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DESCRIPCION DE LA TECNICA AUTORRADIOGRAFICA EN CORTES
HISTÓLOGICOS
Resumen
En el presente trabajo de investigación se describió la técnica autorradiográfica en
diferentes cortes histológicos y especiales por medio de emulsiones fotográficas o nucleares
con la utilización del microscopio óptico y electrónico por transmisión, en la cual se
conoció la utilización, el procedimiento y se determinó cuáles son los distintos tipos de cortes
histológicos en los cuales se puede realizar la técnica autorradiográfica. La información fue
recogida en libros y artículos científicos para poder analizar cada uno de los puntos mencionados,
por lo tanto se redactó un informe descriptivo con la realización de varias revisiones bibliográficas
para las diferentes definiciones de la técnica autorradiográfica dependiendo el punto de vista del
autor.
Objetivo
Describir el proceso de la técnica de autorradiografía, la experimentación por medio del
microscopio óptico y electrónico y la utilización de dicha técnica en diferentes cortes histológicos.
Marco teórico
La autorradiografia según (Freifelder, 2003) “es un método gracias al cual se puede
localizar la situación concreta del material radiactivo, dentro de un tejido concreto, dentro
de una célula, de una parte de una célula o, incluso, dentro de una molécula.”
Además (Junqueira & Carneiro, 2015) determinan que la autorradiografia “posibilita el
estudio funcional de los mecanismos biológicos en cortes de tejidos mediante la
radiactividad, que aprovecha la capacidad que tienen ciertos tipos de emisiones radiactivas
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de sensibilizar emulsiones fotográficas.” Esto quiere decir que el contacto entre la sustancia
reactiva y la emulsión fotográfica representan la base de esta técnica.
Por esto es importante mencionar que de acuerdo con (Rodríguez, 2008) “Las emulsiones
fotográficas son capas sensibles a la luz de las películas y papeles fotográficos. Están
formadas por una suspensión en gelatina de granos ultrafinos de haluros de plata.”
Para aplicar la técnica de autorradiografia es importante conocer cómo se realiza, cómo
seleccionar el isótopo adecuado, la técnica preparatoria, los problemas que origina su
utilización y como puede utilizarse el tipo de información obtenido para proporcionar
respuestas a problemas concretos.
En esta técnica se emplea un isótopo radioactivo que se incorpora a una molécula de
interés. Por ejemplo si se desea estudiar la síntesis de una determinada proteína, se
introducen aminoácidos tritiados en el sistema y posteriormente se recogen muestras en
periodos establecidos (Gartner & Hiatt, 2011). Pueden estudiarse además nucleótidos o
monosacáridos radiactivos.
La historia de la autorradiografía comienza cuando Antoine Henri Becquerel descubrió
en 1896 la radioactividad espontaneo debido a que observó una radiación misteriosa
proveniente de las láminas fotográficas impresas con uranio. Tiempo después, Paul Villard
en 1900 utilizó la autorradiografía para demostrar su descubrimiento en radiación gamma,
él demostró la existencia en un campo magnético. Gracias a la autorradiografía, dice (Luis
Montega, 2009) ”El amplio uso que se ha hecho durante décadas de la autorradiografía
demuestra como una técnica fundamentalmente morfológica puede dar respuestas a
inumerables interrogantes de orden funcional”.
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La palabra autorradiografía resulta de la acción en donde la muestra no se ubica en
medio de la fuente de radiación y el detector como en la radiografía; sin embargo, incluye
adentro la fuente de las radiaciones.
La autorradiografia es un procedimiento manejado para indicar el patrón de localización
de diferentes compuestos señalados con isótopos radiactivos colocados en muestras, las
cuales en estudios médicos y científicos son células y tejidos que abarcan sustancias
radioactivas. Es así que afirma (Pilar Roca, 2003) “la radiactividad es capaz de impresionar
en una placa fotográfica, por lo que puede emplearse esta propiedad tanto para seguir el
destino de un compuesto radiactivo como para cuantificar”. Es un procedimiento idóneo
para localizar y cuantificar una secuencia temporal de fenómenos. Se lo realiza a través de
la inserción de un isótopo radioactivo (generalmente tritio 3H) en el compuesto estudiado,
una vez insertado el isótopo en el sujeto se adquiere muestras de tejido diferentes, se
procesa el tejido de manera habitual colocándolo en un portaobjetos de vidrio, sin embargo,
no acomodamos el cubreobjetos, que en cambio, se administra una fina capa de emulsión
fotográfica. El tejido es colocado en una caja oscura durante unos días o semanas en donde
la emulsión se expondrá sobre las zonas celulares en donde se encuentra el isótopo. Se
revela y fija la emulsión mediante técnicas fotográficas y se ubica gránulos de plata
metálicos sobre las porciones expuestas de emulsión.
Se describe la aplicación de placas de imagen de fósforo de almacenamiento
fotoestimulables a autorradiografía de muestras marcadas. En comparación con la película
de rayos X, las placas de imágenes ofrecen una mayor sensibilidad de 15 a 250 veces. La
resolución está en el rango de 0,3 mm y, por lo tanto, es adecuada para cualquier gel o
aplicación de blot.
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Autorradiografía
La autorradiografía se define según (Oxford University Press, 1998) como una “técnica
de experimentación en la que una muestra radioactiva es colocada en contacto con (cerca
de) una placa fotográfica, para que se refleje en ella la distribución de la actividad
radioactiva de la muestra”
Emulsiones nucleares
Según menciona (Freifelder, 2003) “la emulsión nuclear se diferencia de la película
fotográfica estándar, principalmente por la eleveda relación de haluro de plata con respecto
a la gelatina- en volúmenes prácticamente iguales en las emulsiones nucleares- y en el
pequeño tamaño de granos (0.02-0.3µm)”. Las emulsiones nucleares son muy utilizadas en
la autorradiografía para la detección de isótopos radiactivos que emitan radiaciones β.
Existen tres tipos: la emulsión preparada es una capa gruesa (250µm) de emulsión que se
monta sobre un portaobjetos; la emulsión líquida consiste que la muestra debe ser
sumergida en un gel fundido y posteriormente es retirada que por efecto se solidifica, y va a
formar una capa cuyo grosor dependerá de la cantidad de gelatina en el líquido; y la
emulsión en tiras consiste en una fina película (5µm) montada sobre vidrio. Los métodos
para la colocación de emulsión sobre la muestra son los siguientes:
a) Método de la inmersión
Primeramente se sumerge la muestra en el portaobjetos en un recipiente de emulsión
fundida con ayuda de una pinza siguiente a esto lo sacamos, en la cual se adhiere una
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delgada capa al vidrio del portaobjeto y lo dejamos reposar para que se solidifique a
temperatura ambiente.
b) Método de película a tiras
La película que en una vista lateral se puede observar que tiene 3 capas y de superior a
inferior son: la gelatina más el bromuro de plata, la gelatina y la placa de vidrio. La placa
de vidrio tiene que ser separado de las otras capas superiores, esto se lo realiza con ayuda
de una cuchilla se señalan las piezas rectangulares de aproximadamente 2,5 x 7,5 cm. Así
es posible arrancar la película de la placa, pasando la cuchilla bajo el borde de la película.
Después la película se invierte y se coloca sobre una superficie acuosa que durante este
tiempo la película va ha extender. Para recoger la película en un portaobjetos, es necesario
que el portaobjetos sea colocado dentro del agua bajo la película. Una vez que este centrado
la película sobre el portaobjetos se lo levanta y se aprecia la muestra (la película) sobre el
portaobjetos.
Por otra parte, el uso de la autorradiografia es útil para tejidos frescos, frotis, cortes
congelados, desecados y susititudos.
Esta técnica experimentalmente se la puede realizar de dos métodos. La primera consiste
en el análisis de tejidos de animales suministrados previamente un radioelemento. Mientras
que el segundo método es la incubación de cortes histológicos con material radioactivo.
Para la experimentación de la técnica autorradiográfica en microscopio óptico, antes de
empezar se preparan las muestras y en un cuarto oscuro se coloca una fina capa de
emulsión fotográfica sobre el corte del tejido. Las partículas β b atraviesan una emulsión y
producen una imagen latente ya que por la radiación la capa de la emulsión fotográfica se
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convierte en una capa de plata metálica. Gracias a la eliminación de cristales no expuestos
deja un patrón de granos de plata metálica, cubriendo regiones del tejido, que forman la
verdadera imagen. Más adelante, se pueden teñir para proporcionar un fondo morfológico
donde se localizan las moléculas marcadas por radioactividad. La histoautorradioigrafia
tiene una resolución de 0,1 µm accesible para el microscopio óptico.
La utilización de la técnica autorradiográfica en microscopio electrónico se lo realiza
por un proceso. Antes que nada el portaobjetos de vidrio es lavado con etanol- clorhídrico,
posteriormente es enjuagado con agua y secado con un papel absorbente especial. Luego es
marcado en una de sus caras y se introduce en una solución de celoidina. Después se las
retira y se los deja secar en un recipiente. Una vez seco el portaobjetos se tiene que bañar
nuevamente con celoidina. A continuación, un corte ultrafino se coloca sobre el
portaobjetos ya recubierto por celoidina a través de un papel de filtro. Es así que los cortes
quedan fijados a la película de celoidina. La preparación es sumergida en varios baños de
etanol y citrato de plomo. Por último, el portaobjetos es lavado, secado y recubierto por una
capa de carbón activo vaporizado.
Una vez listos los portaobjetos se introducen en la solución de la emulsión fotográfica
en cámara oscura, igualmente como en microscopía óptica. La película se observa a través
de una cámara oscura y opaca por la presencia de un desecador. Una vez revelado es lavado
con agua destilada y la preparación se fija en una solución de tiosulfato sódico al menos por
5 minutos. Después, es posible raspar el cubreobjetos y dejar desprender la película de
celoidina que es allí donde contiene los cortes donde son trasladados a una rejilla de cobre
sobre un papel filtro para poder separar la lámina de celoidina. Posterior, la lámina de
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celoidina es separada de la rejilla y finalmente ya pueden ser observados o examinados sin
eliminar gelatina de la emulsión.
Información que nos proporciona
En general, la radioautografía emplea congelación, crio sección, liofilización y
aplicación de películas, que muestran compuestos solubles e insolubles y fue desarrollada
para demostrar la localización de la penicilina. En contraste, la radioautografía con
microscopía óptica y electrónica generalmente emplea la fijación química y la aplicación de
emulsiones húmedas que demuestran solo compuestos insolubles. (Res, 1998)
Autorradiografia molecular
(Freifelder, 2003)“Es posible utilizar la autorradiografía para visualizarr o determinar
parámetros físicos de moléculas y esto es lo que se denomina autorradiografía molecular”,
Esta técnica se lo emplea para estudios de la estructura del ADN ya que es el único que se
puede obtener información por medio de esta técnica.
Técnicas autorradiográficas especiales
Antes de determinar los distintos tipos de cortes en los cuales se puede realizar la
autorradiografía se debe tener en cuenta ciertas especificaciones como su espesor y la
emulsión.
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- Espesor de los cortes y de la emulsión
Se explica considerando el haz de radiación alcanza mayor superficie a medida que
aumenta la distancia entre su lugar de origen y su destino en la emulsión fotográfica, dando
esto como resultado que: los cortes de un mayor grosor, los isótopos situados en la
profundidad del corte originan autorradiogramas en los que la impresión se dispersa más
que los isótopos de las capas más superficiales. Por tanto, para la obtención de resoluciones
ópticas es esencial utilizar cortes histológicos delgados y emulsiones también finas que se
consigue de diluir la emulsión original
Una vez detallado esto, se identificará los distintos tejidos
- Cortes incluidos en resinas
Los cortes procedentes de tejidos incluidos en Epon pueden ser usador para realizar
estudios autorradiográficos a nivel de microscopía óptica. Su proceso se revela y fija como
se hace con cortes con parafina.
- Frotis
De sedimentos celulares se fijan con etanol durante 5 minutos. Luego del secado se
introducen en la emulsión fotográfica, se deja impresionar, se revela y se fija.
- Cultivos celulares
Se pueden someter a estudios de autorradiografía los cultivos celulares usando diferentes
protocolos. El sedimento celular puede extender sobre un porta-objeto que se fijará
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introduciéndolo en una solución de Boun o un líquido de Carnoy, deshidratando y
rehidratando con una serie de etanol. Una vez que estén secos se introduce en emulsión
fotográfica.
Para realizar autorradiografías al nivel de microscopía electrónica, el sedimento celular
se fija con glutaraldehído durante 1 hora, durante 2 días en una solución fisiológica
tamponada, se deshidrata y se incluye Epon. Los cortes luego de pasar por el
ultramicrotomo, se montan en rejillas. (Martinez & Gragera, 2008)
Conclusión
Con esta técnica especial hemos concluido que podemos utilizar la emisión de energía
de un tejido, o una célula aplicando isótopos reactivos para determinar la ubicación del
material radioactivo, y así obtener una imagen radioactiva; es decir, que la autorradiografía
aprovechará la capacidad radiactiva de ciertas estructuras de la célula que puedan activar
una emulsión y si se pone en contacto con una fuente radioactiva, sobre las partículas
emitidas por la fuente quedarán unos pequeños gránulos de plata metálicos. Esta técnica se
le aplica en el estudio de membranas para entender de qué manera se comportan ciertos
tejidos. Cabe recalcar que dentro de los métodos de emulsión, la más utilizada es la
emulsión líquida.
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Anexos
Método de colocación de emulsión sobre la muestra
a) Método de la inmersión
b) Método de película a tiras
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Preparación de muestras para la observación en microscopio óptico y electrónico.
Microfotografía de un corte histológico por
microscopio eléctrico de transmisión con el empleo de la técnica de autorradiografía
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