Detectores HPLC
INTRODUCCION
Los detectores empleados en HPLC se han diseñado, adaptado y perfeccionado con el fin
de incorporar celdas de flujo que permitan medir las bajas concentraciones de analito que
hay en el líquido. Los distintos detectores se clasifican según se encarguen de medir una
propiedad del soluto o de la disolución.
D E TE C TO R D E AB SO R CI Ó N U V, VI S Y P D A
Los detectores UV, VIS, y PDA se clasifican como detectores de absorbancia. Proporcionan
una buena sensibilidad para que compuestos que absorbe la luz a nivel ~ pg. Son fáciles
de operar y proporcionar una buena estabilidad. Detectores de UV es un detector muy
comúnmente utilizado para el análisis HPLC. Durante el análisis, la muestra pasa a través
de una celda de vidrio claro sin color, llamada celda de flujo. Cuando la luz UV se irradia en
la celda de flujo, la muestra absorbe una parte de la luz UV. Así, la intensidad de la luz UV
observada para la fase móvil (sin muestra) y la muestra que contiene eluyente será
diferente. Mediante la medición de esta diferencia, la cantidad de muestra se puede
determinar. Puesto que la absorbancia de UV también difiere dependerá de qué longitud de
onda se utiliza, es importante elegir una longitud de onda apropiada en función del tipo de
analito. Un detector de UV estándar permite al usuario elegir la longitud de onda entre 195
a 370 nm. Se usa más comúnmente de 254 nm. En comparación con un detector de UV,
VIS utiliza un detector de longitud de onda más larga (400 ~ 700 nm). Hay detectores que
proporcionan más amplia selección de longitud de onda, cubriendo ambos rangos de UV y
VIS (195 ~ 700 nm), llamados UV / VIS detector. PDA detecta un espectro completo de
forma simultánea. Detectores UV y VIS visualizar el resultado obtenido en dos dimensiones
(intensidad de la luz y el tiempo), pero PDA añade la tercera dimensión (longitud de onda).
Esto es conveniente para determinar la longitud de onda más adecuada sin repetir los
análisis.
El flujo de líquido que sale de la columna pasa a través de una pequeña celda, de pequeño
volumen (entre 1 a 10 μl), para minimizar el ensanchamiento de banda. La medida de la
absorbancia del líquido que la atraviesa en función del tiempo constituye el cromatograma.
Su límite de detección oscila entre 0’1 y 1 ng y puede emplearse en cromatografía de
elución en gradiente.
Fotómetro de filtro: es el detector de absorción UV más sencillo. Emplea una lámpara de
mercurio como fuente y una serie de filtros para aislar la intensa línea a 254 nm, con la
que se mide la absorbancia (variando los filtros se pueden seleccionar otras líneas).
Espectrómetro de barrido: permite realizar el análisis seleccionando una o varias
longitudes de onda en la región de interés.
Espectrómetro de arreglos de diodos: debido a su rapidez, son capaces de registrar la
totalidad del espectro proporcionando un cromatograma tridimensional que muestra la
absorbancia en función de la longitud de onda cada pequeños intervalos de tiempo.
D E TE C TO R D E AB S O R C I Ó N I N F R AR R O J A
Las celdas empleadas en estos detectores son similares a las empleadas en los detectores
de absorción UV-vis, excepto por las ventanas ópticas, que en este caso son de cloruro de
sodio o de fluoruro de calcio.
Se emplea en aquellos analitos que absorben radiación infrarroja (IR, cuya longitud de onda
supera los 700 nm), por lo que se debe prestar atención al disolvente utilizado, ya que
muchos de ellos también absorben estas radiaciones.
Los detectores más sofisticados se basan en instrumentos de transformada de
Fourier (FTIR). El límite de detección es de 1.000 ng y también pueden emplearse en
cromatografía de elución en gradiente.
D E TE C TO R AC O P L AD O A E S P E C TR Ó M E TR O D E M AS AS
El principal problema que surge al acoplar un espectrómetro de masas al cromatógrafo
HPLC es la enorme cantidad de disolvente que acompaña al analito, para lo cual se han
desarrollado diversas interfases:
Termovaporizador (termospray): con esta interfase se vaporiza el eluato y se forma un
aerosol, formado por moléculas de disolvente y de analito. Mediante un mecanismo de
ionización química, se ioniza el analito y los iones son conducidos hacia el espectrómetro
y el disolvente es expulsado mediante una bomba. Los analitos deben ser termoestables
y polares.
Interfase de ionización química a presión atmosférica (APCI): utiliza calefacción y
nitrógeno para convertir el eluato en aerosol, del que se evapora el disolvente. Mediante
una descarga eléctrica el analito se convierte en iones que son conducidos hacia el
espectrómetro de masas.
Interfase de ionización por electronebulización (electrospray): el eluato pasa a través de
un capilar metálico, en cuya salida se aplica un fuerte campo eléctrico a la vez que una
corriente coaxial de nitrógeno gaseoso, con lo que se crea un fino aerosol de partículas
cargadas.
