FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
Carrera de Medicina Humana
LABORATORIO DE BIOLOGÍA CELULAR
Prácticas 13
MEIOSIS
Docente encargado:
SÁNCHEZ GARCÍA, GERARDO JUNIOR
Presentado por:
STEFANY CASANOVA ALEGRIA
GRUPO 1J2
HORARIO DE PRÁCTICA: 11:10 - 13:00
LIMA – PERÚ
2019
INTRODUCCIÓN
El ADN es una molécula formada por dos cadenas de polinucleótidos unidas por puentes de
hidrógeno. Los nucleótidos que presenta son: timina, adenina, guanina y la citosina; los cuales
forman los genes, que de acuerdo a la secuencia de orden en que se encuentran, determinan las
características biológicas de todo ser vivo. Además está moléculas de vida está constituido de un
azúcar desoxirribosa y un grupo fosfato.
La mayoría de los organismos están formados por millones de células, el ADN está presente en
todas las células de estos seres vivos. En las células procariotas el ADN se encuentra disperso en
el citoplasma, mientras en la célula eucariota está ubicado dentro de un núcleo, asociado con
proteínas y el ARN.
Por lo cual, el objetivo de esta práctica en la sesión uno es extraer, conocer y analizar la técnica
de aislamiento de ADN a partir de muestras biológicas, en la sesión dos es conocer los
fundamentos y la importancia de la técnica de PCR para el diagnóstico de enfermedades en los
seres humanos; y, por último, en la sesión tres es separar mediante electroforesis en gel agarosa
las moléculas de ADN obtenidos en la práctica anterior y determinar el peso molecular del ADN.
MARCO TEÓRICO
La extracción de ADN es un método por el cual se obtiene el ADN a partir de material biológico,
utilizando técnicas físicas y químicas, que permitirá la separación y purificación del ADN con el
fin de poder estudiarlo, analizarlo o manipularlo.1 Es una técnica relativamente sencilla, y tan
solo es necesario evitar toda destrucción enzimática o mecánica de los mismos, esto se debe a
que los ácidos nucleicos que son estables en la célula intacta, al ser sometidos a procesos de
digestión por nucleasas endógenas, se vuelven muy vulnerables después que la célula es lisada.2
Es por ello que tiene tres etapas consecutivas: disgregación de las células o tejidos (lisis celular),
inactivación de las nucleasas intracelulares y la separación de los ácidos nucleicos de los demás
componentes celulares. Es decir, primero se tiene que romper la membrana plasmática para
poder acceder al núcleo de la célula y después romper la membrana nuclear para dejar libre el
ADN. Los jabones utilizados como lavavajillas emulsionan los lípidos de las membranas celulares
y las rompen.
Figura 1. Método de purificación en la columna de centrifugado PureLink. Recuperado de:
[Link]
La reacción en cadena de la polimerasa es una reacción enzimática in vitro que amplifica millones
de veces una secuencia específica de ADN durante varios ciclos repetidos en los que la secuencia
blanco es copiada fielmente. Para ello, la reacción aprovecha la actividad de la enzima ADN
polimerasa, que tiene la capacidad de sintetizar naturalmente el ADN en las células. Es por ello
que la PCR se lleva a cabo en tres etapas principales: desnaturalización, hibridación y extensión.
- Desnaturalización. En esta etapa, las cadenas de ADN son calentadas y separadas a una
temperatura de 95 °C durante 20-30 segundos; el tiempo depende de la secuencia del
templado, es decir, si la cantidad de G-C es alta, será necesario más tiempo para romper
sus uniones debido a que el apareamiento de estas bases está formado por tres enlaces,
uno más que las bases de A-T. Además, depende de la velocidad en la que el termociclador
aumenta la temperatura, esto varía de acuerdo al modelo del equipo. Al final de esta
etapa tendremos las cadenas separadas que servirán como templado para el siguiente
paso.
- Hibridación. En esta etapa, los primers se alinean al extremo 3’ del templado previamente
separado e hibridan con su secuencia complementaria. Para que se forme el complejo
templado-primers, es importante que la temperatura de hibridación o temperatura
melting (Tm) sea la óptima; ésta generalmente oscila entre 50-60 °C. Si el diseño de los
primers es el correcto y la temperatura es la adecuada, la estabilidad y especificidad del
complejo será eficiente.
- Extensión (Elongación). En esta etapa, la Taq polimerasa actúa sobre el complejo
templado-primers y empieza su función catalítica a una velocidad muy rápida; agrega
dNTPs complementarios para crear las cadenas completas de ADN. La extensión de las
cadenas es en dirección de la síntesis del ADN, es decir, de 5’ a 3’. La temperatura óptima
para la reacción es de 72 °C, ya que a esa temperatura la enzima es funcional. Al final del
ciclo, se habrán formado los amplicones con un tamaño dictado por el número total de
pares de bases (pb) que deberá ser conocido por el investigador.3
Figura 2. Pasos de un ciclo de la PCR. Recuperado de: [Link]
La electroforesis en gel de agarosa se utiliza comúnmente para separar moléculas en función de
su carga, tamaño y forma de las biomoléculas como el ADN, el ARN y las proteínas. En el caso de
los ácidos nucleicos, el grupo fosfato les proporciona la carga negativa, por lo que durante la
electroforesis migran desde el polo negativo hacia el polo positivo.
Esta separación se hace bajo un buffer o tampón que puede ser TAE o TBE. A pesar de que la
electroforesis en gel de agarosa sea una técnica simple y fácil, posee dotes de separación
eficaces. El gel se fabrica disolviendo polvo de agarosa en una solución tampón hirviente. A
continuación, se deja enfriar la solución a 55°C y se vierte en un soporte, donde se solidifica. Se
sumerge después el soporte en un equipo de electroforesis de electrodos que contiene solución
tampón.
MATERIALES Y MÉTODOS
Dicho apartado se puede consultar en el manual de práctica Biología Celular en la página 48 hasta
la página 55, donde se especifica claramente los materiales que se utilizó, la técnica y el
procedimiento que se empleó sin modificación en la práctica excepto en la sesión dos en el mix
de PCR donde el volumen del primers R y primers F se añadio 0.6 μl y ADN 0.5 μl. Así mismo hubo
modificación de tiempo en el termociclador en la hibridación antes de un minuto se modificó a
30 segundos y la elongación se cambió a 15 segundos.
RESULTADOS
Sesión 1: Extracción de ADN
GRUPO SANGRE TOTAL CONCENTRACIÓN ABSORBANCIA
J1 20 μl 32.91 μg/ml 12.4 abs
J2 20 μl 56.58 μg/ml 67.41 abs
H1 20 μl 35.11 μg/ml 20.39 abs
H2 20 μl 40.88 μg/ml 10.24 abs
Tabla 1. Cuantificación de iones de ADN a través del Qubit Kit en las diferentes muestras de
ADN con la concentración y absorbancia cada uno de los diferentes grupos.
Sesión 2: PCR
Figura 3. Muestras biológicas con solución mix de PCR después de centrifugación colocadas en
el termociclador.
Figura 4. Las fases de la PCR, programado con las condiciones de amplificación en el
termociclador. Donde Stage 1 es la desnaturalización, Stage 2 es la hibridación y Stage 3 es la
elongación. Para mantener la muestra es a 4 °C.
Sesión 3: Electroforesis
Figura 5. La imagen obtenida del gel mediante la visualización con luz UV del
transiluminador.
ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS
-Sesión 1: Extracción de ADN
Como sabemos, el ADN se encuentra en el interior del núcleo de las células eucariotas rodeado
de proteínas (histonas) que lo mantienen unido y compactado. Para poder aislarlo y observarlo
se debe deshacer la membrana plasmática, la envoltura nuclear y desnaturalizar las proteínas.
Para esto, se añadió sangre al tubo con proteinasa K, ya que esta es una enzima que sirve para
romper/ degradar a las proteínas o enzimas que están unidas al ADN; también degrada a otras
enzimas que destruyen al ADN; y, posteriormente, se agregó RNAsa, ya que esta es una
ribonucleasa, enzima que degrada al ARN; otra explicación para añadir RNAsa, es que el etanol,
el cual usaremos más adelante, precipita también al ARN dado que son polímeros muy similares,
pero nosotros no necesitamos al ARN. Ambas enzimas proteasas se aplican en este orden, para
no dañar al material genético, ya que lo que queremos obtener en la extracción es únicamente
ADN.4
Al añadir el Buffer de lisis, lo que estamos haciendo es degradar la célula y romper la membrana
celular. Posteriormente de someter a vórtex, el cual ayuda con la ruptura mecánica; se incubó la
muestra donde estaba la proteinasa K, la RNAsa y la solución de lisis a 55°C ; esto se debe a que
el detergente (buffer) cuando está caliente remueve la grasa (los lípidos) de las membranas más
rápido y las rompe, permitiendo que las enzimas se activan. En el sexto paso, se agregó etanol al
96%, esto sirvió principalmente porque es un disolvente que se une a los grupos fosfato, esta
mezcla reduce las fuerzas repulsivas entre las cadenas y permite que el ADN se pliegue sobre sí
mismo, haciéndolo insoluble; como también sirvió para disminuir la grasa en forma de ácidos
grasos o lípidos sueltos. Un paso de centrifugación permite que el ADN permanezca en el fondo
del tubo mientras que el etanol es desechado. (Checa, 2017)
Como parte de los pasos siguientes de nuestro ADN extraído, purificamos la solución para que el
ADN se quede en el filtro de la columna de extracción; este proceso lo hacemos con ayuda de la
centrífuga. Se emplearon tampones como el Buffer de lavado, el cual es una solución acuosa y
salina que contiene cloruro sódico, fosfato sódico, cloruro de potasio y fosfato de potasio;
básicamente la función del buffer fosfato salino es mantener un pH fisiológico constante junto a
una concentración electrolítica similar a la que se encuentra en el interior del organismo, en este
ambiente las células son capaces de mantenerse estables, pues se simula en lo posible las
condiciones fisiológicas; y cualquier residuo de este buffer que pueda interferir con otras
reacciones enzimáticas, es removido en el paso de centrifugación.5
También se usó el Buffer de elución, el cual funciona de manera más eficiente bajo condiciones
básicas y de baja concentración salina; lo que hace este tampón es que todo lo del filtro (ADN) baje
a la columna de lavado, o sea, despega el ADN de la membrana de sílica de la columna, permitiendo
que atraviese ésta una vez se centrifuge, y utiliza sales caotrópicas (sales que desestabilizan la
estructura de las moléculas de agua) para promover la desnaturalización de proteínas y la extracción
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del ADN. Los Buffer de lavado se usaron para el mecanismo de purificación del kit, el cual se basa
en la adsorción y desorción de los ácidos nucleicos en presencia de las ya mencionadas sales
caotrópicas.
La ruptura celular y la inactivación de nucleasas intracelulares deben de ser combinadas. Se utilizó en
esta ocasión, una solución con detergentes para solubilizar las membranas celulares y sales
caotrópicas fuertes para inactivar las nucleasas. El ADN y otros componentes celulares como lípidos,
azúcares y proteínas, se disuelven en la solución de lisis. El ADN tiene carga negativa debido a los
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grupos fosfato de su estructura, y esta carga eléctrica es lo que hace soluble a esta molécula.
Hoss y Pääbo reportaron la aplicación exitosa de un prometedor método de extracción para ADN
antiguo usando sílica, el cual hace uso de la fuerte afinidad del ADN a la sílica e incluye la presencia
del desnaturalizante isotiocianato de guanidina, que ayuda en la desasociación de las
macromoléculas. Esta técnica tiene dos ventajas, primero se elimina rápida y efectivamente los
inhibidores de la PCR que fueran aislados simultáneamente con el ADN antiguo y que son el mayor
factor limitante en la amplificación del mismo. Segundo, se emplean pocos pasos y reactivos,
minimizando así la exposición a contaminación con ADN moderno.
Obtenido nuestro ADN cuantificado, como muestra la tabla 1, es posible que solo hayan salido
eritrocitos en el momento de la extracción, por lo que las concentraciones son distintas, ya que los
eritrocitos son células sin núcleo, y es posible que hayamos extraído linfocitos en menor proporción
en algunas muestras a comparación de otras.
-Sesión 2: PCR
En el proceso de PCR,(véase la Figura 2 y 4), los productos del mix ayudarán a obtener las copias
del fragmento de ADN deseado; el templado son las cadenas de ADN que se separan y funcionan
como molde para que la enzima sintetice las nuevas cadenas que llevan la secuencia blanco de
interés. Por su parte, la ADN polimerasa se encarga de la catálisis de la reacción, sintetizando las
nuevas cadenas de ADN que llevan la secuencia blanco. La enzima más usada con frecuencia se
llama Taq ADN polimerasa.8 Para que la enzima funcione con alta especificidad y la reacción
transcurra exitosamente, también se necesita de los elementos ya mencionados como primers,
dNTPs, Mg +, buffer y H2O.
Es importante mencionar que en este caso usamos agua libre de nucleasas, que por acción del
magnesio (Mg), presente en el ADN purificado, inhibe estas enzimas (nucleasas) de posibles
contaminantes. El tampón es la solución amortiguadora usada en la reacción y está compuesta
de Tris-HCl, cuya concentración final es 1X; el Tris-HCl permite mantener el pH y así proteger al
9
ADN.
El magnesio también es considerado un cofactor enzimático que influye en la especificidad de la
reacción, por eso se debe tener una concentración adecuada para que no afecte el rendimiento
de la Taq polimerasa; regularmente su concentración oscila entre 0.5 y 2.5 mM. En ocasiones ya
viene incluido en el buffer, pero en otras se le tiene que agregar.
Los primers son secuencias de oligonucleótidos o compuestos de ARN que flanquean y delimitan
la secuencia blanco que se desea amplificar y son complementarios a ésta. Generalmente su
tamaño oscila entre 15-25 pares de bases y la cantidad de G-C no debe ser más del 55% de la
secuencia. Si no se respetan estas reglas, existe la posibilidad de la formación de dímeros de
primers, es decir, de productos inespecíficos. Esto repercutirá en el rendimiento de la reacción,
así como en la especificidad del producto esperado.
Son dos secuencias diferentes de primers las que se utilizan en la PCR, una denominada
«forward» o sentido y otra «reward» o antisentido; ambas deben estar diseñadas para que
hibriden con el templado y las cadenas de ADN puedan ser extendidas por la Taq polimerasa en
dirección 5’-3 (como sucede endógenamente). Un dato importante es que el primer debe tener
mucha guanina y citosina, para asegurar que se una al ADN. La hibridación va a generar el CTP
(complejo templado primer).10
Los dNTPs son las bases nitrogenadas (nucleótidos) con los que la Taq polimerasa se une y
construye las nuevas cadenas de ADN, contribuyen a la especificidad de la reacción, por ello es
importante que su concentración sea la adecuada. La Taq polimerasa es una enzima
termoestable que actúa en el paso de la replicación, ya que constituye cada cadena simple de
ADN marcada por un iniciador en una cadena doble de ADN. Cabe mencionar que el tipo de ADN
que hemos usado para este proceso es el ADN genómico humano.
La PCR tuvo gran impacto en 4 áreas principales de la Biología Molecular: el mapeo de genes, la
clonación, la secuenciación de ADN y la detección de genes. La PCR es ahora utilizada como una
herramienta de diagnóstico médico de enfermedades infecciosas o para detectar mutaciones
específicas que pueden causar enfermedades genéticas, en las investigaciones criminales para
identificar a los sospechosos a nivel molecular, en pruebas de paternidad y en la secuenciación
del genoma humano, por mencionar algunos usos.11
En la sesión 3: La electroforesis de ADN se realizó en el gel de agarosa que es considerado como
un método estándar para separar y purificar fragmentos de ADN cuando no requerimos un alto
poder de resolución, a través de una matriz sólida que funciona como un filtro para separar las
moléculas en un campo eléctrico de acuerdo a su tamaño y carga eléctrica.
Las muestras de ADN, luego de aplicarles la fuerza eléctrica, van a migrar hacia el lado positivo
de la cámara debido a los grupos fosfato que le dan una carga negativa al ADN. La resolución y la
separación de fragmentos de ADN por electroforesis son regulados gracias a la concentración de
agarosa en el gel y su voltaje. Debido a esto, las moléculas con menor tamaño migran con mayor
rapidez hacia el polo positivo, y al aumentar la concentración de agarosa es más difícil el
movimiento a través del gel, de esta manera se pueden identificar los fragmentos con bajo peso
molecular.12
La electroforesis en gel de agarosa tiene un límite superior de unas 40-50 kb en el tamaño de las
moléculas de ADN que puede separar. Por lo tanto, no es posible separar el producto de
digestiones con enzimas de restricción de corte infrecuente, como NotI o SfiI, y menos aún
separar cromosomas enteros (los cromosomas de eucariotas inferiores tienen tamaños de entre
0.2 y 12 Mb). Reducir la concentración de agarosa hasta un 0.1 o 0.2% puede incrementar el
límite de separación hasta los 750 pb, sin embargo estos geles son extremadamente frágiles y
muy difíciles de manipular.13
El fundamento de esta técnica es la reorientación de las moléculas cuando cambia la dirección
del campo eléctrico; en la electroforesis convencional las moléculas de ADN de gran tamaño
quedan “atrapadas” en la malla que forma la agarosa en su avance a través del gel, pero la
aplicación de dos campos eléctricos alternantes en ángulo permite una reorientación de las
moléculas que de esta forma avanzan un tramo más, antes de quedar de nuevo atrapadas. El
ADN superenrollado viaja más rápido por el gel de agarosa que el ADN lineal de longitud completa
La agarosa es un polímero lineal compuesto de residuos alternantes de D-galactosa y 3,6-
anhidro-L-galactosa unidos por enlaces glucosídicos α(13) y β(14); este permite generar espacios
en los fragmentos de ADN. Las cadenas del polímero de agarosa forman fibras helicoidales, que
al solidificar forma una malla tridimensional de canales con diámetros entre 50 y >200 nm. 14 El
buffer de carga, el cual contiene bromoformo que arrastra el ADN, debe tener una alta densidad
que permita que la muestra se introduzca en el pocillo del gel, además de colorantes que nos
indiquen cuándo debe detenerse la electroforesis.
El Sybr Green sirve como colorante que puede hacer visualizar y comparar el fragmento de bajo
peso molecular al colocar en el transiluminador. El buffer de electroforesis se utiliza para la
preparación del gel, puede utilizarse opcionalmente TAE (Tris-Acetato EDTA) o TBE (Tris-Borato
EDTA). El TAE tiene una menor capacidad de amortiguación que el TBE, y puede resultar en una
acidificación del medio si la electroforesis se desarrolla durante un periodo muy prolongado, pero
funciona muy bien con tiempos normales de electroforesis, además tiene una mayor capacidad
de resolución que el TBE para tamaños grandes de ADN (véase la Figura 5).15
A partir de nuestro resultado, se observan bandas anchas y difusas, esto se debe a la baja
cantidad de voltaje que se aplicó y por ende, hubo poca migración de ADN. Objetivamente, no
se puede realizar la correcta lectura de la electroforesis, debido a que un patrón de peso
molecular se ve muy difuso y no se pueden definir la cantidad de pares de bases, por consiguiente
tampoco se puede analizar en cada una de las demás muestras de ADN. Dentro de las
posibilidades, vemos la opción de que hubo contaminación durante el experimento.
CONCLUSIONES
Los retos que se presentan día a día en la investigación biomédica nos abren la posibilidad de
conocer nuevas herramientas tecnológicas para afrontarlos experimentalmente.
Por eso que la obtención de ADN genómico de muestras biológico requiere de procedimientos
muy precisos que se deben seguir a la perfección, para evitar obtener muestras de mala
calidad que arrojen resultados indeseados en la electroforesis.
Mientras en el PCR es una de esas herramientas que se ha desarrollado para ofrecer una
alternativa para el estudio de los ácidos nucleicos. Tal fue su impacto en la comunidad científica
que hoy en día es una técnica que se usa a diario en muchos laboratorios y que se incrementó
cuando apareció la modalidad de PCR en tiempo real, permitiendo el establecimiento y la
aplicación de nuevos protocolos experimentales más precisos que generan resultados confiables
y reproducibles aunque es una técnica muy costosa y toma tiempo.
En la sesión 3, la práctica de electroforesis en gel de agarosa nos permite la visualización del ADN,
ya que al observar la electroforesis bajo luz fluorescente su puede ver cada banda fluorescente,
lo cual es debido a la presencia de material genética en la muestra del grupo.
La etapa de extracción del ADN es muy importante ya que es la que permite dar secuencia a las
demás.
La técnica de PCR es de gran utilidad en distintos campos como la biología molecular, la
biotecnología, entre otros; además brinda un resultado rápido y seguro.
Estos procesos son de gran ayuda para la investigación de ciertos patógenos que pueden ser
heredado, ayuda para médicos forenses, entre otras áreas; a nosotros, como futuros médicos,
para la determinación de enfermedades genéticas y demás.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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2. Osorio J; Quenan Y. Modificación de una técnica para extracción de adn de glóbulos
blancos humanos. Colombia: Biosalud; 2013 vol 11 (2) pp 20 - 25.
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5. U.S. National Library of Medicine. (2016). What is DNA? de NIH Sitio web:
[Link] Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M.,
Roberts, K., Walters, P. (2002) Molecular Biology of the Cell (4a ed.). Nueva York, Londres:
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6. Muralidharan K, Wakeland EK. Concentration of primer and template qualitatively
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7. Krsek M, Wellington EMH. Comparison of different methods for isolation and
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9. Strachan T, Read AP. Amplificación del DNA: clonación de DNA por PCR y basada en células.
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10. Zhang Q, Lambert G, Liao D, Kim H, Robin K, Tung C, et al. Acceleration of emergence of
bacterial antibiotic resistance in connected microenvironments. Science. 2011;333:1764-7
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17. Contreras, J. Electroforesis de DNA. Guía unificada de laboratorios. pp. 1-3.
18. Advincula. Extracción de ADN. Ministerio de salud. Santiago. Chile.
19. Karp, G. Biología molecular y celular. Conceptos y experimentos. 7ma edición. Editorial
Mc GrawHill Education.
ANEXO
¿Por qué el alcohol se debe encontrar a bajas temperaturas?
El DNA es una molécula polar, pero la reacción con el etanol a muy baja temperatura hace que
se vuelva apolar e insoluble en el etanol formándose un precipitado justo entre la capa con etanol
líquido y la capa con el extracto. El DNA es el único componente de la solución que no es soluble
en el etanol, y se hace visible porque las diferentes cadenas se van aglutinando entre sí al
precipitar debido a la acción de fuerzas físicas. El alcohol es menos denso que el agua del extracto
y por eso flota sobre la capa del extracto.
¿Cuáles son otros métodos de extracción de ADN?
- Método enzimático
- Tiocianato de Guanidinio
- Tritón X-100
- Método mecánico
- Método del fenol-cloroformo
- Método del acetato de potasio
- Acetato de potasio modificado
- Método del CTAB
¿Cómo se cuantifica el ADN?
La espectrofotometría es un método de cuantificación es decir nos permite medir de forma
altamente específica muestras de DNA en microgramos, teniendo cuenta la absorbancia y la
pureza de la muestra.
¿Qué es buffer de carga y su función?
Es un buffer que contiene sucrosa o glicerol, lo cual da peso a la muestra para que el ADN se
precipite al fondo de los pozos de siembra y los colorantes. Su función es ayudar a conducir
corriente y controlas el pH.
¿En qué caso se utiliza la poliacrilamida para separación de ADN?
Cuando se quiere tener un producto más puro con mayor resolución. Permite utilizar
concentraciones variables de ADN sin afectar el poder de resolución.
¿Por qué se utiliza luz UV para visualizar el ADN?
Porque la luz UV es muy bien absorbida por el ADN.
