2019

AVANCES GENÉTICOS EN
EQUINOS
Mvz MSc. Verónica Macías

Karen Guevara Q
 Karen Guevara Q
26/04/2018

Contenido

AVANCES GENÉTICOS EN EQUINOS ....................................................................................................................... 2

INTRODUCCIÓN .......................................................................................................................................................... 2
OBJETIVOS .................................................................................................................................................................... 2
ARTÍCULOS ................................................................................................................................................................... 2
GENOMA DE LA ESPECIE EQUINA ................................................................................................................. 2
SELECCIÓN ASISTIDA POR MARCADORES GENÉTICOS ....................................................................... 5
BIOTECNOLOGÍAS UTILIZADAS EN LA ESPECIE EQUINA. .................................................................. 7
POLIMORFISMO EN GENES DE INTERÉS ................................................................................................. 11
CONCLUSIÓN ............................................................................................................................................................ 15
BIBLIOGRAFÍA.......................................................................................................................................................... 16
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AVANCES GENÉTICOS EN EQUINOS

INTRODUCCIÓN

La explotación equina tradicional se enfocaba principalmente al uso de las caballerías

como animales de silla, tiro o enganche y muy ligados a las labores del campo para el
manejo de otras especies ganaderas. En la actualidad estos usos están derivando hacia
una en la práctica más lúdica e incluso deportiva en los países más desarrollados.
(Gómez, 2017)
Las razas de animales domésticos han estado íntimamente ligadas con el medio
ambiente en que habitan y con la cultura humana que las explotan, por lo cual los
productores han tomado medidas como el mejoramiento genético de acuerdo a sus
necesidades.

Las herramientas y/o procesos tecnológicos que el hombre aplica de manera directa o
indirecta a la reproducción, en este caso animal, se conocen como Biotecnologías
Reproductivas. Los reportes anecdóticos de estas herramientas de manejo
reproductivo en equinos son muy antiguos (s.XVI) pero el verdadero auge ocurre
durante el siglo pasado con la expansión de la inseminación artificial (IA) como la de
mayor impacto sobre los sistemas productivos. Desde la segunda mitad del siglo XX la
aplicación masiva de estas tecnologías ha crecido exponencialmente en la industria
equina mundial en especial la IA y la transferencia embrionaria (TE) (Squires, 2005)

La reproducción asistida en caballos ha mejorado enormemente en los últimos años

con la producción de potrillos de yeguas o padrillos subfértiles o infértiles usando
técnicas de reproducción convencionales como son la inseminación artificial o la
transferencia de embriones. Debido al alto valor económico de estos animales o la
importancia genética de los mismos sin el uso de estos procedimientos la vida
reproductiva de estos animales estarían casi terminados. (Rodríguez, 2014)

OBJETIVOS

 Analizar la importancia de la aplicación de biotecnología en la especie equina.

 Describir las últimas biotecnologías reproductivas desarrolladas y sus
aplicaciones potenciales en la clínica reproductiva y la producción equina.
 Conocer los diferentes métodos de selección por medio de marcadores
moleculares en la especie.

ARTÍCULOS

GENOMA DE LA ESPECIE EQUINA

El caballo posee 32 pares de cromosomas, que son el soporte de los genes que llevan
implícito el material hereditario, y a su vez, las diferentes formas posibles de existir
cada gen se denominan alelos, constituyendo éstos el abanico de posibilidades en que
puede mostrarse ese caracter concreto. Cada individuo llevará únicamente dos alelos,
correspondientes uno a cada progenitor. Sin embargo, hay circunstancias que
producen un cambio en la secuencia génica de una población, y son la selección, la
mutación, la migración y el azar. (Martín & García, 2017)
Como una de las primeras especies domesticadas, el caballo, Equus caballus, ha jugado
un papel importante en la exploración humana de nuevos territorios. El género Equus,
que pertenecía al orden perissodactyla (es decir, animales con patas extrañas y
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pezuñas), irradiaba en 8 o 9 especies hace unos tres millones de años. Los miembros de
la familia de los équidos exhiben cariotipos divergentes y posicionamiento
centromérico variable. Con más de 90 condiciones hereditarias, que pueden servir
como modelos para trastornos humanos (como infertilidad, enfermedades
inflamatorias y trastornos musculares), el caballo tiene mucho que ofrecer como
especie modelo.
El ADN de una única yegua de la raza Thoroughbred se secuenció a una cobertura de
6.8 × [texto en línea de apoyo (SOM)], lo que dio como resultado un conjunto de
borrador de alta calidad (designado EquCab2.0) con un tamaño de contig N50 de 112
kb (SOM) y un tamaño de andamio N50 de 46 Mb, y> 95% de la secuencia anclada a los
64 (2N) cromosomas equinos. El tamaño del genoma de 2.5 a 2.7 Gb es algo más
grande que el genoma del perro (2.5 Gb) y más pequeño que el genoma humano y
bovino (2.9 Gb). Duplicaciones segmentarias constituyen <1% del genoma equino, y la
mayoría son duplicaciones intracromosómicas, como se ven en muchos otros genomas
de mamíferos (SOM). Las secuencias repetitivas, muchas de ellas específicas del
equino, constituyen el 46% del ensamblaje del genoma (SOM). Las clases de repetición
predominantes incluyen elementos nucleares largos intercalados, dominados por los
tipos L1 y L2 (19% de las bases), y elementos nucleares cortos intercalados, incluidas
las recientes ERE1 y ERE2 y las principales regiones inmunogénicas ancestrales (7%
de bases). La comparación de los cromosomas humanos y de los caballos revela una
fuerte sintenidad conservada entre estas especies. De hecho, 17 cromosomas de
caballo (53%) comprenden material de un solo cromosoma humano (en el perro, es
29%).
Una característica inesperada del paisaje del genoma del caballo fue la identificación de
un nuevo centrómero evolutivo (ENC) en el cromosoma 11 (ECA11), capturado en un
estado inmaduro. Se han generado varias ENCs en el género Equus mediante el
reposicionamiento de centrómeros (un cambio de posición centromérica sin
reorganización cromosómica). Los centrómeros de mamíferos son típicamente
estructuras complejas caracterizadas por la presencia de repeticiones en tándem por
satélite. Se cree que las ENCs se forman inicialmente por mecanismos desconocidos en
regiones libres de repetición y luego adquieren progresivamente arreglos extendidos
de repeticiones en tándem satelitales que pueden contribuir a la estabilidad funcional.
El centrómero de ECA11 reside en una gran región de sintenia conservada en muchos
mamíferos, donde el caballo es la única especie con un centrómero presente, lo que
sugiere fuertemente que este centrómero es evolutivamente nuevo. El centromero
ECA11 es el único centrómero equino que carece de cualquier señal de hibridación en
los experimentos de hibridación in situ fluorescentes que sondean con las dos
secuencias de satélite de caballo principales, como si no hubiera tenido suficiente
tiempo para adquirir el satélite. ADN. Citogenéticamente localizamos la constricción
primaria, y luego mapeamos con precisión, a nivel de secuencia, la función
centromérica mediante inmunoprecipitación de cromatina (ChIP), en experimentos
con chip. En esta región, encontramos solo cinco brechas de secuencia [ninguno> 200
pares de bases (pb)], no hay secuencias codificantes de proteínas. Tampoco
encontramos evidencia de acumulación de transposones L1 o elementos KERV-1, que
se suponía previamente que influyen en la formación de ENC. Proponemos que el
centrómero ECA11 se formó muy recientemente durante la evolución del linaje de los
caballos y, a pesar de ser funcional y estable en todos los caballos, aún no ha adquirido
las marcas típicas de los centrómeros de mamíferos.
Principales hallazgos del análisis del genoma.
A. Análisis de la constricción centromérica primaria de ECA11: 26,000,000 a
30,000,000 bases. El análisis de ChIP-on-chip con anticuerpos contra proteínas
centroméricas (CENP-A y CENP-C) muestra dos regiones (136 y 99 kb) unidas
por proteínas kinetochore. No hay espacios vacíos sin capturar y pocos
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capturados, una fracción normal de bases en secuencias repetidas, no hay
repeticiones en tándem satélite, no hay secuencias codificantes de proteínas
presentes cerca, y niveles normales de elementos conservados no codificantes
(29 eutherianos).
B. El caballo LD es intermedio entre humanos y perros.
C. Los caballos exhiben más haplotipos de raza cruzada que los perros. Los
haplotipos tienen el mismo color en todas las razas. Los haplotipos en <5% de
todos los individuos son de color gris claro, y los haplotipos en> 5% de todos
los individuos, pero una sola raza es de color gris oscuro. Los datos muestran
las regiones LD en ECA18 (primeros 100 kb) y en el cromosoma 12 (primeros
100 kb), que son representativos.
El conjunto de genes equinos es similar a los de otros mamíferos euterios y tiene
20.322 genes codificadores de proteínas (ENSEMBL build 52.2b), de los cuales 16.617,
17.106 y 17.106 han evidenciado ortología en humanos, ratones y perros,
respectivamente. El resto está compuesto de genes codificantes de proteínas
proyectados, nuevos genes codificantes de proteínas y pseudogenes. Ortólogos
individuales con la cuenta humana de 15.027 predicciones de genes de caballo (SOM).
El análisis del transcriptoma de ocho muestras equinas confirmó la expresión del 87%
de los 18,039 genes no superpuestos predichos por ENSEMBL y el 88% de los 169,073
exones predichos. El análisis de la familia de genes muestra una expansión paráloga en
caballos en comparación con humanos y bovinos (SOM) para varias familias
interesantes, como los genes de queratina relacionados con la condición de
pachyonychia (engrosamiento del lecho ungueal) en humanos, tal vez afectando la
formación de pezuña y genes de opsina para la fotorrecepción, posiblemente
ventajosos para la percepción visual de los depredadores.
La historia de la domesticación de los caballos, que tiene importantes implicaciones
para las estrategias de mapeo de rasgos, difiere de manera importante de la del perro
doméstico, pero es quizás similar a la de la vaca. Los caballos no parecen haber sufrido
un estrecho cuello de botella de domesticación, y se ha postulado la presencia de
muchas matrilinas en la historia del caballo doméstico. El examen del cromosoma Y del
caballo reveló un número limitado de patrilines, lo que concuerda con un fuerte sesgo
sexual en el proceso de domesticación.
Primero generamos un mapa de polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) de más de
un millón de marcadores a una densidad promedio de un SNP por 2 kb al secuenciar
ligeramente a siete caballos de diferentes razas y al extraer el ensamblaje para los SNP.
Caracterizamos la estructura del haplotipo dentro y entre las razas mediante el
genotipado de 1,007 SNP de 10 regiones del genoma (SOM) en 12 poblaciones,
incluidas 11 grupos de razas (cada uno con 24 representantes) y 1 grupo de
representantes individuales de otras 24 razas y équidos. El 98% de los SNP fueron
validados, con un promedio del 69% siendo polimórficos en razas alternativas (SOM).
Al igual que el bovino, el desequilibrio de ligamiento (LD) dentro de la raza es
moderado, disminuyendo a dos veces los niveles de fondo ( r 2 ) de 100 a 150 kb. La
mayoría de las razas mostraron LD similar (SOM y fig. S7), y los haplotipos principales
se compartieron con frecuencia entre diversas poblaciones. En función de la longitud
de LD en el caballo, el número de haplotipos dentro de los bloques de haplotipos y la
tasa de polimorfismo, los cálculos de potencia sugieren que ~ 100,000 SNP son
suficientes para el mapeo de asociación en todas las razas y en todas las razas (SOM y
fig. S8) .
Las relaciones filogenéticas entre las razas fueron inconsistentes en las regiones
resecuenciadas, que es muy probablemente una consecuencia de las relaciones
cercanas de las razas de caballos en todo el mundo. No pudimos separar
filogenéticamente E. przewalskii de los caballos domesticados, a pesar de su cariotipo
diferente (2N = 66 versus 2N = 64 para el caballo domesticado), que está de acuerdo
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con los hallazgos recientes, mientras que el burro (E. africanus) es claramente un taxón
distinto (fig. S9, tabla S14 y texto de SOM). Esto sugiere que o bien la mezcla de E.
przewalskii y E. caballus ocurrió después de la separación de subespecies o que E.
przewalskii se derivó recientemente de E. caballus.
Demostramos la utilidad de la secuencia del genoma equino y un mapa de SNP
aplicando estos recursos a la detección de mutaciones para el locus de localización de
Leopard Complex (LP). LP (Appaloosa spotting) se define por patrones de blanco que
ocurren con o sin manchas pigmentadas. La homocigosidad confiere un fenotipo
asociado con la ceguera nocturna estacionaria congénita en la raza Appaloosa. El
mapeo fino de una región de 2 Mb seguido de una secuencia de captura y secuencia
regional (300 kb) no encontró indicaciones de variantes de número de copias
asociadas o inserciones o eliminaciones, pero encontró 42 SNP asociados. De estos, 21
residen en un haplotipo asociado cerca de un gen candidato, melastatina 1 ( TRPM1 ),
que se expresa en el ojo y los melanocitos. Dos SNPs conservados pueden ser buenos
candidatos para la mutación causal.
Fuente: (Instituto Broad del MIT; Harvard. , 2009)

Discusión
Este análisis de la primera secuencia de borrador de alta calidad de un caballo (E.
caballus) distingue a E. caballus de los genomas eutherianos anteriores por su gran
relación con los humanos y la identificación de un evento de reposicionamiento
centrómero que puede proporcionar un modelo eficaz para estudiar los factores
epigenéticos responsable de la función centrómera. los resultados demuestran que la
historia de la población de caballos ha llevado a compartir haplotipos de razas,
aumentando la viabilidad de la cartografía de razas cruzadas. Es probable que los
proyectos de mapeo en el caballo se aceleren en los próximos años e identifiquen
mutaciones en los genes relacionados con la morfología, la inmunología y el
metabolismo, que pueden beneficiar la salud humana. En otro artículo la autora Claire
Wade ex investigadora del Instituto Broad y del Centro de Investigación Genética
Humana en el Hospital General de Massachusetts mencionó “No sabemos mucho
acerca de los centrómeros, particularmente porque han demostrado ser tan difíciles de
analizar por secuenciación de ADN".

SELECCIÓN ASISTIDA POR MARCADORES GENÉTICOS

Los estudios sobre el DNA han puesto de manifiesto en el genoma humano unas
secuencias muy peculiares denominadas microsatélites. Se trata de repeticiones en
tándem de motivos simples, así (TG)n donde 10<n<30. La función que tienen, así como
su mecanismo de acción, son poco conocidos.

Los microsatélites presentan una serie de características: Son muy frecuentes y están
repartidos por todo el genoma eucariótico y, a menudo, presentando un alto grado de
polimorfismo en cuanto al número de repeticiones de la secuencia.
El modelo de herencia es mendeliano y los alelos detectados presentan codominancia.

Las técnicas empleadas para la detección de la variabilidad son muy simples en

comparación con otras técnicas de investigación del polimorfismo del DNA.
Se necesitan cantidades muy pequeñas de material biológico para la determinación de
las variantes alélicas, incluso aunque el DNA esté bastante degradado, lo que permite el
estudio de muestras muy antiguas y de origen diverso.
Estas características han llevado a considerar a los microsatélites como los marcadores
de elección para conseguir, no sólo un modo fiable de identificación individual y de
control de las genealogías, sino también una mejor apreciación y caracterización de la
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diversidad genética de las razas. La estrategia más empleada para la detección de
microsatélites equinos consiste en construir en plásmidos una genoteca parcial de
fragmentos de DNA inferiores a 1000 pb y explorarla con sondas de motivos
dinucleotídicos repetidos.

Una vez completamente solubilizado el DNA, se calcula la concentración obtenida y su

grado de pureza. Siguiendo la técnica de Estoup se selecciona la enzima Sau3A1 y se
realiza una digestión completa de 25 mg de DNA genómico. Se separan los fragmentos
del DNA digerido por electroforesis en un gel de agarosa al 1 p.100 (p/v), utilizando
como referencia de tamaños el plásmido pBR322 digerido con HaeIII. Una vez que la
separación es suficiente para discriminar 200 pb, se detiene la electroforesis y se
recorta la porción de agarosa que contiene el DNA de talla comprendida entre
aproximadamente 200 y 400 pb, se extrae el DNA, se cuantifica y se inserta en un
plásmido pUC18 digerido con BamH1 y desfosforilado. Se preparan células
competentes E. coli JM105 siguiendo el protocolo del Dr. Mike Scott, basado en
resiembras sucesivas en cultivos en medios líquidos y la utilización del CaCl2 como
agente permeabilizador de la membrana. Se transforman con 10 ng de vector
recombinante. Una vez que se dispone de las colonias de bacterias suficientemente
crecidas (1-2 mm) sobre las cajas de LB-agar selectivo, se transfieren las colonias y se
fija el DNA de las mismas a una membrana de nailon. La sonda que se utiliza para la
detección de clones portadores de microsatélites es un oligonucleótido (TG)7T
marcado en el extremo 3' con DigoxigeninaÒ. Se rastrea la membrana de nailon con la
sonda y se identifican las colonias positivas mediante un anticuerpo anti-Digoxigenina
que lleva unida una fosfatasa alcalina, quien al actuar sobre el sustrato adecuado
(Lumigen PPD), produce una emisión lumínica capaz de impresionar una placa
radiográfica en unos minutos. Las colonias positivas se siembran en medio de cultivo
LB con 60 mg/ml de ampicilina, se incuban 12 horas a 37°C y se extraen y purifican los
plásmidos por lisis alcalina. Se utiliza un procedimiento de secuenciación automática
basado en el método de los didesoxinucleótidos de Sanger con los cuatro
didesoxinucleótidos terminadores marcados con fluorocromos distintos. Los productos
de cada reacción se resuspenden en 4 ml de solución de carga (5:1, formamida
desionizada y EDTA 50 mM, pH, se desnaturalizan a 90°C durante 2 min, se enfrían
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sobre hielo picado y se cargan en un gel de poliacrilamida que se ha colo- cado
previamente en un secuenciador automático ABI 373 Strech (APPLIED BIOSYSTEMS,
PERKIN ELMER). La electroforesis se realiza a potencia constante (32 vatios) y 40 °C
de temperatura. Se siguen las recomendaciones del fabricante para obtener la
secuencia del fragmento de DNA en estudio. Se identifica la secuencia correspondiente
al inserto del DNA y al plásmido y se resuelven las posibles ambigüedades comparando
las secuencias complementarias obtenidas en las dos reacciones.

Fuente: (Vega-Pla, De Andrés, Garrido, & Dorado, 2013)

Discusión

El autor de este articulo propone una metodología relativamente sencilla en lo que

respecta a la selección de marcadores genéticos por medio de la detección de
secuencias microsatélitales a partir de genotecas parciales en plásmidos y explorar por
medio de sondas de motivos dinucleotídicos repetidos esto para determinar en
pruebas de identificación y control de paternidad equino y en la confección de mapas
genéticos, combinando técnicas de otros autores para la extracción del DNA y selección
de enzimas determinadas.

BIOTECNOLOGÍAS UTILIZADAS EN LA ESPECIE EQUINA.

INSEMINACIÓN ARTIFICIAL (IA)

Los métodos que se realiza en esta especie son:
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1) IA con semen refrigerado. La criopreservación del semen diluido a 5ºC por periodos
de hasta 24-48 hs en contenedores de diseño simple, económicos, transportables, aun
descartables, resistentes a malos tratos y a temperaturas externas elevadas junto a la
difusión del uso de diferentes tipos de diluyentes de alta eficiencia, ha contribuido al
crecimiento de este sistema que esencialmente disminuye los costos operativos al
evitar transportar animales valiosos, sin disminución en los índices de preñez por ciclo
si los procedimientos se realizan correctamente y los animales no tienen problemas de
fertilidad aditivos.

2) IA con semen congelado. Los avances en la investigación de nuevos

criopreservadores como las amidas, diferentes curvas de descenso térmico, la
evidencia que no hay un patrón standard de respuesta de los espermatozoides a la
injuria térmica, inclusive variando dentro de cada padrillo en diferentes eyaculados,
época del año, etc. y la presión del mercado y los criadores respecto a implementar
protocolos eficientes y comercialmente aceptables, ha llevado a esta técnica a índices
de preñez comparables a los de semen refrigerado. En razas deportivas, en especial de
salto (pero extendiéndose rápidamente a las demás), el semen de la mayoría de los
padrillos importantes se comercializa congelado lo que permite preservar su genética,
aun después de muerto el animal, por tiempo indefinido y la difusión internacional de
la misma en pequeños contenedores.

3) IA con baja dosis. Descripta inicialmente para ser utilizada en padrillos con baja
fertilidad y a través de una histeroscopía, esta técnica propone utilizar dosis
inseminantes de hasta 1/10 de la recomendada para IA tradicional colocando el semen
sobre la unión útero-tubarica (papila). El desarrollo de la técnica y su traslado a
sistemas de campo utilizando una pipeta de IA más larga y flexible, guiada
trasrectalmente permite depositar el semen sobre la papila disminuyendo la dosis
(tanto de semen fresco, refrigerado y congelado) y aumentar la eficiencia en términos
de dosis/eyaculado, bajando los costos con resultados en muchos casos superiores a
las técnicas convencionales.

TRANSFERENCIA EMBRIONARIA (TE)

La técnica de transferencia de embriones en equinos es el procedimiento por el cual se

recolecta uno o más embriones por un método no-quirúrgico a través de un lavaje
uterino transcervical de una yegua donante inseminada o servida, 6 a 10 días post-
ovulación, y se transfiere (de manera quirúrgica o no quirúrgica) al útero de otra yegua
receptora sincronizada previamente. Coincidentemente con el desarrollo de la
ultrasonografia reproductiva, a partir de los primeros reportes a comienzos de los ´80,
las TE han crecido sostenidamente durante las últimas tres décadas, instalándose como
una de las herramientas biotecnológicas de alto impacto en sistemas de producción de
equinos de alta performance o valor genético. Entre los factores más importantes que
pueden condicionar los resultados de un programa de TE merecen destacarse:
Dificultad en superovular las donantes; fertilidad del padrillo; edad de la donante;
correcta detección de la ovulación; condición reproductiva/nutricional/sanitaria y
edad de la receptora; entrenamiento del operador y calidad del embrión.

Bajo condiciones ideales (donantes, receptoras, padrillos fértiles y personal

capacitado), se puede esperar una tasa de recuperación de embriones de 50 a 80 % y
una tasa de preñez de 50 a 80 %, lo que determinaría una tasa de eficiencia total del 25
al 65 %. Tanto la tasa de recuperación como la de preñez post-transferencia de yeguas
subfértiles son significativamente más bajas comparadas con yeguas normales (20-
30% vs 60-80%).
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Por ésta técnica es posible obtener, en promedio, 4 ó más potrillos por año hijos de la
misma yegua.

VITRIFICACIÓN DE EMBRIONES

La vitrificación es un proceso físico de criopreservación donde una solución líquida es

transformada en un sólido particular amorfo y estable, llamado vítreo, cuando se
congela a bajas temperaturas (criogénicas) utilizando altas concentraciones de
crioprotectores. Como resultado, los fluidos intra y extracelulares se tornan más
viscosos a medida que el medio se enfría, evitando la unión de moléculas de agua y
consecuentemente la formación de cristales de hielo. Para lograr esto, el enfriamiento
debe ser muy rápido obteniendo un estado vítreo, de manera casi inmediata. Este
estado tiene la distribución iónica y molecular de un líquido, por eso se evitan los
efectos nocivos (mecánicos y químicos) de los cristales de hielo que se forman durante
la criopreservación convencional. La técnica de vitrificación posee varias ventajas: es
simple, puede realizarse en poco tiempo y no necesita equipos costosos. Sin embargo
también presenta algunas desventajas: la alta concentración de crioprotectores
utilizados puede ser tóxica para las células. Un problema severo es la remoción de las
altas concentraciones intracelulares del crioprotector luego del descongelamiento. Las
exigencias de las competencias en los diferentes deportes hípicos dificultan que las
yeguas gesten o permanezcan en un centro de TE durante su etapa reproductiva o
deportiva.

La criopreservación permite el transporte de los embriones desde la yegua donante

hacia la receptora sin necesidad de mantener la misma sincronizada, reduciendo los
costos de mantenimiento y por otra parte posibilitando que completen su temporada
deportiva.

Una de las ventajas más importantes de criopreservar embriones es que éstos, a

diferencia de las gametas, contienen el genoma completo de un nuevo individuo y está
listo para ser transferido a una madre sustituta. Además de las ventajas mencionadas,
la criopreservación permite conservar material genético de animales superiores,
seleccionados por su desempeño atlético o por sus características raciales o
productivas.

A diferencia de los bovinos y otras especies domésticas, una de las limitaciones en los
equinos es la dificultad, hasta el momento, de superovular yeguas consistentemente,
por lo tanto la cantidad de embriones obtenidos por yegua por ciclo es
comparativamente muy baja.

Como resultado, los embriones disponibles para investigaciones en esta área de la

biotecnología se encuentran muy acotados. De hecho es una de las especies de
mamíferos domésticos en la que menos se ha avanzado en este campo, donde
solamente se reportan alrededor de 50 potrillos nacidos en el mundo producto de
embriones criopreservados, a diferencia de decenas de miles de bovinos.

El proceso de vitrificación de embriones equinos es un proceso sencillo que se realiza

en poco tiempo (3-4 minutos por embrión) y no requiere de equipamiento complejo.
Una vez vitrificado el embrión este se puede mantener por tiempo indefinido dentro
del termo de nitrógeno líquido. Para transferir el embrión vitrificado debemos contar
con receptoras que se encuentren entre los días 5 a 6 post ovulación. Los resultados
obtenidos hasta el momento en cuanto a preñeces de embriones equinos son muy
alentadores.
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INYECCIÓN INTRACITOPLASMÁTICA DE ESPERMATOZOIDE (ICSI)

Esta técnica de alta complejidad fue desarrollada como alternativa para el tratamiento
de casos específicos de infertilidad masculina. En equinos, los resultados hasta el
momento demuestran que es más eficiente que la de FIV para la producción in vitro de
embriones y es ofrecida comercialmente desde el año 2003 para el tratamiento de
determinados casos de infertilidad de padrillos.

La técnica de ICSI consiste en seleccionar e inyectar un espermatozoide mediante un

micromanipulador en el citoplasma de un ovocito en MII, es decir necesita de un
ovocito maduro, que puede ser obtenido mediante punción folicular (in vivo) o post
mortem (ex vivo). Se puede utilizar semen fresco, refrigerado, congelado o liofilizado
(desecado). El procesamiento del semen consiste en colocar los espermatozoides en un
gradiente de percoll para disminuir el número de espermatozoides muertos, luego es
centrifugado y colocado en un medio de alta densidad (PVP). Este medio permite
disminuir la velocidad del movimiento de los espermatozoides, seleccionar uno, fijarlo
mediante la aguja del micromanipulador y aspirarlo desde la cola. El siguiente paso
consiste en inyectar el ovocito con el espermatozoide seleccionado. Luego el ovocito
inyectado puede ser cultivado in vitro o transferido directamente al oviducto de una
receptora previamente acondicionada.

TRANSFERENCIA INTRAOVIDUCTAL DE GAMETAS (GIFT)

Consiste en transferir quirúrgicamente al oviducto de una yegua receptora

sincronizada e inseminada, uno o más ovocitos de una donante. Los ovocitos pueden
ser obtenidos mediante punción folicular (in vivo) o post mortem (ex vivo) y
madurados in vitro.

Esta técnica presenta menos dificultades técnicas y mayores aplicaciones clínicas que
las descriptas anteriormente dado que en resumen solo necesita de la donante un
ovocito viable; y puede ser aplicada en casos de endometritis persistentes, fallas
ovulatorias, desgarros cervicales, o en algunos casos de infertilidad idiopática.

En ambos casos (ICSI y GIFT) es en general necesario realizar la aspiración folicular

guiada por ultrasonido (OPU). Actualmente los resultados de tasas de aspiración en
programas comerciales pueden ser en promedio de 50-70% /ciclo lo que claramente
justifica su aplicación comercial.

CLONACIÓN

Es una técnica que permite producir un individuo a partir de una célula somática
(embrionaria, fetal o adulta) y un ovocito en MII enucleado. Se obtiene un individuo
con la misma carga genética que otro/s, pero sujeto a variaciones epigenéticas,
ambientales y con el agregado del ADN mitocondrial del ovocito receptor, por lo que
estrictamente un clon animal no es exactamente igual a otro.

Hasta el momento hay entre 10 y 15 clones equinos nacidos reportados.

Fuente: (Losinno, 2007)

Discusión

La IA con baja dosis y TE han crecido sostenidamente instalándose como unas de las
herramientas biotecnológicas de alto impacto en sistema de producción de equinos de
alto valor genético, seguido de la Vitrificación de embriones que abrirá pasos a nuevos
escenarios ya que es una técnica accesible por su bajo costo y no necesita
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equipamientos sofisticados, en comparación con otras técnicas de mayor complejidad,
costo elevado y su baja eficiencia que describe el autor de este artículo.

POLIMORFISMO EN GENES DE INTERÉS

Las enfermedades se relacionan de una forma u otra con los genes. La información
codificada por ellos es tan crítica que el cambio en un sólo nucleótido (mutación
puntual) del ADN (Ácido Desoxirribonucleico), puede ser suficiente para desencadenar
enfermedades hereditarias, afectar la susceptibilidad a contraer enfermedades
infecciosas y la vulnerabilidad de los individuos a padecerlas crónicamente. Es por ello
que pequeñas variaciones en genes específicos de la respuesta inmune, podrían tener
un impacto importante en la patogénesis de una enfermedad y en las respuestas
posteriores a ésta, incluso bajo condiciones ambientales diferentes.
Las mutaciones que generan variaciones genéticas, alterando el riesgo de ocurrencia de
una enfermedad infecciosa, se conocen como genes de susceptibilidad/resistencia.
Dichos genes se manifiestan con mayor frecuencia en individuos emparentados e
influencian la edad de ocurrencia y/o la progresión de la enfermedad o ayudan a
proteger contra esta.

En potros se han observado variaciones individuales en la susceptibilidad genética a

desarrollar la enfermedad clínica, que han sido asociadas con el uso de microsatélites a
genes relacionados con la inmunidad como la Caspasa-I (Casp-I) y el receptor de la
interleucina-7 (IL-7R), que juegan un papel importante en la activación de citoquinas,
linfocitos T y de apoptosis. La Caspasa-I, es una proteasa de cisteína, que desempeña
un papel importante en los procesos inflamatorios y en apoptosis, siendo responsable
de la maduración de la pro-interleucina 1b y de la pro-interleucina 18 a sus formas
pro-inflamatorias y biológicamente activas; también actúa en la inactivación de
precursores de interleucina-1 (IL-1), interleucina-6 (IL-6) y en el factor de necrosis
tumoral α (TNF-α) para producir la activación de citoquinas.

La IL-1β está asociada a varias reacciones inmunes, incluyendo el reclutamiento de

células inflamatorias en el sitio de la infección, mientras que la IL-18 es importante
para la producción de interferón gamma (IFN-γ) y la amplificación de la actividad
citolítica de las células asesinas naturales. Estos procesos se requieren para la
eliminación de la infección por Rhodococcus equi debido a su naturaleza intracelular
dentro de los macrófagos.

El gen de Casp-I se encuentra localizado en el cromosoma equino (Equus caballus)

siete, tiene un tamaño de 1218 pares de bases (pb) y una longitud de 405 aminoácidos,
la cual cuenta con una similitud del 72% y del 68% con la del humano y la del ratón
respectivamente. El receptor de la interleucina-7 (IL-7R) es un heterodímero formado
por la cadena alfa (IL-7Rα) y por la cadena gamma común (γc). La señalización del
receptor de la IL-7 es esencial para la linfopoyesis de las células T y B, mediante la
promoción de la proliferación, diferenciación y supervivencia de estas células. Se
encuentra localizado en el cromosoma equino 21 y contiene 1377 pb.

Métodos

Los individuos incluidos en el estudio fueron revisados y manipulados en el lugar de

alojamiento de cada animal. Se tomaron muestras de sangre de la vena yugular,
haciendo punción con un Vacutainer™ 21 x 1,5’’ (BD Vacutainer, Plymouth, UK) para
extraer 3 ml de sangre venosa depositados en tubo con anticoagulante EDTA (Vacutest
Kima, Arzergrande, Italia). Las muestras fueron rotuladas y transportadas al
laboratorio Iagen S.A.S. (Municipio La Estrella, Antioquia). Se realizó aislamiento y
purificación del ADN, mediante el kit comercial DNeasy® Blood & Tissue (Qiagen,
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Hilden, Alemania), el cual se visualizó por electroforesis en gel de agarosa al 0,7% por
40 minutos a un voltaje de 75 mV para verificar su integridad y concentración. Para la
amplificación del ADN, se realizó la PCR utilizando todas las muestras procesadas,
empleando dos juegos de cebadores (primers) en sentido/antisentido previamente
descritos por Horín et al 2010, cuyas secuencias se detalla en la tabla 1. Los fragmentos
seleccionados para amplificación se tomaron de estudios previos donde los relacionan
con la susceptibilidad genética a infecciones por Rhodococcus equi.

La reacción de PCR tuvo un volumen final de 25 µl con 15 µl de buffer 10x (Thermo

Scientific, Waltham, Massachusetts, Estados Unidos), 0.2 µl de dNTP’s (Thermo
Scientific, Waltham, Massachusetts, Estados Unidos) a 10 µm, 1 µl de cada primer a 10
µm, 0.3 µl de la Taq polimerasa (Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, Estados
Unidos) y 1.2 µl de DNA. La PCR se realizó en un termociclador convencional
(PerkinElmer 9600, Shelton, Estados Unidos). El protocolo final fue definido
experimentalmente durante una prueba piloto, y consistió en una desnaturalización
inicial a 95 C° seguida de 35 ciclos a 94 C° por 30 segundos, temperatura de
hibridación 66 C° a 30 segundos y una extensión final a 72 C° por 5 minutos. Los viales
con 25 µl del producto de amplificación fueron corridos inmediatamente por
electroforesis de la siguiente manera: 8 µl de la reacción de PCR fueron mezclado con 2
µl de buffer de carga y sembrados en un gel de agarosa al 1,8% (Amresco, Solon, Ohio,
Estados Unidos) junto con 4 µl de marcador de peso molecular en escala 100 (3000-
100 GeneRulerTM DNA (Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, Estados Unidos).
Para el corrido electroforético se utilizó como fuente de iones 500 ml de TBE 1X
(Amresco, Solon, Ohio, Estados Unidos) a 100 voltios constante durante 35 minutos. Al
gel se le añadieron 2 gotas de bromuro de etidio (0.625 mg/ml) (Amresco, Solon, Ohio,
Estados Unidos) y los productos de amplificación fueron visualizados en un
transiluminador de luz ultravioleta. Los amplicones fueron almacenados a – 20 C°,
hasta su envío a secuenciar.

Las secuencias fueron obtenidas por la empresa Macrogen® utilizando un

secuenciador Illumina, quienes purificaron los amplicones obtenidos y realizaron la
secuenciación utilizando cada par de cebadores para procesar la región en los sentidos
5’- 3’ y 3’- 5’ y así incrementar la confiabilidad de los resultados. La calidad de las
secuencias se controló con el programa Sequence scanner realizando la verificación
con un valor de QV20+, incluyendo longitud mínima de la secuencia, y esta información
es la presentada en la secuencia consenso final. Las secuencias obtenidas se verificaron
contra las bases de datos disponibles en NCBI, utilizando el programa BLAST (Basic
Local Alignment Search Tool, para asegurar que el producto secuenciado
correspondiera a los genes de Casp-I e IL-7R equinos y elegir la secuencia para usar
como referencia durante el alineamiento. Se realizó un alineamiento de las secuencias
obtenidas utilizando el programa MUSCLE (Multiple Sequence Comparison by Log-
Expectation, con las secuencias de referencia elegidas, y se compararon las secuencias
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obtenidas con las secuencias de referencia utilizando el programa BLAST para
identificar variaciones con respecto a la secuencia de referencia del genoma equino
(EquCab2 GCA_000002305.1).

Resultados

Se secuenciaron 12 muestras en total, tanto para Casp-I como para IL-7R. A cada
muestra se le asignó un código de secuenciación los cuales se detallan en las tablas 2 y
3.

Análisis de los resultados de Casp-I

La longitud de la secuencia obtenida para el gen de Casp-I tras el alineamiento con

MUSCLE fue de 240 pb. Para su alineamiento se uso como referencia la secuencia de
Caspasa-I para Eqqus caballus (EF492868).

El análisis en BLAST presenta una similitud de las secuencias de Casp-I obtenidas con
la reportada con un valor de 79% con Eqqus caballus.

Después de alineado el fragmento obtenido para Casp-I se encuentran dos regiones de

saltos entre las posiciones 17-34 y 45-58, generados por la existencia de inserciones en
las secuencias 56 y 57 que correspondían a dos equinos.

El dendrograma realizado para la región de Casp-I (Ver figura 1), mostró que las
secuencias 52, 53, 54, 55, 58 y 59 son las que menos distancia genética tienen con la
secuencia EF492868, mientras que las secuencias 56 y 57 son las que más se alejan
debido a las inserciones que presentan. De acuerdo a lo anterior, la mayoría de las
muestras, excepto las 56 y 57, son afines a Equus caballus y estadísticamente la
agrupación tiene un 100% de soporte en los remuestreos realizados.
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Análisis de los resultados para IL-7R

Se analizaron ocho muestras consenso (1-3, 5-6, 8-10), descartando cuatro secuencias
(4,7,11 y 12) debido a la baja calidad de los cromatogramas y a la corta longitud de
lectura obtenida para estas secuencias tras el proceso de secuenciamiento realizado
por Macrogen®.

Tras la alineación con MUSCLE la longitud de la secuencia obtenida para IL-7R fue de
457 pb.

Para su alineamiento se uso como referencia la secuencia del gen del receptor de
interleucina 7 de Equus caballus (RNA mensajero - NM_001081942).

El análisis en BLAST, verifica que la similitud de las secuencias de IL-7R obtenidas

respecto a la secuencia de referencia es de 99%.

En la secuencia 8 se encontró el indicativo de la presencia de dos alelos en la posición

110. Así mismo, se encontraron polimorfismos de nucleótido simple en las posiciones
101(T, A), 110 (A, G), 125 (A, T), 311 (G, A), 370 (A, C) y en la 389 (G,A). Las muestras 6
y 9 presentaron todos los polimorfismos, y adicionalmente el polimorfismo encontrado
en la posición 110 se observó en 6 de las 8 muestras analizadas. El dendrograma
realizado para la región de IL-7R mostró que la secuencia 2 es la que menos distancia
genética tiene con la secuencia de referencia NM_001081942, mientras que las
secuencias 6 y 9 son las que más se alejan debido a la alta carga de polimorfismos que
presentan. De acuerdo a lo anterior, la mayoría de las secuencias, excepto las 6 y 9,
muestran una agrupación. Ver figura 2.
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26/04/2018

Fuente: (Ramírez, Valencia, & Peréz, 2015)

Discusión

La falta de identificación de la susceptibilidad genética que pueden presentar los

potros al organismo estudiado como el rhodococcus equi contribuye en un problema
para la selección de individuos, trayendo una alta mortalidad y pérdidas económicas
para el productor. El autor describe los polimorfismos en 12 equinos en genes Casp-I e
IL-7R (relacionados a infecciones por este microorganismo) a través de la reacción de
cadena de polimerasa y análisis de secuencia a 12 potros. Se identificó inserciones en el
gen Casp-I y 6 polimorfismos de nucleótido simple en el gen de IL-R7. En un estudio
realizado por Horín también se encontró asociación significativa entre los dos genes
(IL-7R) y (Casp-I) con la infección por Rhodococcusequi en potros, información útil a la
hora de enfrentar la problemática de salud animal.

CONCLUSIÓN

El genoma equino (Equss caballus) guarda estrecha relación con la estructura

genómica en notables similitudes con los humanos y más de un millón de diferencias
genéticas en una variedad de razas de caballos. Los caballos y los humanos padecen
enfermedades similares, por lo que la identificación de los culpables genéticos en los
caballos promete profundizar nuestro conocimiento de la enfermedad en ambos
organismos.

Los métodos de mejora animal se basan en la selección de individuos que transmitan

unos caracteres productivos muy concretos, lo que a medio o largo plazo, implica un
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aumento de la consanguinidad y, por lo tanto, una mayor homogeneidad genética de la
raza. Este fenómeno dificulta cada vez más la identificación de los individuos y el
control de su genealogía, por lo que se hace necesario definir nuevos marcadores que
detecten las cada vez menores variaciones entre los ejemplares de una misma familia,
ganadería o grupo racial.

El crecimiento de las biotecnología en los sistemas de producción de caballos en el

mundo en general ha sido exponencial dado que en este periodo la mayoría de las
asociaciones de criadores de caballos de razas puras ha aceptado es uso de estas. Las
técnicas de reproducción asistida de mayor complejidad como ICSI, GIFT y clonación se
posicionan por debajo de la elección de los productores por su baja eficiencia y alto
costo a diferencia de otras técnicas como la IA, TE y vitrificación de embriones.

La realización de más estudios acerca de asociaciones genéticas con una mayor

población podría ayudar con más certeza para establecer la prevalencia de
polimorfismos en la población y verificar la información de asociación de
polimorfismos que se encuentra en presencia de determinada enfermedad.

BIBLIOGRAFÍA

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