III Encuentro de Inmunohematología y

Medicina Transfusional

Problemas de Compatibilidad
en
Transplante de Medula Osea:
Repaso de Principios de HLA y
PCR

. . . . . . . . .
Discusión de los principios del Sistema Antígeno
Leucocitario Humano (HLA) y su relación con el
transplante de medula ósea. Nomenclatura,
características del sistema genético, tipificación
y aplicación clínica del HLA. Ejercicios prácticos
incluidos.

Agueda I. Cohen, MD
Investigador Asociado
Departamento de Transplante de Medula Osea
UT M.D. Anderson Cancer Center
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Repaso de Principios de HLA y PCR

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Indice de Contenido

Introducción 3

Sistema Antígeno Leucocitario Humano (HLA) 3

Características Genéticas 3

HLA Clase I 4

HLA Clase II 4

HLA Clase III 5

Nomenclatura del Sistema HLA 5

Tipeaje de HLA 5

serológico 6

PCR – SSOP 6

Aplicación Clínica 7

Tablas 8

Ejercicios Prácticos para la Selección del Donante 10

Referencias 13

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Introducción

Los antígenos de histocompatibilidad constituyen entre otros factores, uno de los factores

más cruciales en la selección de donantes y posterior análisis de la evolución clínica del

transplante de sangre y medula ósea.

El transplante de tejidos genéticamente desiguales resulta en una reacción de tipo inmunológico

que conlleva como resultado, el rechazo del tejido o la presencia de la enfermedad de injerto

contra huésped, incluso en presencia del uso de terapia inmunosupresiva.

Estos antígenos de histocompatibilidad se encuentran codificados en una serie de genes

localizados en una región cromosomica denominada Complejo de Histocompatibilidad Mayor

(CHM), y estos genes están presentes en casi todas las células nucleadas. En los humanos el

CHM es denominado Antígeno Leucocitario Humano (HLA). El termino HLA se deriva de la

combinación de Antígeno Leucocitario (LA) y la designación Human-1 (HU-1) utilizada para

describir en 1950, el descubrimiento reciente del Sistema Antígeno Leucocitario.

El Sistema Antígeno Leucocitario Humano (HLA)

El HLA esta constituido por un conjunto de moléculas de membranas polimorficas, cuya

función es la presentar peptidos al receptor de linfocitos T. Estas moléculas están presentes en la

posición p21 del cromosoma 6 y están distribuidos en tres regiones designadas clase I, clase II y

clase III (Figura 1).

Características Genéticas:

 Cada cadena se codifica en un locus.

 Cada locus puede ser ocupado por diferentes alelos que se identifican con un numero.

 Cada individuo posee 2 alelos de cada locus, uno procedente del padre y otro de la madre.
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 El conjunto de alelos heredados en bloque de un progenitor se denomina Haplotipo.

 La probabilidad de tener un hermano HLA idéntico es aproximadamente 30%.

 La frecuencia de cada alelo es distinta de una raza a otra.

 Los alelos de diferentes locus no se asocian al azar, sino que existen desequilibrios de

ligamiento dando lugar a haplotipos mas frecuentes. (ej: A3-B7-DR2)

 Algunas especificidades serológicas amplias “broad” se han subdividido en “splits”, que

tienen algunas características en común y otras que los diferencian unos de otros. (ej: A9 se

subdividió en A23(9) y A24(9) ).

 Algunas especificidades comparten epitopos (o características antigénicas) y constituyen los

Grupos de Reacción Cruzada (CREG)

Clase II Clase III Clase I

21A C4A

DP DN DO DQ DR C4B Bf TNF B C E A G F

    21B C2

     

500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000

Thomas Donnal, Karl Blume.Histocompatibility. Hematopoietic Cell Transplantation. Second Edition.1998, p 29.

Figura 1 - Complejo HLA en el Cromosoma # 6

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HLA Clase I

Existen por lo menos 17 locus incluyendo los diferentes pseudogenes existentes en la región

clase I. Tres de estos locus codificados como HLA-A, HLA-B y HLA-C, son los mas

determinantes de la clase I, para establecer si los tejidos son idénticos. Su estructura molecular

consiste, en una cadena simple polimórfica  (pesada). En la clase I los polipéptidos son de 338

a 341 aminoácidos en longitud, y tienen enlaces no covalentes unidos en la superficie celular a la

cadena liviana 2- microglobulina. El gen que representa a la 2-microglobulina esta localizado

fuera del complejo HLA en el cromosoma 15.

La tabla 1 muestra la lista de Aloantígenos que pueden ser actualmente identificados a través de

tipiaje serológico.

HLA Clase II

Los genes clase II han sido identificados como HLA-D y esta dividido en cinco grupos: DR, DQ,

DO, DN y DP ( Figura 1). Estas moléculas están constituidas por una cadena simple 

polimórfica (DQ y DP), o no polimórfica (DR) unida a través de un enlace no covalente a la

cadena polimórfica . Las cadenas  del HLA-DR, DQ y DP están codificadas como DRB, DQB

y DPB.

El polimorfismo de las moléculas clase II esta localizado en una región especifica 1 y 1 de las

cadenas  y  respectivamente, para facilitar la unión de fragmentos pépticos largos, así como

también determina la aloespecificidad. De todos los Aloantígenos clase II, el DRB1 y el DQB se

conocen como estimulantes de reacciones inmunológicas en el transplante de tejido

hematopoyetico.

La Tabla 2 muestra la lista de los Aloantígenos clase II.

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HLA Clase III

Aunque los genes están localizados dentro del complejo HLA, son diferentes a los dos grupos

descritos anteriormente. Están constituidos por un grupo proteínas que incluyen componentes del

complemento, el factor de tumor necrosis, transporte de proteínas, etc.

Es conocido que tienen un rol importante en el sistema inmune, sin embargo hasta ahora no se

ha identificado su función antigénica en el transplante de tejido hematopoyetico.

Nomenclatura HLA

La determinación de la nomenclatura a utilizar para identificar el sistema HLA, esta bajo la

responsabilidad del Comité de Nomenclatura de la Organización Mundial de la Salud, para los

factores del sistema HLA.

Esta nomenclatura intenta relacionar la secuencia del DNA de determinado gen HLA con su

serología especifica predominante.

De esta forma cuando se designa la nomenclatura HLA-B*4402. Lo que representa es: HLA-B

define el locus genético, el asterisco separa el nombre del locus del nombre del alelo y el dígito

02 únicamente identifica el alelo que codifica al aloantigeno B44. En ocasiones se utiliza un

quinto dígito que representa una designación tácita de una sustitución en el gen HLA, pero que

no representa una variante molecular. Por ejemplo, HLA-A*68011 y HLA-A*68012 indican dos

formas del HLA-A*6801 que se diferencian en un solo nucleotido, que no altera la secuencia de

proteínas.

Tipiaje HLA

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Se utilizan múltiples técnicas para el tipiaje HLA, tales como la amplificación del DNA, PCR-

SSP (PCR con cebadores específicos de secuencia), PCR- SSOP (hibridización de oligo-sondas

especificas de secuencia), secuenciación de DNA, etc. En este articulo se mencionan dos de los

métodos mas utilizados en el MD Anderson Cancer Center.

Serológico - Anticuerpos específicos con capacidad lítica

Los antígenos HLA clase I se identifican inicialmente en la mayoría de los casos utilizando el

método serológico, en el cual se utiliza el análisis de microcitotoxicidad dependiente del

complemento y paneles de aloantisuero que contienen anticuerpos HLA. Este antisuero se

obtiene de mujer multiparas que han sido inmunizadas por Aloantígenos a traves de los

embarazos. En la tabla 1 se puede observar que actualmente se pueden identificar 25

Aloantígenos HLA-A , 51 Aloantígenos HLA-B y 9 HLA-C. Actualmente se conocen un

creciente numero de alelos que no se pueden identificar por este método. Es por eso que

gradualmente esta siendo sustituido por el tipiaje molecular.

PCR-SSOP - Reacción de cadena polimerasa - hibridación de oligonucleotidos específicos

fijados a soporte

Este método puede ser utilizado tanto para tipiaje de baja y como de alta resolución. El gen es

amplificado por PCR e inmovilizado con membranas de nylon. Los soportes de oligonucleotidos

son etiquetados con marcadores moleculares, y luego se les permite la hibridizacion a la

membrana. Los soportes con las secuencias que son complementarias a la unión DNA-membrana

se hibridizan, mientras que las secuencias que tienen tanto como un solo nucleotido desigual no

se hibridiza. La presencia o ausencia de hibridización es utilizada para deducir el tipo HLA de

determinado DNA. Este método es denominado también SSOP avanzado.

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Otro método utilizado es el denominado SSOP reverso, donde los soportes de secuencias

especificas son inmovilizados en una fase sólida. La muestra de DNA es marcada durante la

amplificación del DNA y se deja hibridizar. Así como el SSOP avanzado los alelos HLA se

deducen por la presencia o no de la reacción.

Aplicación Clínica del HLA

Actualmente el concepto utilizado en la selección de donantes se basa en el tipiaje

serológico para HLA-A, B y DR. Lo ideal es que el donante tenga alelos idénticos al paciente en

todos los locus HLA. Sin embargo, como se menciono anteriormente la posibilidad de tener un

hermano HLA idéntico es 30%, y este porcentaje se ve disminuido cuando el donante no es un

familiar. Por lo tanto la igualdad HLA no siempre se alcanza. De manera tal que en muchos casos

se acepta algún grado de incompatibilidad, especialmente si el transplante se requiere para

prolongar sobrevida.

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Tabla 1 - Aloantígenos (Alo Ag) y Alelos Clase I

A locus B locus C locus

Alo Ag Alelo(s) Alo Ag Alelo(s) Alo Ag Alelo(s) Alo Ag Alelo(s)
A1 A0101-02 B7 B0702; B4005 B4005 Cw1 C0102-03
0704-08
A2 A0201-22 B703 B0703 B41 B4101-02 Cw2 C0202
A3 A0301-02 B8 B0801-04 B42 B4201-02 Cw10(w3) C0302;03044
A23 (9) A2301 B13 B1301-04 B44 (12) B4402-08 Cw9 (w3) C0303
A24 (9) A2402-14 B64 (14) B1401 B45 (12) B4501 Cw4 C0401-03
A9 A2410 B65 (14) B1402 B12 B4409 Cw5 C0501
A25 (10) A2501 B62 (15) B1501; B46 B4601 Cw6 C0602
1504-08
1515;1520;
1524-25;
1527
A26 (10) A2601-08 B63 (15) B1516-17 B47 B4701-02 Cw7 C0701-07
A10 A2502 B71 (15) B1510;1518 B48 B4801-03 Cw8 C0801-03
A11 A1101-04 B72 (15) B1503 B49 (21) B4901  C1202-04
A29 (19) A2901-03 B75 (15) B1502;1521; B50 (21) B5001-02  C1301
1530-31
A30 (19) A3001-04 B76 (15) B1512;1514 B51 (5) B5101-05;  C1402-03
1519 5107-09
A31 (19) A3101 B77 (15) B1513 B5 B5106  C1502-05
A32 (19) A3201-02 B15 B1511; B52 (5) B5201  C1601-02;
1528-29; 1604
1533-35
A33 (19) A3301;3303 B18 B1801-05 B53 B5301-02  C1701-02
A34 (10) A3401;3402 B27 B2701-07; B54 (22) B5401  C1801-02
2709-11
A36 A3601 B2708 B2708 B55 (22) B55 (22)
A43 A4301 B35 B3501-21 B22 B5505;5603
A66 (10) A6601-03 B37 B3701-02 B56 (22) B5601-02
A68 (28) A6801;6802 B38 (16) B3801-02 B57 (17) B5701-04
A69 (28) A6901 B39 (16) B3901-04 B58 (17) B5801-02
3906-12
A28 A6803 B16 B3905 B59 B5901
A74(19) A7401;7402 B60 (40) B4001;4010 B67 B6701
A19 A7403 B61 (40) B4002;4006; B73 B7301
0) 4009
A80 A8001 B40 B4003 B78 B7801-02
B40 B4004 B81 B8101

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 B8201
Thomas Donnal, Karl Blume.Histocompatibility. Hematopoietic Cell Transplantation. Second Edition. 1998, p30.

Tabla 2 - Aloantígenos ( Alo Ag) y Alelos Clase II

Alo Ag DRB1 Locus

Alelo(s) Alo Ag QB1 Locus
Alelo(s) Alo DPB1 Locus
Alelo(s)
DR1 DRB10101-04 DQ5(1) DQB10501-04 DPw1 DPB10101
DR15(2) DRB11501-06 DQ6(1) DQB10601-12 Ag
DPw2 DPB10201-02
DR16(2) DRB11601-08 DQ2 DQB10201-03 DPw3 DPB10301
DR17(3) DRB10301;0304-05 DQ(7) DQB10301;0304 DPw4 DPB10401-02
DR18(3) DRB10302-03 DQ8(3) DQB10302;0305 DPw5 DPB10501
DR3 DRB10306-11 DQ9(3) DQB10303 DPw6 DPB10601
DR4 DRB10401-24 DQ3 DQB10306  DPB10801-7301
DR11(5) DRB11101-03 DQB10307
DR12(5) DRB11201-05 DQ4 DQB10401-05
DR13(6) DRB11301-30
DR14(6) DRB11401-29
DR7 DRB10701
DR8 DRB10801-16
DR9 DRB10901 DQA1 Locus DPA1 Locus
Dr10 DRB11001  DQA10101-05  DPA10103-05
 DQA10201  DPA10201-03
 DQA10301-03  DPA10301
 DPA10401
Thomas Donnal, Karl Blume.Histocompatibility.Hematopoietic Cell Transplantation.Second Edition.1998, p 32.

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Ejercicios Prácticos Para La Selección De Donantes

Paciente Donante

1.- HLA Locus : A

DR/mol

DQ/mol

DP/mol

# Ag desiguales IvH

# Ag desiguales HvI

Crossmatch

Paciente Donante

2.- HLA Locus : A

DR/mol

DQ/mol

DP/mol

# Ag desiguales IvH

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# Ag desiguales HvI

Crossmatch

Paciente Donante

3.- HLA Locus : A

DR/mol

DQ/mol

DP/mol

# Ag desiguales IvH

# Ag desiguales HvI

Crossmatch

Paciente Donante

4.- HLA Locus : A

DR/mol

DQ/mol

DP/mol

# Ag desiguales IvH

# Ag desiguales HvI

Crossmatch

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Paciente Donante

5.- HLA Locus : A

DR/mol

DQ/mol

DP/mol

# Ag desiguales IvH

# Ag desiguales HvI

Crossmatch

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REFERENCIAS

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Hematopoyetico-Carreras, Enric.1998 : 123-128.

2.- Madrigal JA. Bone Marrow Using unrelated donors. Bone Marrow Transplant

(1998) 21, sppl.2, S2-S4.

3.- Scott Ian et al. Molecular Typing Shows a High Level of HLA Class Incompatibility in

Serologically Well Matched Donor/ Patient Pairs: Implications for Unrelated Bone Marrow

Donor Selecction. Blood, vol 92, No12, 1998: pp 4864-4871.

4.- Thomas Donnal, Karl Blume E.Histocompatibility.Hematopoietic Cell Transplantation .

Second Edition. 1998, pp28-37

5.- Begovich AB. HLA Typing for Bone Marrow Transplantation. New Polymerase Chain

Reaction-Based Methods. JAMA, 273(7):586-91 1995.

6.- Bunce M, Young NT, Welsh KI. Molecular HLA typing- -the brave new world.

Transplantation, 64 (11): 15005-13 1997 Dec15

7.- Madrigal JA. Current methodologies of human leukocyte antigen typing utilized for bone

maow donor selection.Curr Opin Hematol, 5 (6): 419-28 1998 Nov

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