Introducción
En la década de 1880, en un hospital de Berlín trabajó el médico danés Hans
Christian Gram (figura 1), quien desarrolló la más importante tinción
bacteriológica. Él desarrolló una técnica de tinción en la cual observaba
bacterias en tejidos de pulmones de pacientes que morían de neumonía. El
procedimiento que desarrolló, ahora llamado tinción de Gram, demostró dos
categorías generales de bacterias que causaban neumonía: algunas se teñían
de violeta y otras se teñían de rojo. Las bacterias teñidas de azul fueron
conocidas como Gram positivas, y las teñidas de rojo como Gram negativas.
Pero fue hasta 1963 cuando M.R.J. Salton explicó el mecanismo de
diferenciación de la técnica de Gram.
Tinción de Gram: mecanismo y usos
La tinción de Gram diferencia a las bacterias en dos grandes grupos. Se
llama bacterias Gram positivas a aquellas que retienen la tinción azul-
violeta, y se denomina bacterias Gram negativas a las que se decoloran y
después se tiñen con safranina. Esta diferencia de tinciones se debe a la
estructura de las paredes celulares de ambos tipos de bacterias (tabla 1).
Tabla 1. Diferencias entre bacterias Gram positivas y Gram negativas
Las bacterias Gram positivas tienen una pared gruesa compuesta de
peptidoglucanos y polímeros, e impermeable, que hace que resista la
decoloración. En cambio, las bacterias Gram negativas tienen una capa
delgada de peptidoglucanos más una bicapa de lipoproteínas que se puede
deshacer con la decoloración. La tinción de Gram puede proporcionar
información rápida para diagnósticos de infecciones, puede revelar los
agentes causales incluso con una toma de muestra no adecuada. También
hace posible distinguir entre contaminación de la muestra y una verdadera
infección. Puede ayudar al clínico a seguir o cambiar un tratamiento
antibiótico inicial antes de los resultados del cultivo, y en algunos casos, es
capaz de mostrar la necesidad de una atención médica urgente. Actualmente
la tinción de Gram sigue siendo un método eficaz e importante en el
laboratorio, además de que es rápido y económico, por lo que se debe
estandarizar para evitar errores técnicos o de interpretación.
Para explicar el mecanismo de la tinción de gram se han propuesto varias
hipótesis fundadas en la naturaleza química de las paredes celulares de los
microorganismos.
Aquí puedes ver las diferencias estructurales y químicas de los dos tipos de
pared bacteriana:
Pared Gram +
capa densa y uniforme de 200 a 800
A)
ácidos teicoicos
polisacáridos
proteínas (pocas veces)
glicopéptido (50% del peso seco)
Pared Gram -
capa interna delgada de 20 a 30 A
cubierta por capas externas de
densidad menor)
lipopolisacáridos
lipoproteínas
proteínas
glicopéptido (10% del peso seco)
El mecanismo de la tinción Gram es la reseñado en el siguiente
esquema:
Productos
que se
Reacción y coloración de las bacterias
utilizan
GRAM + GRAM -
1) Cristal Células color violeta Células color violeta
violeta
2) Lugol Se forma el complejo CV-I. Se forma el complejo CV-I.
solución Las células continúan Las células continúan
iodada teñidas de color violeta. teñidas de color violeta.
3) Alcohol Se deshidratan las paredes Eliminación por extracción
celulares. Se contraen los de grasas de las paredes
poros. Disminuye la celulares. Aumenta la
permeabilidad. El complejo porosidad. El complejo CV-I
CV-I no sale de las células se separa de la célula.
que continúan teñidas de
color violeta.
4) Safranina Células no decoloradas; Células decoloradas; se
quedan teñidas de color tiñen de color rosado.
violeta.
Material necesario:
Cultivo de bacterias, levaduras, vino agriado.
Antibióticos.
Cristal violeta (1 g de cristal violeta en 100 cc de agua destilada).
Lugol (1 g de iodo en 2 g de ioduro potásico en 100 cc de agua
destilada). Fucsina básica (1 g de fucsina básica en 100 cc de agua
destilada).
Aceite de inmersión.
Microscopio
Portaobjetos, asas de cultivo, mechero, cápsulas de Petri, tubos de
ensayo. Papel secante.
Procedimiento
Poner sobre un portaobjetos una gota de agua y una pequeña alícuota de un
cultivo bacteriano con el asa de siembra estéril.
Hacer el frotis, formando una película homogénea sobre el portaobjetos
con el asa de siembra. Dejar secar.
Fijar la preparación, pasando a través de la llama del mechero el
portaobjetos.
Cubrir con unas gotas de cristal violeta durante 1 minuto.
Lavar el exceso de colorante con agua.
Añadir el mordiente lugol, solución de yodo-ioduro potásico, durante 1
minuto.
Lavar el exceso de mordiente con agua.
Lavar la preparación con alcohol formando un ángulo con la preparación,
durante 30 segundos (el tiempo de decoloración es clave para un resultado
correcto).
Lavar inmediatamente con abundante agua.
Cubrir con el colorante de contraste, safranina durante 1 minuto.
Lavar el exceso de colorante con agua.
Dejar secar al aire.
Añadir una gota de aceite de inmersión.
Observar con objetivo de inmersión (100 x).
2.1.2 Coloración:
a) 1 minuto en cristal violeta de Hucker (colorante inicial)
b) se lava con agua destilada
c) 1 minuto en lugol (mordiente)
d) se decolora con alcohol de 95° (decolorante)
e) se lava con agua destilada
f) 1 minuto en fucsina básica (colorante de contraste)
g) se lava con agua corriente
h) se seca suavemente y sin frotar con papel de filtro
Una vez que la preparación está totalmente seca, poner una
gota muy pequeña de aceite de cedro y observar al microscopio
con el objetivo de inmersión.
2.2. Observación
Debe utilizarse el
objetivo de
inmersión.
Se coloca una
gota de aceite de
cedro sobre la
preparación. Se
enfoca,
preferentemente,
con el
micrométrico.
Bacterias resistentes a la tinción de Gram
Las siguientes bacterias de naturaleza gram positiva se tiñen como gram
negativas:
Mycobacterias (están encapsuladas).
Mycoplasmas (no tienen pared).
Formas L (pérdida ocasional de la pared).
Protoplastos y esferoplastos (eliminación total y parcial de la pared,
respectivamente).
Utilidades
En el análisis de muestras clínicas suele ser un estudio fundamental por
cumplir varias funciones:
Identificación preliminar de la bacteria causal de una infección.
Utilidad como control calidad del aislamiento bacteriano. Los
morfotipos bacterianos identificados en la tinción de Gram se deben
de corresponder con aislamientos bacterianos realizados en los
cultivos. Si se observan mayor número de formas bacterianas que las
aisladas hay que reconsiderar los medios de cultivos empleados así
como la atmósfera de incubación.
A partir de la tinción de Gram pueden distinguirse varios morfotipos
distintos: Los cocos son de forma esférica. Pueden aparecer aislados
después de la división celular (micrococos), aparecer por pares (diplococos),
formar cadenas (estreptococos), o agruparse de manera irregular
(estafilococos).
Los bacilos poseen forma alargada. En general suelen agruparse en forma de
cadena (estreptobacilos) o en empalizada.
También pueden distinguirse los espirales, que se clasifican en espirilos (si
son de forma rígida) o espiroquetas (si son blandas y onduladas). Si por el
contrario, poseen forma de «coma» (o curvados) entonces se los designa
vibrios.
Utilidad en el diagnostico presuntivo
Las características fenotípicas que presentan algunas bacterias contribuyen
a su diagnóstico presuntivo:
La observación de cocos Grampositivos dispuestos en racimos sugieren la
presencia de estafilococos.
La disposición de cocos Grampositivos en cadena indica estreptococos.
Diplococos Grampositivos en forma de lanceta o con extremos alargados
son característicos de S. pneumoniae cuando se observan en esputos.
Diplococos Gram negativos arriñonados o reniformes son característicos
de las especies de Neisseria.
Bacilos Grampositivos ordenados en letras chinas o empalizadas son típicos
del Corynebacterim
Factores que alteran la tinción de Gram
Edad de la bacteria.
Errores del operador.
Uso de antibióticos
A pesar de la gran utilidad de la tinción de Gram, este método debe ser
valorado con precaución, ya que la reacción puede variar según la edad de las
células (cultivos viejos de bacterias gram positivas pueden perder capas de
peptidoglicanos y teñirse como gram negativos) y la técnica empleada (al
decolorar por un tiempo muy prolongado se puede correr el riesgo que
bacterias gram positivas se tiñan como gram negativas). Por esta situación,
junto a la muestra deben teñirse controles con bacterias gram positivas
(por ejemplo Staphylococcus aureus) y gram negativas (por ejemplo,
Escherichia coli).
