TALLER.
1. Describa las etapas básicas de la clonación.
2. ¿Qué es una enzima de restricción? De 3 ejemplos de
enzimas de restricción, con su respectiva secuencia de
reconocimiento y productos resultantes.
3. Indique la importancia de los plásmidos, en el proceso de
clonación.
4. Describa la técnica de secuenciación del DNA de Sanger.
5. Describa los principios de la técnica de PCR. determine
usos y aplicaciones.
1. Preparación del ADN
El gen, fragmento de gen o fragmento de ADN que se quiere clonar debe ser
aislado de la muestra.
Rotura con endonucleasa de restricción y separación de fragmentos.
2. Preparación de vector
Como vector de clonación se puede utilizar un plásmido,
un cósmido, un virus ... Su propiedad esencial es que sean autorepliegativos.
3. Unión del ADN al vector
Habiendo cortado el ADN y el vector con una misma endonucleasa de restricción,
ambos pueden unirse gracias a una ligasa.
4ª etapa: incorporación del ADNr
El ADN recombinante se introduce en bacterias,empleando métodos diversos.
El vector se replica al dividirse la bacteria y también de forma autónoma. Con
ello, aumenta el número de copias. Cada bacteria, haya incorporado o no
un vector y un ADN rcombinante, se multiplica para dar lugar a un "clon",
población de bacterias con idéntico material genético ( incluido el recombinante)
5ª y 6ª etapas (simultáneas) : propagación celular y selección.
No todas las bacterias han incorporado el DNA de interés formando parte del
vector recombinante. Se seleccionan las que sí lo han hecho,
normalmente cultivándolas en un medio con antibiótico, si en el vector se incluyó
el gen de resistencia a ese antibiótico.
7ª etapa (opcional ) : expresión del DNA clonado
R2/
Las enzimas de restricción son nucleasas que cortan ADN de doble cadena
cuando reconocen un patrón de secuencia específico. Generan fragmentos de
ADN conocidos como fragmentos de restricción. Las enzimas de restricción son
herramientas imprescindibles en biología molecular, ingeniería genética y
biotecnología. De la misma manera, es aquella que puede reconocer una
secuencia característica de nucleótidos dentro de una molécula de ADN y cortar el
ADN en ese punto en concreto, llamado sitio o diana de restricción, o en un sitio
no muy lejano a este. Los sitios de restricción cuentan con entre cuatro y seis
pares de bases, con las que son reconocidos.
Ejemplos:
1. Enzima: Sau3A
Origen bacteriano: Staphylococcus aureus
Sitio de reconocimiento: 5'GATC / 3'CTAG
Resultado: 5'--- GATC---3'
3'---CTAG ---3'
2. Enzima: SmaI*
Origen bacteriano: Serratia marcescens
Sitio de reconocimiento: 5'CCCGGG /3'GGGCCC
Resultado: 5'---CCC GGG---3'
3'---GGG CCC---5'
3. Enzima: EcoRI
Origen bacteriano: Escherichia coli
Sitio de reconocimiento: 5'GAATTC
3'CTTAAG
Resultado: 5'---G AATTC---3'
3'---CTTAA G---5'
R3/
Indique la importancia de los plásmidos, en el proceso de clonación.
Un plásmido es una pequeña molécula de ADN circular que a menudo se
encuentran en bacterias y otras células. Los plásmidos son separados del
cromosoma bacteriano y se replican independientemente de ella. Por lo general,
tienen sólo un número pequeño de genes, algunos de ellos asociados con
resistencia a los antibióticos. Los plásmidos se pueden transmitir entre las distintas
células bacterianas.
Ahora bien, En un procedimiento típico de clonación de ADN, el gen u otro
fragmento de ADN de interés se inserta primero en un fragmento circular de ADN
llamado plásmido. La inserción se realiza con enzimas que "cortan y pegan" ADN
y se obtiene una molécula de ADN recombinante, ADN ensamblado de fragmentos
provenientes de múltiples fuentes. Se introduce el plásmido recombinante en
bacterias. Se seleccionan las bacterias que contengan el plásmido y se cultivan. Al
reproducirse, estas replican el plásmido y lo pasan a su descendencia, y de esta
forma hacen copias del ADN que contienen.
El objetivo al clonar es insertar un gen blanco en un plásmido. Con ayuda de una
enzima de restricción cuidadosamente elegida.
R4/
.El método de secuenciación ideado por sanger se basa en el empleo de
dideoxinucleotidos que carecen del grupo hidroxilo del carbono 3’ de manera que
cuando uno de estos nucleótidos se incorpora a una cadena de adn en
crecimiento esta cadena no puede continuar elongandose.
R5/
. La reacción en cadena de la plimersa (PCR) es una técnica de laboratorio común
utilizada para hacer muchas copias (¡millones o miles de millones!) de una región
particular de ADN. Esta región de ADN puede ser cualquier cosa que le interese al
experimentador. Por ejemplo, podría ser un gen cuya función quiere entender un
investigador o un marcador genético usado por científicos forenses para relacionar
el ADN de la escena del crimen con los sospechosos.
.la reacción en cadena de la polimerasa, o PCR, es una técnica para hacer
muchas copias de una determinada región de ADN in vitro (en un tubo de ensayo
en un lugar de un organismo).
.la PCR depende de una ADN polimerasa termoestable, la Taq polimerasa, y
requiere de cebadoras de ADN diseñados específicamente para la región de ADN
de interés.
.En la PCR, la reacción se somete repetidamente a un ciclo de cambios de
temperatura que permiten la producción de muchas copias de la región blanca.
.la PCR tiene muchas aplicaciones en la investigación y en la práctica. Se utiliza
de forma rutinaria en la clonación de ADN, el diagnóstico médico y el análisis
forense de ADN.
Bibliografías
[Link]
[Link]
pcr-electrophoresis/a/dna-sequencing
[Link]
pcr-electrophoresis/a/polymerase-chain-reaction-pcr
TALLER DE GENETICA
ISAAC DAVID HERNANDEZ MARIN
ORLANDO LUIS SANCHEZ BARON
ANA CAROLINA ALVAREZ NEGRETE
UNIVERSIDAD DE CORDOBA
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
PROGRAMA MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
SEDE BERASTEGUI - 2019
