

312
Capítulo 6

313
Capítulo 6

314
Capítulo 6

315
Capítulo 6

316
Capítulo 6

317
Capítulo 6

318
Capítulo 6

319
Capítulo 6

320
Capítulo 6

321
Capítulo 6

322
Capítulo 6

323
Capítulo 6

324
Capítulo 6

325
Capítulo 6

326
Capítulo 6

327
Capítulo 6

328
Capítulo 6

329
Capítulo 6

330
Capítulo 6

331
Capítulo 6

332
Capítulo 6

333
Capítulo 6

334
Capítulo 6

335
Capítulo 6

336
Capítulo 6

337