LA BIBLIA

BIOQUÍMICA 1
REALIZADA POR:

DENISSE ALEJANDRA MORALES TOVAR

OSCAR MARTIN ARROYO LOMAS

 ÍNDICE

Unidad 1 ………………………………………………………………………………………..…. 4

Unidad 2 …………………………………………………………………………………….…… 28

Unidad 3 ……………………………………………………………………………………..….. 68

Unidad 4 ……………………………………………………………………………………...….. 94

Unidad 5 ……………………………………………………………………………………...… 104

Unidad 6 ………………………………………………………………………………………... 125

Unidad 7 ………………………………………………………………………………….…….. 137

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3
 Unidad 1

AGUA Y MINERALES

El agua constituye el principal producto final del metabolismo oxidativo de los alimentos,
sirve como reactante y como producto en muchas reacciones metabólicas.

La homeostasia, es el mantenimiento de la composición del ambiente interno que es

esencial para la salud, incluye considerar la distribución del agua en el cuerpo así como el
mantenimiento de un PH y concentraciones de electrolitos adecuados.

1-ESTRUCTURA MOLECULAR DEL AGUA

 El agua es una molécula tetraédrica ligeramente asimétrica.

 El agua constituye el 60% del organismo y es el solvente universal.
 Su estructura tridimencional es un tetrahedro irregular con el oxigeno en el centro.

La molécula de agua está formada por dos átomos de H unidos a un átomo de O por
medio de dos enlaces covalentes. La disposición tetraédrica de los orbitales sp3 del
oxígeno determina un ángulo entre los enlaces H-O-H. Aproximadamente de 104'5,
además el oxígeno es más electronegativo que el hidrógeno y atrae con más fuerza a los
electrones de cada enlace.

El resultado es que la molécula de agua aunque tiene una carga total neutra (igual
número de protones que de electrones), presenta una distribución asimétrica de sus
electrones, lo que la convierte en una molécula polar, alrededor del oxígeno se concentra
una densidad de carga negativa , mientras que los núcleos de hidrógeno quedan
desnudos, desprovistos parcialmente de sus electrones y manifiestan, por tanto, una
densidad de carga positiva.
Así se establecen interacciones dipolo-dipolo entre las propias moléculas de agua,
formándose enlaces o puentes de hidrógeno, la carga parcial negativa del oxígeno de una
molécula ejerce atracción electrostática sobre las cargas parciales positivas de los átomos
de hidrógeno de otras moléculas adyacentes.

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 PUENTES DE HIDROGENO

Es una interacción electrostática entre un hidrogeno de un dipolo hídrico y el par

de electrones no compartidos de otro
dipolo hídrico.

A. Como se ve en este modelo, el

modelo orbital, desde el núcleo de
oxígeno de una molécula de agua se
ramifican cuatro orbitales constituyendo
un tetraedro hipotético. Dos de los
orbitales están formados por los
electrones compartidos que enlazan los
átomos de hidrógeno al átomo de
oxígeno. Debido a la fuerte atracción que
ejerce el núcleo del oxígeno hacia los
electrones, los electrones que intervienen
en los enlaces covalentes pasan más
tiempo alrededor del núcleo de oxígeno
que el que pasan alrededor de los
núcleos de hidrógeno. En consecuencia,
la región que se encuentra cerca de cada
núcleo de hidrógeno es una zona
débilmente positiva. Además, el átomo de
oxígeno tiene cuatro electrones
adicionales en su nivel energético
exterior. Estos electrones, que no están
implicados en el enlace covalente con el
hidrógeno, están apareados en dos
orbitales. Cada uno de estos orbitales es
una zona débilmente negativa. Así, la
molécula de agua, desde el punto de vista
de la polaridad, tiene cuatro "vértices",
dos "vértices'' cargados positivamente y
otros dos cargados negativamente.
B. Como resultado de estas zonas
positivas y negativas, cada molécula de
agua puede formar puentes de hidrógeno (representadas por líneas de puntos)
con otras cuatro moléculas de agua. En condiciones normales de presión y
temperatura, los puentes de hidrógeno se rompen y vuelven a formarse
continuamente, siguiendo un patrón variable. Por esa causa, el agua es un líquido.

Estos enlaces, en los que se une un átomo de hidrógeno con carga positiva débil que
forma parte de una molécula, con un átomo de oxígeno que posee carga negativa débil y
que pertenece a otra molécula, se conocen como puentes de hidrógeno . Cada molécula
de agua puede formar puentes de hidrógeno con otras cuatro moléculas de agua. Aunque

5
los enlaces individuales son débiles y se rompen continuamente, la fuerza total de los
enlaces que mantienen a las moléculas juntas es muy grande.

Los puentes de hidrógeno son los responsables de las propiedades características del
agua; entre ellas, de la gran cohesión, o atracción mutua, de sus moléculas. La cohesión
trae como consecuencia la alta tensión superficial que permite.

La enorme cantidad de puentes de hidrógeno que presenta el agua también es

responsable de su resistencia a los cambios de temperatura. El agua tiene un alto calor
específico -o capacidad calorífica- un alto calor de vaporización y un alto calor de fusión .
La acción capilar -o capilaridad- y la imbibición son también fenómenos relacionados con
las uniones entre moléculas de agua. La imbibición, es la absorción o penetración capilar
de moléculas de agua en sustancias tales como la madera o la gelatina que, como
resultado de ello, se hinchan. Las presiones desarrolladas por imbibición pueden ser
sorprendentemente grandes.

El agua la podemos encontrar en tres estados:

Sólido Líquido Gas

Adopta la forma del

Forma y volumen propio. recipiente que los contiene. Sin forma ni
Incompresible. Volumen propio volumen propio.
Difusión extremadamente incompresible. Compresibles.
lenta de las partículas. Difusión lenta de las Se expanden.
partículas

PROPIEDADES DEL AGUA

El papel primordial del agua en el metabolismo de los seres vivos se debe sus
propiedades físicas y químicas, derivadas de la estructura molecular.

Propiedades físicoquímicas

1. Acción disolvente
2. Elevada fuerza de cohesión
3. Elevada fuerza de adhesión
4. Gran calor específico
5. Elevado calor de vaporización
6. Liquido inodoro, incoloro e insaboro.
7. Densidad máxima 4°C a 100°C se produce su ebullición.

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 8. Se descompone por encima de los 1000°C
9. Se solidifica a 0°C en forma de hielo.

CONTENIDO Y DISTRIBUCION DEL AGUA CORPORAL

Nuestro cuerpo está constituido por múltiples sustancias (agua, grasa, hueso,
músculo, etc.) pero, de todas ellas, el agua es el componente mayoritario. El agua
constituye más de la mitad (50-65%) del peso del cuerpo y en su mayor parte (80%) se
encuentra en los tejidos metabólicamente activos. Por tanto, su cantidad depende de la
composición corporal y, en consecuencia, de la edad y del sexo: disminuye con la edad y
es menor en las mujeres.

CONTENIDO DE AGUA CORPORAL (% del peso corporal total)

 Recien nacido 80%

 Hombre normal 60%
 Mujer normal 55%
 Hombre obeso 55%
 Mujer obesa 50%
 Ancianos 50%

Compartimientos de Agua/ Distribución de Líquidos en el Cuerpo

 Intracelular: El agua intracelular es aquella que se encuentra dentro de la célula.

Hombre 45%
Mujer 40%

 Extracelular: Es el agua que se encuentra fuera de la membrana celular.

Hombre 15%
Mujer 15%

 Intravascular Hombre 5%
Mujer 5%

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  Intersticial Hombre 10%
Mujer 10%

3-EQUILIBRIO HÍDRICO

El equilibrio hídrico es la relación entra el aporte y la eliminación corporal del agua

bajo condiciones normales.

REGULACIÓN DEL EQUILIBRIO HÍDRICO (AGUA)

Hay un equilibrio hídrico en el organismos, si se conserva un balance entre el ingreso y la

excreción, siempre que haya libre aporte de agua. Dicho balance lo controla las
sensaciones de sed y los riñones. Por ejemplo, cuando aumentan las pérdidas de agua
por sudoración excesiva o diarreas, la saliva de la boca absorbe agua, dejando una
sensación de sequedad en la boca, lo cual estimula la ingestión de agua. Además, los
riñones conservan el agua secretando menos orina; este mecanismo renal es regulado
por la hormona vasopresina o antidiurética (ADH) que estimula la resorción de agua en
los túbulos renales.

RELACIÓN ENTRE EL APORTE Y LA ELIMINACION DEL AGUA.

Las fuentes de ingreso del agua al cuerpo y las vías de su eliminación se discutirá a
continuación:

Ingreso - Fuentes de Agua para el Cuerpo

 El agua en líquidos: como la leche, las sopas y las bebidas.

 El agua misma: Esta debería compensar cualquier diferencia entre la absorción y la
eliminación.
 El agua en forma de alimentos sólidos: Hortalizas y fruta, por ejemplo, tienen un
alto contenido de agua.
 El agua producida durante el metabolismo: Al quemar u oxidar en las células los
hidratos de carbono, grasas y proteínas.

Excreción - Vías para Perder Agua Normalmente

 Por la piel: En forma de transpiración (sudoración) sensible (que se puede ver el

sudor) y pérdida insensible (o invisible).
 A través de los pulmones: en forma de vapor de agua en el aire expirado.
 Por medio de los riñones: en forma de orina.
 Por los intestinos: en las heces fecales.

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 EFECTOS DE LA DEFICIENCIA Y EXCESO DE AGUA EN EL CUERPO

 Deficiencia

La deficiencia de agua puede ser causado por muchas razones, tales como vomitar en
exceso, diarrea o sudoración excesiva. Ésta última causa es la más comun y ocurre
frecuentemente al llevar a cabo actividades físicas vigorosas cuando la temperatura
ambiental esta alta. El efecto principal es la deshidratación (pérdida de los líquidos del
cuerpo). Alrededor de un cuarto de líquido se pierde por cada dos libras de peso que se
rebaje.

 Exceso

Si de alguna forma el agua que se ingiera en el cuerpo no se puede eliminar (como en el

caso de algunos individuos que padecen de hipertensión), los siguientes efectos pueden
ocurrir:

 Aumenta el volumen de sangre en el cuerpo.

 Aumenta la presión arterial.
 Se experimentan dolores de cabeza.
 Aparecen áreas en el cuerpo con edema (acumulación de líquidos en los tejidos
corporales).

ELECTROLITOS.

Los electrolitos son la forma iónica de un metal que se encuentra en solución acuosa, y
son sustancias que tienen la capacidad de conducir la corriente eléctrica. En los
organismos vivos se encuentran los electrolitos en un balance llamado electrolítico. Los
electrolitos tienen un gran uso en medicina. Es una solución o sustancia disuelta que
consta de varios químicos que pueden llevar cargas eléctricas. Los electrolitos están
presentes en la sangre como ácidos, bases y sales (como sodio, calcio, potasio, cloro,
magnesio y bicarbonato) y se pueden medir mediante estudios de laboratorio en suero.

4- VALORES NORMALES DE ELECTROLITOS EN LOS LIQUIDOS CORPORALES

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Osmosis: El agua se mueve de un lugar a otro por ósmosis a causa de una diferencia de
potencial osmótico. Este es un fenómeno natural en el cual el agua pasa a través de una
membrana semi-permeable, desde una solución menos concentrada a una solución más
concentrada. Hay dos mecanismos involucrados en el movimiento del agua y de los
solutos: el flujo global y la difusión. En los sistemas vivos, el flujo global mueve agua y
solutos de una parte de un organismo multicelular a otra, mientras que la difusión mueve
moléculas e iones hacia dentro, hacia fuera y a través de la célula. Un caso particular de
difusión, el del agua a través de una membrana que separa soluciones de diferente
concentración, se conoce como ósmosis.

Presión Osmótica: presión que se desarrolla en una solución salina, dependiente de la

diferencia de concentración de iones presentes a ambos lados de la membrana, es el
fenómeno resultante de la diferencia de la concentración de sales a través de una
membrana semi-permeable. Esta presión osmótica debe ser compensada antes de poder
producir permeado en el sistema.

EFECTO DE LAS SOLUCIONES ISOTONICAS, HIPERTONICAS E HIPOTONICAS.

Homeostasis y el equilibrio hídrico

Existe equilibrio hídrico o equilibrio respecto al agua, cuando las soluciones

citoplasmáticas y los fluidos extracelulares que rodean las células son soluciones
isotónicas, es decir, tienen la misma concentración.El desequilibrio hídrico provoca sed.Es
importante el equilibrio hídrico para el mantenimiento de la presión arterial normal, para el
funcionamiento del corazón y el equilibrio total del organismo.

SOLUCIONES ISOTÓNICAS. Tiene concentración similar a la del plasma. En esta la

célula no sufre modificaciones. En estas soluciones las moléculas de agua se mueven
hacia adentro y hacia afuera de la célula por la igualdad de concentración en ambos lados
de la membrana celular.

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SOLUCIONES HIPERTONICAS. La célula se contrae ó deshidrata por que su entorno es
mayor en cuanto a sales, por lo que la célula tratara de mantener el equilibrio; sacando
agua para poder disminuir la concentración extracelular. El agua se sale de la célula por
ósmosis y la célula se encoge.

SOLUCIÓN HIPOTÓNICA: Deja pasar agua para disminuir la concentración interna de la

célula. La célula se hincha ó expande por que el agua entra en la célula por ósmosis.

5- ANÁLISIS DEL EQUILIBRIO HIDROELECTROLITICO EN LA DESHIDRATACIÓN

ISOTÓNICA, HIPERTÓNICA E ISOTÓNICA

DESHIDRATACIÓN: Es la perdida excesiva de agua en el organismo, acarrea

eventualmente deficiencia de sal. El peligro de la deshidratación reside en la eventual
formación de acidosis y la acumulación de productos de desecho en el organismo. Las

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pérdidas ó contracciones de volumen (mal llamadas deshidratación) pueden ser de tres
tipos:

a) Contracción Isotónica: Ocurre cuando se pierden electrolitos y agua extracelular

en proporciones iguales, como por el tracto gastrointestinal, en donde además si la
pérdida es de liquido ácido por el estómago, esta pérdida puede conducir a
alcalosis metabólica; la pérdida de bilis, liquido pancreático y liquido por diarrea, a
una alcalosis metabólica.
b) Contracción Hipertónica: Ocurre cuando existen pérdida de agua superiores a la
de Na, como en la insolación, adipsia prolongada, diabetes, sudoración excesiva y
en la diuresis osmótica; por la tanto, la pérdida externa de sodio y agua disminuye
el volumen extracelular y en compensación, se redistribuye de intra a extracelular.
c) Contracción Hipotónica: Se produce cuando la pérdida de Na es superior a la de
agua, como en la insuficiencia renal crónica o en la insuficiencia
corticosuprarrenal, y el tratamiento consistirá en reponer el sodio perdido en
solución salina al 0.9%, solución de Ringer o si además existe acidosis con
Hartman o en caso de desnutrición asociada, Ringer glucosa como aporte calórico.

6- PRINCIPALES MACROMINERALES

Los minerales, junto con el agua, son los componentes inorgánicos de la alimentación, es
decir, aquellos que se encuentran en la naturaleza sin formar parte de los seres vivos.
Son necesarios para la elaboración de los tejidos y para sintetizar las hormonas.
Colaboran en la mayor parte de las reacciones químicas en las que intervienen las
enzimas. Intervienen en la transmisión del impulso nervioso a los músculos y actúan como
reguladores del balance hídrico del organismo, entre otras muchas funciones. Se puede
decir que los minerales intervienen en todas las fases del funcionamiento del cuerpo
humano. Los minerales se pueden dividir en tres grupos: macrominerales (se miden en
gramos y son: sodio, potasio, calcio, fósforo, magnesio y cloro), microeminerales (se
miden en miligramos y son: cromo, cobalto, cobre, yodo, hierro, magnesio, molibdeno,
selenio y zinc).

SODIO.- Es un mineral que se encuentra en el organismo en forma iónica, en su

mayor parte en el líquido extracelular. También hay una pequeña parte en el interior de la
célula y el resto unido a los componentes inorgánicos del hueso. Junto con el potasio y el
cloro, el sodio es uno de los electrolitos mas abundantes en el organismo. Regula el
balance hídrico del organismo e interviene en la transmisión del impulso nervioso a los
músculos (bomba de sodio) Se encuentra principalmente en la sal, pero esta presente en
muchos alimentos como las aceitunas, las conservas, los embutidos, los quesos, el
jamón, los pescados, etc. El consumo excesivo de sal se ha relacionado con el desarrollo
de la hipertensión. Su déficit produce calambres, normalmente relacionados con la
pérdida de sodio por el sudor, por diarrea, por vómitos o por tomar diuréticos. La Cantidad
Diaria Recomendada (C.D.R.) es de 0,5 gramos para un adulto en caso de actividad física
moderada. Si la persona trabaja en ambientes muy calurosos y suda mucho debe
incrementar esta cantidad recomendada.

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 POTASIO.- El potasio es un mineral que se encuentra en el organismo en forma
iónica y, junto con el sodio y el cloro, son los electrolitos mas abundantes en el organismo.
El 97% del potasio se encuentra intracelularmente y el 3% restante en forma extracelular.
Actúa como regulador del balance hídrico del organismo y participa en la contracción del
músculo cardiaco. Esta relacionado con el equilibrio ácido base. Aproximadamente el 90%
del potasio ingerido es absorbido en el intestino delgado y se elimina a través de la orina.
Se encuentra principalmente en la fruta, en la verdura fresca y en las patatas y, en
menores cantidades, en las legumbres y en los frutos secos. Su déficit se puede producir
como consecuencia de efectuar dietas muy estrictas en calorías, de vómitos, de diarreas,
de una transpiración excesiva, del uso indiscriminado de diuréticos y como consecuencia
de quemaduras. Se manifiesta con debilidad muscular, nauseas, vómitos e irritabilidad.
Por el contrario, la poca ingestión de líquidos o un fallo renal, puede producir excesos de
potasio en la sangre. La Cantidad Diaria Recomendada (C.D.R.) es de 500 miligramos. El
consumo excesivo de café, té, alcohol y azúcar aumenta su pérdida a través de la orina.

CALCIO.- El calcio es el mineral mas abundante del cuerpo humano,

representando del 1,5% al 2% del peso corporal y el cuarto componente del cuerpo
después del agua, de las proteínas y de las grasas. Se encuentra en los huesos, en los
dientes, en la sangre, en los líquidos intersticiales y en las células. El calcio de los huesos
y de los dientes desempeña una función plástica y de sostén, y el calcio plasmático una
función reguladora: participa en la coagulación, en la permeabilidad de las membranas,
como regulador nervioso y neuromuscular, favoreciendo la absorción y la secreción
intestinal y la liberación de hormonas. El calcio esta vinculado también al fósforo, ya que
la falta o exceso de uno de ellos puede afectar a la absorción del otro. Las fuentes de
calcio mas importantes son la leche y los productos lácteos, pero también son ricos en
este metal la mayoría de los vegetales y las aguas duras. La falta de calcio en la dieta
provoca retraso del crecimiento y deformaciones óseas. También se manifiesta con una
osteoporosis que produce debilidad de los huesos y fracturas frecuentes. La Cantidad
Diaria Recomendada (C.D.R.) es de unos 800 miligramos para el adulto y de unos 1500
miligramos en el embarazo, en la lactancia y en la vejez.

FÓSFORO.- Es el elemento químico que interviene en la mineralización de los

huesos y de los dientes. Interviene en la transmisión de los impulsos nerviosos, en la
contracción muscular y en el metabolismo de los azucares, las grasas y las proteínas. Es
necesario también para la formación de los huesos y de los dientes, así como del tejido
muscular. La mayor parte del fósforo del cuerpo se encuentra unida al calcio. Se
encuentra en mayor cantidad en el queso, en la yema de huevo, en los frutos secos, en
las legumbres y en algunos pescados. Esta presente, en los organismos de los seres
vivos, en forma de sales minerales llamadas fosfatos. La Cantidad Diaria Recomendada
(C.D.R.) es similar a la del calcio, es decir, unos 800 miligramos para el adulto y unos
1500 miligramos en el embarazo, en la lactancia y en la vejez.

CLORO.- El cloro es un mineral que se encuentra en el organismo en forma iónica

y, junto con el sodio y el potasio, son los electrolitos mas abundantes en el organismo.
Favorece el equilibrio ácido-base y ayuda al hígado en su labor de desintoxicación.

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Interviene en la regulación del balance hídrico del organismo. Cualquier dieta mixta cubre
las necesidades de cloro ya que se encuentra en muchos alimentos como en la sal
común, en las algas, en las aceitunas y en el agua que bebemos entre otros. La Cantidad
Diaria Recomendada (C.D.R.) no esta determinada todavía.

MAGNESIO.- El magnesio es el quinto mineral por su abundancia en el organismo

y es imprescindible para la correcta asimilación del calcio y de la vitamina C. Es necesario
para activar numerosas enzimas y las vitaminas del grupo B. Interviene en la síntesis de
las proteínas, en la excitabilidad de los músculos y en la liberación de energía. Equilibra el
sistema nervioso central (acción sedante) Aumenta la secreción de la bilis e interviene en
la secreción y en la acción de la insulina. Se encuentra en el cacao, en la soja, en los
frutos secos, en la avena, en el maíz y en algunas verduras. La carencia de magnesio es
muy común, sobre todo en ancianos y en las mujeres durante el periodo menstrual.
También contribuyen a ello la cirugía, los diuréticos, el alcohol, las enfermedades renales,
etc. La Cantidad Diaria Recomendada (C.D.R.) es de 300-400 miligramos.

7- PRINCIPALES MICROMINERALES

CROMO.- Mineral que aparece en el organismo en cantidades muy pequeñas.

Participa en el transporte de proteínas e interviene en el metabolismo del azúcar,
mejorando la diabetes. Se encuentra en las carnes, en los aceites vegetales, en la
levadura de cerveza, en la cebolla, en la lechuga, en las patatas, en los berros y en los
cereales integrales. Su déficit se produce, generalmente, por desnutrición o estrés y
produce una menor tolerancia a la glucosa, neuropatía periférica, balance de hidrógeno
negativo y adelgazamiento. Es muy raro que aparezcan intoxicaciones por cromo, ya que
su presencia en los alimentos es muy reducida. La Cantidad Diaria Recomendada
(C.D.R.) es de 200 a 400 microgramos.

COBALTO.- El cobalto es un mineral que contribuye a la formación de los glóbulos

rojos ya que constituye el núcleo metálico de la vitamina B12 necesaria en la
eritropoyesis. Cualquier dieta mixta cubre las necesidades de cobalto, ya que se
encuentra en las carnes, en los pescados , en los productos lácteos, en las lentejas, en
las cebollas, en los higos, etc. Su déficit se relaciona con la carencia de vitamina B12 y
produce anemia, problemas neurológicos y falta de crecimiento. La Cantidad Diaria
Recomendada (C.D.R.) no está todavía determinada.

COBRE.- Es un mineral presente en el organismo en el plasma, unido a la

globulina Ceruloplasmina. El cobre es necesario para convertir el hierro almacenado en el
organismo en hemoglobina y para asimilar correctamente el hierro de los alimentos.
Participa en la asimilación de la vitamina C y forma parte de las oxigenasas, enzimas
encargadas de transformar el oxígeno molecular en agua y peróxido de hidrógeno. Es
fundamental para el desarrollo de huesos, tendones, tejido conectivo y sistema vascular.
Se encuentra en el cacao, en los cereales integrales, en las legumbres, en los frutos

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secos, en las carnes, en las frutas, en los vegetales y en la pimienta. El déficit de cobre es
poco frecuente y puede producir anemia, desmineralización ósea, anorexia y facilidad
para las infecciones, entre otras. En niños alimentados exclusivamente con leche se
pueden dar casos de anemia que responden al tratamiento con cobre. Hay una
enfermedad genética, la enfermedad de Wilson, que se caracteriza por un aumento de los
depósitos de cobre en el hígado y en el cerebro. En intoxicaciones aparecen síntomas
hemolíticos y lesiones cerebrales y hepáticas. La Cantidad Diaria Recomendada (C.D.R.)
es de 1,3-1,5 miligramos.

YODO.- Es un mineral imprescindible para la producción de hormonas tiroideas.

También interviene en el crecimiento mental y físico, en el funcionamiento de los tejidos
nerviosos y musculares y en el metabolismo de otros nutrientes. Esta presente, en mayor
cantidad, en los pescados y en los mariscos, en la sal marina, en las algas y en los
vegetales cultivados en tierras que sean ricas en yodo. El déficit de yodo da lugar al bocio,
en el que la glándula tiroides aumenta de tamaño. Una forma de prevenir la posible
carencia de yodo es añadírselo a la sal de las comidas (en el comercio se vende como sal
yodada) La Cantidad Diaria Recomendada (C.D.R.) es de 120 a 150 microgramos.

HIERRO.- El hierro es un componente inorgánico de la alimentación que

desempeña un papel importante en el organismo. Este mineral es necesario para la
producción de hemoglobina y de glóbulos rojos y forma parte de algunas enzimas que
intervienen en el metabolismo celular. Los alimentos mas ricos en hierro son: la carne, el
hígado, los mejillones, los huevos, las legumbres, los frutos secos y los cereales. Para
mejorar la absorción del hierro, es bueno consumir al tiempo alimentos que contengan
vitamina C. Por el contrario, hay otros que son inhibidores de su absorción, como lo son el
café, el te, la clara de huevo y el salvado de trigo. Su déficit provoca la anemia
ferropénica, una mala síntesis de las proteínas, deficiencia inmunitaria, menor respuesta
al estrés y alteraciones de la conducta. La Cantidad Diaria Recomendada (C.D.R.) es de
10 a 15 miligramos, aunque estas cantidades dependen de la edad y de las necesidades
de cada etapa de la vida, siendo necesario un mayor aporte durante el embarazo y la
lactancia, pudiendo llegar hasta los 40 mg./día.

MANGANESO.- El manganeso es un mineral que se encuentra en el organismo

participando en la asimilación de las vitaminas C, B1 y H. Esta relacionado con la
formación de los huesos, con el desarrollo de los tejidos y con la coagulación de la
sangre. También activa los enzimas que intervienen en la síntesis de las grasas. Se
encuentra en el pescado, en los cereales integrales, en las legumbres, en la yema de
huevo y en las verduras de hojas verdes. Su déficit puede provocar crecimiento lento de
las uñas y del cabello, mala formación de los huesos y disminución de la tolerancia a la
glucosa. La Cantidad Diaria Recomendada (C.D.R.) es de 2-9 miligramos.

MOLIBDENO.- Es un mineral que ayuda a prevenir la anemia y la caries. El

molibdeno es un componente esencial de una coenzima denominada pterina, necesaria
para la actividad de otras enzimas muy importantes para el organismo, como son: sulfito
oxidasa, aldehido oxidasa y xantina oxidasa. Se encuentra en el germen de trigo, en las

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legumbres, en los cereales integrales y en los vegetales de hoja verde oscura. La
Cantidad Diaria Recomendada (C.D.R.) es de 250 microgramos.

SELENIO.- El selenio es un mineral presente en el organismo en pequeñísimas

cantidades. Tiene propiedades desintoxicantes. Es un potente antioxidante (evita la
oxidación de los ácidos grasos poliinsaturados en las membranas celulares) por lo que
ayuda a prevenir el envejecimiento de los tejidos. Por el mismo motivo, se le asocia a la
prevención de ciertos tipos de cáncer. Protege de enfermedades cardiovasculares y
estimula el sistema inmunológico. Se encuentra en el germen y en el salvado de trigo, en
las cebollas, en el ajo, en el tomate, en el brécol y en la levadura de cerveza. La Cantidad
Diaria Recomendada (C.D.R.) es de 55-70 microgramos.

ZINC.- El zinc es un mineral presente en el organismo formando parte del hueso y

de numerosas enzimas, entre ellas, la anhidarasa carbónica, la carboxipeptidasa y las
deshidrogenasas. Interviene en procesos metabólicos como la producción de linfocitos, la
síntesis de proteínas y la formación de insulina. Se encuentra en los crustáceos, en la
levadura de cerveza, en el germen de trigo, en las carnes, en los huevos, en los quesos y
en las legumbres secas. Su déficit produce un retraso del crecimiento y un retraso del
desarrollo de los órganos genitales. También puede producir anemia, retraso en la
cicatrización de las heridas y pérdida del apetito. La Cantidad Diaria Recomendada
(C.D.R.) es de 12-15 miligramos, aumentando en mujeres embarazadas y en lactantes.
Los niveles de zinc en el organismo se suelen ver disminuidos por el consumo de tabaco,
de café y de alcohol en exceso.

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8- DISOCIACIÓN DEL AGUA. CONCEPTO DE PH

El agua tiene una ligera capacidad de ionizarse. Toda vez que el agua puede actuar como
ácido o como base, su ionización puede representarse como una transferencia de
protones para formar un ion hidronio (H3O+) y u ión hidroxilo (OH-):

H2O + H2O H3O+ + OH-

En tanto que los iones se recombinan constantemente para formar moléculas de agua y
viceversa, no es posible definir el momento en que un hidrógeno o u oxígeno individual
presentan como iones o como moléculas de agua.. Sin embargo no es necesario tomar en
consideración los iones o las moléculas individuales. Dado que un gramo de agua tiene
3.46 x 1022 moléculas, es posible describir estadísticamente la ionización del agua.

La probabilidad de que un átomo de hidrógeno, exista en el agua pura como ion

hidrógeno es de aproximadamente 1.8 x 10 -9; sin embargo aunque esta cantidad sea muy
pequeña, la característica del agua de presentar estos iones es muy importante para las
propiedades del agua.

La fórmula para la disociación del agua:

𝐻 𝑂𝐻
𝑘=
𝐻2 𝑂

Los términos entre corchetes representan las concentraciones molares de los iones
hidrógeno, iones hidroxilo y las moléculas sin disociar del agua, mientras que K es el
termino correspondiente a la constante de disociación. Como 1 mol de agua pesa 18gr, un
litro de agua tiene 1000 / 18 = 55.56 mol. La concentración molar de iones H ( o de iones
OH) en el agua se calcula de multiplicar la probabilidad por la concentración molar del
agua, y el resultado es 1 x 10-7 mol/l, y así se calcula la K del agua:

10−7 10−7
𝐾= = 1.8 × 10−16
55.56

20
Como la disociación no afecta de manera significativa la gran concentración de agua
molecular, es conveniente considerarla básicamente como constante.. Esta constante
puede incorporarse a la K, para obtener una nueva constante denominada Kw o el
producto iónico del agua:

Kw = [H] [OH] = 1 x 10-14

El término pH fue introducido por Sorensen, quién lo definió como el logaritmo negativo de
la concentración del ión hidrógeno.

pH = - log [H]

La escala de pH es el número que determina la concentración de iones hidrógeno en una

solución, siendo éste el número del logaritmo decimal del reciproco de la concentración de
iones hidrógeno. La escala va de 0 a 14. Siendo el pH de las llamadas soluciones ácidas
de 1, 2, 3, 4 ,5 ,6 y el pH de las soluciones alcalinas de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, mientras
una solución neutra vale 7. Mientras más alto es el valor del pH, la solución es más
alcalina y mientras menor es el pH será una solución más ácida.

Escala de pH
• pH • [H+] en Eq/l
1.0 0.1
2.0 0.01
3.0 0.001
4.0 0.0001
5.0 0.00001
6.0 0.000001
7.0 0.0000001
7.4 0.000000040
8.0 0.000000010
9.0 0.000000001

21
 9- COMPORTAMIENTO DE ÁCIDOS Y BASES DÉBILES, ECUACIÓN DE
HENDERSON-HASSELBACH, COMPORTAMIENTO DE LOS AMORTIGUADORES DE
PH

Las definiciones más generales de ácidos y bases son las siguientes:

Para Lewis, un ácido es un aceptor de pares electrónicos potencial; mientras que una
base es una sustancia que puede actuar como dadora de pares electrónicos.
También está el concepto de Bronsted y Lowry, el cual dice que un ácido es una
sustancia dador de protones y una base es una sustancia aceptor de protones.
Una reacción ácido-básica comprende siempre un par ácido-básico conjugado, constituido
por un dador de protones y un aceptor. Cada base conjugada tiene una afinidad
característica para su protón; los que tienen una afinidad elevada por el protón son ácidos
débiles y sólo se disocian ligeramente; los que muestran una afinidad pequeña son ácidos
fuertes y pierden iones H con facilidad.

La tendencia de cualquier ácido a disociarse viene de su constante de disociación.

𝐻 + 𝐴−
𝐾=
𝐻𝐴
La interrelación puede establecerse de modo convencional con la ecuación de
Henderson-Hasselbach:

𝑙𝑜𝑔 𝐴−
𝑝𝐻 = 𝑝𝐾 +
𝐻𝐴

Donde:

[A-] = forma base del amortiguador (meq/L)

[HA] = forma ácida del amortiguador (meq/L)

El pK de un grupo ácido corresponde al pH al cual las variantes protonada y no protonada

se presentan con iguales concentraciones.

La ecuación de Henderson-Hasselbach como ya se dijo describe el comportamiento de

ácidos débiles y también de amortiguadores

22
 Amortiguación

Principios de amortiguación-Amortiguador es una mezcla de un ácido débil con su base

conjugada (o viceversa).

 -Una solución amortiguada resiste cambios de pH drásticos.

 -Los líquidos del cuerpo contienen gran variedad de amortiguadores que
representan una primera defensa importante contra los cambios de pH.

El amortiguamiento produce la liberación y captación de electrones.

Los mecanismos homeostáticos que conservan el pH celular incluyen amortiguadores

fisiológicos.

Las soluciones de ácidos y bases débiles y sus bases conjugadas amortiguan con mayor
eficiencia en el intervalo de pH equivalente a la pK +- 2 unidades de pH.

23
10- PH DE LOS LÍQUIDOS INTRA Y EXTRACELULARES

PH DE ALGUNOS LÍQUIDOS CORPORALES

 Sangre 7.4

 Líquido intersticial 7.4

 Osteoblastos 8
 Hepatocito 6.9
 Cél. Muscular 6.1
 Cél. Prostática 4
 Jugo gástrico 1.2-3
 Jugo pancreático 7.8-8
 Saliva 6.4-6.9

11-PRINCIPALES SISTEMAS AMORTIGUADORES DEL PH EN LOS LÍQUIDOS

CORPORALES

Los principales sistemas amortiguadores del organismo son HPO 3 - H3PO4, hemoglobina
– hemoglobinato, Proteínas- proteinatos, pero los más abundantes son HCO 3- H2CO3..
Todos aceptan y liberan protones cuando hay cambios drásticos en el pH de nuestro
cuerpo por ejemplo:

H+ + HCO3 H2CO3 CO2 + H2O

Amortiguadores del LIC

 Los fosfatos orgánicos del LIC incluyen ATP, ADP, AMP, glucosa-1-fosfato y 2,3-
difosfoglicerato (pK = 6.0 a 7.5).
 Las proteínas intracelulares sirven como amortiguadores por su abundante
contenido de grupos –COOH/COO- o –NH3/NH2.
 El amortiguador intracelular más significativo es la hemoglobina (pK de la
oxihemoglobina = 6.7 y de la desoxihemoglobina 7.9).

Amortiguadores del LEC

Amortiguador HCO3/CO2•Se utiliza como la primera línea de defensa cuando el cuerpo

pierde o gana H+.

24
 Manejo de la carga ácida diaria
100

% DE RESPUESTA
80
EC
60 IC
40 PULMONAR

20 RENAL

0
1 6 11 16 21 26 31 36 41 46
HORAS

•Características:

a) la concentración de la forma HCO3 es alta (24 meq/L).

b) el pK es 6.1, bastante próximo al pH del LEC.

c) el CO2 es volátil y se puede espirar por los pulmones.

12- MECANISMOS DE REGULACIÓN DEL PH SANGUÍNEO

Los sistemas de amortiguadores y los mecanismos reguladores tienen la misma finalidad:

controlar el pH. Básicamente hay dos mecanismos de regulación que son el respiratorio o
el metabólico, que son compensados el uno al otro en las diversas situaciones del pH,
respectivamente se dan en los pulmones y el riñón con respecto al bicarbonato y ácido
carbónico.

25
13- PARTICIPACIÓN DE LA HEMOGLOBINA EN EL TRANSPORTE DE CO 2 Y EN LA
REGULACIÓN DEL PH SANGUÍNEO

La hemoglobina es una proteína que está presente en los eritrocitos y tiene dos funciones
muy importantes:

1) transporta el O2 desde el aparato respiratorio hasta los tejidos periféricos

2) transporta CO2 Y los protones desde los tejidos periféricos hasta los pulmones
para la excreción subsecuente en ellos

La hemoglobina enlaza cuatro moléculas de oxígeno por tetrámero, es decir 4 por hem de
cada subunidad, La facilidad del enlace de O depende de la misma presencia de O 2 en
el mismo tetrámero, por lo tanto se dice que la hemoglobina tiene una cinética de enlace
cooperativa.

La oxigenación de la hemoglobina en los pulmones, se acompaña pues, de la expulsión y

espiración subsecuente del CO2. Conforme éste se absorbe en la sangre, la anhidrasa
carbónica en los eritrocitos cataliza la formación de ácido carbónico. El ácido carbónico se
disocia rápidamente en un protón y bicarbonato. Para evitar la acidez de la sangre, un
sistema amortiguador debe aceptar este exceso de protones. La hemoglobina enlaza dos
protones por cada cuatro moléculas de oxígeno liberadas y así amortigua el pH de la
sangre.

En los pulmones el proceso se invierte, es decir el oxígeno se enlaza a la hemoglobina

desoxigenada, los protones se liberan y se combinan con el bicarbonato para formar ácido
carbónico. Con ayuda de la anhidrasa carbónica, el ácido carbónico forma CO 2, el cual se
exhala.

14- TRASTORNOS DEL EQUILIBRIO ÁCIDO-BÁSICO

Hay principalmente 4 tipos de trastornos del equilibrio ácido básico:

Acidosis respiratoia Alcalosis respiratoria

Acidosis metabólica Alcalosis metabólica

Acidosis respiratoria. Aquí existe un aumento del CO2, posiblemente por un problema
respiratorio, lo que va a tener consecuencias en un aumento en la fracción ácida del
sistema amortiguador por que se va a generar más ácido carbónico.

El pH será menor de 7.4, va a haber secreción de iones H, el riñón va a retener HCO3

para tratar de compensar.

26
Algunas patologías que las presentan son: mistenia grave, enfisema, poliomielitis o una
sobredosis de sicotrópicos, asma y neumonía.

Alcalosis respiratoria. Aquí hay probablemente una hiperventilación, lo que aumenta la

excreción de CO2 y causa que haya disminución de la fracción ácida, por lo tanto se
generará una alcalosis.

El pH será mayor de 7.4, el HCO3 va a disminuir un poco, disminuyen los iones H, poco
CO2, el riñón trata de compensar

Algunas patologías que las presentan son: ingestión de estimulantes respiratorios,

tumores vecinos al centro respiratorio, histeria, hiperventilación.

Acidosis metabólica. Aquí hay un aumento de producción de ácidos no volátiles en el

organismo, hay una aumento de la fracción ácida en el sistema, el pH disminuye.. Hay
menos HCO3, aumentan los iones H, la compensación va a ser pulmonar, que va a tratar
de aumentar la excreción de CO2.

Algunas patologías que las presentan son: cetoacidosis diabética, insuficiencia renal,
diarreas, sobredosis de salicilicatos, enfermedades renales o diarrea.

Alcalosis metabólica. Resulta cuando se tienen grandes cantidades de álcali o bien se

pierden ácidos en exceso, lo que va a ocasionar que que haya aumento en hco 3 y en el
pH del cuerpo. La compensación va a ser pulmonar disminuyendo la excreción de CO 2.

Algunas patologías que las presentan son:aspiración gástrica, vómitos frecuentes,

sobredosis de bicarbonato de sodio, uso de diuréticos eliminadores de potasio, pérdida
del HCl.

27
 UNIDAD II

AMINOACIDOS PÉPTIDOS Y PROTEÍNAS

AMINOÁCIDOS

Los aminoácidos son compuestos orgánicos importantes y necesarios para el buen

funcionamiento de nuestro organismo. Dentro de sus funciones, esta la de servir como las
unidades o monómeros a partir de los cuales se constituyen las cadenas polipeptídicas de
proteínas.
Las clases de aminoácidos, el orden en el cual se reúnen entre sì, y sus interrelaciones
espaciales establecen las estructuras tridimensionales y las propiedades biológicas de las
proteínas sencillas.
Los aminoácidos son los determinantes principales de la estructura y función de las
proteínas complejas que contienen, además de los aminoácidos , el grupo hem,
carbohidratos, lípidos, ácidos nucleicos, entre otros.

Por otro lado en la naturaleza existen mas de 300 aminoácidos diferentes, sin embargo un
subconjunto de 20 constituyen las unidades monoméricas a partir de las cuales se
constituyen, como ya se había mencionado, los esqueletos polipeptídicas de las
proteínas.

De esta manera es importante mencionar la clasificación y composición de los

aminoácidos , así como su importancia biológica en el organismo, propiedades, entre
otras importantes características de los aminoácidos que mencionaremos conforme se
valla desarrollando el tema.

GRUPOS FUNCIONALES Y EQUILIBRIO PROTÒNICO DE LOS L- ALFA-

AMINOACIDOS

Los aminoácidos están constituidos por grupos funcionales, un grupo amino

( -- NH ), y un grupo carboxilo ( -- COOH ).

En un alfa- aminoácido, ambos grupos están adheridos al mismo átomo de carbono,

denominado carbono alfa, ligado a el se encuentra un grupo variable, el grupo R. Es en
dichos grupos R donde las moléculas de los 20 alfa-aminoácidos se diferencian unas de
otras.
Por ejemplo en la glicina, el grupo R se compone de un único átomo de hidrógeno. En
otros aminoácidos el grupo R es mas complejo, conteniendo carbono e hidrogeno, así
como oxigeno, nitrógeno y azufre.
La formula general estructural de los 20 alfa- aminoácidos, llamados también aminoácidos
corrientes es la siguiente:

28
 H

R C COOH

NH

Los átomos del carbono alfa de todos los aminoácidos, excepto la glicina, se hallan
unidos a cuatro grupos químicos diferentes, siendo esta la característica de un átomo de
carbono asimétrico y un centro quiral.

Los isómeros de la molécula alrededor del centro quiral pueden representarse sòlo
mediante dos modelos tridimensionales.

Los dos isómeros se diferencian en la dirección en la que hacen girar el plano de luz
polarizada, estos pares de isómeros reciben el nombre de enantioformos.

Un compuesto que hace girar el plano de la luz polarizada en la dirección de las agujas
del reloj es dextrógiro (+), en oposición al compuesto, levógiro (-).

CLASIFICACIÓN DE LOS L-ALFA- AMINOÁCIDOS

Los aminoácidos son las unidades estructurales básicas de

las proteínas. Un aminoácido (libre, sin polimerizar) siempre
tiene:

- Un grupo amino -NH2

- Un grupo carboxilo -COOH
- Un hidrógeno -H
- Una cadena lateral -R

Estos cuatro elementos están unidos entre sí a través de un

carbono central, conocido como carbono

Puesto que estos cuatro elementos son diferentes (excepto en

el caso de la glicina), los aminoácidos son estereisómeros.
Sólo encontramos L-aminoácidos en las proteínas.

En solución acuosa a PH neutro, los grupos amino y carboxilo están ionizados. La

molécula se comporta como un dipolo.

Los aminoácidos se distinguen unos de otros por la cadena lateral R. Aunque existen
muchos más, sólo hay 20 aminoácidos codificables para la síntesis de proteínas. De una
cadena lateral a otra hay una serie de diferencias químicas (ej. carga), estructurales, de
tamaño, etc.

Habitualmente se agrupan como sigue:

29
 Tabla de Aminoácidos

Esencial
Nombre del 3 1 Pola-
o no Estructura Función Radical
aminoácido letras letra ridad
esencial

Metabolismo de la Alifático
Alanina Ala R NE AP
glucosa hidrófobo

Cicatrización ,
Básico
Arginina Arg A E y NE PB estimula funciones
hidrófilo
inmunológicas
provee sitios clave
Neutro
Aspargina Asn N NE PNI para la N-
hidrófilo
glicosilación

Acido Hidrófilo
Asp P NE PA Neurotransmisor
Aspartico acido
Precursor
Glutamico oxidante
Azufrado
Cisteina Cys C NE AP y paredes disulfuro
hidrófobo
de algunas
proteínas
Neurotransmisor
Acido Hidrófilo
Glu E NE PA excitatorio de la
Glutamico acido
corteza cerebral
Eliminación de
Neutro
Glutamina Gln Q NE PNI amoniaco y síntesis
hidrófilo
proteica

Neurotransmisor Alifático
Glicina Gly G NE AP
inhibidor del SNC hidrófobo

Fabrica de
Básico
Histidina His H E y NE PB proteínas, enzimas
hidrófilo
e histamina
Proteína integral
del tejido muscular Alifático
Isoleucina Ile I E AP
y parte del código hidrófobo
genético
Alifatico
Leucina Leu L E AP Síntesis proteica
hidrófobo
Lys Se metaboliza 30
Básico
Lisina K E PB
(Lis) como acetil CoA, hidrófilo
 construcción
proteica y
absorción de Ca
Esencial
Nombre del 3 1 Pola-
o no Estructura Función Radical
aminoácido letras letra ridad
esencial
Deterioro de
metiles y pro Azufrado
Metionina Met M E AP
síntesis de hidrófobo
fosfolipidos
Se transforma en
tirosina y es Aromático
Fenilalanina Phe F E AP
bloqueador de hidrófobo
enzimas

Alifático
Reparación y
imino-
Prolina Pro P NE AP mantenimiento
ácido
óseo
hidrófobo

Biosíntesis de
Neutro
Serina Ser S NE PNI purinas y
hidrófilo
pirimidinas
Desintoxicación
hepática, formación
Thr Neutro
Treonina T E PNI de colágeno y
(Tre) hidrófilo
elastina, transporte
de fosfatos
Promueve la
liberación de
Trp serotonina, Aromático
Triptófano W E AP
(Tri) involucrado en la hidrófobo
regulación del
sueño y el placer.
Precursor de
esterocolamina, Aromático
Tirosina Tyr Y NE PNI
melanina y hidrófobo
hormonas tiroideas
Parte integral del
tejido muscular y Alifatico
Valina Val U E AP
reparación de hidrófobo
tejidos.
*AP apolar *PNI polar no ionizable *PA polar acido *PB polar basico

31
ESENCIALIDAD EN LA DIETA

Hasta el momento han sido identificados 20 aminoácidos necesarios para el crecimiento y

metabolismo humanos. De esos 20, once para niños y doce para adultos se consideran
no esenciales, pues son aquellos que nuestro organismo puede sintetizar o formar y por lo
tanto no es imprescindible obtenerlos de los alimentos. Los 8-9 restantes se denominan
aminoácidos esenciales debido a que el cuerpo humano no los sintetiza y, por lo tanto,
debe ser parte esencial de nuestra alimentación diaria. La ausencia de uno de estos
aminoácidos esenciales impide la formación de la proteína que lo contiene y por lo tanto el
tejido que la requiere no puede ser mantenido.

Aminoácidos no esenciales: Alanina, arginina, asparagina, acido aspártico, cistenina,

ácido glutámico, glicina, prolina, serina, tirosina, histidina (en adultos).
Aminoácidos esenciales: isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, treonina,
triptofano, valina, histidina (en niños).

Las denominadas proteínas completas - es decir, que contienen todos los aminoácidos
esenciales- en general se encuentran en alimentos tales como carnes, huevos, lácteos y
derivados. Es interesante destacar que las proteínas de los vegetales y los cereales son
incompletas, o sea, no aportan todos los aminoácidos esenciales. Este concepto es muy
importante para las personas vegetarianas.La mayoría de las personas necesitan ingerir
del 10% al 15% de su consumo calórico total en proteínas; esto viene a ser
aproximadamente 0,75 gramos por kilogramo de peso corporal al día. De esta forma, un
hombre de 70 kilos y una mujer de 55 kilos necesitan de 50 a 60 gramos y de 40 a 50
gramos al día, respectivamente. Las proteínas requeridas pueden obtenerse fácilmente
con dos o tres raciones de alimentos ricos en proteína animal o con cuatro raciones de
alimentos con proteína vegetal variados, como cereales integrales, verduras, legumbres,
frutos secos y semillas.

32
 PROPIEDADES DE LOS AMINOÁCIDOS
PROPIEDADES ÁCIDO-BÁSICAS DE LOS AMINOÁCIDOS.

Considerando las especies iónicas corrientes de los aminoácidos:

Los aa cristalizados poseen un punto de fusión o de descomposición relativamente

elevado, generalmente por encima de 200°c.

Los aa se encuentran y cristalizan a partir de las disoluciones acuosas neutras en forma

de iones dipolares, llamadas también iones híbridos en lugar de hacerlo en forma de
moléculas no disociadas.

Cuando se disuelve en el agua un ion híbrido cristalizado, como la alanina, puede actuar
como ácido o como base.

Las sustancias que poseen estás propiedades son anfóteras y se llaman anfolítos.

La alanina se considera como un ácido dibásico cuando se halla en su forma totalmente

protonizada; puede ceder protones durante su valoración completa con una base.

Ninguno de los aminoácido monoamino- monocarboxílicos posee capacidad de

tamponamiento significativo en la zona de pH fisiológico, es decir, entre pH 6-8. Muestran
capacidad de tamponamiento en las zonas próximas de sus valores de pKa. Solamente
existe un aminoácido con capacidad de tamponamiento entre pH 6-8 se trata de
HISTAMINA.

El formaldehído en exceso se combina fácilmente co0n los grupos amino libre (es decir no
protonizados) de los aminoácidos y origina metilol derivados. Esta reacción provoca que
un aminoácido isoeléctrico pierda un protón del grupo amonio del ion híbrido.

El protón así liberado puede valorarse directamente con NaOH hasta el punto final de la
fenoftaleína pH 8. Este sistema de valoración de aminoácidos o de mezclas de
aminoácidos en presencia de exceso se formaldehído (valoración con formol) se utiliza

33
para seguir la formación de aminoácidos libres durante la hidrólisis de las proteínas por
enzimas proteolíticas.

ESTEREOQUÍMICA DE LOS AMINOÁCIDOS

Tres aminoácidos: tirosina, triptófano y fenilalanina absorben luz significativamente en el

espectro ultravioleta. Puesto que muchas proteínas contienen restos de tirosina, las
medidas de absorción de la luz a 280nm en un espectrofotómetro constituyen el medio
conveniente de determinar el contenido en proteína de una disolución.

Todos los aminoácidos absorben en el ultravioleta lejano (menor que 220nm).

El triptófano, la tirosina y la fenilalanina tienen más capacidad de absorción (280nm); la

capacidad normal de absorción es de 220nm.

REACCIONES QUÍMICAS DE LOS AMINOÁCIDOS

Corresponden a las de sus grupos funcionales, es decir:

A) Reacciones de grupos Carboxilo.- conducentes a la formación de amidas,

ésteres y haluros de acilo.

La esterificación de los aminoácidos con etanol o con alcohol bencilo, se utiliza para
proteger el grupo carboxilo de los aminoácidos en la síntesis química de los péptido.

Reducción de un medio anhidro con el potente reductor brohidruro de litio para obtener el
correspondiente alcohol primario.

B) Reacciones con grupos Amino

El grupo alfa-amino de los aminoácidos puede asilarse por tratamiento con anhídridos o
haluros de ácidos. Un reactivo utilizado es el CLOROCARBONATO DE BENCILO que
rinde el correspondiente benciloxicarbonilo derivado del aminoácido designado
frecuentemente como cárbobenzoxiderivado.

La Reacción amino más característica es: la reacción Ninhidrina para valorar los
aminoácidos cuantitativamente, por calefacción de un alfa-aminoácido con dos moléculas
de ninhidrina da un producto intensamente coloreado (púrpura), con todos los

34
aminoácidos y péptidos que poseen grupos alfa-amino libres, mientras que la prolina y la
hidroxiprolina, en los que el grupo alfa-amino se halla sustituido, rinden derivados algo
diferentes que poseen un color amarillo algo característico.

C)Reacciones de los grupos R

Son reacciones coloreadas cualitativas típicas de las funciones presentes en sus grupos
R, tales como el grupo tiol de la cisteína, el grupo hidroxilo fenólico de la tirosina y el
grupo guanidinio de la arginina.

- Una reacción importante y característica del grupo tilo ocurre con metales pesados tales
como Hg y Ag con los que forma mercáptidos.

- La cistina forma oxidasa de la cistina, tiene un grupo disulfuro que actúa como enlace
covalente transversal entre cadenas polipeptídicas o entre dos puntos de la misma
cadena. Los enlace disulfuro transversales pueden escindirse por la acción de agentes
reductores como el mercaptoetanol que rinde dos moléculas de cisteína, que puede ser
oxidada también mediante el ácido perfórmico y origina dos moléculas de ácido cistéico.

ESPECTROS DE ABSORCIÓN

Los tres aminoácidos tirosina, triptófano, y fenilalanina absorven luz significativamente

en el espectro ultravioleta. Puesto que muchas proteínas contienen restos de tirosina, las
medidas de absorción de la luz a 280nm es un espectrofotómetro constituyen un medio
conveniente de determinar el contenido en proteína de una disolución.
Todos los aminoácidos absorben en el ultravioleta lejano ( menor de 220nm).

REACCIÓN CON NINHIDRINA Y FLUORESCAMINA

Ninhidrina.
La ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) reacciona con los aminoácidos en medio ácido
(pH entre 3 y 4) y en caliente produciendo amoniaco, dióxido de carbono y un complejo de
color púrpura azulado. Todos los aminoácidos primarios forman el mismo complejo tras su
reacción con ninhidrina, haciendo este agente inapropiado para la precolumna de
derivatización. La mayoría de columnas de HPLC de intercambio catiónico utilizadas para
el análisis de aminoácidos con postcolumna basada en la ninhidrina todavía emplean
resinas de sulfonato de poliestireno/divinilbenceno.
Los primeros sistemas automáticos para el análisis de aminoácidos descritos en 1958
basados en la separación de aminoácidos por cromatografía de intercambio catiónico y
posterior reacción con ninhidrina, permanecen hoy día como la metodología más fiable
para el análisis de aminoácidos en péptidos y proteínas. Analizadores comerciales
basados en esa metodología están disponibles en compañías como Beckman y
Pharmacia. A altas temperaturas ( 100ºC), todos los aminoácidos primarios reaccionan
con dos moléculas de ninhidrina para formar un cromóforo (púrpura de Ruthermann) con
máxima absorción a 570 nm.
En la cuantificación de los aminoácidos individuales puede utilizarse el coeficiente de
absorción molar del compuesto coloreado, aunque su valor varía de un aminoácido a otro
y debe determinarse para las condiciones particulares del análisis. Sin embargo, se debe
escoger un valor de referencia para utilizarlo en la cuantificación de los aminoácidos

35
totales de una mezcla.
La reacción coloreada de la ninhidrina se utiliza en trabajos analíticos, así como en la
visualización de las bandas de los aminoácidos después de su separación por
electroforesis o por cromatografía. El reactivo que se utiliza en estas circunstancias se
prepara generalmente disuelto en etanol; cuando se añade 2,4-6colidina, las diferencias
de color entre cada mancha ayudan a la identificación de los distintos aminoácidos

Fluorescamina.
La fluorescamina fue también introducida como una posible alternativa a la ninhidrina en
postcolumnas de derivatización. Todas las aminas primarias reaccionan con la
fluorescamina en medio básico (pH 9-11) dando un producto fluorescente con un
incremento en sensibilidad de detección mayor que la ninhidrina, aunque la fluorescamina
por si misma no tiene fluorescencia. El producto fluorescente es inestable en disolución
acuosa y el reactivo debe prepararse en acetona. Las aminas secundarias no reaccionan,
a menos que se conviertan previamente en aminas primarias, lo que puede hacerse con
N-clorosuccinimida, hipoclorito o cloramina-T. Aunque el reactivo tiene interés por su
rápida velocidad de reacción con los aminoácidos a temperatura ambiente, la reacción no
es tan sensible como la de la ninhidrina.

PROPIEDADES ÁCIDO-BÁSICAS DE LOS AMINOÁCIDOS

El conocimiento de las propiedades ácido~básicas de los aminoácidos es sumamente

importante en la comprensión y el análisis de las propiedades de las proteínas.

Por otra parte, todo el arte de la separación, la identificación y la valoración cuantitativa de

los diferentes aminoácidos, que son etapas necesarias en la determinación de la
composición de los aminoácidos y de la secuencia de las proteínas, se basa en su
conducta ácido~base.

Consideremos, en primer lugar, las especies iónicas corrientes de los aminoácidos. Los
aminoácidos cristalizados poseen puntos de fusión o de descomposición relativamente
elevados; generalmente por encima de los 200 °C son mucho más solubles en el agua
que en los disolventes no polares.

Tales propiedades son, precisamente, las que deben esperarse si el retículo de las
moléculas de los aminoácidos en estado cristalino está estabilizado por fuerzas
electrostáticas de atracción entre grupos con cargas opuestas, como ocurre en el elevado
punto de fusión de la red cristalina de las sales, como el cloruro sádico.

Si los aminoácidos cristalizasen en una forma no iónica, quedarían estabilizados por las
fuerzas de van der Waals, mucho más débiles, y tendrían puntos de fusión bajos.

Los aminoácidos se encuentran y cristalizan a partir de las disoluciones acuosas neutras

en forma de iones dipolares llamados también iones híbridos, en lugar de hacerlo en
forma de moléculas no disociadas.

36
Cuando se disuelve en el agua un ion híbrido cristalizado, como la alanina, puede actuar o
bien como ácido, (dador de protones) o como base (aceptor de protones):

Como ácido: H3nNCH(CH3)C00- H+ + H2NCH(CH)3,COO-

Como base: H+ + H3NCH(CH3)COO- H3NCH(CH3)COOH

Las sustancias que poseen esta propiedad son anfóteras (del griego amphi: «ambos») y
se llaman anfólitos locución abreviada de «electrolitos anfóteros».

El comportamiento ácido-base de los anfolitos se formula sencillamente en términos de la

teoría de ácidos y bases de Brónsted-Lowry.

Un alfa-aminoácido sencillo, monoamino y monocarboxílico, por ejemplo la alanina, es

considerado como un ácido dibásico cuando se halla en su forma totalmente protonizada;
puede ceder dos protones durante su valoración completa con una base.

** Formas no ionizadas y de ion híbrido de los aminoácidos

37
COMPORTAMIENTO DE LOS AMINOÁCIDOS EN SOLUCIÓN A DISTINTOS VALORES
DE PH

Dependiendo del pH los aminoácidos pueden tener carga neta positiva, negativa o cero.

Los aminoácidos portan por lo menos dos grupos ácidos débiles ionizables, un COOH y
un NH3. En solución dos formas de estos grupos, uno con carga y otra sin carga, existen
en equilibrio protónico:

R – COOH R – COO + H

R – NH3 R – NH2 + H

El RCOOH y el RNH3 representan los miembros protonados acidicos en estos equilibrios

el RCOO y el RNH3 son ácidos débiles el RCOOH es un ácido con mayor fuerza que el
RNH3.

Al pH del plasma sanguíneo o al liquido intracelular (7.4 y 7.1 respectivamente), los

grupos carboxilos existen casi enteramente como iones carboxilato RCOO.

A estos valores de pH, la mayor parte de los grupos amino están predominantemente en
la forma asociada (protonina), R- NH3.

En un pH suficientemente bajo para ionizar al grupo carboxilo, el grupo amino, el ácido

mas débil también se protonaria.

Si el pH se eleva gradualmente el protón del ácido carboxílico se perdería mucho antes

que el RNH3.

A cualquier pH suficientemente alto para que predomine la base conjugada sin carga del
grupo amino, un grupo carboxilo estará presente como ion carboxilato ( R – COO ).

A un pH isoeléctrico (pI) un aminoácido tiene carga neta de cero. El pH isoeléctrico es el

pH que esta en medio de los valores de pk de ambos lados de la especie isoeléctrica:

𝑃𝐾1 + 𝑃𝐾2
𝑃𝐼 =
2

Donde pk es el pk de los grupos disociables de un aminoácido.

El grupo alfa-carboxilo de los ácidos monoamino-monocarboxílicos es un ácido más fuerte

que el grupo carboxilo de los ácidos alifáticos comparables, tales como el ácido acético
(pK' = 4,76). El incremento de la fuerza ácida de este grupo está originado por la
presencia del grupo alfa-amonio, que atrae electrones, y por su carga positiva que

38
produce un efecto de campo intenso, incrementando de este modo la tendencia del
hidrógeno carboxílico a disociarse como un protón.

El grupo alfa-amino de los ácidos monoamino-monocarboxílicos es un ácido más fuerte (o

una base más débil), que el grupo amino de las aminas alifáticas comparables.

Todos los aminoácidos monoamino-monocarboxílicos que poseen grupos R sin carga

tienen valores casi idénticos de pK'I, y también lo son los valores de pK'2,

Ninguno de los aminoácidos monoamino-monocarboxílicos posee capacidad de

tamponamiento significativa en la zona de pH fisiológico, es decir, entre pH 6,0 y 8,0.
Muestran capacidad de tamponamiento en las zonas próximas a sus valores de pK', es
decir, en las zonas de pH 1,3 a 3,3 y de pH 8,6 a 10,6. Solamente existe un aminoácido
con capacidad de tamponamiento significativa entre pH 6 a 8; se trata de la histidina.

El grupo beta-carboxilo del ácido aspártico y el gamma-carboxilo del ácido glutámico,

aunque se hallan totalmente ionizados a pH 7,0, poseen valores de pK'
considerablemente más elevados que los correspondientes valores de pK' de los grupos
alfa-carboxilos, y más aproximadamente iguales a los de los ácidos carboxílicos sencillos,
tales como el ácido acético.

El grupo tiol o sulfhidrilo (-SH) de la cisteína y el grupo p-hidroxí de la tirosina son ácidos
muy débiles. A pH 7,0 el primero de ellos está ionizado alrededor de un

8%, y el segundo un 0,01%.

El grupo E-amino de la lisina y el grupo guanidinio de la arginina son fuertemente

básicos; sólo pierden sus protones a valores de pH muy elevados. A pH 7.0 estos
aminoácidos poseen carga positiva neta.

Las curvas de valoración de los aminoácidos con grupos R que se ionizan son mas
complejas, puesto que son una combinación de curva correspondiente a la disociación
del grupo R y las curvas de valoración de los grupos alfa–amino y alfa-carboxilo.

** Curvas de valoración del ácido glutámico, de la lisina y de la histidina. El pk’ del grupo
R se designa momo pK’R.

39
 ENLACE PEPTÍDICO

El enlace peptídico es el único enlace covalente existente entre aminoácidos.

La formación del enlace peptídico involucra la eliminación de 1 mol de agua entre el grupo
alfa- amino de un aminoácido y el grupo alfa carboxilo de un segundo aminoácido.

**aminoácidos unidos por un enlace peptídico.

El enlace peptídico posee carácter parcial de doble enlace C N , supone una clara
restricción para la forma de la molécula, siendo posible la rotación libre solo alrededor de
los enlaces C R, C NH3 y C COO. Cuando un estructura polipetidica presenta
esta flexibilidad máxima se dice que tiene una conformación aleatoria, siendo esta la
forma tridimensional de la molécula.

Por otro lado , existen otras propiedades características de los polipéptidos en las cuales
tienden a estabilizar la molécula de un a forma mas rígida, mediante:

 Enlaces de hidrogeno
 Interacciones iónicas
 Interacciones hidrofóbicas

40
 PÉPTIDOS

La polimerización de los L-alfa- aminoácidos mediante enlaces peptídicos, constituye el

marco estructural para las proteínas, formando de esta manera los péptidos.

Los pépticos son de gran interés biomédico ya que muchas hormonas importantes son
péptidos, y pueden emplearse para corregir los estados de deficiencia correspondientes,
por ejemplo, la administración de insulina a pacientes con diabetes mellitus.

Del mismo modo ciertos antibióticos son péptidos como por ejemplo la valinomicina y
gramicidina A, asì como algunos antitumorales como la bleomicina.

Por otro lado con el avance de la tecnología se pueden sintetizar otros pépticos, también
disponibles en la naturaleza solo en cantidades pequeñas para utilizarlos en vacunas.

ESTRUCTURA DE LOS PÉPTIDOS

Los péptidos sencillos que contienen dos, tres , cuatro o mas restos aminoácidos es decir,
los dipéptidos, tripéptidos, tetrapéptidos, etc. que se hallan unidos covalentemente,
proceden de la hidrólisis parcial de cadenas polipeptídicas de las proteínas mucho mas
largas.

Los péptidos se forman también en el tracto gastrointestinal durante la digestión de las

proteínas por las proteasas, enzimas que hidrolizan los enlaces peptidicos. Los péptidos
se designan a partir de sus restos aminoácidos componentes en la secuencia que
comienza con el resto aminoterminal (N-terminal).

41
ESTRUCTURA DE UN PENTAPÉPTIDO.

Los péptidos se designan comenzando por el resto N-terminal.

Los péptidos pueden considerarse como amidas sustituidas. A semejanza del grupo
amida, el enlace peptídico muestra un elevado grado de estabilización por resonancia. El
enlace simple C – N del enlace peptídico posee alrededor del 40% de carácter de enlace
doble y el enlace doble C = O posee cerca de 40% de carácter de enlace simple.

Este hecho determina dos consecuencias importantes:

 El grupo imino (-NH-) del enlace peptídico no posee tendencia significativa a

ionizarse o a captar protones en el intervalo de pH entre 0 y 14.2
 El enlace C – N del enlace peptídico es relativamente rígido y no puede girar
libremente, propiedad que es de suprema importancia con respecto a la
conformación tridimensional de las cadenas polipeptídicas.

PROPIEDADES ACIDO-BASE DE LOS PÉPTIDOS

Los péptidos poseen habitualmente puntos de fusión elevados, lo cual indica que
cristalizan de las disoluciones neutras en forma de retículo iónico, como iones dipolares
igual que los aminoácidos.

El comportamiento ácido-base de los péptidos viene determinado por el grupo alfa-amino

libre del resto N-terminal, por el grupo alfa-carboxilo libre del resto carboxil-terminal (C-
terminal) y por los grupos R de los restos situados en posiciones intermedias que pueden
ionizarse. En las cadena polipeptídicas largas los grupos R que se ionizan sobrepasan en
gran número a los grupos ionizables de los restos terminales.

Los valores de pk’ de los grupos R en los péptidos cortos se aproximan mucho a los que
exhiben los correspondientes alfa-aminoácidos libres.

Las curvas de valoración ácido-base de los péptidos cortos son muy semejantes a las de
los alfa-aminoácidos libres.

Las especies iónicas predominantes en las diferentes etapas de las curvas de valoración
son comparables a las de los aminoácidos libres. Los péptidos poseen también un pH
isoeléctrico que puede calcularse a partir de sus valores de pK’.

42
 PÉPTIDOS DE ACTIVIDAD BIOLOGICA

Las células animales, vegetales y bacterianas contienen diversos polipéptidos de peso

molecular bajo (3 a 100 residuos de animoácidos) que tienen actividad fisiológica
importante. Algunos incluyendo la mayoría de las hormonas polipeptídicas de los
mamíferos, contienen solo enlaces peptídicos formados entre los grupos alfa-amino y alfa-
carboxilo, de los L-alfa-aminoácidos de las proteínas, en los polipéptidos también pueden
existir aminoácidos o derivados de aminoácidos proteínicos adicionales.

GLUTATIÓN

Hallado en todas las células de los animales superiores, contiene un resto de ácido
glutámico unido mediante un enlace peptídico poco frecuente en el que interviene su
grupo α-carboxilo en lugar de su grupo α-carboxilo.

En el cual el glutamato amino terminal esta enlazado a la cisteina por un enlace alfa no
peptídico, es requerido por varias enzimas. El glutatión y la enzima glutatión reductasa
participan en la formación de los puentes disulfuro correctos de numerosas hormonas
proteínicas y polipeptídicas así como también en el metabolismo de los xenobióticos.

Actúa como componente de un sistema de transporte aminoácido como activador de

determinadas enzimas y como protector de los lípidos contra la oxidación, se sintetiza en
dos etapas a partir de L-glutamato, L-cisteina y glicina. Por cada enlace peptídico formado
una molécula de ATP resulta degradada a ADP y fosfato:

Glutamato + cisterna + ATP--------- -glutamilcisteina + ADP + Pi

-glutamilcisteina + glicina + ATP------------ Glutatión + ADP + Pi

ANTIBIOTICOS POLIPEPTIDICOS

Elaborados por hongos, contienen aminoácidos D y L, así como otros no presentes en las
proteínas. Ejemplo: la valinomicina, tirocidina y la gramidicina S, polipéptidos cíclicos que
contienen D-fenilalanina y el aminoácido no proteico ornitina.

HORMONA LIBERADORA DE TIROTROPINA (TRH)

El glutamato amino terminal experimenta ciclización a ácido piroglutamico y el carboxilo

del propio carboxilo terminal se amida.

Un polipéptido de mamífero puede contener más de un péptido con actividad fisiológica

potente. Dentro de la estructura primaria de la beta-lipotropina (hormona hipofisiaria que
estimula la liberación de ácidos grasos del tejido adiposo) hay secuencias de aminoácidos
que son comunes a otras hormonas polipeptídicas con actividades biológicas diversas.

43
OXITOCINA

En 1953 V. du Vigneaud y sus colaboradores, lograron la síntesis de las hormonas de la

pituitaria posterior oxitocina y vasopresina que contienen 9 restos aminoácidos.

Los impulsos neurales que resultan de la estimulación de los pezones son el estimulo
primario para la liberación de oxitocina, la distensión vaginal y uterina son los estímulos
secundarios.

La prolactina PRL se libera por muchos de los estímulos que liberan oxitocina y se ha
propuesto un fragmento de la oxitocina como el factor liberador de la prolactina.

El estrógeno estimula la producción de oxitocina y de neurofisina I y la progesterona la

inhibe.

Se desconoce el mecanismo de acción de la oxitocina, causa contracción del músculo liso

uterino y por eso se emplea en cantidades farmacológicas para inducir el parto humano.

La función fisiológica más probable de la oxitocina es estimular la contracción de las

células mioepiteliales que rodean a los alvéolos mamarios. Esto facilita el movimiento de
la leche en el sistema de conductos alveolares y permite la expulsión de la leche.

Los receptores de membrana para la oxitocina se localizan tanto en el tejido uterino como
en el mamario. Estos receptores aumentan en número por la presencia de estrógenos y
disminuyen por la progesterona. La elevación de los estrógenos, con la caída de
progesterona, que se produce inmediatamente antes del parto, es una explicación
probable para el comienzo de secreción Láctea antes del nacimiento.

La oxiticina y la neurofisina I son producidas en el ovario, en donde la oxitocina puede

inhibir la esteroidogénesis.

Los grupos químicos importantes para la acción de la oxitocina son el amino primario de
la cisterna, amino terminal, el fenólico de la tirosina, los tres grupos carboxiamídicos de
asparagina, glutamina y glicinamida y el enlace disulfuro (S-S). Mediante la supresión de
estos grupos se han producido numerosos análogos de la oxitocina.

ANGIOTENSINA

La renina (enzima producida en las células yuxtaglomerulares de la arteriola aferente

renal) actúa sobre el sustrato angiotensinogeno (alfa globulina sintetizada en el hígado)
para producir el decapeptido angiotensina I.

La síntesis de angiotensinogeno se potencia por glucocorticoides y estrógenos.

La hipertensión vinculada a estas hormonas puede deberse en parte al incremento de la

concentración de angiotensinogeno plasmático.

La enzima convertidora de angiotensina, una glucoproteina encontrada en pulmón, células

endoteliales y plasma, elimina 2 aminoácidos del extremo carboxiterminal del decapeptido

44
angiotensina I para formar angiotensina II en un paso que se considera no limitante de la
velocidad.

Varios nonapéptidos análogos ala angiotensina I inhiben a la enzima convertidota y se

utilizan para tratar la hipertensión dependiente de renina. Estos también se conocen como
inhibidores ACE (enzima convertidota de angiotensina). La enzima convertidota también
degrada la bradicinina, un vasodilatador potente, por tanto esta enzima aumenta la
presión arterial por dos vías distintas.

La angiotensina II incrementa la presión arterial al causar vaso constricción de las

arteriolas y es la sustancia vaso activa más potente conocida. Inhibe la liberación de
renina de las células yuxtaglomerulares y es un estimulador potente de la producción de
aldosterona.

Aunque la angiotensina II estimula directamente a la suprarrenal, no tiene efecto sobre la

producción de cortisol. En algunas especies la angiotensina II, se convierte en
heptapeptido des – Asp , Angiotensina III, estimulador igualmente potente de la
producción de aldosterona.

En humanos la concentración plasmática de angiotensina II es 4 veces mayor que la

angiotensina III, asi la mayor parte de los efectos los ejerce el octapéptido. Las
angiotensinas II y III se inactivan con rapidez por las angiotensinasas.

La angiotensina II se une a receptores específicos de las células glomerulares.

La interacción de la hormona con el receptor no activa a la adenilil ciclasa y al parecer el

CAMP no media la acción de esta hormona.

Las acciones de la angiotensina II, que consisten en estimular la conversión del colesterol
a pregnenolona y de la corticosterona a 18-hidroxicorticosterona y aldosterona, pueden
comprender cambios en la concentración del calcio intracelular y de los metabolitos de
fosfolípidos.

45
 TÉCNICAS DE SEPARACIÓN DE AMINOÁCIDOS Y PÉPTIDOS

CROMATOGRAFIAS

Los métodos cromatográficos pueden aplicarse no solamente a la separación,

identificación y análisis cuantitativo de mezclas de aminoácidos, sino también de pépticos,
proteínas, nucleótidos, ácidos nucleicos, lípidos e hidratos de carbono.

En todas las separaciones cromatografías, las moléculas son separadas dentro de una
fase estacionaria y una móvil. La separación depende de la tendencia de las moléculas en
la mezcla para asociarse con mayor fuerza a una o a otra fase.

CROMATOGRAFIA EN PAPEL

Para este tipo de cromatografía, se coloca una gota de solución que contenga uno o mas
aminoácidos a unos 5cm del borde de una tira de papel filtro, la tira se coloca en un vaso
cerrado donde su extremo entra en contacto con un solvente generalmente un alcohol de
bajo peso molecular en solución saturada con agua que contiene un ácido o una base.
Después de la migración del solvente sobre el papel, se seca la tira, se trata con
ninhidrina en acetona y se calienta un poco, entonces las posiciones de los aminoácidos
aparecen como puntos de color púrpura.

Los aminoácidos con grandes cadenas laterales no polares emigran más que los que
tienen cadenas laterales más cortas no polares o cadenas laterales polares. Esto refleja la
mayor solubilidad relativa de las moléculas polares en la fase estacionaria hidrófila y de
las moléculas no polares en solventes orgánicos.

Para una serie no polar (Gli, Ala, Val, Leu) a mayor longitud de la cadena lateral no polar
se incrementa su carácter no polar, lo cual incrementa su movilidad.

La relación entre la distancia recorrida por una aminoácido con la distancia que viaja el
solvente, medidas ambas desde el sitio marcado para la aplicación de la mezcla de
aminoácidos, se designa como valor Rf (movilidad relativa con el solvente) de ese
aminoácido.

𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎 𝑝𝑜𝑟 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎

𝑅𝑓 =
𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑠𝑜𝑙𝑣𝑒𝑛𝑡𝑒

Los valores Rf para un aminoácido dado varían de acuerdo con las condiciones
experimentales, por ejemplo según el solvente usado. Aunque es posible identificar
tentativamente un aminoácido solo por su valor Rf, es preferible hacer la cromatografía
estándar de aminoácidos conocidos de manera simultánea con la mezcla desconocida.
Luego la movilidad puede expresarse en relación a la de un estándar.

Las movilidades expresadas como relativas a un estándar varían menos que los valores
Rf de un experimento a otro.

46
CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA

Hay dos tipos distintos en cromatografía en capa fina.

 Cromatografía en capa fina por partición. CCFP

 Cromatografía en capa fina de Absorción CCFA

En la CCFP, la resolución implica partición de los elementos de una mezcla entre 2 fases
liquidas, una estacionaria y otra móvil de polaridad diferente, conforma la fase móvil pasa
sobre la estacionaria. La separación se produce por la diferencia de solubilidad de los
componentes en las fases estacionaria y móvil.

En la CCFP normal, la fase estacionaria es el componente más polar. El solvente contiene

ambos elementos: polares y débilmente no polares, agua, un alcohol de 4 o 5 carbonos
un ácido débil como ácido acético o una base débil como amoniaco.

Conforme se desplaza, el solvente cambia de composición debido a los electos mas

polares que acompañan a los grupos OH polares de la celulosa. Por tanto el solvente que
avanza paulatinamente se convierte en más no polar.

Los componentes no polares de una mezcla, se desplazan más lejos que los
componentes polares de mismo tamaño. Ej. El glutamato y lisina se retardan, la leucina y
la valina migran junto con el solvente.

La CCFP en “fase de reversa” tanto las polaridades de las fases como las movilidades de
los componentes de la mezcla se revierten respecto a la CCFP normal. La fase móvil
suministra la fase polar, la fase estacionaria por lo común celulosa cubierta con un liquido
no polar como el aceite de silicón, suministra la fase mas no polar.

En contraste con la CCFP normal, los componentes polares migran con el solvente y se
retraza el desplazamiento de los menos polares.

En la CCFA, la separación se basa en un principio totalmente diferente. La resolución

implica absorber los componentes de la mezcla en gel de sílice que se calienta para
expulsar toda el agua fija. La fase mocil, una mezcla simple o binaria de solventes
orgánicos, desplaza los compuestos absorbidos compitiendo por los sitios de unión sobre
el gel de sílice. Primero de desplazan los componentes unidos con menor firmeza y así se
logra la resolución.

CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IÓNICO

El análisis de los residuos de aminoácidos después de la hidrólisis de un péptido, por lo

general involucra a la cromatografía de intercambio iónico. La separación, identificación y
cuantificación completas requieren menos de 3 horas. El procedimiento de Moore y Stein
utiliza una columna corta y una larga las cuales contienen la forma ionizada Na de una
resina de poliestireno sulfatada. Cuando el ácido hidrolizado a pH 2 se aplica a las

47
columnas de los aminoácidos se unen mediante el intercambio de catiónes con el catión
Na. Las columnas se eluyen después con citrato de sodio bajo condiciones
predeterminadas de pH y temperatura.

El material eluído se hace reaccionar con la solución de ninhidrina y las densidades de

coloración se miden en un colorímetro de flujo. Los datos aparecen en un tubo de rayos
catódicos con integración relacionada con computadora.

DETERMINACIÓN DE LA ESTRUCTURA PRIMARIA DE UN PÉPTIDO

Dado que numerosas proteínas están constituidas por mas de una cadena polipeptídica
ligada por fuerzas no covalentes o por puentes disulfuro, es posible que el primer paso
sea disociar y separar las cadenas polipeptídicas individuales. Los agentes
desnaturalizantes como la urea o el clorhidrato de guanidina destruyen los puentes
hidrogeno y disocian polipéptidos unidos de modo no covalente. Por su parte los agentes
oxidantes y reductores rompen los puentes disulfuro. Entonces los polipéptidos son
separados por cromatografía.

La estructura primaria es el esqueleto covalente de las cadenas polipeptídicas, incluida la

secuencia de restos de aminoácidos.

Los péptidos sencillos que contienen dos, tres, cuatro o más restos de aminoácidos
(dipéptidos, tripéptidos, etc) se hallan unidos covalente mente, proceden de la hidrólisis
parcial de cadenas polipeptídicas de las proteínas mucho mas largas.

El enlace peptídico es el único enlace existente entre los aminoácidos que constituyen el
esqueleto de la estructura lineal de las proteínas. Existe otro enlace covalente entre los
aminoácidos, el enlace disulfuro de la cistina, que actúa en algunas proteínas como
enlace transversal entre dos cadenas polipeptídicas separadas o entre curvaturas de una
misma cadena.

48
 PROTEINAS

DEFINICIÓN Y COMPOSICIÓN DE LAS PROTEÍNAS

DEFINICIÓN

Las proteínas son las moléculas orgánicas más abundantes en las células; constituyen
más del 50 % de su peso seco.

Cada proteína tiene funciones diferentes dentro de la célula. Además la mayor parte de la
información genética transmitida por las proteínas.

Las proteínas son verdaderas macromoléculas que alcanzan dimensiones de las micelas
en el estado coloidal. La estructura de tamaño micelar con cargas eléctricas en su
superficie les confiere propiedades de absorción.
Las macromoléculas proteínicas en ocasiones están compuestas por una sola cadena
polipeptídica; en tal caso reciben el nombre de monoméricas. Cuando la proteína esta
formada por varias cadenas polipeptídicas que pueden o no ser idénticas entre sí, reciben
el nombre de oligoméricas.

Existen 20  -aminoácidos, como sillares para la formación de proteínas, enlazados por

uniones cabeza-cola, llamadas: Enlace Polipeptídico.

COMPOSICIÓN DE LAS PROTEINAS

Todas las proteínas contienen: Carbono, Hidrógeno, Nitrógeno, Oxígeno

Y otros elementos tales como: Azufre Hierro Fósforo Zinc

NIVELES DE ESTRUCTURA PROTEICA Y ENLACES QUE LOS ESTABILIZAN

(PUENTE DE HIDRÓGENO, ENLACE DISULFURO, ATRACCIÓN ELECTROSTÁTICA,
ATRACCIÓN HIDROFÓBICA, FUERZAS DE VAN DER WAALS)

ESTRUCTURA PRIMARIA

La estructura primaria es la secuencia de aminoácidos de la proteína. Indica qué

aminoácidos componen la cadena polipeptídica y el orden en que se encuentran. La
función de una proteína depende de su secuencia y de la forma que ésta adopte.

Características:

 Secuencia de aminoácidos
 Enlace peptídico
 Estructura lineal
 Semirrígida

49
ESTRUCTURA SECUNDARIA

La estructura secundaria es la disposición de la secuencia de aminoácidos en el espacio.

Los aminoácidos., a medida que van siendo enlazados durante la síntesis de proteínas y
gracias a la capacidad de giro de sus enlaces, adquieren una disposición espacial estable,
la estructura secundaria.

Características.-

 Relaciones geométricas entre el conjunto de átomos

 Se establecen uniones covalentes
 Interacciones electrostáticas
 Puentes salinos
 Fuerzas de Van Der Waals
 Plegamientos de Hélices alfa y laminas beta

Existen dos tipos de estructura secundaria:

 La (alfa)-hélice
 La conformación beta

La (alfa)-hélice: Esta estructura se forma al enrollarse helicoidalmente sobre sí misma la

estructura primaria. Se debe a la formación de enlaces de hidrógeno entre el -C=O de un
aminoácido y el -NH- del cuarto aminoácido que le sigue, se estabiliza la forma espiralada
debido a los enlaces de hidrógeno, de la cadena principal del polipéptido, se considera a
la hélice alfa como una estructura en forma de bastón, donde la cadena principal
espiralada representa la parte principal del bastón, mientras que las cadenas laterales se
orientan hacia fuera.

Características.-

 Están formadas por aminoácidos qirales.

 Se encuentran limitadas por factores estéricos y por
las uniones que las estabilizan.
 Contienen de 4 a 50 residuos, en un promedio de
doce.
 Los grupos R se dirigen hacia fuera.

Parámetros.-

 Posee 3.6 residuos de un giro a otro, en una

distancia de .54 nm.
 La distancia entre los residuos es de .15 nm.

50
La conformación beta: En esta disposición los aminoácidos. no forman una hélice sino
una cadena en forma de zigzag, denominada disposición en lámina plegada.

Características de la lamina beta.-

 Los carbones alfa y sus grupos R alternan en un plano ligeramente arriba y debajo
de la cadena principal del polipéptido.
 Los polipéptidos se alinean a lo largo y están estabilizados por puentes de
hidrógeno que se forman entre los hidrógenos de los péptidos nitrogenados y los
de los carbonilos oxigenados de iras adyacentes.
 Implican tramos de 5 a 10 aminoácidos de diferentes regiones de estructuras
primarias
 Se encuentra casi totalmente extendida.
 Pueden ser paralelas o antiparalelas, determinado según la dirección de la cadena
polipeptídica.
 Puede estar conformada por dos a quince cordones y son comunes donde hay
laminas mixtas.
 Son características de las proteínas globulares.

Hoja plegada beta antiparalela, los grupos R están

arriba y abajo del plano de la hoja y los puentes de
hidrógeno están agrupados por pares y estabilizan la
conformación de la hoja beta.

ESTRUCTURA TERCIARIA

La estructura terciaria informa sobre la disposición de la estructura secundaria de un

polipéptido al plegarse sobre sí misma originando una conformación globular.

En definitiva, es la estructura primaria la que determina cuál será la secundaria y por tanto
la terciaria.

Esta conformación globular facilita la solubilidad en agua y así realizar funciones de

transporte, enzimáticas , hormonales, etc.

Esta conformación globular se mantiene estable gracias a la existencia de enlaces entre

los radicales R de los aminoácidos. Aparecen varios tipos de enlaces:

51
El puente disulfuro entre los radicales de aminoácidos que tiene azufre, los puentes de
hidrógeno, los puentes eléctricos y las interacciones hidrófobas.

Estructura terciaria de una proteína globular, constituida

por 4 beta – alfa – beta consecutivas en los dos sentidos
estructurales primarios y terciario.

La estructura terciaria se organiza en unidades relativamente independientes pero

estructuralmente conectadas llamadas dominios, los cuales actúan como unión con
ligandos específicos, estos últimos pueden estar en contacto con residuos de más de un
dominio.

ESTRUCTURA CUATERNARIA

Esta estructura informa de la unión, mediante enlaces débiles ( no covalentes) de varias

cadenas polipeptídicas con estructura terciaria, para formar un complejo proteico. Cada
una de estas cadenas polipeptídicas recibe el nombre de protómero.

El número de protómeros varía desde dos como en la hexoquinasa, cuatro como en la

hemoglobina, o muchos como la cápsida del virus de la poliomielitis, que consta de 60
unidades proteicas.

En base a su numero de protomeros, se clasifican en biméricas o tetraméricas, también

pueden ser homodimeras o heteroligomericas, las cuales se caracterizan por protomeros
iguales o diferentes con las mismas funciones.

PUENTES DE HIDRÓGENO

Se produce cuando átomos hidrógenos con positividad relativa son atraídos por átomos
con negatividad relativa. La interacción de un átomo H unido a un átomo electronegativo
como el nitrógeno, oxigeno y azufre.

52
La formación de un enlace hidrógeno no implica el intercambio de electrones, ni que se
comparten pares electrones. Se establece entre los átomos que forman uniones
peptídicas.

Los enlaces hidrógeno son débiles, a menudo se forman muchos enlaces hidrógeno
dentro de una molécula o entre moléculas distintas y, así, la fuerza conjunta de los
enlaces de hidrógeno es capaz de estabilizar la estructura de moléculas como proteínas y
ácidos nucleicos.

Los enlaces hidrógeno se rompen con mayor facilidad que en los enlaces covalentes, ya
que su fuerza es menor, mas cuando aumenta la temperatura

ENLACES DISULFURO
Cuando en la estructura primaria de un polipéptido existe mas ce una CISTEINA, es
posible que se formen uniones disulfuro (por oxidación de grupos –SH) entre diferentes
segmentos de una misma cadena polipeptídica o entre diferentes segmentos de una
cadena polipeptídica, dependiendo donde se encuentran colocadas las cisteinas.

S–S

ATRACCIÓN ELECTROSTÁTICA
También denominado enlaces ionógenos, se producen cuando un ion o un grupo de iones
son atraídos por un ion o grupo de iones con carga opuesta. Entre las cadenas laterales
de los aminoácidos, se requiere que las cadenas con cargas opuestas se dispongan en el
espacio de tal manera, que estas atraerse. Así, el ambiente altamente iónico del medio
intracelular bastaría para separar las cargas opuestas que se encuentran interactuando
en la proteína. El medio intracelular cuyo solvente principal es el agua, posee una
constante dieléctrica muy alta.

FUERZAS DE VAN DER WAALS

Pueden ser de atracción o de repulsión y se debe a que se crean desequilibrios
transitorios y aleatorios cuando se comparten los electrones de un enlace covalente. Un
átomo es atraído hacia otro, porque la distribución asimétrica de sus nubes electrónicas
produce la aparición de polos en cada átomo, y estos átomos se atraen al interactuar el
polo negativo de unos con el polo positivo de otros. La distancia de separación entre dos
átomos en que la atracción es máxima, se llama distancia de Van Der Waals. Solo se
establece cuando los átomos quedan situados en cierta disposición en el espacio que
permite la interacción entre ellos.

La atracción de Van Der Waals con distancia optima entre dos átomos es débil, de todos
modos estabiliza la conformación de la molécula .

53
 Hélice alfa, donde se muestran las uniones de Van Der
Waals, en donde casi no hay espacio libre en el interior
de la célula

ATRACCIONES HIDROFÓBICAS
En aminoácidos que poseen cadenas laterales apolares existe la tendencia a segregarse
del contacto con el solvente acuoso y a formar estructuras con características miscelares;
mientras el resto de las cadenas laterales de los aminoácidos que forman la proteína,
aquellas que tienen características polares quedan situadas en contacto con el solvente.
De ello dependen las zonas en que la cadena polipeptídica se dobla hacia el interior de la
molécula.

Hélice alfa donde se indican los enlaces que la estabilizan, puentes

de hidrógeno, atracción hidrofóbica, fuerzas de Van Der Waals,
enlace disulfuro y atracción electrostática.

54
 DESNATURALIZACIÓN PROTEICA

DESNATURALIZACIÓN

Muchas moléculas proteicas sólo retienen su actividad biológica dentro de una fluctuación
muy limitada de temperatura y de pH. La exposición de proteínas solubles o globulares a
pH extremos o a temperaturas elevadas, les hace experimentar un cambio conocido como
desnaturalización, el efecto más visible del cual, consiste en un descenso de su
solubilidad. Puesto que los enlaces químicos covalentes del esqueleto peptídico de las
proteínas no se rompen durante este tratamiento relativamente suave, se ha llegado a la
conclusión que la estructura primaria permanece intacta. La mayor parte de las proteínas
globulares experimentan el proceso de desnaturalización cuando se calientan por encima
de 60-701C. La formación de un coágulo insoluble blanco cuando se hierve la clara de
huevo es un ejemplo común de desnaturalización térmica.

La consecuencia más significativa de la desnaturalización es que las proteínas pierden su

actividad biológica característica, Por ejemplo, al calentar los enzimas se suele perder su
capacidad catalítica.

La desnaturalización consiste en el desplegamiento de la estructura nativa plegada

característica de la cadena polipeptídica de las moléculas de las proteínas globulares.
Cuando la agitación térmica provoca que la estructura nativa plegada se desarrolle o se
distienda, originando una cadena libremente ondulada, la proteína pierde su actividad
biológica. Aunque cada tipo de proteína posee una composición fija de aminoácidos, así
como una determinada secuencia, establecida durante su biosíntesis, la secuencia
aminoácida no confiere directamente a la proteína su función biológica o actividad. Sin
embargo, la secuencia aminoácida determina en último extremo la actividad biológica de
la proteína ya que de ella depende la conformación nativa o estado de plegamiento de la
molécula proteica, gracias a las interacciones recíprocas entre las cadenas laterales de
aminoácidos, así como entre el disolvente y solutos.

Esta conclusión es consecuencia del descubrimiento, de que la desnaturalización o

desplegamiento de las proteínas nativas, que origina formas enrolladas al azar,
desprovistas de actividad biológica, no es un proceso irreversible como se creía. Se han
observado muchos casos en que una molécula desplegada recupera su forma nativa en el
tubo de ensayo, en un proceso que recibe el nombre de renaturalización. Si la proteína
desnaturalizada fuese un enzima, puede también recuperar su actividad catalítica por
renaturalización, sin ningún cambio en la especificidad de la reacción catalizada. Sin
embargo, la renaturalización de una proteína desnaturalizada no desarrolla ninguna
actividad biológica que no se hallase ya presente en la proteína original. Estos hechos
indican, por tanto, que la secuencia de aminoácidos en la cadena polipeptídica contiene la
información requerida para especificar su conformación plegada nativa, y que esta
conformación nativa determina su actividad biológica.

55
Una proteína desnaturalizada presenta propiedades diferentes a cuando se encuentra en
su estado nativo como son; pérdida de solubilidad, modificación en la capacidad de
fijación de agua, pérdida de la actividad biológica, incremento de la susceptibilidad al
ataque de proteasas, incremento de la viscosidad intrínseca, incapacidad de cristalizar,
incremento en la reactividad química, cambios en la conductividad eléctrica y variaciones
en el espectro de absorción y en el punto isoeléctrico.

Cabe mencionar que durante la desnaturalización existe un rompimiento de las uniones

no covalentes ya antes mencionadas, persistiendo solamente los enlaces peptídicos, y
por lo tanto su estructura primaria.

MÉTODOS UTILIZADOS EN LA PURIFICACIÓN (PRECIPITACIÓN SALINA,

CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR, CROMATOGRAFÍA DE
INTERCAMBIO IÓNICO, CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD, CROMATOGRAFÍA
LIQUIDA, ELECTROFORESIS), Y EN LA DETERMINACIÓN DE LA COMPOSICIÓN
(HIDRÓLISIS) DE LAS PROTEÍNAS.

MÉTODOS DE SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS.

Desde el siglo pasado las separaciones analíticas se llevaban a cabo por métodos
clásicos como son la precipitación, destilación y extracción. Los crecientes esfuerzos por
conocer más sobre la composición y función de las proteínas han obligado a los
científicos a buscar técnicas, cada vez, más precisas.

Actualmente las separaciones analíticas se realizan fundamentalmente por cromatografía

y electroforesis.

La cromatografía comprende un conjunto importante y diverso de métodos que permite a

los científicos separar componentes estrechamente relacionados en mezclas complejas,
lo que en muchas ocasiones resulta imposible por otros medios. Se pueden separar
moléculas en función de sus cargas, tamaños y masas moleculares. También a través de
la polaridad de sus enlaces, sus potenciales redox, etc.

La cromatografía no solo permite la separación de los componentes de una mezcla, sino

también su identificación y cuantificación. El análisis cualitativo está basado en la medida
de parámetros cromatográficos (tiempos y volúmenes de retención) mientras que el
análisis cuantitativo está basado en la medida de alturas o áreas de picos cromatográficos
que se relacionan con la concentración. La columna cromatográfica y la forma con la que
se diseña, constituye el corazón de la separación.

En todas las separaciones cromatográficas la muestra se desplaza con una fase móvil,
que puede ser un gas, un líquido o un fluido supercrítico. La fase móvil puede pasarse a
través de una fase estacionaria, con la que es inmiscible y que se fija a una columna o a
una superficie sólida. Las dos fases se eligen de forma, que los componentes de la
muestra se distribuyen de modo distinto entre la fase móvil y la fase estacionaria.

56
 Aquellos componentes que son fuertemente retenidos, por la fase estacionaria se
mueven lentamente con el flujo de la fase móvil; por el contrario los componentes que se
unen débilmente a la fase estacionaria, se mueven con rapidez. Como consecuencia de la
distinta movilidad, los componentes de la muestra se separan en bandas o zonas
discretas que pueden analizarse cualitativa y/o cuantitativamente. Estos resultados se
recogen en forma de gráficos llamados cromatogramas.

Los métodos cromatográficos se pueden clasificar según la forma en que la fase móvil y la
fase estacionaria se pongan en contacto. Así en la cromatografía de columna, un tubo
estrecho contiene la fase estacionaria a través de la cual se hace pasar la fase móvil por
presión. En la cromatografía en plano, la fase estacionaria se fija sobre una placa plana o
a los intersticios de un papel; en este caso la fase móvil se desplaza a través de la fase
estacionaria por capilaridad o por gravedad.

Las tres clases de cromatografía desde un ángulo más general son cromatografía de
líquidos, cromatografía de gases y cromatografía de fluidos supercríticos. Como su
nombre lo indica, la fase móvil en las tres técnicas son líquido, gas y fluido supercrítico
respectivamente.

Solo la cromatografía de líquidos es la que puede llevarse acabo en columna o sobre

superficies planas, por otra parte tanto la de gas como la de fluidos supercríticos están
restringidas a los procedimientos en columna de tal manera que las paredes de la
columna contienen la fase móvil.

La técnica más usada es la cromatografía líquida de alta resolución, HPLC por su

sensibilidad, fácil adaptación a las determinaciones cuantitativas exactas, su idoneidad
para la separación de especies no volátiles o termolábiles y su aplicación a sustancias de
primordial interés en la industria, como son los aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos,
hidrocarburos, carbohidratos, entre otros. Se ofrece a continuación un esquema relativo a
este método de separación.

LOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS

La cromatografía líquida la podemos diferenciar en cuatro grupos:

 de reparto: separa los solutos basándose en la solubilidad

 de adsorción: se basa en la afinidad de adsorción
 C. de exclusión: separa solutos según el peso molecular
 C. de intercambio iónico: separa solutos según la carga iónica

57
CROMATOGRAFÍA DE REPARTO

La cromatografía de reparto está formada por la cromatografía Líquido-Líquido y la

cromatografía unida químicamente. Estas técnicas se diferencian en la forma en que se
retiene la fase estacionaria sobre las partículas del soporte relleno. En el segundo caso,
como su nombre lo indica, la fase estacionaria se une químicamente a la superficie del
soporte.

En general los soportes para casi todos los rellenos de fases unidas químicamente se
preparan con sílice rígida o composiciones donde la sílice es el elemento básico. Estos
sólidos están formados por partículas mecánicamente resistentes, porosas y uniformes.

Los rellenos de columna en la cromatografía de fase unida químicamente se clasifican

como de fase inversa cuando el recubrimiento enlazado tiene carácter no polar, y de fase
normal cuando el recubrimiento contiene grupos funcionales polares.

CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN

La cromatografía de adsorción o Líquido-Sólido es la forma clásica de la cromatografía de

líquidos. Ha sufrido algunas transformaciones que la han convertido en un método
importante de la HPLC.

Las únicas fases que se utilizan en este tipo de cromatografía son la sílice y la alúmina,
siendo la primera la preferida.

Es adecuada para compuestos no polares probablemente con masas moleculares

inferiores a 5 000. Los métodos de la cromatografía de adsorción y reparto tienden a ser
complementarios, aunque en algunos casos se superponen.

En general la cromatografía Líquido-Sólido es más adecuada para muestras que son

solubles en disolventes no polares y por ello tienen solubilidad limitada en disoluciones
acuosas que son las que se utilizan en cromatografía de reparto en fase inversa. En este
tipo de cromatografía también se pueden separar compuestos con diferentes grupos
funcionales. Una característica particular de este método es su capacidad para diferenciar
compuestos isómeros en mezclas.

CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN

La cromatografía de exclusión, también llamada de filtración en gel o cromatografía de

permeación en gel, se basa en la diferencia de penetración de las moléculas en los poros
de la fase estacionaria debido a que la separación obtenida depende del tamaño de la
molécula. El tiempo de elusión es proporcional al peso molecular de los mismos, por lo
que no es muy usada con los compuestos de alto peso molecular. Este tipo de separación
por tamaño difiere de las demás técnicas de cromatografía en que no existen
interacciones físicas o químicas entre el analito y la fase estacionaria. Es una técnica
reproducible, escalable y rápida.

58
La fase fija está formada por partículas poliméricas o de sílice que contienen una red
uniforme de poros por los que pueden penetrar las moléculas de pequeño tamaño. Las
moléculas de tamaño grande se excluyen totalmente y son eluídas en primer lugar,
mientras que las de pequeño tamaño tienen acceso a todo el volumen poroso y son las
últimas que se eluyen; de esto se deduce que el volumen disponible para las moléculas
pequeñas es mayor que para las grandes. Por lo tanto las moléculas se eluyen por su
tamaño decreciente. En resumen los factores que determinan la separación de las
moléculas son el tamaño del poro, el tamaño de la partícula y el flujo de elusión.

Los diferentes tipos de partículas usadas deben ser estables, mecánica y químicamente,
tener bajo contenido en grupos iónicos, uniformidad de poro y tamaño. Los compuestos
pueden ser derivados de dextranos (Sephadex), derivados de agarosa (Sepharosa),
derivados de acrilamidas (Biogel P) y esferas de vidrio. Hay diferentes tamaños de
partícula para un gel: a menor tamaño mayor resolución y menor gasto en la columna.

Este técnica se emplea en la separación de proteínas de alimentos, determinación de

glucosa y fructosa en zumos de fruta, etc.

CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO

La cromatografía de intercambio iónico

está basada en la atracción entre iones
del soluto y puntos cargados que existen
en la fase estacionaria. En el caso de
intercambiadores aniónicos, grupos
cargados positivamente en la fase
estacionaria atraen aniones del soluto.
Los intercambiadores catiónicos
contienen puntos cargados
negativamente que atraen catiónes del
soluto.

Los intercambiadores iónicos se clasifican en ácidos o básicos, fuertes o débiles. Las

resinas ácidas fuertes siguen ionizadas incluso en disoluciones muy ácidas, en cambio las
resinas ácidas débiles se protonan a un pH próximo a 4 y pierden su capacidad de
intercambio catiónico. Los grupos muy básicos de amonio cuaternario siguen siendo
catiónicos a cualquier valor de pH. Los básicos débiles de amonio terciario se
desprotonan en disoluciones moderadamente básicas y pierden entonces su capacidad.

Las resinas de intercambio iónico tienen aplicación en estudios donde intervienen

moléculas pequeñas (PM=500) que pueden penetrar en los poros pequeños de la resina.

59
Los intercambiadores iónicos de poliestireno son tan grandes que las macromoléculas
muy cargadas, como las proteínas, se pueden enlazar irreversiblemente a ellos.

Los de celulosa y dextranos sirven para intercambio iónico de macromoléculas. Los geles
de intercambio iónico se usan en el caso de moléculas grandes (proteínas y ácidos
nucleicos). Cuando las separaciones exigen condiciones químicas fuertes se emplean
intercambiadores iónicos inorgánicos.

Todas estas técnicas tienen en común la existencia de una fase estacionaria a través de
la cual fluye una fase móvil, así como la presencia de un mecanismo de inyección de la
muestra y un mecanismo de detección de los diferentes componentes separados.

LA ELECTROFORESIS

La electroforesis fue desarrollada por primera vez por el químico sueco Arne Tiselius,
merecedor del Premio Nobel en 1948 por sus trabajos realizados en esta esfera. La
electroforesis es una técnica analítica de separación de fundamento cinético basada en el
movimiento o migración de las macromoléculas disueltas en un determinado medio
(solución tampón de electroforesis), a través de una matriz o soporte reticulado como
resultado de la acción de un campo eléctrico. El comportamiento de la molécula viene
dado por su movilidad electroforética y ésta por la carga, tamaño y forma de la misma.
Cuanto mayor es la relación carga/tamaño más rápido migra un ión en el seno del campo
eléctrico.

Esta técnica tiene como ventaja su capacidad de separar macromoléculas de interés en la

industria biotecnológica y química. Ha sido un método muy útil para la separación de
proteínas (enzimas, hormonas) y ácidos nucleicos (DNA y RNA) con gran resolución.

En un sistema electroforético pueden originarse distintos fenómenos que afectan la

separación de las sustancias:

DIFUSIÓN

Este fenómeno es provocado por la existencia de gradientes de concentración que

favorecen el transporte hacia las zonas de menor concentración de cada especie. Afecta
tanto a partículas cargadas como no cargadas. Las moléculas tienden a moverse de una
forma aleatoria debido a que poseen energía cinética propia. Esto es lo que se denomina
difusión. Con un aumento de la temperatura aumentará la difusión por un incremento de la
energía cinética.

MIGRACIÓN

Es el movimiento producido por una fuerza externa que es impuesta al medio, en este
caso, el campo eléctrico y su intensidad.

60
FLUJO TÉRMICO

Al pasar una corriente eléctrica a través de un sistema que origina una resistencia dada,
se produce calor. Por tanto el sistema electroforético no es isotérmico. En general la fase
líquida se mueve hacia las zonas de menor temperatura, lo que origina un transporte de
las partículas de interés no debido a la migración.

FRICCIÓN

La fricción con el solvente dificultará el movimiento (es decir, al moverse los solutos
chocarán con las moléculas del solvente que están en su camino), lo que genera una
fuerza que se opone al movimiento.

La suma de todos estos factores provoca que las moléculas no migren de una manera
uniforme, de modo que, si las moléculas son colocadas en un cierto lugar de la solución,
los iones comenzarán a moverse formando un frente cuya anchura aumentará con el
tiempo. Para reducir esta anchura podemos reducir el movimiento de las moléculas
empleando un medio que oponga más resistencia a dicho movimiento.

ELECTROFORESIS CONVENCIONAL

La electroforesis convencional ha sido utilizada durante muchos años para separar

especies complejas de elevado peso molecular de interés biológico y bioquímico. Las
separaciones se llevan a cabo sobre una capa delgada y plana o placa de un gel
semisólido y poroso que contiene un tampón acuoso en el interior de sus poros. Esta será
la sustancia encargada de ofrecer resistencia al movimiento de las moléculas, controlando
así su migración uniforme.

Mediante esta técnica se pueden separar varias muestras simultáneamente. Dichas

muestras se depositan sobre el gel, se aplica un potencial de corriente continua a través
del mismo durante un tiempo fijo. Cuando las separaciones se han completado se
interrumpe el paso de corriente y las especies separadas se tiñen para visualizarse.

La electroforesis en gel es muy utilizada en la detección, control de pureza,

caracterización, cuantificación (por comparación con controles) así como preparación y
purificación (por extracción de bandas desde el gel) de moléculas y fragmentos de DNA y
RNA.

Los geles que se emplean son geles tridimensionales de polímeros ramificados que tienen
los espacios entre ramificación rellenos de líquido. Las redes de polímeros no solo
reprimen la convección sino que también actúan como cribas que pueden retardar y hasta
bloquear la migración de los analitos poliméricos más grandes. En cambio los iones
pequeños pueden moverse libremente a través de la estructura porosa del gel. De este
modo la electroforesis en gel tiene dos mecanismos de separación: electroforesis, que
separa por la relación carga/tamaño y tamizado, que separa mayormente por tamaño. Los
geles más comunes son agarosa y poliacrilamida.

61
La agarosa es un polímero derivado de un polisacárido neutro, que gracias a su poder de
gelificación y propiedades físico-químicas, lo han convertido en el soporte más común
para electroforesis en el área de Biología Molecular. La poliacrilamida es un polímero
formado a partir de acrilamida y N,N´ metilenbisacrilamida. La concentración de ambos
reactivos define el grado de reticulación del gel.

Ambos geles tienen en común que adquieren la misma forma y están prácticamente libres
de cargas iónicas. Esto es importante para evitar que la disolución tampón se desplace
por el gel cuando se active el campo eléctrico.

HIDRÓLISIS

La hidrólisis de las proteínas termina por fragmentarlas en a -aminoácidos. Se basa en el

rompimiento dela estructura primaria de la proteína por intervención de una molécula de
agua. Existen 3 tipos de hidrólisis :

HIDRÓLISIS ÁCIDA

Se basa en la ebullición prolongada de la proteína con soluciones ácida fuertes (HCl y

H2SO4). Este método destruye completamente el triptófano y parte de la serina y la
treonina.

HIDRÓLISIS BÁSICA

Respeta los aminoácidos que se destruyen por la hidrólisis anterior, pero con gran
facilidad, forma racematos. Normalmente se utiliza (NaOH e BaOH).

HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA

Se utilizan enzimas proteolíticas cuya actividad es lenta y a menudo incompleta, sin

embargo no se produce racemización y no se destruyen los aminoácidos; por lo tanto es
muy específica.

CLASIFICACIÓN DE LAS PROTEINAS EN BASE A SU FORMA, COMPOSICIÓN Y

FUNCIÓN BIOLÓGICA

Las proteínas poseen veinte aminoácidos, los cuales se clasifican en:

glicina, alamina, valina, leucina, isoleucina, fenil, alanina, triptófano, serina, treonina,
tirosina, prolina, hidroxiprolina, metionina, cisteína, cistina, lisina, arginina, histidina, ácido
aspártico y ácido glutámico.

SEGÚN SU COMPOSICIÓN

Pueden clasificarse en proteínas "simples" y proteínas "conjugadas".

Las "simples" o "holoproteínas" son aquellas que al hidrolizarse producen únicamente

aminoácidos, mientras que las "conjugadas" o "heteroproteínas" son proteínas que al
hidrolizarse producen también, además de los aminoácidos, otros componentes orgánicos
o inorgánicos. La porción no proteica de una proteína conjugada se denomina "grupo

62
prostético". Las proteínas conjugadas se subclasifican de acuerdo con la naturaleza de
sus grupos prostéticos.

La siguiente tabla muestra la clasificación completa.

SEGÚN SU CONFORMACIÓN

Se entiende como conformación, la orientación tridimensional que adquieren los grupos

característicos de una molécula en el espacio, en virtud de la libertad de giro de éstos
sobre los ejes de sus enlaces. Existen dos clases de proteínas que difieren en sus
conformaciones características: "proteínas fibrosas" y "proteínas globulares".

Las proteínas fibrosas

Las proteínas fibrosas se constituyen por cadenas polipeptídicas alineadas en forma

paralela. Esta alineación puede producir dos macro-estructuras diferentes: fibras que se
trenzan sobre si mismas en grupos de varios haces formando una "macro-fibra", como en
el caso del colágeno de los tendones o la a-queratina del cabello; la segunda posibilidad
es la formación de láminas como en el caso de las b-queratinas de las sedas naturales.

Las proteínas fibrosas poseen alta resistencia al corte por lo que son los principales
soportes estructurales de los tejidos; son insolubles en agua y en soluciones salinas
diluidas y en general más resistentes a los factores que las desnaturalizan.

Las proteínas globulares

Las proteínas globulares son conformaciones de cadenas polipeptídicas que se enrollan

sobre si mismas en formas intrincadas como un "nudillo de hilo enredado". El resultado es
una macro-estructura de tipo esférico.

La mayoría de estas proteínas son solubles en agua y por lo general desempeñan

funciones de transporte en el organismo. Las enzimas, cuyo papel es la catálisis de las
reacciones bioquímicas, son proteínas globulares.

63
SEGÚN SU FUNCIÓN

La diversidad en las funciones de las proteínas en el organismo es quizá la más extensa

que se pueda atribuir a una familia de biomoléculas.

Enzimas

Son proteínas cuya función es la "catálisis de las reacciones bioquímicas". Algunas de

estas reacciones son muy sencillas; otras requieren de la participación de verdaderos
complejos multienzimáticos. El poder catalítico de las enzimas es extraordinario:
aumentan la velocidad de una reacción, al menos un millón de veces. Las enzimas
pertenecen al grupo de las proteínas globulares y muchas de ellas son proteínas
conjugadas.

Proteínas de transporte.

Muchos iones y moléculas específicas son transportados por proteínas específicas. Por
ejemplo, la hemoglobina transporta el oxígeno y una porción del gas carbónico desde y
hacia los pulmones, respectivamente. En la membrana mitocondrial se encuentra una
serie de proteínas que transportan electrones hasta el oxígeno en el proceso de
respiración aeróbica.

Proteínas del movimiento coordinado.

El músculo está compuesto por una variedad de proteínas fibrosas. Estas tienen la
capacidad de modificar su estructura en relación con cambios en el ambiente
electroquímico que las rodea y producir a nivel macro el efecto de una contracción
muscular.

Proteínas estructurales o de soporte.

Las proteínas fibrosas como el colágeno y las a-queratinas constituyen la estructura de

muchos tejidos de soporte del organismo, como los tendones y los huesos.

Anticuerpos

Son proteínas altamente específicas que tienen la capacidad de identificar sustancias

extrañas tale como los virus, las bacterias y las células de otros organismos.

Proteoreceptores

Son proteínas que participan activamente en el proceso de recepción de los impulsos

nerviosos como en el caso de la "rodapsina" presente en los bastoncillos de la retina del
ojo.

64
Hormonas y proteínas represoras

Son proteínas que participan en la regulación de procesos metabólicos; las proteínas

represoras son elementos importantes dentro del proceso de transmisión de la
información genética en la biosíntesis de otras moléculas.

CLASIFICACIÓN DE LAS PROTEÍNAS POR SU FUNCIÓN BIOLÓGICA.

Grupos, ejemplos y función.

Enzimas

1. Hexoquinasa Fosforila glucosa

2. Lactato-deshidrogenasa Deshidrogena lactato
3. Citocromo c Transfiere electrones
4. DNA~polimerasa Replica y repara DNA

Proteínas de reserva

1. Ovoalbúmina Proteína de la clara de huevo

2. Caseína Proteína de la leche
3. Ferritina Reserva de hierro en el bazo
4. Gliadina Proteína de la semilla de trigo
5. Ceina Proteína de la semilla de maíz

Proteínas transportadoras

1. Hemoglobina Transporta 02 en la sangre de los vertebrados

2. Hemocianina Transporta 0, en la sangre de algunos invertebrados
3. Mioglobina Transporta 02 en el músculo
4. Seroalbúmina Transporta ácidos grasos en la sangre
5. ffi-Lipoproteína Transporta lípidos en la sangre
6. Globulina que liga hierro Transporta hierro en la sangre
7. Ceruloplasmina Transporta Cu en la sangre.

Proteínas contráctiles

1. miosina Filamentos estacionarios en las miofibrillas

2. Actina Filamentos móviles en las miofibrillas
3. Dineína Cilios y flagelos

Proteínas protectoras en la sangre de los vertebrados

1. Anticuerpos Forman complejos con proteínas extrañas

2. Complemento Complejos con algunos sistemas antígeno-anticuerpo
3. FibrInógeno Precursor de la fibrina en la coagulación sanguínea
4. Trombina Componente del mecanismo de coagulación

65
 5. Toxinas
6. Toxina de Clostridium botulinum Origina envenenamiento bacteriano de
los alimentos
7. Toxina diftéríca Toxina bacteriana
8. Venenos de serpiente Enzimas que hidrolizan los fosfoglicéridos
9. Ricina Proteína tóxica de la semilla del ricino.

Hormonas

1. Insulina Regula el metabolismo de la glucosa

2. Hormona adrenocorticotrópica Regula la síntesis de corticosteroides
3. Hormona del crecimiento Estimula el crecimiento de los huesos

Proteínas estructurales

1. Proteínas recubrimiento viral Cubierta alrededor del cromosoma

2. Glucoproteínas Recubrimientos celulares y paredes
3. a-Queratina Piel, plumas, uñas, pezuñas
4. Esclerotina Exoesqueletos de los insectos
5. Fibrina Seda de los capullos, telarafías
6. Colágeno Tejido conectivo fibroso (tendones, hueso, cartílago)
7. Elastina Tejido conectivo elástico (ligamentos)
8. Mucoproteínas Secreciones mucosas, fluido sinovial

66
67
 UNIDAD III ENZIMAS

DEFINICIÓN Y CLASIFICACIÓN DE ENZIMAS

Concepto:

Las enzimas son proteínas especializadas en la catálisis de las reacciones biológicas.

Son polímeros biológicos que catalizan las reacciones químicas, son esenciales para la
desintegración de nutrientes a fin de proporcionar energía y la utilización de esta para
impulsar la motilidad celular, la función neural y la contracción muscular. A excepción de
las enzimas de RNA catalíticas, todas las enzimas son proteínas. Su estereoespecificidad
absoluta es en particular valiosa para su uso como catalizadores solubles o
inmovilizadores para reacciones especificas en la síntesis de un fármaco.

Clasificación:

Los nombres de uso frecuente para todas las enzimas describen el tipo de reacción
catalizada seguido por el sufijo –asa. Así por ejemplo, las deshidrogenasas eliminan
átomos de hidrogeno, las proteasas hidrolizan proteínas y las isomerasas catalizan
reordenamientos de configuración. Los modificadores pueden preceder o seguir al
nombre para indicar el sustrato (xantina oxidasa), la fuente de la enzima (ribonucleasa
pancreática), su regulación (lipasa sensible a hormona) o una característica de su
mecanismo de acción (cisteína proteasa). Cuando es necesario, se añaden designaciones
alfanuméricas para identificar multiples formas de una enzima (RNA polimerasa III).

La International Union of Biochemists (IUB) desarrollo un sistema de nomenclatura en la

que cada enzima tiene un nombre y un número de código singular que identifican el tipo
de reacción catalizada y los sustratos comprendido, agrupando a las enzimas en 6
categorías:

1. Oxidorreductasas: Catalizan oxidaciones y reducciones. Con frecuencia utilizan

enzimas como el dinucleótido nicotinamida adenina (NAD  ), su derivado fosfato
(NADP  ), el dinucleótido de flavina adenina o el lipoato. Son ejemplos de estas
enzimas las deshidrogenasas, oxigenasas, reductasas y peroxidasas.

1.1. actúan sobre CH  OH

1.2. actúan sobre C  O
1.3. actúan sobre C  CH 
1.4. actúan sobre CH  NH 2
1.5. actúan sobre CH  NH 
1.6. actúan sobre NADH; NADPH

2. Transferasas: Catalizan la transferencia de grupos como el amino, el carboxilo, el

carbonilo, el metilo, el acilo, el glucosilo o el fosforilo. Las cinasas catalizan la
transferencia de grupos fosforilo de la adenosina trifosfato (ATP) a otros nucleótidos

68
 trifosfato. Entre los nombres comunes están en éste caso aminotransferasa, carnitina
acil transferasa y transcarboxilasa.

2.1 Grupos de un átomo de carbono

2.2 Grupos aldehídicos o acetónicos
2.3 Grupos acilos
2.4 Grupos glucosilos
2.5 Grupos fosfato
2.6 Grupos que contienen azúfre

3. Hidrolasas: Catalizan la división hidrolitica por medio de hidrólisis de enlaces C-C, C-

O, C-N, dejando dobles enlaces. Catalizan la escisión de enlaces entre un átomo de
carbono y algún otro átomo por adición de agua. Sus nombres comunes en éste caso
los de la esterasa, peptidasa, amilasa, fosfatasa, ureasa, pepsina tripsina y
quimotripsina.

3.1 Ésteres
3.2 Enlaces glucosidicos
3.3 Enlaces peptidicos
3.4 Otros enlaces C-N
3.5 Anhídridos de ácido

4. Liasas: Catalizan la rotura de enlaces carbono-carbono, carbono-azufre, y ciertos

enlaces carbono-nitrogeno. Entre sus nombre encontramos la descarboxilasa,
aldolasa, hidratasa, desaminasa, citrato liasa, y deshidratasa.

4.1 C  C 
4.2 C  O
4.3 C  N 

5. Isomerasa: Catalizan cambios geometricoso estructurales dentro de una molecula,

esto mediante la catálisis de la racemización de isómeros ópticos o geométricos y
ciertas reacciones intramoleculares de oxido-reducción. Entre algunos de sus
nombres encontramos: epimerasa, racemasa y mutasa.

5.1 Racemasas

6. Ligasas: Catalizan la unión de dos moléculas acopladas a la hidrólisis de ATP.

Catalizan la formación de enlaces entre el carbono y el oxígeno, azúfre, nitrógeno y
otros átomos.

69
 La energía necesaria para la formación del enlace deriva a menudo de la hidrólisis
del ATP; a éste grupo se refiere el átomo el término sintasa. Algunos nombres son
la tiocinasa y carboxilasa.

6.1 C-O
6.2 C-S
6.3 C-N
6.4 C-C

DEFINICIÓN Y CARACTERÍSTICAS DE HOLOENZIMA, APOENZIMA, COFACTOR,

COENZIMA, GRUPO PROSTÉTICO, SUSTRATO.

Además del componente proteico, muchas enzimas requieren constituyentes no proteicos

para su función como catalizadores. Estas sustancias accesorias reciben diversos
nombres, como grupo prostético, cofactor o coenzima.

Holoenzima: Es una enzima formada por una proteína (apoenzima) y un cofactor, que
puede ser un ion o una molécula orgánica compleja unida (grupo prostético) o no
(coenzima). Son enzimas que carecen de los componentes químicos necesarios para
realizar una actividad catalítica, por ello, se ayudan de otras sustancias no proteicas o
cofactores que fijadas a su superficie covalentemente le aportan los grupos y funciones
químicas que necesita. En estos casos la parte proteica se denomina apoenzima y la
fracción no proteica cofactor. Una holoenzima se considera el complejo funcional
completo de una proteína.

𝐻𝑜𝑙𝑜𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚𝑎 ↔ 𝐴𝑝𝑜𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚𝑎 + 𝐶𝑜𝑓𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 (𝐶𝑜𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚𝑎 𝑜 𝐺𝑟𝑢𝑝𝑜 𝑝𝑟𝑜𝑠𝑡𝑒𝑡𝑖𝑐𝑜)

Apoenzima: Es la parte proteica de una holoenzima, es decir, una enzima que no puede
llevar a cabo su acción catalítica desprovista de los cofactores necesarios metálicos u
orgánicos, son catalíticamente inactivas, hasta unirse al cofactor adecuado. Estas son de
naturaleza proteica, no dializables, poseen alto peso molecular y son termolábiles.

Cofactor: Es un componente no proteico, termoestable, dializable y termorresistente, de

bajo peso molecular, necesario para acción de una enzima. Entre los cofactores se
encuentran: iones metálicos (si requiere un cofactor ion metálico se llama enzima activada
por un metal) y moléculas orgánicas(si es una molecula organica recibe el nombre de
coenzima).

En tales enzimas el ión metálico puede actuar como un centro catalítico primario, como un
grupo puente para reunir el sustrato y el enzima, formando un complejo de coordinación o
como agente estabilizante de la conformación de la proteína enzimática en su forma
catalíticamente activa. El término coenzima se aplica a moléculas orgánicas, derivadas a
menudo de una vitamina, y que son esenciales para la actividad de una enzima.

Coenzima: son factores orgánicos no proteicos, termoestables, que tienen baja masa
molecular, claves en la catálisis. A diferencia de las enzimas las coenzimas se modifican y

70
se consumen durante la reacción química. Las principales coenzimas son el NAD, FAD y
FMN, aunque algunas vitaminas pueden actuar como coenzimas (grupo B).

Grupo prostético: Es cualquier porción no aminoacídica de una proteína que confiere a

ésta alguna propiedad especial. Este se encuentra unido al resto de la molécula, y de
manera muy estable a la enzima. Aquellas que reciben un metal como grupo prostético se
llaman metaloenzimas.

Sustrato: Es la sustancia sobre la cual actúa la enzima. El sustrato se une al sitio activo
de la enzima y forma un complejo Enzima (E)-Sustrato (S). El sustrato por acción de la
enzima es transformado en producto (P) y es liberado del sitio activo, quedando libre para
recibir otro sustrato. Con el incremento de sustrato, la velocidad de la reacción aumenta
por la formación de complejos Enzima-sustrato (ES), hasta que ya no haya más enzimas
disponibles, siendo así la enzima el factor limitante.

𝐸 + 𝑆 ↔ 𝐸𝑆 → 𝐸𝑃 ↔ 𝐸 + 𝑃

ESPECIFICIDAD ENZIMÁTICA. SITIO ACTIVO CATALÍTICO. MODELO DE LA “LLAVE

CERRADURA”. MODELO DE AJUSTE INDUCIDO.

Especificidad enzimática: Una de las principales características de las enzimas es su

alta especificidad. Estas son especificas para el sustrato y la reacción, esto depende de
las características del sitio activo..
Ello significa que las enzimas pueden catalizar la transformacion de apenas un substrato
o una familia de substratos relacionados estructuralmente, catalizando solo una de las
posibles reacciones que ese substrato puede experimentar.

Cuando la enzima solo puede actuar sobre un tipo de substrato, se dice que la enzima
muestra especificidad absoluta para el substrato. Ese es el caso de la deshidrogenasa
succinica, que es especifica para el succinato, o la L-glutamico deshidrogenasa,
especifica para el glutamato.

Si la enzima puede actuar sobre substratos con estructuras muy similares, se dice que la
enzima muestra especificidad relativa para el substrato. La L-aminoacido oxidasa, por
ejemplo, puede catalizar la oxidacion de diferentes aminoacidos de la serie L.

Esta caracteristica de algunas enzimas puede ser aprovechada en algunos escenarios

clinicos. Por ejemplo, en pacientes intoxicados con metanol, se utiliza etanol en el
tratamiento. La enzima puede unirse a cualquiera de los dos alcoholes (especificidad
relativa), pero tiene de 10 a 20 veces mas afinidad por el etanol, lo cual favorece la
oxidacion del etanol por sobre la oxidacion del methanol.

La especificidad de accion consiste en que la enzima solo cataliza una de las posibles
reacciones que puede seguir un substrato.
En el caso del glutamato, por ejemplo, que puede experimentar diferentes
transformaciones, se requiere una enzima diferente para cada una de esas
transformaciones:

71
 Conversión del glutamato a: Enzima empleada
Glutamina (Fijación de amoniaco) Glutamina sintetasa
GABA (Descarboxilación) Glutamato Descarboxilasa
Alfacetoglutarato Glutamato Deshidrogenasa

Sitio activo catalítico: Las moléculas de enzimas contienen hendiduras o cavidades

denominadas sitio activo. No toda la molecula enzimatica se pone en contacto con el
substrato al momento de la catalisis de la reaccion, sino apenas una parte de la enzima.
A esa porcion de la molecula enzimatica que entra en contacto con el substrato y al la
cual el substrato se une, intimamente, pero de una forma reversible, para ser
transformado quimicamente, se denomina sitio o centro activo. El sitio activo está
formado por las cadenas laterales de residuos específicos, lo que ocasiona que tenga un
arreglo tridimensional particular, diferente al resto de la proteína. Este sitio es afín por la
estructura tridimensional del sustrato. La especificidad de las enzimas depende de las
caracteristicas del sitio o centro activo. El enlace de la enzima a substratos especificos
depende de los diferentes grupos (usualmente de las cadenas laterales de aminoacidos,
aunque puede haber otros grupos) relacionados con el sitio activo:

 Grupos que forman el “esqueleto” peptidico en el area del sitio activo (proporcionan
la conformación apropiada para el enlace).
 Grupos de orientación (obligan” al substrato a adoptar la orientación apropiada para
la reacción)
 Grupos “ambientadores” (proporcionan el medio adecuado: hidrofobico, polar,
negativa o positivamente cargado, etc. necesario para garantizar una apropiada
afinidad entre la enzima y el substrato especifico).
 Grupos catalíticos (responsables por crear las tensiones necesarias para la ruptura
de viejos enlaces y la formación de otros nuevos, entre los metabolitos que
participan en la reacción: substrato (s), coenzima(s) y/o otros grupos prostéticos).

En el caso de las enzimas formadas por una sola unidad el sitio activo con frecuencia
reside en una hendidura de la enzima. Uno de estos ejemplos corresponde a la lisozima,
una enzima presente en las lágrimas y en el moco nasal, la cual lisa la pared celular de
muchas bacterias grampositivas transmitidas por el aire. Constituida por una cadena
polipeptidica sencilla, de 129 residuos la lisozima posee una hendidura central profunda
que alberga un sitio catalico con 6 subsitios, los cuales enlazan varios sustratos. Los
residuos responsables de la ensicion del enlace, se localizan entre los sitios D y E,
cercanos a los grupos carboxilo del Asp 52 y el Glu 35. Al parecer, este ultimo cede
protones al enlace acetal del sustrato, mientras el Asp 52, cargado negativamente,
estabiliza desde la parte posterior al ion carbonio resultante.

El sitio catalico de la ribonucleasa también se localiza en el interior de una hendidura

similar a la de la lisozima; transversales a esta se encuentran los residuos His 12 el His
119 localizados, de acuerdo con la evidencia química, en el sitio catalico.

Los sitios activos de las enzimas multimericas pueden localizarse en las interfaces de las
subunidades. En el caso de ciertas enzimas con múltiples polipéptidos o subunidades, el

72
sitio activo reside en la interfase entre dichas subunidades. Los residuos aminoácido
procedente de los dos sustratos, contribuyen al sitio activo, al servir para enlazar los
sustratos o para intervenir en la catálisis. Un ejemplo corresponde a la enzima HMG-CoA
reductasa, que es la enzima limitante de la velocidad en la síntesis del colesterol.

Modelo de la “llave cerradura”.

El modelo llave-cerradura, propuesto por Emil Fisher, supone que la estructura del
sustrato y la del centro activo son complementarias, de la misma forma que una llave
encaja en una cerradura. Este modelo es válido en muchos casos, pero no es siempre
correcto. El modelo de Fischer explicó la especificidad de las interacciones enzima-
sustrato, la rigidez del sitio activo de la enzima, implícita en dicho modelo, resulto incapaz
de explicar los cambios dinámicos que tienen lugar durante la catálisis.

Modelo del ajuste inducido: se ha observado que la formación del complejo Enzima-
Substrato es realmente el resultado de la interacción entre el substrato y un sitio activo
flexible. Este modelo postula que el substrato produce cambios en la conformación de la
enzima, provocando la alineación apropiada de los grupos funcionales de la enzima para
un mejor enlace entre la Enzima y el Substrato y a la vez, garantizar la catálisis. El centro
activo adopta la conformación idónea sólo en presencia del sustrato. La unión del sustrato
al centro activo del enzima desencadena un cambio conformacional que da lugar a la
formación del producto.

Un modelo que considera ambos aspectos de la catálisis enzimática, corresponde al

modelo del “ajuste inducido” de Koshland. En el modelo de Fisher, se presume que el sitio

73
catálico esta preconfigurado para ajustarce al sustrato. En el modelo del “ajuste inducido”,
el sustrato induce un cambio en la conformación de la enzima, de la misma manera en
que la introducción de la mano en un guante, induce cambios en la forma del guante. El
enlace con el sustrato alinea los residuos de aminoácidos u otros grupos en la enzima, a
una orientación espacial correcta para el enlace del sustrato, la catálisis o ambos. La
enzima, a su vez, induce cambios recíprocos en los sustratos correspondientes, los
cuales modifican la orientación y las configuraciones, hacia las de un estado de transición
y, por tanto, dicha enzima utiliza la energía intrínseca del enlace, liberada por la
interacción sustrato-enzima a fin de disminuir la AGF.

Este modelo propone que la interacción inicial entre la enzima y el sustrato es

relativamente débil, pero que estas interacciones débiles rápidamente inducen cambios
conformacionales en la enzima que fortalecen la unión y atraen los sitios catalíticos en
proximidad a los enlaces del sustrato que deben alterar. Después de que la unión se ha
hecho, uno o más mecanismos de catálisis generan complejos de estado-de transición y
productos de la reacción. Los posibles mecanismos de catálisis son cuatro:

1. Catálisis por tensión de enlace: los rearreglos estructurales inducidos que se hacen
con la unión del sustrato y enzima finalmente producen uniones de sustrato
tensionadas, que mas fácilmente logran el estado de transición. La nueva
conformación frecuentemente forza a los átomos del sustrato y a grupos catalíticos,
como el glutamato y el aspartato, a conformaciones que tensan enlaces de sustrato
existentes.
2. Catálisis por proximidad y orientación: las interacciones enzima-sustrato orientan
los grupos reactantes y los juntan uno con otro. Además de inducir tensión, grupos
como el aspartato son frecuentemente químicamente reactivos también, y su
orientación y proximidad al sustrato favorecen su participación en la catálisis.
3. Catálisis que involucran donadores (ácidos) y aceptores (bases) de protones:
contribuyen significativamente para completar los eventos catalíticos que se inician por
mecanismos de tensión, por ejemplo, el uso de glutamato como un catalizador acido en
general (donador de protones).
4. Catálisis covalente: en las catálisis que se realizan por mecanismos covalentes, el
sustrato se orienta a los sitios activos de las enzimas de tal manera que se forma un
intermediario covalente entre la enzima o la coenzima y el sustrato. Uno de los
ejemplos mas conocidos de este mecanismo es el que involucra proteólisis por las
proteasas de serina, que incluye a enzimas digestivas (tripsina, quimiotripsina, y
elastasa) y varias enzimas de la cascada de la coagulación.

MECANISMO DE ACCIÓN DE LAS ENZIMAS. CINÉTICA ENZIMÁTICA. FORMACIÓN

Y DEGRADACIÓN DE LOS ESTADOS DE TRANSICIÓN. TEORÍA CINÉTICA PARA
LAS REACCIONES QUÍMICAS.

Cinética Enzimática: Estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas.

Estos estudios proporcionan información directa acerca del mecanismo de la reacción
catalítica y de la especifidad del enzima. La velocidad de una reacción catalizada por un
enzima puede medirse con relativa facilidad, ya que en muchos casos no es necesario
purificar o aislar el enzima. La medida se realiza siempre en las condiciones óptimas de
pH, temperatura, presencia de cofactores, etc, y se utilizan concentraciones saturantes
de sustrato. En estas condiciones, la velocidad de reacción observada es la velocidad

74
máxima (Vmax). La velocidad puede determinarse bien midiendo la aparición de los
productos o la desaparición de los reactivos.

Al seguir la velocidad de aparición de producto (o de desaparición del sustrato) en

función del tiempo se obtiene la llamada curva de avance de la reacción, o simplemente,
la cinética de la reacción. A medida que la reacción transcurre, la velocidad de
acumulación del producto va disminuyendo porque se va consumiendo el sustrato de la
reacción. Para evitar esta complicación se procede a medir la velocidad inicial de la
reacción (v0). La velocidad inicial de la reacción
es igual a la pendiente de la curva de avance a
tiempo cero. De esta forma, la medida de v 0 se
realiza antes de que se consuma el 10% del
total del sustrato, de forma que pueda
considerarse la [S] como esencialmente
constante a lo largo del experimento. Además,
en estas condiciones no es necesario
considerar la reacción inversa, ya que la
cantidad de producto formada es tan pequeña
que la reacción inversa apenas ocurre. De esta
forma se simplifican enormemente las ecuaciones de velocidad.

Para estudiar la cinética enzimática se mide el

efecto de la concentración inicial de sustrato sobre
la velocidad inicial de la reacción, manteniendo la
cantidad de enzima constante. Si representamos v 0
frente a [S]0 obtenemos una gráfica como la de la
Figura de la derecha. Cuando [S]0 es pequeña, la
velocidad inicial es directamente proporcional a la
concentración de sustrato, y por tanto, la reacción
es de primer orden. A altas [S]0, el enzima se
encuentra saturada por el sustrato, y la velocidad ya
no depende de [S]0. En este punto, la reacción es
de orden cero y la velocidad es máxima (Vmax).

Formación y degradación de los estados de transición.

El cambio de energía libre de Gibbs ΔG (también llamado la energía libre o energía de

gibbs) describe tanto la dirección en la cual tendrá que proceder una reacción química,
como las concentraciones de reactivos y productos que estarán presentes en equilibrio la
ΔG para una reacción química es igual a la suma de las energias libres la formación de
productos de la reacción ΔGp menos la suma de las energias libres de la formación de los
sustratos ΔGs.

El concepto de estado de transición es fundamental para la comprensión de las catálisis

enzimática. Por ejemplo, considerese una reaccion de desplazamiento donde un grupo N
que se desprende, adherido en un principio a R, es desplazado por el grupo E:

𝐸+𝑅−𝐿 ↔𝐸−𝑅+𝐿

75
El resultado neto de este proceso es transferir R desde L hacia E. A la mitad del
desplazamiento, el enlace entre R y L se ha debilitado pero todavía no se ha roto por
completo, y el nuevo enlace entre E y R hasta ahora esta formado de manera incompleta.
Dicho intermediario transitorio se denomina Estado de Transición, E**R**L, los *
representan los enlaces parciales que están pasando por formación y rotura. Cabe
considerar que la reacción consta de dos reacciones parciales; la primera corresponde a
la formación de (F) y la segunda a la descomposición de (D) subsiguiente del
intermediario de estado de transición. Al igual que para todas las reacciones, los cambios
característicos de la energía libre, ΔGF y ΔGD se relaciona con cada reacción parcial.

𝐸 + 𝑅 − 𝐿 ↔ 𝐸 ∗∗ 𝑅 ∗∗ 𝐿 ΔGF

𝐸 ∗∗ 𝑅 ∗∗ 𝐿 ↔ 𝐸 − 𝑅 + 𝐿 ΔGD

ΔG es la suma de , ΔGF y ΔGD. al igual que para cualquier ecuación de dos términos, es
imposible inferir a partir de , ΔG el signo o la magnitud de , ΔGF o ΔGD.

𝐸 ∗∗ 𝑅 ∗∗ 𝐿 ↔ 𝐸 − 𝑅 + 𝐿 𝛥𝐺𝐹 = 𝛥𝐺𝐹 + 𝛥𝐺𝐷.

Muchas reacciones comprenden multiples estados de transición, cada uno con un cambio
relacionado de energía libre. Para estas reacciones, la ΔG representa la suma de todos
los cambios de energía libre relacionados con la formación y la descomposición de todos
los estados de transición. Por ende, a partir de la ΔG general es imposible inferir el
número o el tipo de estados de transición a través de los cuales procede la reacción.
Dicho de otra manera, la termodinámica general no dice nada acerca de la cinética.

Teoría cinética para las reacciones químicas.

Consideremos el estado de cualquier sistema de moléculas. Cualquiera que sean las

condiciones, el sistema contendrá cierta cantidad de energía. La energía cinética de
traslación estará distribuida al azar entre todas las moléculas del sistema. La energía
cinética de traslación estará distribuida al aza entre todas las moléculas del sistema, y el
porcentaje de moléculas con energía elevada aumenta rápidamente al elevar la
temperatura del sistema.

Como resultado de esta distribución variable de energía, entre las moléculas, pueden
producirse colisiones moleculares, choques, cuya energía de impacto esta influenciada
por la energía cinética de las moléculas y sus trayectorias relativas en el momento del
choque.

Todas las reacciones químicas, tienen lugar a través de una colisión ente partículas que
produce la formación de moléculas que no estaban presentes antes de la colisión. Las
moléculas pueden ser nuevas porque unos enlaces se han roto, o porque se han formado
enlaces nuevos o ambas a la vez.

76
Ahora bien, dos moléculas pueden chocar entre si y no verificarse reacción alguna. Para
que un choque sea eficaz, esto es, se produzca reacción, hacen falta al menos dos
condiciones:

1. Que las moléculas posean suficiente energía (cinética), para que al chocar
puedan romperse algunos enlaces (o relajarse mucho). Estas moléculas se
llaman moléculas activadas, y la energía mínima requerida se llama energía
de activación.
2. Que el choque se verifique con una orientación adecuada. Aunque las
moléculas tengan la suficiente energía, puede suceder que el choque no sea
eficaz, por tener lugar con una orientación desfavorable.

FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA (TEMPERATURA, Ph,

CONCENTRACIÓN ENZIMÁTICA Y SUSTRATO, INHIBIDORES COMPETITIVOS Y NO
COMPETITIVOS). CONSTANTE DE MICHAELIS-MENTEL.

Factores que afectan la actividad enzimática:

Temperatura: Incrementa el número de moléculas que pueden reaccionar, ya que

aumenta la energía cinética e incrementa la frecuencia de las colisiones. Este incremento
de la velocidad de reacción no continua de manera indefinida, dado que finalmente se
alcanza una temperatura a la cual las moléculas reactantes ya no son estables. Aunque
la elevación de la temperatura incrementa la velocidad de una reacción catalizada por
enzimas, solo dentro de los limites de la temperatura. Al principio la velocidad de una
reacción aumenta cuando la temperatura se eleva, debido al incremento de las moléculas
reactantes. Mientras más tiempo se conserve una enzima a una temperatura a la cual su
estructura es apenas estable, tiene mayor probabilidad de experimentar
desnaturalización.

En general, los aumentos de temperatura

aceleran las reacciones químicas: por
cada 10ºC de incremento, la velocidad de
reacción se duplica. Las reacciones
catalizadas por enzimas siguen esta ley
general. Sin embargo, al ser proteínas, a
partir de cierta temperatura, se empiezan
a desnaturalizar por el calor. La
temperatura a la cual la actividad
catalítica es máxima se llama temperatura
óptima. Por encima de esta temperatura, el aumento de velocidad de la reacción debido a
la temperatura es contrarrestado por la pérdida de actividad catalítica debida a la
desnaturalización térmica, y la actividad enzimática decrece rápidamente hasta anularse.

77
El factor por el cual el proceso biológico aumenta para un incremento de temperatura de
10°C es el coeficiente de temperatura o Q10.

pH: El índice de casi tidas la reaccione catalizadas por enzima muestra una dependencia
importante de la concentración de ion hidrógeno. Casi tidas las enzimas intracelulares
muestran actividad optima a valores de pH entre 5 y 9. La relación entre la actividad y
concentración de pH refleja el equilibrio entre la desnaturalización de enzima a pH alto o
bajo, y los efectos sobre el estado cargado de la enzima, los sustratos o ambos.

Una enzima cargada negativamente (Enz-) que reacciona con un sustrato positivamente
cargado (SH+), a un PH bajo, la Enz- adquiere protones y pierde su carga negativa. A
valores PH altos, SH+ se ioniza y pierde su carga positiva.

Las enzimas pueden experimentar cambios de conformación con las variaciones del PH
depende del comportamiento ácido-básico de los reactantes.

El PH modifica los grupos ionizables de la enzima o del sustrato y pueden desnaturalizar

la enzima. El pH optimo es un pH característico en el cual su actividad enzimática es
máxima.

Los enzimas poseen grupos químicos ionizables (carboxilos -COOH; amino -NH2; tiol -SH;
imidazol, etc.) en las cadenas laterales de sus aminoácidos. Según el pH del medio, estos
grupos pueden tener carga eléctrica positiva, negativa o neutra. Como la conformación de
las proteínas depende, en parte, de sus cargas eléctricas, habrá un pH en el cual la
conformación será la más adeuada para la actividad catalítica (Figura de la derecha). Este
es el llamado pH óptimo.

La mayoría de los enzimas son muy

sensibles a los cambios de pH.
Desviaciones de pocas décimas por
encima o por debajo del pH óptimo
pueden afectar drásticamente su
actividad. Así, la pepsina gástrica tiene
un pH óptimo de 2, la ureasa lo tiene a
pH 7 y la arginasa lo tiene a pH 10
(Figura de la izquierda). Como ligeros
cambios del pH pueden provocar la
desnaturalización de la proteína, los
seres vivos han desarrollado sistemas
más o menos complejos para mantener
estable el pH intracelular: Los
amortiguadores fisiológicos.

Concentración del sustrato: Las reacciones enzimáticas son tratadas como si tuvieran
un solo sustrato y un producto único, la mayor parte de estas reacciones tienen dos o mas
sustratos y dos productos.

78
Si aumenta la concentración del sustrato mientras que todas las demás condiciones se
conservan constantes, la velocidad inicial medida (Vi), crece hasta un valor máximo (Vmax)
y no más.

La velocidad crece al aumentar la concentración del sustrato hasta el punto donde se dice
que la enzima esta “saturada” con el sustrato. La velocidad inicial medida alcanza un
valor máximo y no es afectada por el incremento ulterior en la concentración del sustrato.

En la saturación se ocupan los sitios activos de la enzima por lo que no hay capacidad
para unirse y transformar el sustrato, debido a altas concentraciones de sustrato. A bajas
concentraciones de sustrato el factor limitante es la concentración del sustrato. A altas
concentraciones de sustrato el factor limitante concentración de la enzima. Cuando ya no
hay sustrato se termina la reacción y se cae la curva.

Concentración de la enzima: La velocidad inicial de una reacción es la velocidad

medida antes de que se haya formado suficiente producto para permitir que la reacción
inversa ocurra. Además la velocidad inicial de una reacción enzimática es siempre
proporcional a la concentración de la enzima.

La concentración de la enzima es directamente proporcional a la velocidad de reacción o

inicial. El factor limitante es el sustrato porque si se termina aunque haya mucha
concentración de enzima, la curva termina por caer.

Inhibidores: Son moléculas que se unen a enzimas y disminuyen su actividad. La unión

de un inhibidor puede impedir la entrada del sustrato al sitio activode la enzima y
obstaculizar que la enzima catalice su reaccion correspondiente. La unión de un inhibidor
puede ser reversible o irreversible. Los inhibidores irreversibles reaccionan de forma
covalente y modifican su estructura química a nivel de residuos esenciales de los
aminoácidos. Los inhibidores reversibles se unen a la enzima de forma no covalente,
dando lugar a diferentes tipos de inhibiciones dependiendo de si el inhibidor se une a la
enzima o al complejo ES o ambos.

 Inhibidor competitivo: El inhibidor y el sustrato no se pueden unir a la misma

enzima al mismo tiempo de manera que compiten por el acceso al sitio activo de la
enzima. Actúa al disminuir el numero de moléculas de enzima libres disponibles
para unión a sustrato. Se pueden unir a E, pero no al complejo ES. La inhibición
competitiva aumenta el valor de Km pero no afecta a la Vmax debido a que no puede
unirse a ES. Puede ser el maloato, sulfas, antihipertensores y el alopurinol.

 Inhibidor no competitivo: Proveen una forma de inhibición mixta donde la unión del
inhibidor con la enzima reduce su actividad pero no afecta la unión del sustrato.
Como resultado el grado de inhibición depende solamente de la concentración de
inhibidor. Estos tienen afinidades idénticas por E y ES (K i=Ki). en la
inhibición no competitiva no cambia Km, pues no afecta la unión del
sustrato, pero disminuye la Vmax, es decir la unión del inhibidor obstaculiza
la catálisis. Modifica la conformación de la enzima aunque aumente la
cantidad de sustrato

79
 Los inhibidores no competitivos pueden retardar la formación del complejo y
la del producto ya que Km no se ve afectada porque si se alcanza la ½ de la
velocidad máxima, solo que se tardara mas, esto altera la velocidad
máxima.

 Inhibidor a competitivo: El inhibidor solo se une al complejo ES y no a la

enzima libre. La adición de mas sustrato a la reacción da lugar a un
aumento en la velocidad de reacción pero no hasta el grado que se
absorben en las reacciones sin inhibir. Suele observarse en las reacciones
en que las enzimas unen mas de un sustrato.

Constante de Michaelis-Mentel

. En 1913, Leonor Michaelis (foto de la izquierda) y Maud Menten (foto de la derecha)

desarrollaron esta teoría y propusieron una ecuación de velocidad que explica el
comportamiento cinético de los enzimas.

Para explicar la relación oservada entre la velocidad inicial (v0) y la concentración inicial
de sustrato ([S]0) Michaelis y Menten propusieron que las reacciones catalizadas
enzimáticamente ocurren en dos etapas: En la primera etapa se forma el complejo
enzima-sustrato y en la segunda, el complejo enzima-sustrato da lugar a la formación del
producto, liberando el enzima libre:

En este esquema, k1, k2 y k3 son las constantes cinéticas individuales de cada proceso y
también reciben el nombre de constantes microscópicas de velocidad. Según esto,
podemos afirmar que:

 𝑉1 = 𝐾1 𝐸 𝑆
 𝑉2 = 𝐾2 𝐸𝑆
 𝑉3 = 𝐾3 𝐸𝑆
Se puede distinguir entre enzima libre (E) y enzima unido al sustrato (ES), de forma que la
concentración total de enzima, [ET], que permanece constante a lo largo de la reacción es:

𝐸𝑇 = 𝐸 + 𝐸𝑆

𝐸 = 𝐸𝑇 − 𝐸𝑆 ∴ 𝑉1 = 𝐾1 𝑆 𝐸𝑇 − 𝐾1 𝑆 𝐸𝑆

Este modelo cinético adopta la hipótesis del estado

estacionario, según la cual la concentración del
complejo enzima-sustrato es pequeña y constante a lo

80
largo de la reacción. Por tanto, la velocidad de formación del complejo enzima-sustrato
(V1) es igual a la de su disociación (V2+V3):

𝑉1 = 𝑉2 + 𝑉3

Además, como [ES] es constante, la velocidad de formación de los productos es

constante:

𝑉 = 𝑉3 = 𝐾3 𝐸𝑆 = 𝐶𝑂𝑁𝑆𝑇𝐴𝑁𝑇𝐸

Como 𝑉1 = 𝑉2 + 𝑉3 , podemos decir que:

𝐾1 𝑆 𝐸𝑇 − 𝐾1 𝑆 𝐸𝑆 = 𝐾2 𝐸𝑆 + 𝐾3 𝐸𝑆

𝐸𝑇 𝑆 𝐾2 +𝐾3
Despejando [ES], queda que: 𝐸𝑆 = , siendo 𝐾𝑀 = , en donde la expresión
𝐾𝑀 + 𝑆 𝐾1
𝐾2 +𝐾3
se ha sustituído por KM, o constante de Michaelis-Menten. Este enlace nos
𝐾1
aporta una explicación sobre las razones que hacen de la KM un parámetro cinético
importante.

Por lo tanto, en el estado estacionario, la velocidad de formación del producto es:

𝐾3 𝐸𝑇 𝑆
𝑉 = 𝑉3 = 𝐾3 𝐸𝑆 =
𝐾𝑀 + 𝑆

Para cualquier reacción enzimática, [E T], K3 y KM son constantes. Vamos a considerar tres
casos:

 A concentraciones de sustrato pequeñas ([S] << KM) V = (K3 [ET]/KM) [S]. Como los
términos entre paréntesis son constantes, pueden englobarse en una nueva
constante, Kobs, de forma que la expresión queda reducida a: v = k obs [S], con lo
cual la reacción es un proceso cinético de primer orden.
 A concentraciones de sustrato elevadas ([S] >> KM), V = K3 [ET]. La velocidad de
reacción es independiente de la concentración del sustrato, y por tanto, la reacción
es un proceso cinético de orden cero. Además, tanto K3 como [ET] son constantes,
y nos permite definir un nuevo parámetro, la velocidad máxima de la reacción
(Vmax): Vmax = K3 [ET], que es la velocidad que se alcanzaría cuando todo el enzima
disponible se encuentra unido al sustrato.
 Cuando KM=[S]: Cuando KM es igual a la cantidad de sustrato, la velocidad inicial
es de la mitad del máximo, entonces KM es la concentración de sustrato a la cual la
𝑉
velocidad inicial es la mitad del máximo ( 𝑚𝑎𝑥 )
2

Si introducimos el parámetro Vmax en la ecuación general de la velocidad, obtenemos la

expresión más conocida de la ecuación de Michaelis-Menten:

𝑉𝑚𝑎𝑥 𝑆
𝑉=
𝐾𝑚 + 𝑠

81
Hay enzimas que no obedecen la ecuación de
Michaelis-Menten. Se dice que su cinética no es
Michaeliana. Esto ocurre con los enzimas
alostéricos, cuya gráfica v frente a [S] no es una
hipérbola, sino una sigmoide. En la cinética
sigmoidea, pequeñas variaciones en la [S] en una
zona crítica (cercana a la KM) se traduce en
grandes
variaciones
en la
velocidad de
reacción.

La representación gráfica de la ecuación de

Michaelis-Menten (v 0 frente a [S]0) es una
hipérbola. La Vmax corresponde al valor máximo al
que tiende la curva experimental, y la K M
corresponde a la concentración de sustrato a la cual la velocidad de la reacción es la
mitad de la Vmax.

Representación de Lineweaver-Burk

Para determinar gráficamente los valores de K M y Vmax es más sencillo utilizar la

1 1
representación doble recíproca ( frente a ), ya que es una línea recta. Esta
𝑉0 𝑆0
representación doble recíproca recibe el nombre de representación de Lineweaver-Burk .
Es una recta en la cual:

𝐾𝑀
 La pendiente es
𝑉𝑚𝑎𝑥
1 1
 La abscisa (eje Y) en el origen ( = 0) es −
𝑉0 𝐾𝑀
1 1
 La ordenada (eje X) en el origen ( = 0) es
𝑆0 𝑉𝑚𝑎𝑥

De esta forma, a partir de los datos experimentales se puede

calcular gráficamente, los valores de K M y Vmax de un enzima
para diversos sustratos. Al momento del trazo se revela que
1
la intersección X es − .
𝐾𝑀

82
REGULACIÓN DE LA ACTIVIDAD CATALÍTICA DE LAS ENZIMAS: RECAMBIO
DE PROTEÍNAS. ENZIMAS ALOSTERICAS Y SUS MODULADORES.
MODIFICACIÓN COVALENTE DE ENZIMAS “ENZIMAS
INTERCONVERTIBLES”. CIMÓGENOS

En los humanos, la concentración del sustrato depende en la fuente de comida y

usualmente no es un mecanismo fisiológico importante para la regulación de rutina de la
actividad Enzimática. Por otro lado, la concentración de la enzima es modulada
continuamente en respuesta a las necesidades fisiológicas. Se conocen tres mecanismos
principales para regular la concentración de enzimas activas en los tejidos:

1. La regulación de la expresión de genes controla la cantidad y proporción de la

síntesis Enzimática.
2. La actividad proteolíca determina la proporción de degradación Enzimática.
3. Modificaciones covalentes de pro enzimas inactivas pre-existentes producen
enzimas activas.

La regulación enzimática puede ser de tipo covalente cuando se trata de enzimas

alostericas y no covalente cuando se habla de cimógenos y enzimas interconvertibles.

Recambio de proteínas: Los procesos combinados de la síntesis y degradación de las

enzimas constituyen el recambio enzimático. El recambio de una proteína fue descubierto
como una propiedad característica de las células de los mamíferos, mucho tiempo antes
de que se mostrara que también ocurría en las bacterias.

Midiendo las velocidades de incorporación de aminoácidos marcados con 15N a la

proteínas y los índices de perdida de 15N de las proteínas. Las proteínas están en un
estado de “equilibrio dinámico”.

Las proteínas sintetizadas en las células son degradadas y re-sintetizadas en las células,
a esto se le conoce como “recambio de proteínas”.
El tiempo de vida de una proteína varía dependiendo d las necesidades del organismo, y
la composición de los aminoácidos que la forman.
Otro factor que afecta el tiempo de vida son cuando las proteínas son dañadas ya sea por
un defecto en la traducción o por tóxicos en la célula.

Casi todas las proteínas del organismo están en una constante dinámica de síntesis (1-
2% del total de proteínas), a partir de aminoácidos, y de degradación a nuevos
aminoácidos. Esta actividad ocasiona una pérdida diaria neta de nitrógeno, en forma de
urea, que corresponde a unos 35-55 gramos de proteína. Cuando la ingesta dietética
compensa a las pérdidas se dice que el organismo está en equilibrio nitrogenado.

Dos son las vías por la que son degradadas las proteínas mediante proteasas
(catepsinas).

1. Vía de la ubiquitina (pequeña proteína básica). Fracciona proteínas anormales y

citosólicas de vida corta. Es ATP dependiente y se localiza en el citosol celular.

83
 2. Vía lisosómica. Fracciona proteínas de vida larga, de membrana, extracelulares y
organelas tales como mitrocondrias. Es ATP independiente y se localiza en los
lisosomas.

Enzimas alostéricas y sus moduladores: Algunas enzimas no siguen la cinética

enzimática de Michaelis-Menten. Un grupo importante de éstas enzimas se haya bajo el
control de moléculas llamadas efectores, que se unen a zonas de la enzima distintas de
los sitios catalíticos y que influyen en la unión del sustrato al sitio catalítico. Estas enzimas
se conocen con el nombre de enzimas alostéricas.

Hay enzimas que pueden adoptar 2 conformaciones interconvertibles llamadas R

(relajada) y T (tensa). R es la forma más activa porque se une al sustrato con más
afinidad. Las formas R y T se encuentran en equilibrio R <==> T.

Ciertas sustancias tienden a estabilizar la forma R. Son los llamados moduladores

positivos. El propio sustrato es a menudo un modulador positivo. Las moléculas que
favorecen la forma R pero que actúan sobre una región de la enzima distinta del centro
activo son los activadores alostéricos.

Las sustancias que favorecen la forma T y disminuyen la actividad enzimática son los
moduladores negativos. Si estos moduladores actúan en lugares distintos del centro
activo del enzima se llaman inhibidores alostéricos.

La mayoría de las enzimas alostéricas están formadas por subunidades de cadenas

peptídicas idénticas o estrechamente relacionadas. La conformación cuaternaria resulta
modificada por los correspondientes efectores alostéricos. Uno o más de los sitios
funcionales de estas enzimas pueden ser catalíticos (C) mientras que uno o más de los
sitios pueden ser reguladores (R) y no idénticos a los puntos catalíticos o activos. En la
mayor parte de los casos, los sitios R y C se encuentran en subunidades distintas; en
otras enzimas, los sitios alostéricos y catalíticos se localizan en la misma subunidad.

Cuando la velocidad de reacción de una enzima alostérica se representa en función de la

concentración del sustrato, se obtiene una curva sigmoidea en lugar de hiperbólica.

84
Puede observarse que las curvas alostéricas cambian considerablemente al alterar la
concentración de los efectores, bien positivos o bien, negativos. La cinética alostérica
puede representarse mediante la ecuación:

𝑆 𝑛 𝑉𝑚𝑎𝑥
𝑉=
𝑆 𝑛 +𝐾

Donde n es coeficiente que representa la interacción de los sitios de unión, K constituye

una medida de la afinidad del sustrato por la enzima.

Las enzimas alostéricas:

 Están constituidas en lo general por más de dos cadenas polipeptídicas

 Pueden contener dos centros funcionales distintos, uno catalítico y otro regulador y
estar sujetas al control, bien positivo bien negativo de uno o más cofactores.
 Poseen efectores que pueden ser coenzimas, sustratos o productos y sufren
cambios en la conformación o la cooperatividad de sus componentes polipéptidos
cuando se hallan bajo el efecto de los efectores adecuados.
 Son homotropicas si el sustrato es el modulador +
 Son heterotropicas si modulador + es un compuesto diferente al sustrato.

Regulación covalente de enzimas

La regulación covalente se realiza en varias enzimas por procesos de unión o eliminación

de fosfato. Existen enzimas cuya actividad es modulada por la inserción covalente de
otros grupos.

 Cimógenos: Son precursores inactivos de las enzimas, es una molécula que

necesita ser activada para convertirse en enzima activa. Las enzimas digestivas,
algunos factores de coagulación y otras proteínas son sintetizadas como
cimógenos. Estos cimógenos son activados cuando un factor externo, cambios de
pH, otra enzima etc. Actúa sobre ellos.
 Pepsinógeno: pro enzima precursora de la pepsina. Es secretada por las células
principales o cimogénicas de las glándulas fundicas u oxintricas del estomago. Se
activa formando pepsina al entrar en contacto con el HCl del estomago. Su
exocitocis se produce por inducciones neurales y hormonales, todo ello por parte
del nervio vago.
El Pepsinógeno I es secretado por las células principales y por células mucosas
del cuello de las glándulas oxintricas. El Pepsinógeno II se secreta por las células
mucosas a los largo y ancho del estomago.
 Quimiotripsinógeno: pro enzima precursora de la quimiotripsina el cual es
sintetizado en el páncreas y se compone de 245 residuos de aminoácidos, esta
prácticamente desprovisto de actividad enzimática. Cuando la tripsina corta el
enlace pepitico que une la arginina 15 con la isoleucina 16, el cimógeno se
convierte en un enzima completamente activo. La enzima resultante quimiotripsina
π actúa con otras quimiotripsina π, separando dos di péptidos y originando

85
 quimiotripsina α, que es la forma estable de la enzima. Las tres cadenas
resultantes que componen la quimiotrpsina α, permanecen unidas por dos puentes
de disulfuro intercatenarios.
 Tripsinógeno: en su activación se altera la conformación de cuatro hebras
polipeptidicas conocidas como dominio de activación. Es la tripsina el activador
común de diversos cimógenos pancreáticos (Quimiotripsinógeno, tripsinógeno,
proelastasa, procarboxipeptidasa y prolipasa). Para producir tripsina activa, las
células que revisten el duodeno, secretan la enteropeptidasa enteroquinasa, que
hidroliza un único enlace peptidico lisina-isoleucina del tripsinógeno, al tiempo que
este cimógeno entra en el duodeno. La pequeña cantidad de tripsina producida
activa mas tripsinógeno y demás cimógenos.

Pepsinogeno Quimiotripsinogeno Tripsinogeno

Sitio de secreción Mucosa estomacal Páncreas Páncreas
Sitio de acción Estomago Intestino delgado Intestino delgado
Forma activa Pepsina Quimiotripsina tripsina
Tripsina corta el
enlace peptidico que Las células que
une la arginina 15 y revisten el duodeno,
la isoleucina16 el secretan una
Se activa al entrar
cimógeno se enteroquinasa, que
Activación en contacto con el
convierte en hidrolisa el enlace
HCl del estomago
quimiotripsina π, que peptidico lisina-
junto a otras iguales isoleucina del
origina quimiotripsina tripsinogeno.
α
pH de activación 1,8 - 2 8.0 5.2 -6
Proteínas
Proteínas polipeptidos
Sustratos proteinas polipeptidos
perptidos
perptidos
pepsina + 42 restos Quimotripsina + 2 tripsina +
Productos
de aminoácidos Dipéptidos Hexapeptido

 Enzimas interconvertibles: Son aquellas que pueden exixtir en dos estados:

activo ó inactivo, y pueden pasar de uno a otro a través dela unión covalente o
separación de un grupo químico de su estructura.

86
La forma modificada de la enzima se denomina “m” y la forma original se designa “o”, la
interconversion siempre es catalizada por otras enzimas (E1 y E2), las cuales, a su vez
pueden ser reguladas alostéricamente o por modificacioens químicas.
La modulación reversible de la actividad catalítica de las enzimas puede producirse
por la adherencia covalente de un grupo fosfato o de nucleótidos. Las enzimas
que experimentan modificación covalente con modulación concomitante de su
actividad se denominan enzimas interconvertibles .
Las enzimas interconvertibles existen en dos condiciones de actividad, una de eficacia
catalítica elevada y otra de baja eficacia. Dependiendo de la enzima que se trate, el
catalizador mas activo puede ser la fosfoenzima a lo que no posee grupo fosfato.

ISOENZIMAS. ENZIMAS PLASMÁTICAS FUNCIONALES Y NO

FUNCIONALES. IMPORTANCIA CLÍNICA DE LA DETERMINACIÓN
PLASMÁTICO DE ENZIMAS (ENZIMAS ESCAPE).

Isoenzimas: Son proteínas con diferente estructura pero que catalizan la misma reacción,
con frecuencia son oligomeros de diferentes cadenas peptidicas y usualmente difieren en
los mecanismos de regulación y las características cinéticas. Fisiológicamente esto
permite que haya enzimas similares con diferentes características, de acuerdo a los
requerimientos específicos del tejido o determinadas condiciones metabólicas.

Un ejemplo de isoenzima es la lactato deshidrogenasa (LDH), que consta de dos tipos de

monómeros: H (de Heart) y M de musculo que se combinan para originar 5 isoformas, y
que sintetizan la reacción:

𝐿𝑎𝑐𝑡𝑎𝑡𝑜 + 𝑁𝐴𝐷+ ↔ 𝑃𝑖𝑟𝑢𝑣𝑎𝑡𝑜 + 𝑁𝐴𝐷𝐻 + 𝐻 +

Isoforma Composición Ubicación % Sérico

total
LDH 1 HHHH corazón y glóbulos rojos 17% – 27%
LDH 2 MHHH corazón y glóbulos rojos 27% – 37%
LDH 3 MMHH variedad de órganos 18% – 27%
LDH 4 MMMH variedad de órganos 3% – 8%
LDH 5 MMMM hígado músculo esquelético 0% – 5%

87
Enzimas plasmáticas funcionales y no funcionales:

 Enzimas plasmáticas funcionales.- Se sintetizan en el hígado pero siempre se

presentan en la circulación sanguínea y realizan una función fisiológica en la
sangre. Incluyen: proteínas inmunoglobulinas, la albúmina, la pseadocolinesterasa
y las proenzimas de la coagulación sanguínea.
 Enzimas plasmáticas no funcionales.- No realizan ninguna funcion fisiológica
conocida, se presentan en la sangre de personas sanas en concentraciones
millones de veces menos a la de los tejidos. Su presencia en el plasma en
concentraciones por arriba de los valores normales sugiere un incremento en la
velocidad de destrucción tisular. Incluyen las glándulas presentes en secreción
exocrinas: amilasa pancreática, lipasa, fosfatasa alcalina biliar y fosfatasa ácida
prostática y las enzimas intracelulares verdaderas

Importancia clínica de la determinación plasmática de enzimas (enzimas de

escape):

Por mucho tiempo, la práctica profesional médica ha usado la cuantificación de ciertas

enzimas plasmáticas no funcionales. Esta valiosa información para el diagnóstico y
pronostico se obtiene muchas veces con equipos automáticos.
El análisis cuantitativo de la actividad de las enzimas de otras proteínas liberadas
proporciona información respecto del diagnostico, pronostico y respuesta al tratamiento.
En el análisis de la actividad enzimática de manera característica se emplean
valoraciones cinéticas estándar de índices de reacción inicial.

Las enzimas hepáticas típicas que se determinan son la AST y la ALT. La ALT es
diagnostica de daño hepático porque esta enzima se encuentra predominantemente en
los hepatocitos. Cuando se miden ambas la AST y la ALT el radio de los niveles de estas

88
enzimas también puede ser de diagnostico. La medición de la AST es util no solamente
para detectar daño hepático sino también para detectar daño o enfermedad cardiaca.
Luego del daño, los niveles de AST se incrementan dentro de las primeras 8 horas y
hacen un pico 24 a 36 horas mas tarde. Dentro de los 3 a 7 días los niveles de AST deben
regresar a los niveles antes del daño, previendo que no este presente un daño continuo o
que un nuevo insulto ocurra. Aunque la medición de AST no es, en si misma, diagnostico
para infarto del corazón, en conjunto con las mediciones de LDH y CK, el nivel de AST es
util para determinar el tiempo del infarto. La CPK se encuentra primariamente en los
músculos cardiaco y esquelético así como también en el cerebro. Por tanto, las
mediciones de los niveles de CPK en el suero es un buen diagnostico de daño de estos
tejidos. Los niveles de CPK se incrementaran dentro de las 6 horas luego del daño y
harán un pico alrededor de las 18 horas. Si el daño no es persistente el nivel de CK
regresa a lo normal en 2 a 3 días. Como la LDH, existen isozimas tejido específicas de
CPK y sus designaciones se indican abajo:

 CPK3 (CPK-MM) es la isozima predominante en el músculo y es 100% del nivel

sérico total.
 CPK2 (CPK-MB) corresponde al 35% de la actividad de la CPK en el músculo
cardiaco, pero menos del 5% en el músculo esquelético y es el 0% del nivel sérico
total.
 CPK1 (CPK-BB) es la isozima característica del cerebro y esta en cantidades
significativas en el músculo liso y es el 0% del nivel sérico total.

Debido a que la mayoría de la CPK liberada en un infarto del corazón es la CPK-MB, un

radio elevado de CPK-MB a CPK total puede ayudar en el diagnostico de un infarto
agudo, pero un incremento de CPK solamente no. Los niveles de CPK-MB se
incrementan 3–6 horas del infarto del miocardio y hacen un pico entre las 12–24 horas
mas tarde si no hay mas daño y regresan a valores normales a las 12–48 horas luego del
infarto.

Otras enzimas séricas son:

Enzima sérica Principal uso diagnóstico

(AST) Aspartato Infarto de miocardio
Aminotranferasa
(ALT) Alanina Hepatitis viral
Aminotrasferasa
Amilasa Pancreatitis aguda
Ceruloplasmina Degeneración hepatolenticular (enfermedad de Wilson)
Creatina Cinasa Transtornos Celulares e infarto al miocardio
γ- glutamil transferasa Diversas enfermedades hepaticas
Isoenzima 5 de la LDH Enfermedades hepaticas
Lipasa Pancreatitis aguda
Fosfatasa ácida Carcinoma metastasico de próstata
Fosfatada alcalina Trastornos óseos, enfermedades hepáticas obstructivas

89
 PROCEDIMIENTOS CLÁSICOS PARA LA CUANTIFICACIÓN, PURIFICACIÓN
Y LOCALIZACIÓN INTRACELULAR DE ENZIMAS.

Cuantificación de las enzimas: La teoría fundamental de la catálisis enzimática se basa

en los estudios clásicos de Michaelis y Menten y de Haldane .El análisis cuantitativo de la
acción de las enzimas que ha sido desarrollado depende en gran medida de la
determinación de las velocidades de reacción.

Si la velocidad de reacción inicial, definida como la velocidad observada para una

cantidad dada de enzima cuando la concentración del producto formado está próxima a
cero, se expresa en función de la concentración del sustrato.

Purificación de las enzimas: El objetivo de la purificación enzimática es aislar una

enzima específica a partir de un extracto celular crudo, que contiene muchos otros
componentes. Las moléculas pequeñas pueden eliminarse mediante diálisis o filtración en
gel; los ácidos nucleicos mediante precipitación con el antibiótico estreptomicina; y a si
sucesivamente. El problema consiste en separar la enzima deseada de los cientos de
proteínas químicamente y físicamente similares.
Las enzimas se obtienen a partir de fuentes naturales, o de las células las cuales se
expresan a partir de genes clonados.
Hoy en día, la tecnología del DNA recombinante permite a los científicos reproducir
proteínas en células en las cuales dichas proteínas no se presentan normalmente. Las
células huésped típicas corresponden a las bacterias y a las levaduras, fáciles de cultivar
en grandes cantidades.
La capacidad para expresar proteínas recombinantes en concentraciones relativamente
grandes, permite a los científicos aislar enzimas cuyas escasas concentraciones en las
células donde se presentan de manera natural, hacen difícil purificarlas. Incluso el
modificar el DNA que codifica la proteína mediante mutagénesis puntual dirigida, los
científicos pueden adicionar, eliminar o modificar aminoácidos específicos en la enzima
recombinante, con objeto de facilitar la determinación de sus participaciones funcionales o
estructurales. Sin embargo la purificación de las enzimas a partir de las fuentes naturales
sigue siendo importante, con objeto de identificar la naturaleza y función de las
modificaciones postraduccionales que regulan la localización y la eficiencia catalítica de la
enzima.
Para la purificación se utiliza cromatografía de intercambio iónico o cromatografía con
soportes de exclusión
Los procedimientos clásicos de purificación útiles incluyen precipitación con diversas
concentraciones salinas (por lo general sulfato de amonio o de sodio) o solventes
(acetona o etanol), a si como desnaturalización mediante calentamiento diferencial o pH,
centrifugación diferencial, filtración en gel y electroforesis. Para la purificación extensa y
rápida de las proteínas, también han resultado extremadamente exitosas la adsorción y la
elucion selectivas de las proteínas de celulosa de intercambio anionico, dietilaminoetil
celulosa (DEAE), y en la de intercambio catiónico carboximetilcelulosa (CMC).

90
Por ejemplo, un extracto acuoso de tejido hepático se ajusta a un pH de 7.5 en el cual la
mayor parte de las proteínas poseen una carga negativa neta. Enseguida se aplica la
mezcla de proteínas solubles a una columna de celulosa DEAE amortiguada a un pH de
7.5, en el cual la DEAE presenta carga positiva. Luego, las proteínas con carga negativa
se enlazan a la DEAE mediante interacción de carga opuesta, al tiempo que las proteínas
sin carga o con carga positiva fluyen directamente a lo largo de la columna. A
continuación se eluye la columna, casi siempre mediante un gradiente, desde una
concentración baja hasta una alta de NaCl disuelto en amortiguador con pH de 7.5.
Toda vez que el Cl compite con las proteínas por el enlace al soporte con carga positiva,
las proteínas se eluyen selectivamente; primero la mas débilmente enlazada, y al final la
enlazada con mas fuerza. La separación de las proteínas análogas utiliza un soporte con
carga negativa, como la carboximetilcelulosa o la fosfocelulosa, a un pH algo menor, a fin
de asegurar que las proteínas posean mas carga positiva.
La separación de las proteínas también puede lograrse con materiales porosos conocidos
como “filtros moleculares”. Cuando una mezcla de proteína fluye a través de una columna
con filtro molecular, las proteínas pequeñas se distribuyen en los espacios entre las
partículas y en los espacios internos de los poros del soporte. Conforme la mezcla de
proteínas de tamaños diferentes fluye a lo largo de la columna, se retarda la movilidad de
las proteínas pequeñas respecto a las proteínas que son demasiado grandes para
ingresar a estos poros. Por tanto, las proteínas grandes emergen a la columna antes que
las proteínas más pequeñas. El perfil de la elusión presenta un patrón gradual de las
proteínas, que va desde las más grandes hasta las más pequeñas. Sin embargo los filtros
moleculares tienen una capacidad limitada y por lo general se utilizan solo después de
lograr, mediante otras técnicas, la purificación inicial.
La afinidad de los soportes cromatograficos reconoce regiones especificas de las enzimas
La característica sobresaliente de la cromatografía por afinidad consiste en el aislamiento
selectivo de una proteína en particular, o cuando mucho, de una cantidad pequeña de
proteínas particulares a partir de una mezcla proteica compleja. La técnica utiliza un
ligando inmóvil que interactúa de manera con la enzima cuya purificación se desea. Al
exponer la mezcla proteica a este ligando inmóvil, las únicas proteínas que se enlazan
son las que interactúan fuertemente con el ligando; las proteínas indeseables fluyen a lo
largo de la columna y se descartan. A continuación, la proteína deseada se eluye a partir
del ligando inmóvil, por lo general una gran concentración de sal, o mediante la variante
soluble del ligando.
Las purificaciones logradas mediante las técnicas cromatográficas por afinidad resultan
impresionantes, y a menudo superan lo que es posible lograr mediante la aplicación
sucesiva de diversas técnicas típicas.
Los ligandos preferidos corresponden a los derivados de los sustratos y de las coenzimas,
o los colorantes orgánicos, los cuales actúan como análogos de nucleótidos o de
coenzimas enlazados de manera covalente a un soporte inerte. Estos ligandos se
adhieren al soporte mediante una molécula enlazadora con una longitud de 3 a 8
carbonos. Sin embargo el “enlazador” hidrófobo puede complicar la separación, al

91
introducir un elemento correspondiente a la cromatografía de ligando hidrófobo. Los
ejemplos de cromatografía por afinidad exitosa incluyen la purificación de diferentes
deshidrogenasas en soportes con afinidad por NAD. Si bien es posible el enlace de
muchas deshidrogenasas y la correspondiente elusión conjunta al tratar la columna con
NAD soluble, la utilización subsecuente de soportes con afinidad de sustrato (en vez de
coenzima) o la elusión con una mezcla ternaria abortiva de un producto y un sustrato,
han demostrado resultar exitosas en muchos casos.
En la cromatografía con ligando hidrófobo se adhiere un hidrocarburo alquilo, o un arilo, a
un soporte como Sephadex. La retención de las proteínas en estos soportes involucra
interacciones hidrófobas entre la cadena alquilo y las regiones hidrófobas de la proteína.
Las proteínas se aplican en soluciones que contienen una alta concentración salina y se
eluyen con gradientes decrecientes de la misma sal.
Las proteinas de fusion recombinantes se purifican mediante cromatografia por afinidad
Además de proporcionar una fuente abundante de una enzima, lo cual facilita en gran
mediada la purificación, la tecnología del DNA recombinante puede utilizarse para crear
proteínas modificadas, las cuales pueden purificarse mediante cromatografía por afinidad.
El enfoque general consiste en enlazar al gen secuencias de nucleótidos que codifican
para extensiones de la proteína, generando una proteína de fusión que se utiliza como
ligando para un soporte de afinidad especifica. Un sistema común consiste en enlazar una
tira de 5 o 6 histidinas, o como opción, el dominio para el enlace del sustrato en la enzima
glutation S- transferasa, a las terminales amino o carboxilo de las enzimas de interés. A
continuación es posible purificar la proteína de fusión recombinante, en una columna por
afinidad en la cual, para el enlace se coloca un ion metálico divalente como el Ni (para las
fusiones con polihistidina) o glutatión (para las proteínas de fusión de la glutatión S-
transferasa). A menudo las proteínas de fusión incorporan, en la región que enlaza las
dos partes de la proteína de fusión, un sitio de escisión para la proteasa muy especifica,
como la trombina. Esto permite la remoción del dominio de fusión adicionado, después de
la purificación por afinidad.

Localización intracelular de las enzimas: Las enzimas pueden presentarse en

orgánulos específicos. El arreglo espacial y la compartimentalización de las enzimas, los
sustratos y los cofactores en el interior de la célula, resultan de importancia cardinal. Por
ejemplo, en las células hepáticas, las enzimas para la glucólisis se localizan en el
citoplasma, en tanto que las enzimas para el ácido cítrico se hallan en las mitocondrias.
La distribución de las enzimas entre los organelos subcelulares, pueden estudiarse
después del fraccionamiento de los homogeneizados celulares, mediante centrifugación
de alta velocidad.
Con frecuencia, es posible obtener la localización de una enzima particular de un tejido o
en una célula mediante procedimientos histoquímicos (histoenzimología). Para ello, los
cortes congelados de tejido delgados (2 a 10 um) se tratan con un sustrato de una enzima
particular. En presencia de la enzima se forma el producto de la reacción catalizada por
dicha enzima.

92
Si dicho producto es colorido e insoluble, permanece en el sitio de su formación y localiza
a si a la enzima.
La histoenzimologÍa proporciona una representación gráfica y relativamente fisiológica de
los patrones de la distribución enzimática.
La localización subcelular de los sistemas enzimáticos puede resumirse de la siguiente
manera. Muchas enzimas asociadas al núcleo participan en el mantenimiento, la
renovación y la utilización del aparato genético. La mayoría de las enzimas mitocondriales
guardan relación con la producción de energía o con reacciones oxidativas que
proporcionan la fuerza de inducción necesaria para muchas funciones celulares.

Las enzimas asociadas a los ribosomas favorecen la biosíntesis de proteínas. Los

lisosomas contienen enzimas que catalizan la destrucción hidrolítica de materiales que la
célula ya no necesita.

El complejo de Golgi es un sistema de túmulos y vesículas que actúan en las células

secretoras para reunir y expulsar de la célula proteínas u otros productos del
metabolismo celular. En las células especializadas en la absorción, el complejo de Golgi,
parece actuar de forma opuesta: reúne el material captado por otras células.

Por otro lado, las enzimas citosólicas catalizan el tipo de metabolismo de los
carbohidratos conocido como glucólisis. Las enzimas responsables de la biosíntesis de
los ácidos grasos son también citosólicas aunque, a diferencia de las que participan en la
glucólisis, éste sistema de enzimas se halla perfectamente organizado en forma de un
péptido de gran longitud que desarrolla las siete actividades enzimáticas necesarias.

Los orgánulos aislados muestran a menudo su propia arquitectura estructural con más
detalle. Así por ejemplo, las partículas mitocondriales tienen una doble membrana. La
membrana interna, la membrana externa y el espacio entre ellas constituyen regiones,
cada una de las cuales posee grupos específicos de enzimas que desarrollan así sus
funciones de manera más eficaz. Esta misma descripción es aplicable a la membrana que
delimita la célula. O membrana plasmática, que no es una simple barrera inerte; contiene
su propia serie característica de enzimas, la mayoría de las cuales favorecen o controlan
la entrada de materiales en la célula o la salida de las sustancias de ella.

93
 UNIDAD IV QUÍMICA Y METABOLISMOS DE NUCLEÓTIDOS

ESTRUCTURA DE NUCLEÓTIDOS Y NUCLEÓSIDOS

Nucleósidos

Corresponde al esquema general: 𝑛𝑢𝑐𝑙𝑒ó𝑠𝑖𝑑𝑜 = 𝑏𝑎𝑠𝑒 𝑛𝑖𝑡𝑟𝑜𝑔𝑒𝑛𝑎𝑑𝑎 + 𝑎𝑧ú𝑐𝑎𝑟

La unión de una base nitrogenada a una pentosa da lugar a los compuestos llamados
Nucleósidos. Pueden considerarse como el producto de la hidrólisis de los nucleótidos,
con liberación de fosfato inorgánico. Equivale, por lo tanto, a un nucleótido carente de
fosfatos.

La unión base-pentosa se efectúa a través de un enlace glicosídico, con configuración

beta (β) entre el carbono uno de ribosa o desoxirribosa, y un nitrógeno de las base, el 1
en las pirimidinas, y el 9 en las purinas, con la pérdida de una molécula de agua.
Para evitar confusiones en la nomenclatura de nucleósidos y nucleótidos, los átomos de la
pentosa se designan con números seguidos de un apóstrofe (1', 2', 3', 4' y 5'), para
distinguirlos de los de la base, por lo que los enlaces de los nucleósidos se designan
como β(1’-1) en las pirimidinas y β(1’-9) en las purinas.

Como el enlace glicosídico es sencillo, las bases pueden presentar dos conformaciones
diferentes:
• anti cuando el plano de la base está alejada del plano de la pentosa
• syn cuando las bases están sobre el plano de la pentosa

94
 Los nucleósidos púricos pueden presentar ambas conformaciones, aunque la anti es más
estable; los pirimidínicos sólo pueden existir en anti, porque el Oxígeno en el carbono 2 no
permite que se forme la syn.

Debe distinguirse entre nucleosidos constituyentes de acidos nucleicos y otros

nucleosidos de interés biológico y clínico. Su descripción siempre se hace en función de la
naturaleza química de la base del azúcar.

La pentosa puede ser D-Ribosa (D-ribofuranosa), en cuyo caso hablamos de

Ribonucleósidos, o bien 2-D-Desoxirribosa (D-desoxirribofuranosa), constituyendo los
Desoxirribonucleósidos.

Nucleósidos purinicos Nucleósidos pirimidinicos

Ribonucleosido (en
Tipo

Ribonucleosidos (se encuentran en el

RNA) y Desoxirribonucleosido Ribonucleosido
RNA) y desoxirribonucleosidos (se
desoxirribonucleosido (en DNA) (en RNA)
encuentran en el DNA)
(en DNA)
Estructura

Sufijo -osina Sifujo -idina

Adenosina guanosina Uridina
Citidina
9-(1'-β- 9-(1'-β- 1-(1'-β-
1-(1'-β-ribofuranosil) no existe
riboruranosil) riboruranosil) ribofuranosil)
Nombre

citosina
adenosina guanina uridina
2'-
2'-desoxiadenosina
desoxiguanosina 2'-desoxicitidina 2'-desoxitimidina
9-(2'-desoxi-1'-β-D-
9-(2'-desoxi-1'-β- 1-(2'-desoxi-1'-β-D- 1-(2'-desoxi-1'-β-D- no existe en DNA
ribofuranosil)
D- ribofuranosil) ribofuranosil) citosina ribofuranosil) timina
adenina
guanina

En los tRNA existen en forma característica, nucleósidos modificados como la

Seudouridina, formada por Uracilo y Ribosa unidos a través de un enlace β (1’-5).
También se encuentra un nucleósido de Timina y Ribosa, la Ribotimidina. Otro nucleósido
presente en el tRNA es la Dihidrouridina, formado por Ribosa y Dihidrouracilo unidos por
enlace β(1’-1).
En el metabolismo de las bases púricas se forma un nucleósido con Hipoxantina y Ribosa
llamado Inosina.

95
Nucleótidos

Corresponden a: 𝐵𝑎𝑠𝑒 𝑛𝑖𝑡𝑟𝑜𝑔𝑒𝑛𝑎𝑑𝑎 + 𝑎𝑧𝑢𝑐𝑎𝑟 + Á𝑐𝑖𝑑𝑜 𝑓𝑜𝑠𝑓𝑜𝑟𝑖𝑐𝑜 = 𝑛𝑢𝑐𝑙𝑒𝑜𝑡𝑖𝑑𝑜

Los nucleótidos son los ésteres fosfóricos de los nucleósidos. Están formados por la unión
de un grupo fosfato al carbono 5’ de una pentosa. A su vez la pentosa lleva unida al
carbono 1’ una base nitrogenada.

Se forman cuando se une ácido fosfórico a un nucleósido en forma de ión fosfato (PO43-)
mediante un enlace éster en alguno de los grupos -OH del monosacárido. El enlace éster
se produce entre el grupo alcohol del carbono 5´ de la pentosa y el ácido fosfórico.
Aunque la ribosa tiene tres posiciones en las que se puede unir el fosfato (2’, 3’ y 5’), y en
la desoxirribosa dos (3’ y 5’), los nucleótidos naturales más abundantes son los que tienen
fosfato en la posición 5’. Nucleótidos con fosfato en 3’ aparecen en la degradación de los
ácidos nucleicos.
Se nombra como el nucleósido del que proceden eliminando la a final y añadiendo la
terminación 5´-fosfato, o bien monofosfato; por ejemplo, adenosín-5´-fosfato o adenosín-
5´-monofosfato (AMP).

En lo que se refiere a los desoxinucleótidos, la diferencia es que no pueden formarse en

el carbono 2' por razones obvias (no hay grupo -OH) por lo que sólo puede haber 3' y 5'-
desoxinucleótidos. Veremos a título de ejemplo los nucleótidos de las cuatro bases que
forman parte del DNA:

Desoxinucleótidos
Nombre sistemático Abreviatura
Desoxiadenosina-5'-monofosfato dAMP
Desoxiguanosina-5'-monofosfato dGMP
Desoxicitidina-5'-monofosfato dCMP
Timidina-5'-monofosfato TMP
Además de formar la estructura de los ácidos nucleicos los nucleótidos tienen otras
funciones relevantes:

96
 1. El nucleósido Adenosina tiene funciones de neurotransmisor.
2. ATP es la molécula universal para transferencia de energía;
3. UDP y el CDP sirven como transportadores en el metabolismo de glúcidos,
lípidos..
4. AMPc, GMPc y el propio ATP cumplen funciones reguladoras;
5. AMP forma parte de la estructura de coenzimas como FAD, NAD+, NADP+ y CoA.
Aparte de su carácter como monómeros de ácidos nucleícos, la estructura de nucleótido
está generalizada entre las biomoléculas, y particularmente como coenzimas. Entre las
más representativas podemos nombrar:
• Niacina adenina dinucleótido (forma reducida, NADH).
• Flavina Adenina dinucleótido (FAD).
• Coenzima A (forma acetilada, Acetil-CoA).
• Uridina difosfato glucosa (UDPG).

97
Propiedades fisicoquímicas de nucleótidos y Nucleósidos

 Propiedades iónicas: Como consecuencia de la disociación en disolución acuosa

des los grupos P, PP, y PPP, todos los nucleótidos muestran un marcado carácter
acido, con 2,3 y 4 valores de pK a, respectivamente. En general, al ser sus valores
de pKa inferiores a 7. Se encuentran cargados negativamente (existen como
aniones) a pH fisiológico. Gracias a este carácter anionico, los nucleótidos forman
sales con metales, son cristalizables y son mas solubles en agua que los
nucleosidos o sus bases nitrogenadas.
 Formación de complejos: Los grupos PP de NDPs y PPP de NTPs muestran gran
afinidad por cationes divalentes como Mg, Mn, y Ca. Al estar estos presentes a
alta concentración en la célula, los NDPs y NTPs no existen como aniones libres,
sino formando complejos quelato
 Absorción de la luz ultravioleta: Los nucleótidos y nucleósidos muestran el
característico máximo de absorción de la luz UV a 260nm, debido a la base
nitrogenada correspondiente.
 Moléculas de reserva energética: Muchos nucleótidos actúan en todo tipo de
células y en multitud de procesos metabólicos como compuestos ricos en energía.
Entre ellos los nucleósidos trifosfato que intervienen como precursores de la
síntesis de DNA y RNA con liberación de pirofosfato.
 Hidrólisis: Los Nucleósidos y nucleótidos pueden ser hidrolizados en sus
componentes, en medio acido o alcalino. Esta hidrólisis química posee cierto
interés en el estudio de los acidos nucleícos.

98
 NUCLEÓTIDOS DE LOS ÁCIDOS NUCLEÍCOS.

Todo nucleótido se compone de una base nitrogenada, ya sea purina que origina adenina
y guanina, o pirimidina que da origen a citosina, uracilo y guanina. Ademas de esta base
posee una azúcar ya sea de tipo D-ribosa para el ARN o Desoxi-D-ribosa para el ADN, y
por ultimo de un fostato, del que dependiendo el numero se dira es mono, di, o trifosfato.
Se llama ácido ribonucleico (RNA) al ácido nucleico formado por ribonucleótidos. Al ácido
nucleico formado por ribonucleotidos. Al acido nucleico formado por
desoxirribonucleótidos se le denomina ácido desoxirribonucleico (DNA).
Los acidos nucleícos consisten, con escasas excepciones, en DNA puro o en RNA puro,
siendo las funciones del DNA y del RNA muy distintas. En la célula, el DNA es una
molecula que sirve para almacenar información; el RNA, para traducirla. En los ácidos
nucleícos hay dos tipos de bases: purinas y pirimidinas:

En los ácidos nucleícos hay dos bases púrinicas, la adenina y la guanina.

En los ácidos nucleícos se presentan tres bases pirimidinicas: el uracilo, la timina y la

citosina.

99
 Ac. Nucleícos Base nitrogenada Azúcar Fosfato
 Adenina
Monofosfato
 Citosina
ADN Desoxi-D-ribosa Difosfato
 Guanina
Trifostafo
 Timina
 Adenina
Monofosfato
 Guanina
ARN D-ribosa Difosfato
 Citosina
Trifostafo
 Uracilo

OTROS NUCLEÓTIDOS DE IMPORTANCIA, AMPc, NAD, FAD Y FMN.

AMPc: El AMP también puede aparecer en forma de una estructura conocida como
adenosín monofosfato cíclico. En ciertas células la adenilato ciclasa crea AMPc a partir de
ATP, en un proceso regulado por hormonas como la adrenalina o el glucagón. El AMPc
tienen una función importante en la señalización intracelular.
Al gusto humano, las cualidades de supresión del amargor se traducen en la apariencia
más dulce de la comida. Esto permite que los productos bajos en calorías sean más
agradables, lo que transforma el AMP en una buena solución para los productores de
alimentos para responder a la creciente preocupación por la obesidad.

NAD: El dinucleótido de nicotinamida y adenina más conocido como nicotinamida adenina

dinucleótido; abreviado NAD+ en su forma oxidada y NADH en su forma reducida, es una
coenzima encontrada en células vivas y compuesta por un dinucleótido, ya que está
formado por dos nucleótidos unidos a través sus grupos fosfatos, siendo uno de ellos una
base de adenina y el otro de nicotinamida. Su función principal es el intercambio de
electrones e hidrogeniones en la producción de energía de todas las células.

En el metabolismo, el NAD+ está implicado en reacciones de reducción-oxidación,

llevando los electrones de una reacción a otra. Debido a esto, la coenzima se encuentra

100
en dos formas: como un agente oxidante, que acepta electrones de otras moléculas.
Actuando de ese modo da como resultado la segunda forma de la coenzima, el NADH, la
especie reducida del NAD+ y puede ser usado como agente reductor para donar
electrones. Las reacciones de transferencia de electrones son la principal función del
NAD+, que también se emplea en otros procesos celulares, siendo el más notable su
actuación como sustrato de enzimas que adicionan o eliminan grupos químicos de las
proteínas en las modificaciones postraduccionales. Debido a la importancia de estas
funciones, las enzimas involucradas en el metabolismo del NAD+ son objetivos para el
descubrimiento de fármacos.

FAD: El flavín adenín dinucleótido o dinucleótido de flavina-adenina (FAD en su forma

oxidada y FADH2 en su forma reducida) es un coenzima que interviene en las reacciones
metabólicas de oxidación-reducción.

El FAD es una molécula compuesta por una unidad de riboflavina (vitamina B2), unida a
un pirofosfato (P-P), éste unido a una ribosa y ésta unida a una adenina. Por tanto.., la
molécula es en realidad ADP unido a riboflavina; o también AMP unido al coenzima FMN.
La función bioquímica general del FAD es oxidar los alcanos a alquenos, mientras que el
NAD+ oxida los alcoholes a aldehídos o cetonas. Esto es debido a que la oxidación de un
alcano (como el succinato) a un alqueno (como el fumarato) es suficiente exergónica
como para reducir el FAD a FADH2, pero no para reducir el NAD+ a NADH.

La reoxidación del FADH2 tiene lugar en la cadena respiratoria, lo que posibilita la

formación de ATP

FMN: El flavin mononucleótido (FMN), o riboflavina-5'-fosfato, es un derivado de la

riboflavina (vitamina B2) que actúa como coenzima de diversas oxidoreductasas. Durante
el ciclo catalítico se produce la interconversión reversible entre la forma oxidada (FMN),
semiquinona (FMNH•) y reducida (FMNH2) de la coenzima.

El FMN es un agente oxidante más fuerte que el NAD+ y es particularmente útil ya que
puede tranferir uno o dos electrones. Es la principal forma en que se halla la riboflavina en
las células y tejidos.

101
Precursores biosinteticos de los nucleótidos purínicos y pirimidínicos. Productos
resultantes

Purinas Pirimidinas

Inicio de síntesis ATP, D-RIBOSA – 5 P CO2, ATP, GLU

PRODUC. DE VÍAS DE
AMP, GMP CTP, TMP
SÍNTESIS
PRPP SINTETASA (
AMP, ADP, GMP,
CARBAMOIL FOSFATO
GDP, TDP,)
ENZIMAS SINTASA
PRPP –
ALOSTÉRICAS E ASPARTATO TRANS
GLUTAMILAMIDO-
INHIBIDORES CARBAMOILASA
TRANFERASA (GMP)
inhibidores
Enzima d ramificación
(3) Y activadores
Ac. Urico,
PRODUCTOS DEL CO2, NH3, B- alanina, B-
concentraciones
CATABOLISMO amino isobutirato
normales
CO2, C-6,
GLU, N-9, N-3
ASP N-1, CARBAMOIL FOSFATO N-
PRECURSORES METENILFOLATOS C- 3, C-2
8 ASP C-4, C-5,C-6 , N-1
FORMIL FOLATOC-2
GLI N-7, C-4, C-5
PRECURSORES EN
ASP, CO2, GLU
COMUN
 Citosina: 2-oxi-4-
 Adenina: 6-
aminopirimidina
aminopurina
NOMBRE QUÍMICO  Timina: 2,4-dioxi-
 Guanina: 2-
DE BASES 5 metilpirimidina
amino-6-
 Uracilo: 2,4-
oxipurina
dioxipirimidina

102
103
 UNIDAD V. BIOQUÍMICA DE LOS ÁCIDOS NUCLÉICOS.

Organización de la cromatina y sus diferentes formas.

La cromatina consta de moléculas de DNA de doble cadena muy largas, y una masa casi
igual de proteínas básicas más bien pequeñas llamadas histonas, así como una cantidad
menor de proteínas no histonas, y una pequeña cantidad de RNA. Las proteínas no
histonas incluyen enzimas involucradas en la replicación y reparación del DNA, y las
proteínas participantes en la síntesis, el procesamiento y el transporte hacia el citoplasma,
del RNA. La hélice de DNA bicatenario en cada cromosoma tiene una longitud que es
miles de veces el diámetro del núcleo de la célula. Un propósito de las moléculas que
comprenden la cromatina, en especial las histonas, es condensar el DNA. En estudios de
microscopia electrónica de cromatina se han demostrado partículas esféricas densas
denominadas nucleosomas, que tienen alrededor de 10 nm de diámetro y están
conectadas por medio de filamentos de DNA. Los nucleosomas están compuestos de
DNA enrollado alrededor de un conjunto de moléculas de histona.

Las histonas son una familia pequeña de proteínas básicas estrechamente relacionadas.
Las histonas H1 son las que están menos estrechamente unidas a la cromatina y, en
consecuencia se eliminan con facilidad con una solución salina, tras lo cual la cromatina
se hace más soluble. La unidad organizacional de esta cromatina soluble es el
nucleosoma. Los nucleosomas contienen cuatro tipos de histonas: H2A, H2B, H3 y H4.
Éstas son las llamadas histonas centrales que forman el nucleosoma.

Las histonas interactúan entre sí de modos muy específicos, H3 y H4 forman un tetrámero

que contiene dos moléculas de cada una (H3-H4)2, mientras que H2A y H2B forman
dímeros (H2A-H2B). En condiciones fisiológicas, estos oligómeros de histona se asocian
para formar el octámero de histonas de la composición (H3-H4)2-(H2A-H2B)2.

El tetrámero (H3-H4)2 en sí puede conferir propiedades parecidas a nucleosoma sobre el

DNA y, de esta manera, tiene una función fundamental en la formación del nucleosoma.
La adición de dos dímeros H2A-H2B estabiliza la partícula primaria y une firmemente dos
medias vueltas adicionales de DNA previamente unidas sólo de modo laxo al (H3-H4)2.
De esta manera. 1.75 giros de superhélice de DNA están enrollados alrededor de la
superficie del octámero de histonas, lo que protege 146 pares de bases de DNA y forma
la partícula central del nucleosoma. En la cromatina, las partículas centrales están

104
separadas por una región de DNA de alrededor de 30 pb (pares de bases) denominada
“enlazador”. La mayor parte del DNA está en una serie repetitiva de estas estructuras, lo
que da el llamado aspecto en “cuentas sobre un hilo” en la microscopia electrónica.

La microscopia electrónica de la cromatina revela dos órdenes de estructura superiores, la

fibrilla de 10 nm y la fibrilla de cromatina de 30 nm, más allá que la del nucleosoma
mismo. La estructura del nucleosoma parecida a disco tiene 10 nm de diámetro y 5 nm de
altura. La fibrilla de 10 nm consta de nucleosomas dispuestos con sus bordes separados
por una distancia pequeña (30 pb de DNA) con sus caras planas paralelas al eje de la
fibrilla. La fibrilla de 10 nm probablemente está más superenrollada con 6 o7 nucleosomas
en cada vuelta, para formar la fibrilla de cromatina de 30 nm. Cada giro de la superhélice
es relativamente plano y las caras de los nucleosomas de vueltas sucesivas serían casi
paralelas entre sí. Las histonas H1 parecen estabilizar la fibra de 30 nm, pero no están
claras su posición ni la del DNA espaciador de longitud variable.

105
Algunas regiones de la cromatina con “activas” y otras “inactivas”. La cromatina inactiva
en el aspecto transcripcional está densamente aglomerada durante la interfaz, como se
observa mediante estudios con microscopia electrónica, y se denomina heterocromatina;
la cromatina activa desde el punto de vista transcripcional se tiñe menos densamente, y
se llama eucromatina.

Hay dos tipos de heterocromatina: constitutiva y facultativa. La heterocromatina

constitutiva siempre está condensada y, de este modo, es en esencia inactiva. Se

106
encuentra en las regiones cercanas al centrómero cromosómico y en terminaciones
cromosómicas (telómeros). La heterocromatina facultativa en ocasiones está condensada,
pero algunas veces se transcribe de manera activa y, así, está no condensada y aparece
como eucromatina.

Cromosomas: una forma de organización de la cromatina.

En el transcurso de la metafase, los cromosomas poseen una simetría doble, con las
cromátides hermanas duplicadas idénticas conectadas en un centrómero, cuya posición
relativa es característica para un cromosoma dado. El centrómero es una región rica en
adenina-timina (A-T) que contiene secuencias de DNA repetidas que varían en tamaño
desde 102 hasta 106 pb.

Los extremos de cada cromosoma contienen estructuras llamadas telómeros, que constan
de repeticiones cortas ricas en TG. En seres humanos, los telómeros tienen un número
variable de repeticiones de la secuencia 5’-TTAGGG-3’, que puede extenderse por varios
kilobases. La telomerasa, un complejo que contiene RNA de múltiples subunidades
vinculado con DNA polimerasas dependientes de RNA virales (transcriptasas inversas),
es la enzima que se encarga de la síntesis de telómero y, de este modo, de mantener la
longitud del mismo.

107
 ADN como fuente de información genética. Estructura del DNA (modelo de Watson
y Crick).

El descubrimiento de que la información genética está codificada a lo largo de una

molécula polimérica compuesta por sólo cuatro tipos de unidades monoméricas, es uno
de los logros científicos más importantes de este siglo. Esta molécula polimérica, el DNA,
es la base química de la herencia y está organizada en genes, unidades fundamentales
de la información genética. Los genes controlan la síntesis de varios tipos de RNA, que en
su mayor parte están involucrados en la síntesis de proteínas. Los genes no funcionan de
manera autónoma; su replicación y funcionamiento se controlan por varios productos de
gen, a menudo en colaboración con componentes de varias vías de transducción de
señales. El conocimiento de la estructura y función de los ácidos nucleicos es esencial
para comprender la genética y muchos aspectos de la fisiopatología de la enfermedad, así
como los fundamentos genéticos de la enfermedad.

La demostración de que el DNA contiene la información genética se hizo por primera vez
en 1944 en una serie de experimentos realizados por Avery, MacLeod y McCarty, quienes
mostraron que la determinación genética del carácter (tipo) de la cápsula de un
neumococo específico podía ser transmitida a otro neumococo de un tipo capsular
diferente introduciendo DNA purificado del primer tipo en el segundo. Estos autores se
referían al agente (después mostraría ser el DNA) que efectuaba el cambio como el
“factor de transformación”). Subsecuentemente, este tipo de manipulación genética se ha
hecho común. Recientemente se han realizado experimentos similares utilizando
levaduras, células de mamíferos cultivadas, embriones de insectos y roedores como
receptores y DNA clonado como el donador de la información genética.

La naturaleza química de las unidades desoxinucleótidas mononuméricas del DNA –

desoxiadenilato, desoxiguanilato, desoxicitidilato y timidilato- . Estas unidades
monoméricas del DNA se conservan en la forma polimérica por puentes 3’, 5’ fosfodiéster
constituyendo una sola tira.

108
Segmento de la estructura de la molécula de DNA en la cual las bases purínicas y
pirimidínicas, adenina (A), timina (T), citosina (C) y guanina (G) se mantienen juntas por
un esqueleto fosfodiéster entre los fragmentos 2’-desoxirribosilo adheridos a las
nucleobases por un enlace N-gulocosídico. Nótese que el esqueleto tiene polaridad (es
decir, dirección). Esto, por lo general, se representa en la orientación 5’ a 3’.

El contenido informativo del DNA (el código genético) reside en la secuencia en que se
ordenan estos monómeros –desoxirribonucleótidos de purina y pirimidina. El polímero
posee una polaridad; un extremo tiene terminal 5’-hidroxilo o fosfato, en tanto que el otro
tiene a una fracción 3’-fosfato o hidróxilo. La importancia de esta polaridad se hará
evidente en las secciones posteriores. Dado que la información genética reside en el
orden de las unidades monoméricas en los polímeros, debe existir un mecanismo para
reproducir o replicar esta información específica con un elevado grado de fidelidad. Ese
requerimiento, junto con los datos de difracción con rayos X de la molécula del DNA y con
la observación de Chargaff de que en las moléculas de DNA la concentración de los
nucleótidos de desoxiadenosina (A) es igual a la de los nucleótidos de timidina (T) (A=T),
en tanto que la concentración de los nucleótidos de desoxiguanosina (G) es igual a la de
los nucleótidos de desoxicitidina (C) (G=C), condujo a Watson, Crick y Wilkins y proponer

109
al principio del decenio de 1950 el modelo de una molécula de doble tira del DNA. Las dos
tiras de esta molécula de doble hélice con giro a la derecha se mantienen juntos por
puentes de hidrógeno entre las bases purínicas y pirimidínicas de las respectivas
moléculas lineales. La paridad entre los nucleótidos de las tiras opuestas es sumamente
específico y depende de los enlaces del hidrógeno de A con T y de G con C.

El pareamiento de bases entre desoxiadenosina y timidina implica la formación de dos

puentes de hidrógeno. Entre la desoxicitidina y la desoxiguanosina son tres los enlaces.
Las líneas punteadas representan los puentes de hidrógeno.

En la molécula de doble tira, las restricciones impuestas por la rotación alrededor del
enlace fosfodiéster, la configuración favorecida anti del enlace glucosídico y los
tautómeros predominantes de las cuatro bases (A, G, T y C), permiten a A parearse sólo
con T y a G sólo con C. Esta restricción de pareamiento de bases explica la observación
anterior de que en una molécula de DNA de doble tira, el contenido de A es igual al de T y
el contenido de G es igual al de C. Las dos tiras de la molécula de doble hélice, cada una
de las cuales posee una polaridad, son antiparalelas, es decir, una tira corre en dirección
5’ a 3’ y la otra en dirección 3’ y 5’. Esto es análogo a dos calles paralelas, cada una con
un solo sentido, pero con el movimiento del tránsito de direcciones opuestas. En las
moléculas de DNA de doble tira, dado que la información genética reside en la secuencia
de nucleótidos de una, la tira codificadora; la opuesta se considera la tira no codificadora
debido a que es complementaria de la transcripción de RNA que codifica proteínas.

110
Las dos tiras, en donde las bases están opuestas, se conservan juntas por puentes de
hidrógeno, giran alrededor de un eje central para formar una hélice doble. El DNA de tira
doble existe en seis formas por lo menos (A a E y Z). Bajo condiciones fisiológicas
(escasa sal, grado elevado de hidratación), la forma B alrededor del eje de la molécula
contiene 10 pares de bases. La longitud de expansión de ese giro es de 3.4nm. Su
anchura (diámetro helicoidal) es de 2 nm.

Tres puentes de hidrógeno unen al nucleótido desoxiguanosina con el nucleótido

desoxicitidina en tanto que el otro par, el A-T, se conserva junto por dos puentes de
hidrógeno. Por tanto el enlace G-C es más fuerte, aproximadamente en 50 por ciento.
Debido a esa fuerza adicional y también por las interacciones de las columnas, las
regiones de DNA ricas en enlaces G-C son mucho más resistentes a la desnaturalización
o “fusión” que las regiones ricas en A-T.

Constitución del ADN y sus diferentes formas estructurales.

Las cadenas poliméricas complementarias se presentan como una doble hélice o espiral
determinada por dos hebras -las columnas vertebrales constituidas por azúcares y
fosfatos- que se enrollan en forma paralela alrededor de un eje imaginario a la manera de
una escalera caracol. Esta disposición se denomina plectonémica. Escalones de la
metafórica escalera serían los pares de bases unidas por puentes de hidrógeno.

En el caso del ADN más frecuente, el de tipo B, el ancho de la doble hélice es de 20 Å (Å

= Angstrom = 1/10.000.000 mm). Cada vuelta entera de la hélice tiene una longitud de 34
Å y la distancia entre dos pares de nucleótidos sucesivos es de 3,4 Å, de manera que se
necesitan 10 pares de bases para completar un giro completo de la hélice. Asimismo, el
sentido de giro se corresponde con el de las agujas del reloj (sentido horario).

Los nucleótidos se unen mediante los fosfatos que conectan el carbono en la posición 5'
de una pentosa con el carbono en la posición 3' de la adyacente. Estas uniones 5'-3'
determinan la direccionalidad de las cadenas.

El ADN presenta tres organizaciones espaciales diferentes, todas ellas con forma de
hélice, a las que se ha denominado A, B y Z. La figura 4 muestra, en el caso de las bases
complementarias G-C, por dónde pasa el eje imaginario de la hélice en cada uno de estos
tres tipos de ADN. Como puede observarse, la ubicación del eje modifica la profundidad
de los surcos mayor y menor. Esta misma figura nos ilustra acerca de cómo pueden

111
situarse las pentosas de manera que los carbonos en posición 4' 'y 5' se orienten hacia el
surco mayor (forma anti) o hacia el surco menor (forma syn). Estas orientaciones
caracterizan a los distintos tipos de ADN, pues mientras las pentosas de las formas A y B
se ubican según una modalidad anti, la forma Z presenta a la pentosa de la base C en
posición anti y a la de la base G en posición syn, hecho que, como luego veremos,
determina su forma peculiar.

Por lo general, el ADN se presenta bajo la forma B, pero ya Watson y Crick observaron
que en condiciones de moderada deshidratación podía adoptar la organización espacial
A. En este caso se requieren 11 pares de bases para la ejecución de un giro completo de
la hélice, lo cual determina una forma ligeramente "subenrollada" con respecto a la que
presenta el tipo B. Asimismo, como indica la figura 4, debido al desplazamiento de los
pares de bases en relación al eje longitudinal de la hélice, el tipo A manifiesta una
marcada diferencia entre sus surcos (el mayor es mucho más profundo que el menor),
distinción que en el tipo B no resulta particularmente notable. El ADN de tipo Z, del que
luego nos ocuparemos en detalle, se diferencia más de las formas A y B que éstas entre
sí.

Watson y Crick describieron el modelo de las formas A y B del ADN mediante la

interpretación de fotografías de difracción de rayos X obtenidas de fibras de ADN nativo,
es decir, extraído de células. Sin embargo, la magnitud de la información que puede
obtenerse de este tipo de estudios es limitada, debido a que las fibras de ADN son
extremadamente largas, no cristalizan y habitualmente presentan un cierto desorden
estructural. El método, a lo sumo, permite establecer la estructura de un ADN promedio o
estadístico, el cual no necesariamente representa la estructura de las diferentes regiones
de ADN A o B existentes en la naturaleza. Cualquier variación local de estructura que
pueda resultar de una secuencia particular de bases, pasará inadvertida al analizar la
difracción de rayos X inducida por una larga fibra de ADN. Resulta claro, entonces, que
los ADN A y B de Watson y Crick son macromoléculas "abstractas" que representan el
promedio de un conjunto de variantes moleculares que se suceden a lo largo de la
cadena. El análisis estructural de estas variantes sólo ha sido posible en los últimos años,
gracias al advenimiento de métodos eficaces para sintetizar cadenas muy cortas de ADN
que se denominan oligómeros. Estas cadenas poseen entre 4 y 24 pares de bases cuya
secuencia ha sido predeterminada por el investigador. Los oligómeros cristalizan con
facilidad y, por lo tanto, cuando se los somete a difracción de rayos X, proveen una

112
información que permite la reconstrucción espacial fidedigna de su estructura. Si además
se desea saber cómo sería la arquitectura de una larga fibra de ADN formada por un gran
número de repeticiones del oligómero, pueden suministrarse los datos moleculares del
mismo a una computadora, la cual se encarga de simular un modelo espacial con tantas
repeticiones como se le ordene.

Fig. 3. Esquema indicativo de la manera en que dos

cadenas complementarias de nucleótidos se unen y
adoptan la forma de doble hélice típica de la
macromolécula de ADN.

Fig.4. Unión complementaria de un par de bases G y C

visto desde el extremo superior del eje vertical de la
doble hélice. La conformación anti de las pentosas es
característica de las formas A y B del ADN. Las
conformacionesanti de la C y syn de la G son
características de la forma Z. Se señalan los puntos por
donde pasa el eje de la doble hélice en las formas A, B y
Z.

113
 Propiedades de ADN: Desnaturalización, hipercromicidad, relajamiento y
superenrollamiento.

 Desnaturalización: Al someter las disoluciones de la forma de doble hélice del ADN a

pHs extremos, temperatura, disminución de la constante dieléctrica del medio acuoso
por incorporación de alcoholes, cetonas etc.. y al exponerlo a la urea, amidas y otros
solutos similares. Así disminuye la viscosidad de la disolución, la absorción luminosa
aumenta, la rotación óptica se torna más negativa y la densidad de flotación aumenta.
A este cambio físico es a lo que se le denomina desnaturalización y estos agentes
deznaturalizantes del ADN son idénticos a los que inducen la desnaturalización de las
proteínas globulares. Se debe tomar en cuenta que en la desnaturalización del ADN
no se rompen enlaces covalentes, pero la estructura duplohelicoidal se desenrolla y se
separa. Los puentes de hidrogeno entre los pares de bases y las interacciones del
apilado entre las bases sucesivas, son los dos conjuntos de fuerzas responsables de
mantener la estructura de doble hélice del ADN. Cuando cualquiera de estas fuerzas
se interrumpe, la estructura duplohelicoidal nativa experimenta su transición a una
forma con lazos al azar, denominada ADN desnaturalizado o monofilar.
La desnaturalización de la molécula del ADN dúplex tiene dos etapas:

En la primera, las dos hebras se desenrollan parcialmente pero permanecen unidas

por lo menos mediante un corto segmento de la estructura duplohelicoidal con algunas
bases complementarias todavía en registro. Los segmentos desenrollados de cada
una de las hebras adoptan una conformación cambiante y al azar. En la segunda
etapa, ambas hebras se separan por completo una de otra. Si en este estado se
enfrían rápidamente, cada una de las hebras liberadas se dobla sobre si misma para
formar unos segmentos duplohelicoidales intracaternarias.

La desnaturalización de un ADN homogéneo es fácilmente reversible si el proceso de

desenrollamiento no ha pasado de la primera etapa. Mientras un segmento
duplohelicoidal esté unido a las dos hebras con los pares de bases en su sitio, los
segmentos desplegados de las dos hebras volverán a enrrollarse espontáneamente
reformando un dúplex completo cuando se haga descender la temperatura. De esta
manera se produce instantáneamente un retorno a la conformación nativa, que es la
de mínima energía libre. Sin embargo, si las dobles hebras se han separado por
completo, la renaturalización se vuelve mucho más lenta.

114
La fusión de un ADN duplohelicoidal homogéneo muestra una temperatura de
transición muy precisa debido a la naturaleza cooperativa de las muchas interacciones
sucesivas que tienen lugar, de suerte que cada una de las acciones recíprocas hace
aumentar en gran manera la tendencia a que se efectúe la siguiente. En la
desnaturalización del ADN los segmentos menos estables son los ricos en pares A-T y
los primeros en abrirse.

 Hipercromicidad :
El efecto hipercrómico es el cambio físico más fácil de utilizar como medida de la
desnaturalización del ADN e indica el incremento de la absorción luminosa observada
a 260 nm. Este efecto se da gracias a la capacidad que tienen las bases púricas y
pirimídinicas, así como sus correspondientes nucleótidos de absorber la luz
ultravioleta a 260 nm. Sin embargo, la el ADN duplohelicoidal nativo absorbe mucha
menos luz de la que podría predecirse por la suma de la luz absorbida por sus
mononucleótidos constituyentes. Una vez desnaturalizado el ADN de doble hélice
nativo por calefacción, se observa un gran incremento de la absorción lumínica a 260
nm que puede llegar a un 40% según la muestra. El porcentaje en incremento de
absorción lumínica inducido por calentamiento esta en relación con su contenido en
pares de bases A-T en cuanto mayor sea la cantidad de estos pares mayor será la
absorción.

La absorción lumínica, menos que aditiva, de las moléculas de ADN de doble hebra,
que se denominan hipocromismo, se debe a las acciones interelectrónicos entre las
bases apiladas de la estructura de doble hélice nativa, que hacen disminuir la cantidad
de luz que puede absorber cada uno de los retos. Cuando se desordena la estructura
duplohelocoidal, las bases se deshacinan y en esta forma, menos obstaculizada,
absorben casi tanta luz como lo harían si se hallaran en forma de nucleótidos libres.

 Relajamiento y Superenrollamiento:
Este se produce cuando el ADN contiene más pares de bases que los normales de
una doble hélice por unidad de longitud. Por lo tanto esta tiende a compensar o aliviar
esta tensión torsional, retorciéndose en sentido opuesto o negativo.

En algunos organismos como bacterias, bacteriófagos y numerosos virus animales

que contienen ADN, los extremos de las moléculas de ADN se unen para crear un
círculo cerrado sin término.

115
 Esto por supuesto no destruye la polaridad de las moléculas pero elimina todos los
grupos libres hidroxilo y fosforilo 3` y 5`. En las formas relajadas o en los
superenrollamientos existen círculos cerrados. Los superenrollados ocurren cuando
una molécula cerrada es torcida alrededor de su propio eje o cuando una pieza lineal
de ADN dúplex, cuyos extremos están fijos, es retorcida. Este proceso que requiere
energía, coloca a la molécula bajo tensión y mientras mayor sea el número de
superenrollamientos, más elevada será la tensión o torsión. Los superenrollamientos
negativos se forman cuando una molécula de ADN es torcida en dirección contraria a
las manecillas del reloj. Se dice que este ADN esta desenrollado. La energía
necesaria para alcanzar este estado está, en cierto sentido, almacenada en los
superenrollamientos. Por lo tanto. La transición a otra forma que requiera energía, es
facilitada por el desenrollamiento. Una de estas transiciones es la separación de las
tiras, el cual es un prerrequisito para la replicación y transcripción del ADN. Así el ADN
superenrollado es una forma preferida en los sistemas biológicos. Las enzimas que
catalizan los cambios topológicos del ADN se llaman topoisomerasas. Las
topoisomerasas pueden relajar o insertar superenrollamientos. La mejor caracterizada
es la girasa bacteriana, que induce superenrollamiento negativo en el ADN utilizando
ATP como fuente de energía.

ADN: Replicación semiconservadora.

La replicación del DNA es el proceso por el cual el DNA es perpetuado. Es un proceso

semiconservativo, esto quiere decir que las moléculas finales contienen una hebra nueva,
recién sintetizada, y la complementaria, hebra antigua, que sirvió como templado (molde).

El DNA es replicado por DNA polimerasas, esta utilizan una hebra como templado, sobre
la cual realizan la síntesis de la hebra complementaria utilizando los desoxinucleótidos
trifosfatos adecuados. La cadena de DNA naciente siempre crece en sentido 5’®3’, es
decir, el nucleótido que se agrega une su a-fosfato al grupo 3’-OH libre de la cadena en
síntesis, este enlace ocurre entre las pentosas que componen los nucleótidos.

Durante el proceso de replicación se forman diferentes estructuras:

 Ojo de replicación.
 Fragmentos de Okazaki.
 Hebra líder.

116
  Hebra discontinua.

Este proceso se lleva adelante por una variedad de enzimas:

 DNA Polimerasa I.
 DNA polimerasa II.
 DNA polimerasa III.
 Girasa.
 Primasa.
 Helicasa.
 Ligasa.

Estructuras formadas para la replicación del DNA:

Ojo de replicación: Es la estructura se forma al separase la doble hebra de DNA durante

la replicación. En ella se pueden distinguir los llamados tenedores de replicación, esto
pueden ocurrir en una o ambas hebras y es donde está ocurriendo la síntesis de DNA.

Fragmentos de Okazaki: Estos son los Fragmentos de RNA-DNA que son resultados de la
síntesis de DNA en la hebra discontinua. Estos son sintetizados en dirección 5’®3’ pero
discontinuamente, luego de la remoción de los primers (RNA) son unidos por la DNA
Ligasa.

Hebra líder:Es la hebra donde la síntesis de DNA está ocurriendo en forma continua.

Hebra discontinua: Es la hebra donde la síntesis de DNA, en esta podemos encontrar los
fragmentos de Okazaki.

Enzimas de la replicación:

DNA polimerasa I: Esta enzima cuenta con tres actividades. Tiene actividad polimerasa,
de síntesis en dirección 5’-3’. Una actividad 3’-5’ exonucleasa, remoción de nucleótidos
erróneos o conocida como proofreading o revisora. Y finalmente, una actividad 5’-3’
exonucleasa, que a partir de un nick (rompimiento del enlace entre dos nucleótidos
vecinos) resintetiza una porción de DNA removiendo la ya existente. Esta enzima no lleva
a cabo el proceso de replicación. Estaría involucrada en la síntesis de los primers.

DNA polimerasa II: Con actividad exonucleasa 3’-5’ está involucrada en procesos de
reparación de DNA.

117
DNA polimerasa III: Esta es la enzima que realiza el proceso replicativo, su función es la
síntesis de DNA. También cuenta con actividad revisora, 3’-5’ exonucleasa.

DNA girasa: La DNA girasa está encargada de desempaquetar el DNA, en eucariontes se

encuentra unido a proteínas y sufre procesos de enrollamiento que lo hacen inaccesibles
para la DNA Pol III, por esta razón es necesario su desenrollamiento para que la
replicación se pueda llevar a cabo.

Primasa:Enzima en cargada de la síntesis de los primers (partidores) para la síntesis del

DNA en E. coli. Esta inicia los fragmentos de Okazaki. En eucariontes este proceso lo
llevaría a cabo la DNA polimerasa I.

Helicasa: Esta enzima está encargada de separar la doble hebra de tal forma que se
puedan formar los primers y luego se lleve a cabo la replicación.

Ligasa: La ligasa va a unir los fragmentos de Okazaki o aquellas zonas del DNA donde se
hayan producidos nicks.

Mecanismo de ruptura y reparación del DNA.

Mecanismos de daño del DNA:

1. Alteración de bases únicas:

A. Despurinización.
B. Desaminación de citosina a uracilo.
C. Desaminación de adenina a hipoxantina.
D. Alquilación de base.
E. Inserción o deleción de nucleótido.
F. Incorporación de análogo de base.
2. Alteración de dos bases:
A. Dímero de timina-timina inducido por luz UV.
B. Entrecruzamiento por agente alquilante bifuncional.
3. Roturas de cadena:
A. Radiación ionizante.
B. Desintegración radiactiva de elemento de esqueleto.
C. Formación de radical libre oxidativo.
4. Entrecruzamiento:
A. Entre bases en la misma cadena o en cadenas opuestas.
B. Entre DNA y moléculas de proteína ( p. ej., histonas)

118
Mecanismos de reparación del DNA:

Mecanismo Problema Solución

Errores de copiado (base Corte de cadena dirigido
Reparación de errores de
única o asas no apareadas hacia metilo, digestión por
apareamiento
de dos a cinco bases) exonucleasa, y remplazo
Daño espontáneo, por Eliminación de base
Reparación por escisión de sustancias químicas o por mediante N-glucosilasa,
base radiación, de una base eliminación de azúcar
única abásico, remplazo
Daño espontáneo, por
Eliminación de un oligómero
Reparación por escisión de sustancias químicas o por
de aproximadamente 30
nucleótido radiación, de un segmento
nucleótidos y remplazo
de DNA
Radiación ionizante,
Reparación de rotura de Sinapsis, desenrollamiento,
quimioterapia, radicales
doble cadena alineamiento, ligadura
libres oxidativos

ADN. Mecanismo de transcripción.

La transcripción es el proceso central en el crecimiento y desarrollo de las células, en la

cual los genes que se encuentran en el ADN de los cromosomas son selectivamente
localizados, reconocidos y transcritos, produciendo ARN mensajeros, ribosomales
(estructurales) y de transferencia (adaptadores). El notable progreso en los últimos años
de la genética bacteriana, el ADN recombinante, la bioquímica-física, etcétera, ha
ampliado considerablemente los conocimientos sobre este proceso. Aun cuando puedan
existir diferencias en los mecanismos de transcripción en diferentes organismos, hay una
serie de características comunes a todos ellos que se enumeran a continuación. Los
precursores de la síntesis de los ARN son los 4 ribonucleósidos trifosfatados, ATP, GTP,
UTP y CTP. En la reacción de polimerización, los ribonucleótidos son añadidos uno a uno
al extremo de una hebra en crecimiento por enzimas denominadas ARN polimerasas
dependientes de ADN o ARN polimerasas.

La secuencia de bases del ARN es complementaria a la hebra de ADN, que se está

copiando. Aunque el ADN es en general de doble hebra, en cada sector específico sólo
una de ellas se utiliza como molde o patrón para la síntesis de ARN. La hebra de ARN
crece en el sentido 5 ' -3 ', mientras va copiando la hebra del ADN que está en dirección
3’-5',luego la síntesis es antiparalela y unidireccional. La reacción básica de
polimerización consiste en la adición de un ribonucleósido trifosfatado al extremo 3 ' -0H

119
del nucleótido precedente, con liberación de pirofosfato, formándose un enlace
fosfodiéster. Al igual que en la replicación, la polimerización avanza acoplada a la
hidrólisis del pirofosfato. Las ARN polimerasas son capaces por sí mismas de iniciar la
síntesis, luego no hay necesidad de un iniciador. En resumen, la transcripción se produce
por el mecanismo básico de complementariedad de bases añadidas en formas gradual,
unidireccional y antiparalela, sin necesidad de un iniciador y acoplada a la hidrólisis del
pirofosfato.

Estructura del ARN y diferencias con respecto al ADN.

El ácido ribonucleico (RNA) es un polímero de purina y pirimidina ribonucleótidos unidos

entre sí por enlaces 3´,5´-fosfodiéster análogos a los que están en el DNA. Aún cuando
comparte muchas características con el DNA, el RNA posee varias diferencias
específicas:

 En el RNA, la parte azúcar a la cual los fosfatos y las bases púricas y pirimídicas
se fijan es ribosa en lugar de la 2´-desoxirribosa del DNA.
 Los componentes pirimídicos del RNA difieren de los del DNA. Si bien el RNA
contiene los ribonucleótidos de adenina, guanina y citosina, no posee timina
excepto en un raro caso. En lugar de timina, el RNA contiene ribonucleótidos de
uracilo.
 El RNA típicamente existe como una cadena única, mientras que el DNA existe
como una molécula helicoidal bicatenaria. Empero, dada la secuencia de bases
complementaria apropiada con polaridad opuesta, la cadena única de RNA tiene
la capacidad de plegarse sobre sí misma a manera de horquilla y, de este modo,
adquirir características bicatenarias: la base G que forma pares con C, y A con U.
 Puesto que la molécula de RNA es una cadena única complementaria a sólo una
de las dos cadenas de un gen, su contenido de guanina no necesariamente es
igual a su contenido de citosina, ni su contenido de adenina es necesariamente
igual a su contenido de uracilo.
 Los álcalis pueden hidrolizar al RNA hacia diésteres 2´,3´cíclios de los
mononucleótidos, compuestos que no se pueden formar a partir de DNA tratado
con álcali debido a la ausencia de un grupo 2´-hidroxilo. La labilidad del RNA a
álcali es útil con fines tanto diagnósticos como analíticos.

120
La información dentro de la cadena única de RNA está contenida en su secuencia de
nucleótidos purina y pirimidina dentro del polímero. La secuencia es complementaria a la
cadena molde del gen a partir del cual se transcribió. Debido a esta complementariedad,
una molécula de RNA puede unirse de manera específica por medio de las reglas de
formación de pares de bases a su cadena de DNA molde; no se unirá con la otra cadena
de su gen. La secuencia de la molécula de RNA es la misma que la de la cadena
codificadora del gen.

Tipos de ARN y su función.

RNA mensajero (ARNm).

ARN lineal, que contiene la información, copiada del ADN, para sintetizar una proteína. Se
forma en el núcleo celular, a partir de una secuencia de ADN. Sale del núcleo y se asocia
a ribosomas, donde se construye la proteína. A cada tres nucleótidos (codón)
corresponde un aminoácido distinto. Así, la secuencia de aminoácidos de la proteína está
configurada a partir de la secuencia de los nucleótidos del ARNm.

Los ARNm se caracterizan por ser los portadores directos de la información genética
desde el núcleo a los ribosomas citoplasmáticos.

En el caso de los ARNm eucarióticos, cada ARNm contiene información sólo para una
cadena polipeptídica, de ahí que se hayan designado monocistrónicos, mientras que en
los procariotas, el ARNm puede existir en forma de moléculas policistrónicas.

El fenotipo y la funcionalidad de una célula van a depender directamente del contenido

citoplasmático de ARNm. En concreto, en las células que muestran una síntesis proteica
muy activa, como es el caso de las células pancreáticas, el cociente ADN/ARN que se
presenta es muy bajo debido a la presencia de grandes cantidades de ARNm y ARNr. Sin
embargo, en las células que presentan tasas bajas de síntesis proteica, tales como las
células musculares, el cociente de ADN/ARN sería mucho más elevado, ya que no
necesitan grandes de ARNm y ribosomas.

En el citoplasma, los ARNm van a tener una duración relativamente corta, determinada,
en parte, por las necesidades concretas de la célula. Se ha observado que algunos ARNm
son sintetizados y almacenados en un estado inactivo o latente en el citoplasma,
preparados para dar una respuesta rápida en la síntesis proteica.

121
Los ARNm eucarióticos tienen la particularidad de que poseen rasgos estructurales únicos
que no están presentes ni en el ARNr ni en el ARNt; éstos rasgos van a ser muy
importantes para el adecuado funcionamiento del ARNm.

Debido a que la información dentro del ARNm se encuentra en la secuencia lineal de los
nucleótidos, se hace necesario la completa integridad de dicha secuencia, de tal modo
que cualquier pérdida o cambio de nucleótidos podría producir una alteración en la
proteína que se está traduciendo.

Estructuralmente, comenzando a partir del extremo 5´, existe una base metilada invertida
unida mediante enlaces 5´-fosfato-5´-fosfato en lugar de los enlaces 3´, 5´fosfodiéster
internucleotídicos habituales entre ribosomas adyacentes. Ésta estructura, que se ha
denominado casquete, es una guanosina 5´-trifosfato metilada en el nitrógeno número 7.

El casquete está unido al primer nucleótido transcrito, normalmente una purina, metilado
en el 2´-OH de la ribosa. A continuación, el casquete tiene una secuencia que no se
traduce que se conoce como conductora en el lado 5´ de la región codificante.

Seguidamente a la secuencia conductora, se encuentra la secuencia o codón de

iniciación, generalmente AUG, y a continuación el mensaje que se ha de traducir o región
codificante de la molécula. Al final de la secuencia codificante, se encuentra una
secuencia de finalización que señala el fin del péptido naciente y la liberación del
ribosoma. Le sigue una segunda secuencia no traducida o remolque que termina con una
serie de ácidos adenílicos, denominada cola de poli (A) que constituye el extremo 3´del
ARNm.

RNA de transferencia (ARNt).

El ARN transferente o soluble es un ARN no lineal. En él se pueden observar tramos de

doble hélice intracatenaria, es decir, entre las bases que son complementarias, dentro de
la misma cadena. Esta estructura se estabiliza mediante puentes de Hidrógeno.

Además de los nucleótidos de Adenina, Guanina, Citosina y Uracilo, el ARN transferente

presenta otros nucleótidos conbases modificadas. Estos nucleótidos no pueden
emparejarse, y su existencia genera puntos de apertura en la hélice, produciendo bucles.

En el ARNt se distinguen tres tramos (brazos). En uno de ellos (1 en la figura), aparece

una secuencia de tres nucleótidos, denominada anticodon. Esta secuencia es
complementaria con una secuencia del ARNm, el codon. En el brazo opuesto (2 en la

122
figura), en el extremo 3' de la cadena, se une unaminoácido específico predeterminado
por la secuencia de anticodon.

La función del ARNt consiste en llevar un aminoácido específico al ribosoma. En él se une

a la secuencia complementaria del ARNm, mediante el anticodon. A la vez,transfiere el
aminoácido correspondiente a la secuencia de aminoácidos que está formándose en el
ribosoma.

Los ARNt constituyen aproximadamente el 15% del ARN celular total. Aunque se
sintetizan en el núcleo, los ARNt son elaborados rápidamente y utilizados en el
citoplasma. Entre las funciones del ARNt, destaca el transporte de aminoácidos a los
polirribosomas (complejo ribosomas · ARNm), así como la traducción del código genético
del ARNm. Los tres nucleótidos de la región del bucle de anticodón de ARNt se unen a
tripletes complementarios de nucleótidos del ARNm. Según esto, los ARNt van a tener
dos centros activos primarios: el -CCAOH, extremo 3´-hidroxilo, al que se van a unir
covalentemente aminoácidos específicos, y el triplete anticodón. Éstos centros van a ser
los responsables de la conversión de la información codificada en la secuencia de un
ácido nucleico (ADN o ARNm) en secuencia de proteínas durante la traducción.

RNA ribosómico (ARNr).

El ARN ribosómico, o ribosomal, unido a proteínas de carácter básico, forma

los ribosomas. Los ribosomas son las estructuras celulares donde se ensamblan
aminoácidos para formar proteínas, a partir de la información que transmite el ARN
mensajero. Hay dos tipos de ribosomas, el que se encuentra en células procariotas y en el
interior de mitocondrias y cloroplastos, y el que se encuentra en el hialoplasma o en el
retículo endoplásmico de células eucariotas.

Los ARNr constituyen el 80% del ARN celular total y tienen la propiedad de que son
metabólicamente estables. Ésta estabilidad, indispensable para el funcionamiento
repetido del ribosoma, está incrementada por su estrecha relación con las proteínas
ribosómicas. Existen proteínas que se unen directamente a los ARNr durante la fase de
transcripción.

Los ribosomas citoplasmáticos eucarióticos están constituidos por cuatro moléculas de

ARN y de 70 a 80 proteínas, que se encuentran divididos entre las dos subunidades
ribosómicas:

123
Subunidad pequeña. Partícula 40S. Contiene un ARNr 18S y el 55% de las proteínas.

Subunidad grande. Partícula 60S. Contiene los restantes ARNr: el 28S ARNr, el 5,8S
ARNr y el ARNr más pequeño, 5S, así como las restantes proteínas.

5.11 Inhibidores de la síntesis de DNA y RNA.

Bromuro de etidio: se enlaza al DNA, intercalándose entre dos pares de bases sucesivos.
A bajas concentraciones se enlaza a DNA circular.

Actinomicina D: antibiótico producido por la especie Streptomyces, el anillo de la

fenoxazona se intercala o inserta entre pares de bases G-C mediante enlaces de
hidrógeno a restos de G y se proyecta en el surco superficial del DNA dúplex. No afecta a
la RNA polimerasa pero bloquea la prolongación de RNA.

Rifampicina: se une a la subunidad β de la RNA polimerasa, inhibe completamente la

reacción de iniciación, sin afectar la prolongación.

Estreptolidigina: se une a la subunidad β de la RNA polimerasa, bloquea el alargamiento

de la cadena. De manera que parece que la subunidad β está implicada tanto en la
iniciación como en la prolongación de la síntesis de RNA.

Aflatoxinas: producidas por el hongo Aspergillus flavus. Inhibe replicación y transcripción.

5.12 Transcripción reversa o inversa (síntesis de DNA a partir de RNA).

El ARN viral, por acción de la transcriptasa reversa se transforma en ADN. Distintas

variantes virales pueden generarse durante este proceso ya que la transcriptasa reversa
tiene tendencia al error (de transcripción) y no posee funciones para corregir los mismos.

Luego el ADN viral transcripto se integra al genoma del huésped, gracias a otra enzima, la
integrasa viral y a enzimas reparadoras de ADN del huésped. Una integrasa de unión del
huésped, facilita la integración.

Cuando la célula es activada, el provirus inicia la síntesis de ARN viral, que servirá para la
síntesis de proteínas estructurales que posteriormente serán clivadas por las proteasas
virales.

Los nuevos virus son liberados al medio externo por gemación o destrucción de la célula,
según la velocidad del proceso de síntesis viral.

124
 Unidad VI Síntesis de proteínas y clave genética.

Flujo de la información genética (ADN, ARN y proteína)

El dogma central de la biología plantea que una molécula de DNA da como resultado una
de RNA, la cual a su vez da como resultado una proteína:

1.- La replicación, en la cual se copia el DNA progenitor en moléculas hijas idénticas

al DNA progenitor.

2.- La transcripción que es el proceso mediante el cual se transcribe o pasa la

información genética del DNA al RNAm, para ser llevado al lugar de síntesis de las
proteínas: los ribosomas.

3.- La Traducción es el proceso mediante el que el mensaje cifrado en el idioma de

los tripletes de bases (código genético) es descifrado por los RNAt sintetizándose una
proteína.

En algunas bacterias y virus la información genética se almacena en forma de RNA, y

tienen la capacidad de sintetizar DNA a partir de RNA, por ello, el dogma se ha
modificado para incluir a estos organismos contemplando el proceso de transcripción
inversa

Codones, clave de la síntesis proteica.

Cada aminoácido de la cadena peptídica está especificado por tres bases de nucleótidos.
Estos tripletes se denominan codones o palabras del código. Cada conjunto de tres bases
es leído en una secuencia lineal, sin que exista solapamiento entre las palabras del
código. Como el ARN contiene cuatro bases diferentes, el número máximo de palabras de
tres letras que se pueden formar es de 43, es decir, 64, de entre ellas, 61 se utilizan para
especificar los 20 aminoácidos. Así, algunos aminoácidos son especificados por varias

125
palabras diferentes; se dice que el código es degenerado. El código es universal en el
sentido de que la mayoría de las palabras significan lo mismo en diferentes especies. Por
lo tanto, el código genético está formado por tripletes, no presenta solapamiento y es
degenerado y universal.

Así pues, codón es un término que define las palabras que utiliza el ADN para especificar
el código genético. El ADN está compuesto por cuatro bases: guanina, adenina, timina y
citosina, las cuales codifican toda la información genética. Las palabras que se usan son
de tres letras y están siempre compuestas por tres de esas cuatro bases y pueden
traducirse en aminoácidos específicos que son las unidades que forman las proteínas. Así
que un codón es la palabra de tres letras que especifica, bien sea el comienzo de una
proteína, el final de una proteína o uno de los aminoácidos o unidades.

126
 Características del código genético.

Tres de los 64 codones posibles no codifican para aminoácidos específicos, éstos se han
denominado codones sin sentido o de terminación, y se utilizan en la célula como señales
de terminación; especifican dónde va a detenerse la polimerización de aminoácidos
cuando se sintetiza una molécula de proteína. Los 61 codones restantes codifican para 20
aminoácidos. De este modo, debe haber “degeneración” en el código genético; esto es,
múltiples codones deben decodificar el mismo aminoácido. El tercer nucleótido en un
codón tiene menos importancia que los dos primeros en la determinación del aminoácido
específico que se va a incorporar, y esto explica la mayor parte de la degeneración de
código. Sin embargo, para cualquier codón específico, sólo está indicado un aminoácido
único; con raras excepciones, el código genético es no ambiguo; esto es, dado un codón
específico, sólo un aminoácido único está indicado. La distinción entre ambigüedad y
degeneración es un concepto importante.

El código no ambiguo pero degenerado puede explicarse en términos moleculares. El

reconocimiento de codones específicos en el mRNA por las moléculas adaptadoras de
tRNA depende de su región anticodón y de reglas de formación de pares de bases
específicas. Cada molécula de tRNA contiene una secuencia específica, complementaria
a un codón, que se denomina su anticodón. Para un codón dado en el mRNA, sólo una
especie única de molécula de tRNA posee el anticodón apropiado. Dado que cada
molécula de tRNA puede cargarse con sólo un aminoácido específico, cada codón, por
ende, únicamente especifica un aminoácido. Sin embargo, algunas moléculas de tRNA
pueden utilizar el anticodón para reconocer más de un codón. Con pocas excepciones,
dado un codón específico, sólo un aminoácido específico se incorporará, aunque, dado un
aminoácido específico, puede usarse más de un codón.

La lectura del código genético durante el proceso de síntesis de proteína no comprende

superposición de codones. De este modo, el código genético no tiene superposición.
Además, una vez que la lectura comienza en un codón específico, no hay puntuación
entre los codones, y el mensaje se lee en una secuencia continua de tripletes de
nucleótido hasta que se llega a un codón de terminación de la traducción.

El código genético es universal, la frecuencia de uso de cada codón para aminoácidos

varía considerablemente entre las especies y en los diferentes tejidos de una misma

127
especie. Los cuadros del uso de los codones se están haciendo cada vez más exactos
conforme aumenta la secuenciación de los genes.

tRNA para cada uno de los 20 aminoácidos.

Primer Tercer
nucleótido Segundo nucleótido nucleótido
U C A G
Fen Ser Tir Cis
U
Fen Ser Tir Cis
U C
Leu Ser CT CT
A
Leu Ser CT Tri
G

Leu Pro His Arg U

Leu Pro His Arg C
C
Leu Pro Gln Arg A
Leu Pro Gln Arg G

Ile Tre Asn Ser U

Ile Tre Asn Ser C
A
Ile Tre Lis Arg A
Met Tre Lis Arg G
Val Ala Asp Gli U
Val Ala Asp Gli C
G
Val Ala Glu Gli A
Val Ala Glu Gli G

MUTACIONES (INSERCIONES, SUPRESIONES, TRANSICIONES,

TRANSVERSIONES) Y AGENTES QUE LAS OCASIONAN (LUZ ULTRAVIOLETA,
ACIDO NITROSO, AFLATOXINAS, MOSTAZAS NITROGENADAS, HIDROXILAMINA,
NITROSAMINA).

Una mutación es una alteración permanente en una secuencia de ADN, capaz de

modificar la información genética previa, lo que repercute en el producto final de su
expresión, codificando proteínas diferentes, si es que el fenómeno afecta genes
estructurales, o interfiriendo en procesos de control si se trata de secuencias de
regulación de expresión génica. Pero lo más importante es su trascendencia, porque
puede transmitirse a generaciones futuras a través de procesos normales de replicación.

Una mutación se refiere a cualquiera de los cambios en el fenotipo de un ser vivo, es decir
cuando ocurren cambios en la secuencia de nucleótidos. El cambio inicial puede no

128
ocurrir en la tira codificadora de la molécula de DNA de doble tira para ese gen, pero
después de la replicación, las moléculas hijas de DNA con mutaciones en la tira
codificadora, se segregarán y aparecerán en la población del organismo.

Las mutaciones puntuales (afectan a una única base, es decir un par de bases
complementarias). Este tipo de mutación consiste en un error en la estructura química de
una base, lo cual determina que, al replicarse el ADN, en vez de incorporar la base
complementaria correcta se incorpore una diferente. Estas mutaciones son de tipo:

o Transiciones: Una pirimidina o una purina es cambiada por la otra purina o

pirimidina según sea el caso.
o Transversiones: Cambios de una purina por cualquiera de las dos pirimidinas, o
el cambio de una pirimidina por cualquiera de las dos purinas.

Si la secuencia de nucleótidos del gen que contiene la mutación se transcribe hacia una
molécula de RNA, la molécula de RNA por supuesto poseerá el cambio de base en la
ubicación correspondiente.
Los cambios de bases individuales en las moléculas de mRNA pueden tener uno de
varios efectos cuando se traducen en proteínas:

1. Puede haber efecto detectable nulo debido a la degeneración del código; esas
mutaciones a menudo se denominan mutaciones silentes. Esto sería más probable
si la base cambiada en la molécula de mRNA fuera a estar en el tercer nucleótido
de un codón Debido al efecto de bamboleo, la traducción de un codón es menos
sensible a un cambio en la posición tercera.
2. Ocurrirá un efecto en sentido equivocado cuando se incorpora un aminoácido
distinto en el sitio correspondiente de la proteína. Este aminoácido equivocado
podría ser aceptable (la molécula de proteína resultante puede no ser distinguible
de la normal), parcialmente aceptable (la molécula proteica tiene función parcial
pero anormal), o inaceptable (la molécula proteica es incapaz de funcionar de
manera normal) para la función de esa proteínas.
3. Puede aparecer un codón sin sentido que después daría como resultado la
terminación prematura de la incorporación de un aminoácido hacia una cadena
peptidica, y a la producción de solo un fragmento de la molécula de proteína
proyectada. Hay probabilidad alta de que la terminación prematura de una
molécula de proteína o de un fragmento de péptido hará que no funcione en su
papel asignado.

Las mutaciones de extensión variable (cuando pueden afectar a más de una base).
Pueden ser delecciones, inserciones, o expansiones de repeticiones de tripletes y tienen
relación con las relaciones de expansión de marco, que se deben a la supresión o
inserción de nucleótidos en el gen. Cada una de estas va a referir a:

129
 o Supresión: La delección de un solo nucleótido de la tira codificadora de un gen,
daría como resultado un marco de lectura alterado en el RNAm. La maquinaria
que traduce el RNAm no reconocería que estaba faltando una base, puesto que no
hay puntuación en la lectura de los codones y resultaría una grave alteración en la
secuencia de aminoácidos polimerizados (ejemplo 1). Puede haber una traducción
alterada de RNAm distal a la delección del nucleótido individual y también la
lectura del mensaje podría dar como resultado la aparición de un codón sin sentido
y la producción de un polipéptido prematuramente terminado y mutilado cerca de
su extremo carboxilo (ejemplo 3). Si 3 nucleótidos o múltiplos de 3 fueran
suprimidos de un gen, el correspondiente mensajero proporcionaría, al ser
traducido, una proteína en al cual faltaría el número correspondiente de
aminoácidos (ejemplo 2). Si la
delección ocurre antes o dentro
del codón de terminación
normal (codón sin sentido),
podría dar por resultado la
lectura a través de una señal de
terminación hasta que se
encontrara otro codón sin
sentido.

o Inserción: Las
inserciones de 1, 2 o de no
múltiplos de 3 nucleótidos en un
gen, darán por resultado un
RNAm en el cual el marco de
lectura estará distorsionado
después de la traducción y los
mismos efectos que ocurren
con las delecciones serán
reflejados en la traducción del
RNAm. Estos pueden ser
secuencias alteradas de
aminoácidos distales a la
inserción, y la generación de un codón sin sentido en la inserción distal a ella, o
quizá la lectura a través del codón de terminación normal. Por lo que después de
una delección en un gen, una inserción puede restablecer el marco de lectura
apropiado(o viceversa, ver el ejemplo 4).

Cuando en una misma cadena de ADN se producen estas mutaciones El RNAm

correspondiente, cuando se tradujera, contendría una secuencia de aminoácido
incomprensible entre la inserción y la delección. Más allá del restablecimiento del arco de
lectura la secuencia de aminoácido seria correcta. Puede imaginarse que la combinación
de delecciones, inserciones o ambas, darían por resultado la formación de una proteína
en la cual una porción es anormal pero está rodeada por secuencias de aminoácidos
normales.

130
  De expansión de repetición de tripletes: consiste en la expansión de regiones
de ADN que contienen normalmente tripletes repetidos; por este mecanismo el
número de tripletes aumenta desde un número normal a un número en el cual se
desencadena la enfermedad. En los progenitores de los pacientes que
experimentan la enfermedad se verifica la existencia de números intermedios de
tripletes repetidos. Este tipo de mecanismo mutacional no es raro sino que ha sido
encontrado en diversas enfermedades como lo son la corea de Huntington, la
distrofia miotónica y el síndrome del “X frágil”.

Un mutágeno o agente mutagenico, es un agente físico, químico o biológico que altera o

cambia la información genética (usualmente ADN) de un organismo y ello incrementa la
frecuencia de mutaciones por encima del nivel natural.

Mutágeno Mecanismo de acción

Ocasiona la desaminación de bases:
 Adenina → Hipoxantina (H se aparea con C)
 Citosina → Uracilo (U se aparea con A)
Acido nitroso
 Guanina → Xantina (X se aparea con C)
Mutaciones puntuales
Mutaciones transicionales A-T↔G-C
Desamina C a U
Hidroxilamina (NH2OH)
Mutaciones transicionales G-C a A-T
Colorantes de acridina Se intercalan entre pares de bases de ADN.
(naranja de acridina o Provocan inserciones o supresiones de uno o más pares de
la proflavina) bases
Mostazas nitrogenadas Agentes alquilantes que ocasionan transversiones
Provoca la formación de dimeros de Timina
Luz ultravioleta
Provoca supresiones
Aflatoxinas Provocan transversiones de G→T

SÍNTESIS PROTEICA (ACTIVACIÓN DE LOS AMINOÁCIDOS, INICIACIÓN,

ALARGAMIENTO Y TERMINACIÓN) Y PROCESO POSTRADUCCIONAL.

Los ribosomas sirven como maquinaria sobre la cual una secuencia de nucleótidos del
RNAm es traducida en la secuencia de aminoácidos de la proteína especificada. La
traducción del RNAm comienza cerca de su extremo 5’ con la formación del
correspondiente amino terminal de la molécula proteica. El mensaje es leído en dirección
5’ a 3’, concluyendo con la formación del extremo carboxilo. La transcripción de un gen en
el correspondiente RNAm o su precursor forma primero el extremo 5’ de la molécula de
RNA. En los procariotas esto permite el comienzo de la traducción del RNAm antes de
que la transcripción del gen esté completa. En las eucariotas el proceso de transcripción
es nuclear, la traducción del RNAm ocurre en el citoplasma.

La iniciación:

Esta requiere la selección de una molécula de RNAm para su traslación por un ribosoma.
En este proceso interviene RNAt, RNAr, RNAm, y por lo menos diez factores de iniciación

131
eucariota (eIF). El inicio pude dividirse en cuatro etapas:1) disociación del ribosoma en
sus subunidades 40s y 60s. 2) fijación de un complejo ternario formando por met-RNA,
GTP Y eIF –2 al ribosoma para formar un complejo de preinicio; 3) unión del RNA m con
el complejo de inicio 40S y 4) combinación del complejo de inicio 40S con la subunidad
60S para formar el complejo de inicios 80S.

 Disociación ribosómica: Dos factores de iniciación, (eIF-3 y eIF-1 A), se unen a

la subunidad ribosómica 40S. esto retrasa su reasociacion con unidad 60S, y
permite que otros factores de inicio de la traducción se unan a la subunidad 60S.
 Formación del complejo de pre inicio 43S: el primer paso comprende la unión
de GTP por eIF-2, este complejo se une a tRNAi met, un tRNA que participa de
manera específica en la unión al codón de inicio AUG. Este complejo ternario se
une a la subunidad ribosómica 40S para formar el complejo de preinicio 43S, que
se estabiliza mediante la asociación con eIF-2 y eIF-1A.
El eIF-2 es uno de los dos puntos de control para el inicio de síntesis de proteína
en células eucarioticas. El eIF-2 consta de subunidades α, β y γ. El eIF-2α es
fosforilado (en la serina 51) por al menos cuatro proteínas cinasa diferentes (HCR,
PKR, PERK y GCN2) que se activan cuando una molécula esta bajo estrés y
cuando el gasto de energía requerido para la síntesis de la proteína seria
perjudicial. Esas condiciones incluyen carencia acentuada de aminoácido y
glucosa, por infección de virus, presencia intracelular de proteínas plegadas
erróneas en cantidades grandes, privación de suero, hiperosmolalidad y choque
por calor. La proteína PKR es en particular importante en este respecto ya que
inhibe la replicación viral. El eIF-2α fosforilado se une de manera estrecha a la
proteína reciclante GTP-GDP eIF-2B y la inactiva, lo que evita la formación del
complejo de preinicio 43S y bloquea la síntesis de proteína.

 Formación del complejo de inicio 43S: los extremos 5’ de la mayor parte de

moléculas de RNAm en las células eucariota están cubiertas. Esta cubierta de
trifosfato de metil-guanosil facilita la fijación del RNAm al complejo de preinicio
43S. Una proteína de unión a región cubierta 5´, e IF-4F (4F), que consta de eIF-
4E y el complejo eIF-4G (4G)- eIF-4ª (4A), se une a la cubierta por medio de la
proteína 4E. Luego eIF-4B se une y es probable que reduzcan la estructura
secundaria compleja del extremo 5’ del RNAm a través de sus actividades
respectivas de ATPasa y helicasa dependiente de ATP. El e IF-3 es una proteína
clave debido a que se une con gran afinidad al componente 4G de 4F y enlaza
este complejo a la subunidad ribosómica 40S. Después de la fijación del complejo
de preinicio 40S a la cubierta de RNAm y reducción (fusión) de la estructura
secundaria próxima al extremo 5’ del RNAm, por medio de la acción de la helicasa
4B y ATP, el complejo trasloca 5´→3’ y escanea al RNAm en busca de un codón
de iniciación adecuado. Este es por lo general el AUG más 5’ pero el codón de
iniciación preciso es determinado por las llamadas secuencias “consenso “kozak
que circundan al AUG. Se prefiere más la presencia de una purina en las
posiciones -3 y +4.

132
  Formación del complejo de inicio 80S: La unión de la subunidad ribosómica 60S
y el complejo de inicio 48S comprende la hidrólisis del GTP adherido a eIF-2 por
eIF-5. Esta reacción origina la liberación de los factores de inicio unidos al
complejo de correspondiente 48S y la unión rápida de la subunidades 40S y 60S
para formar el ribosoma 80S. En este punto, Met-tRNAi está en el sitio P del
ribosoma, listo para que comience el ciclo de alargamiento.

El alargamiento:

Este es un proceso cíclico en el ribosoma, en el cual un aminoácido a la vez se añade a la

cadena peptidica naciente. La secuencia peptidica está determinada por el orden de los
codones en el mRNA. El alargamiento comprende varios pasos catalizados por proteínas
designadas factores de alargamiento (EF). Estos son:

 Unión de aminoacil-tRNA al sitio A: En el ribosoma 80S completo que se forma

durante el proceso de inicio el sitio A (sitio aminoacilo o aceptor) está libre al igual
que el sitio E (sitio de salida del tRNA desacilado). La unión del aminoacil-RNAt
apropiado en el sitio A requiere el reconocimiento del codón correcto. El factor de
alargamiento EF1A forma un complejo ternario con GTP y el aminoacil-RNAt
entrante. A continuación, este complejo permite que el aminoacilRNAt correcto
entre al sitio A con la liberación de EF1A ∙GDP y fosfato. La hidrólisis de GTP es
catalizada por un sitio activo en el ribosoma; la hidrólisis induce un cambio
conformacional en el ribosoma; lo que aumenta concomitantemente la afinidad por
el tRNA y el EF1A-GDP se recicla.
 Formación del enlace peptídico: El grupo α amino del nuevo aminoacil-RNA
lleva a cabo un ataque nucleofílico sobre el grupo carboxílico esterificado del
peptidil-RNAt que ocupa el sitio P (peptidilo o polipeptido). En el momento del
inicio, este sitio está ocupado por aminoacil-tRNA meti. Esta reacción es
catalizada por una peptidiltransferasa, un componente del RNA 28S de la
subunidad ribosómica 60S. Dado que el aminoácido del aminoacil-RNAt ya está
activado, no se requiere una fuente adicional de energía para esta reacción. El
resultado es la adherencia de la cadena peptídico en crecimiento al RNAt en el
sitio A.
 Translocación: El tRNA ahora desacilado se fija mediante su anti codón al sitio P
en un extremo y mediante la cola CCA abierta un sitio de salida (exit o E) en la
subunidad ribosómica grande. En este punto el factor de alargamiento 2 (EF2) se
une al peptidil-tRNA y lo desplaza del sitio A al sitio P. A su vez el tRNA desacilado
está en el sitio E, desde el cual abandona el ribosoma. El complejo EF2-GTP se
hidroliza hacia EF2-GDP, lo que mueve con eficacia el mRNA hacia adelante un
codón, y deja el sitio A abierto para ocupación por otro complejo ternario de tRNA
aminoácido-EF1AGTP y otro sitio de alargamiento.
La carga de una molécula de tRNA con la porción aminoácido requiere la
hidrólisis de un ATP a un AMP, equivalente a la hidrólisis de dos ATP hacia dos
AMP y fosfatos. La entrada del aminoacil-tRNA al sitio A da por resultado la
hidrólisis de un GTP hacia GDP. La translocación del peptidil-tRNA recién formado
del sitio A al sitio P por EF2 origina de manera similar la hidrólisis de un GTP hacia

133
 un GDP y fosfato. Desde este modo, los requerimientos de energía para la
formación de un enlace peptídico incluyen el equivalente de la hidrólisis de dos
moléculas de ATP hacia ADP y de dos moléculas de GTP hacia GDP o la hidrólisis
de cuatro enlaces de alta energía. Un ribosoma eucariotico puede incorporar hasta
6 aminoácidos por segundo mientras que un procariotico 18. De este modo el
proceso de síntesis de péptido que requiere energía ocurre con rapidez y exactitud
en tanto no se llegue a un codón de terminación.

Terminación:

En comparación con el inicio y el alargamiento este es relativamente simple. Después de

que múltiples ciclos de alargamiento culminan en la polimerización de los aminoácidos
específicos en una molécula de proteína, Aparece en el sitio A el codón de paro o
terminal, del RN m (UUA, UAG, UGA).En circunstancias normales no hay tRNA con un
anti codón capaz de reconocer esa señal de terminación. El factor liberador RF1 reconoce
que un codón de parada reside en el sitio A, este factor es unido por un complejo que
consta del factor de liberación RF3 con GTP unido. Este complejo con la peptidil
transferasa, promueve la hidrólisis del enlace entre el péptido y el tRNA que ocupa el sitio
P. De este modo se añade una molécula de agua en lugar de un aminoácido. Esta
hidrólisis libera la proteína y el tRNA del sitio P. En el momento de la hidrólisis y la
liberación, el ribosoma 80S se disocia hacia sus subunidades 40S y 60S que se reciclan.
Por ende los factores de liberación son proteínas que hidrolizan el enlace peptidil-tRNA
cuando el codón de paro ocupa el sitio A.

Los factores liberadores (e RF) son capaces de reconocer que una señal de terminación
reside en el sitio A. El factor liberador conjuntamente con el GTP y el péptido y el RNAt
que ocupa el sitio P. Así se adiciona una molécula de agua, en lugar de un aminoácido.
Esta hidrólisis libera la proteína y el RNAt del sitio P. Después de la hidrólisis y la
liberación, el ribosoma 80S se disocia en sus subunidades 40S y 60S, las cuales son
entonces recicladas. Luego el RNA m se desprende del ribosoma que a su vez se disocia
en sus subunidades componentes 40S y 60S y puede comenzar otro ciclo

EL PROCESAMIENTO POSTRADUCCIONAL:

Una proteína no es biológicamente activa hasta que se encuentra en una conformación

específica o nativa, la cual esta determinada por la secuencia de aminoácidos. De esta
manera el mensaje genético lineal o unidimensional, proviene de la molécula de RNA,
hasta que es sujeta a un procesamiento o a modificaciones covalentes.

a. Todos los polipéptidos se inician con un residuo de N- formilmetionina en

procariotas y de metionina en eucariotas. El residuo del grupo formil, y el
residuo de metionina pueden eliminarse por medio de enzimas específicas.
b. Forman puentes disulfuro entre dos residuos de cisterna, que se forman por una
reacción enzimática y se considera que protegen a la proteína de la
desnaturalización.

134
 c. La fosforilación de los aminoácidos hidroxilados como son serina, treonina y
tirosina. Esta reacción se lleva a cabo con enzimas específicas, formando
fosfoserina, fosfotreonina y fosfotirosina.
d. Algunos aminoácidos pueden hidroxilarse.
e. Es posible que se añadan residuos de ácido aspártico y glutámico.
f. Las glucoproteínas se forman por la unión covalente de ciertos carbohidratos a
residuos de asparagina, serina y treonina.
g. Algunas proteínas son sintetizadas con un número mayor de aminoácidos y
estos residuos pueden eliminarse con peptidasa.
h. La adición de un grupo prostético es necesaria para la actividad biológica.
i. Algunos residuos de lisina puede ser metilados enzimáticamente, también
algunos grupos carboxilo.

ANTIBIÓTICOS QUE INHIBEN LA SÍNTESIS DE PROTEÍNAS BACTERIANAS

Los ribosomas en bacterias y en las mitocondrias de las células eucarioticas superiores

difieren del ribosoma del mamífero. El ribosoma bacteriano es de menor tamaño (70S en
lugar de 80S), y tiene una dotación diferente, un poco más sencilla, de RNA y moléculas
de proteína. Esta diferencia se explota para propósitos clínicos, porque muchos
antibióticos eficaces interactúan de manera específica con las proteínas y los RNA de
ribosomas procarioticos y, así inhiben la síntesis proteica. Esto da por resultado un
bloqueo del crecimiento o muerte de la bacteria.

inhibidor Mecanismo de acción

cloranfenicol Inhibe la peptidil tranferasa en la subunidad mayor de ribosomas
procarioticos
Cicloheximida Inhibe la peptidil transferasa en la subunidad mayor de los ribosomas
procarioticos
Eritromicina Se une a la subunidad 50S inhibiendo la translocacion de ribosomas
procarioticos
Puromicina Análogo de aminoacil-ARNr, provoca terminación prematura de la
traducción en procariotas y eucariotas
Estreptomicina A baja concentración provoca lectura errónea de mARN, una pirimidina
puede estar equivocada por otra en las posiciones primera y segunda
del codón y cualquier pirimidina puede estar equivocada por A en la
primera posición. A concentraciones elevadas impide la iniciación
adecuada de la cadena y por consiguiente causa muerte celular.
Tetraciclina No permite la unión del aminoacil-ARNt en subunidad menor de
procariotas inhibiendo la prolongación de la cadena
Toxina diftérica Inhibe el proceso de prolongación en la etapa de translocación en
procariotas.
Actinomicina D Antibiótico producido por la especie Streptomices, el anillo de la
Fenoxazona se intercala (o inserta) entre pares de bases de G.C
mediante enlaces de H a restos de G y se proyecta en el surco
superficial del ADN dúplex.
No afecta a la ARN polimerasa pero bloquea la prolongación de ARN.
Rifampicina Se une a la subunidad β de la ARN polimerasa, inhibe completamente
la reacción de iniciación, sin afectar la prolongación.

135
Estreolidigina Se une a la subunidad β de la ARN polimerasa, bloquea el
alargamiento de la cadena. Se manera que aparece que la subunidad
β está implicada tanto en la iniciación como en la prolongación de la
síntesis de ARN.
Aflatoxinas Producida por el hongo Aspergillus flavus. Inhibe replicación y
transcripción.

136
 UNIDAD VII

REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN GENÉTICA. TIPOS DE RESPUESTAS

TEMPORALES A UNA SEÑAL REGULADORA. CONTROL GÉNICO DEL
METABOLISMO DE LACTOSA EN E. coli.

Regulación de la expresión genética.

La expresión genética del Genoma Humano es regulada principalmente a través de un

control trasncripcional. Este control trasncripcional es ejercido típicamente a través de
secuencias contenidas en la región que va desde el sitio de inicio de la transcripción hasta
(generalmente) 1 Kb en dirección 5´del gen. Debido a que estas secuencias ejercen su
efecto sobre el propio gen o la propia molécula de DNA, se les describe como elemento
que actúan en “CIS” (“CIS-acting elements”), aunque más coloquialmente se refiere a
ellas como secuencias reguladoras.

La información genética presente en cada célula somática normal de un organismo

metazoario es prácticamente idéntica. Las excepciones se encuentran en las pocas
células que tienen genes amplificados o reordenados para llevar a cabo funciones
celulares especializadas, o células que han pasado por transformación oncogénica. La
expresión de la información genética debe regularse durante la ontogenia y diferenciación
del individuo y de sus componentes celulares. Además, para que este se adapte a su
medio y conserve la energía y los nutrientes, la expresión de la información genética debe
ser incluida por señales extrínsecas y sol mostrar respuesta cuando es necesario. A
medida que los organismos han evolucionado, también han aparecido mecanismos
reguladores más complejos que proporcionan al organismo y sus células la capacidad de
respuesta necesaria para sobrevivir en un ambiente complejo. Las células de mamífero
contienen alrededor de mil veces más información genética que la bacteria Escherichea
coli. Gran parte de esta información genética adicional probablemente esta involucrada en
la regulación de la expresión génica durante la diferenciación de los tejidos y procesos
biológicos en el organismo multicelular, y en el aseguramiento de que el organismo pueda
responder a desafíos ambientales complejos. En términos simples solo hay dos tipos de
regulación:

 Positiva: cuando un elemento regulador, específico aumenta de manera

cuantitativa la expresión de la información genética. Mediada por un regulador
positivo o activador.
 Negativa: cuando la presencia de un elemento regulador específico disminuye la
expresión de la información genética. Mediada por un regulador negativo o
represor

Como ya se dijo la regulación está dada por un activador o un represor. Sin embargo un
doble negativo tiene el efecto de actuar como un positivo. Así, un efector que inhibe la
función de un regulador negativo parecerá desencadenar una reacción positiva. Muchos
sistemas regulados que parecen ser inducidos, en realidad son desreprimidos en el
ámbito molecular.

137
TIPOS DE RESPUESTAS TEMPORALES A UNA SEÑAL REGULADORA.

Existen tres tipos de respuesta, ante los cuales reaccionan los sistemas biológicos ante
una señal reguladora:

 Tipo A: se caracteriza por la expresión aumentada de gen, que depende de la

secuencia continua de la señal inductora. Cuando dicha señal se elimina, la
expresión de gen disminuye hasta sus cifras basales, pero aumenta repetidas
veces en respuesta a la reaparición de la señal especifica. Este tipo de respuesta
por lo general se observa en procariotas en respuesta a cambios repentinos de la
concentración intracelular de un nutriente. También se ve en muchos organismos
superiores después de exposición a inductores, como hormonas, nutrientes o
factores de crecimiento.
 Tipo B: nuestra expresión aumentada de gen que es transitoria incluso en
presencia continua de la señal reguladora, después de que esta ultima señal ha
terminado y se ha permitido a la célula que se recupere, quizá se observe una
segunda respuesta transitoria a una señal reguladora subsiguiente. Este fenómeno
de respuesta-desensibilización-recuperación caracteriza a la acción de muchos
agentes farmacológicos, pero también es una característica de diversos procesos
naturales. Este tipo de respuesta por lo general ocurre durante el desarrollo de un
organismo cuando solo se requiere la aparición transitoria de un producto de gen
específico aunque la señal persista.
 Tipo C: este modelo presenta una expresión génica aumentada en respuesta a la
señal reguladora que persiste por tiempo indefinido incluso después de la
terminación de la señal. La señal actúa como un desencadenante en este modelo.
una vez que la expresión del gen se inicia en la célula, no puede terminarse
incluso en las células hijas; por ende, es una alteración irreversible y hereditaria.

Control Genético del metabolismo de lactosa en E.Coli

El modelo de Operón de Jacob y Monod se basa en el metabolismo de la lactosa en E.

Coli, donde la β-galactosidasa hidroliza a la β-galactosido lactosa hacia lactosa y glucosa.
El gen estructural que codifica para β-galactosidasa (lacZ) se agrupa con los genes que
se encargan de la permeación de lactosa hacia la célula (lacY) y para tiogalactosido
transacetilasa (lacA). Los genes estructurales para estas tres enzimas junto al promotor
lac y el operador lac están físicamente asociados para construir el operón lac.

𝑙𝑎𝑐𝑍 + 𝑙𝑎𝑐𝑌 + 𝑙𝑎𝑐𝐴 + 𝑝𝑟𝑜𝑚𝑜𝑡𝑜𝑟 𝑙𝑎𝑐 + 𝑜𝑝𝑒𝑟𝑎𝑑𝑜𝑟 𝑙𝑎𝑐 = 𝒐𝒑𝒆𝒓ó𝒏 𝒍𝒂𝒄

Este ordenamiento genético permite la expresión coordinada de las tres enzimas que se
relacionan con el metabolismo de la lactosa. Cada uno de estos genes se traduce hacia
se trascribe hacia una molécula de ARNm policistronico largo que contiene múltiples
codones de inicio (AUG) y de terminación (UAA) de la traducción independientes para
cada uno de estos tres cistrones. Así cada proteína se traduce por separado, y no se
procesan a partir de una proteína precursora grande única.

138
Un gen incluye secuencias reguladoras y una región que codifica para el transcrito
primario. El nombre de un gen se escribe en letras cursivas minúsculas y la proteína
codificada de manera abreviada se escribe con letra tipo romano, con la primera letra en
mayúsculas por ejemplo el gen lacI codifica para la proteína represora LacI. Cuando E.coli
es presentada con lactosa o con algunos análogos de lactosa específicos en condiciones
no represoras, la expresión de la β-galactosidasa, galactosido permeasa, y tiogalactósido
transacetilasa aumenta 100 a 1000 veces; se trata de una respuesta de tipo A. La cinética
de la inducción puede ser bastante rápida; los RNAm específicos para lac están por
completo inducidos en el transcurso de 5 a 6 min después de la adición de lactosa a un
cultivo; la concentración de proteína β-galactosidasa será máxima a los 10 min. En
condiciones completamente inducidas, puede haber hasta 5000 moléculas de β-
galactosidasa por cada célula, una cantidad unas 1000 veces mayor que la concentración
basal, no inducida. En el momento de la eliminación de la señal, es decir, el inductor, la
síntesis de estas tres enzimas declina.

Cuando E. coli se expone a lactosa y glucosa como fuentes de carbohidratos, los

organismos metabolizan primero la glucosa y dejan de crecer temporalmente hasta que
los genes del operón lac quedan inducidos para proporcionar la capacidad de metabolizar
lactosa como fuente de energía.
Hasta que la lactosa este presente desde la fase de crecimiento bacteriano, la célula no
inicia su catabolismo hasta que la glucosa se agota. Este fenómeno era atribuido a la
represión del operon lac por algún catabolito de la glucosa, a esto se le denomino
represión por catabolito. Esta represión por catabolito es mediada por una proteína
activadora de gen que codifica para catabolito (CAP) de manera continua con cAMP. Esta
proteína también es denominada la proteína reguladora de cAMP (CRP)
La expresión del gen lacI normal del operon lac es constitutiva; se expresa a un índice
constante y da como resultado la formación de las subunidades del represor lac. Cuatro
subunidades idénticas forman una molécula represora Lac tetramérica. La molécula de
proteína represora LacI, el producto de LacI, este tiene afinidad alta para el locus
operador, una región de DNA bicatenario de 27 pares de bases de largo con una simetría
rotacional de dos pliegues y un palíndromo invertido en una región que tiene 21 pares de
bases de largo como se muestra a continuación:

En cualquier momento, solo 2 de las 4 subunidades del represor parecen unirse al

operador, y dentro de la región de los 21 pares de bases casi casa base de cada par de
bases participa en el reconocimiento de LacI y la unión del mismo. Casi toda la unión
ocurre en el surco mayor sin interrumpir la naturaleza de bases apareadas doble hélice,
del DNA operador. El locus operador está entre el sitio promotor, en el cual la ARN
polimerasa dependiente de DNA se fija para comenzar la transcripción del gen lacZ, el
gen estructural que codifica para β-galactosidasa. Cuando esta fija al locus operador, la
molécula represora LacI evita la transcripción de los genes estructurales distales, lacZ,
lacY y lacA al interferir con la unión de RNA polimerasa con el promotor. La RNA
polimerasa y el represor LacI no pueden unirse con eficacia al operón lac al mismo
tiempo. De este modo la molécula represora LacI es un regulador negativo, y en su
presencia la expresión de lacZ, lacY y lacA es muy baja. Normalmente hay de 20 a 40
moléculas tetraméricas represoras en la célula, una concentración de tetrámero suficiente

139
para asegurar la transcripción de gen operon lac basal baja (pero no de cero) en ausencia
de señales inductoras.

Un análogo de la lactosa que tiene la capacidad de inducir el operon lac, si bien no sirve
como sustrato para la β-galactosidasa es un ejemplo de un inductor gratuito. Un ejemplo
de este es el isopropiltiogalactosido (IPTG). La adición de lactosa o IPTG a bacterias en
crecimiento da como resultado la inducción expedita de enzimas del operon lac.
Pequeñas cantidades del inductor gratuito o de lactosa tienen la capacidad en la célula.
Las moléculas represoras LacI tienen afinidad alta por el inductor. La unión de este último
a la molécula represora induce a un cambio de conformación en la estructura del represor,
y hace que se disocie del DNA operador porque su afinidad por el operador ahora es 10 3
veces más baja que la de LacI en ausencia de IPTG. LA RNA polimerasa dependiente
de ADN ahora puede unirse a la cadena codificadora en el sitio promotor, y la trascripción
empezara, aunque este proceso, aunque este proceso es relativamente ineficiente. De tal
manera un inductor desreprime el operon lac y permite la transcripción de los genes
estructurales que codifican para β-galactosidasa, galactosido permeasa y tiogalactosido
transacetilasa. La traducción de RNAm polistronico puede ocurrir incluso antes de que se
complete la trascripción. La desrepresion del operon lac permite que la célula sintetice las
enzimas necesarias para catalizar lactosa como fuente de energía. Para que la RNA
polimerasa forme un PIC (o complejo de iniciación) en el sitio promotor, también debe
estar presente la proteína activadora de gen que codifica para catabolito (CAP) a la cual
cAMP esta unido. De manera independiente la bacteria acumula cAMP solo cuando esta
privada de una fuente de carbono. En presencia de glucosa o glicerol las bacterias
carecen de cAMP para unirse a CAP ya que la glucosa inhibe a la adenil cinasa que
convierte ATP en cAMP y por lo tanto no puede iniciarse la transcripción del operon lac al
índice máximo.
En presencia del complejo CAP-cAMP, que se une al DNA justo corriente arriba del sitio
promotor, la trascripción ocurre a niveles máximos. Una región CAP entra en contacto con
la subunidad α de la RNA polimerasa facilitando la unión de esta enzima al promotor. Así
CAP-cAMP es un regulador positivo. Por ende el operon lac esta controlado por dos
factores trans de unión a DNA modulados por ligandos, distintos:
 Complejo CAP-cAMP que actua positivo facilitando la unión de la ARN polimerasa
al promotor
 Represor LacI que actúa de manera negativa ya que antagoniza la unión de RNA
polimerasa al promotor
La actividad máxima del operon lac ocurre cuando hay concentraciones bajas de glucosa
(cAMP alto con activación de CAP) y hay lactosa (se evita que LacI se una al operador).
Cuando el gen lacI se ha mutado de manera que su producto LacI es incapaz de unirse al
DNA operador, el organismo mostrara expresión constitutiva del operon lac. Por el
contrario un organismo con una mutación del gen lacI que produce una proteína LAcI que
evita la unión de un inductor al represor, permanecerá reprimido incluso en presencia de
la molécula inductora, ya que no puede desreprimir al operon.

140
 REGULACIÓN GENÉTICA EN PROCARIOTAS Y EUCARIOTAS

En los procariotas, la regulación de la síntesis de proteínas tiene lugar principalmente a

nivel de la transcripción. La regulación de la expresión génica en procariotas implica
interacciones entre el ambiente químico de la célula y proteínas reguladoras especiales,
codificadas por genes reguladores. Dichas proteínas regulan la transcripción
fundamentalmente mediante interacciones proteínas-ADN. Un sistema básico de
regulación genética en las bacterias es el sistema operón. Un operón comprende al
promotor, a los genes estructurales y al operador.
En eucariotas, el escenario es diferente. En primer lugar, el cromosoma eucariótico difiere
en muchos aspectos del cromosoma procariótico. Además, existe una separación física
entre la transcripción que sucede en el núcleo y la traducción que tiene lugar en el
citoplasma. Por ello, aún siendo la transcripción el principal punto de regulación, la
expresión de los genes suele estar sometida también a los distintos tipos de control
postranscripcional, siendo muy importante la regulación del splicing, que puede a veces
dar lugar a distintos ARNm y distintos productos a partir de un transcrito (splicing
alternativo).
Además de la trascripción, las células eucarioticas emplean diferentes mecanismos para
regular la expresión génica.
La expresión de gen está regulada por la La membrana nuclear segrega
trascripción y de muchas otras maneras físicamente la transcripción génica desde
en el ámbito del RNA en células la traducción, dado que los ribosomas
eucarioticas. solo existen en el citoplasma. Participan
 Amplificación de gen muchos más pasos en la expresión de
 Reordenamiento de gen genes eucarioticos, especialmente en el
 Procesamiento de RNA procesamiento del RNA, que en la de
 Empalme de mRNA alterado genes procarioticos, y tales etapas
 Transporte de mRNA desde el núcleo proporcionan sitios adicionales para
hacia el citoplasma influencias reguladoras que no pueden
 Regulación de la estabilidad del existir en procariotas. Estos pasos de
mRNA procesamiento de RNA en eucariotas
comprenden la capucha o casquete de los
extremos 3´de transcripciones, y escisión de regiones intron para generar exones
empalmados en la molécula de mRNA maduro. Hasta la fecha, los análisis de expresión
de gen eucariotico proporcionan evidencia de que ocurre regulación en el ámbito de la
transcripción, el procesamiento de RNA nuclear, la estabilidad de mRNA y la traducción.
Además la amplificación y el reordenamiento génico influyen sobre l expresión génica.

 Los miRNA modulan la expresión génica al alterar la expresión de mRNA.

La clase recién descubierta de RNA pequeños eucarioticos, llamados miRNA, contribuye
de manera importante al control de la expresión génica. Estos RNA de ~22 nucleótidos
regulan la traductibilidad de mRNA específicos al inhibir la traducción o inducir la
degradación de mRNA, aunque en algunos casos se ha mostrado que los miRNA
estimulan la función del mRNA. Se cree que al menor una parte de la modulación de esta
actividad, impulsada por miRNA ocurre en los cuerpos P. La acción de miRNA puede dar
por resultado cambios notorios de la producción de proteína, y por ende, la expresión
genética. Los miRNA se implican con enfermedades como el cáncer, emaciación
muscular, infección viral, diabetes y cardiacas.
Los miRNA al igual que los factores de trascripción de unión a DNA descritos antes con
detalle, tienen actividad trans, y una vez sintetizados y procesados de manera apropiada,
interactúan con proteínas específicas y se unen a mRNA blanco, de forma típica en

141
regiones de mRNA 3’ no traducidas. La unión de miRNA a blancos de mRNA está dirigida
por reglas de formación de pares de bases normales. En general, si la formación de par
de base de miRNA-mRNA tiene uno o más errores de emparejamiento, la traducción del
mRNA blanco afín se inhibe, mientras que la formación de pares de base de miRNA-
mRNA es perfecta en los 22 nucleótidos, el mRNA correspondiente se degrada.

 Los genes eucarioticos se pueden amplificar o reordenar durante el

desarrollo o en respuesta a fármacos.

Durante el desarrollo temprano de metazoarios hay un aumento en la necesidad de

moléculas específicas como rRNA y mRNA para proteínas estructurales. Esto
incrementando el número de genes disponibles para la transcripción de estas moléculas
especificas. Entre las secuencias repetitivas de DNA figuran cientos de copias de genes
que codifican para rRNA, estos genes preexisten de manera repetitiva en el DNA de los
gametos y, así, se trascribe de una generación a otra. En algunos organismos
específicos, como la mosca de la fruta (Drosophila), ocurre durante la oogenesis una
amplificación de genes preexistentes. Después estos genes amplificados, probablemente
generados por un proceso de inicio repetido durante la síntesis de DNA, proporcionan
múltiples sitios para la transcripción génica.
A menudo, las secuencias codificadoras de las cuales depende la generación de
moléculas de proteína específicas no son continuas en el genoma. En el caso de los
genes que codifican para el anticuerpo, esto es verdadero. Las inmunoglobulinas estas
compuestas de dos polipéptidos: una cadena pesada y una ligera, los mRNA que
codifican para estas dos subunidades proteicas están codificados por secuencias de gen
sujetas a extensos cambios de codificación de la secuencia de DNA. Estos cambios de
codificación de DNA son esenciales para generar la diversidad de reconocimiento
indispensable para la función inmunitaria correcta.
Los mRNA que codifican para cadenas pesada y ligera de IgG son codificados por varios
segmentos diferentes que se repiten en tándem en la línea germinal. Así la cadena ligera
está compuesta e dominios o segmentos variable (V L), de unión (JL) y constante (CL). Hay
aproximadamente 300 segmentos codificadores de gen VL repetidos en tándem, cinco
secuencias codificadoras de J L dispuestas en tándem y alrededor de 10 segmentos
codificadores de gen CL. Al tener múltiples segmentos VL, JL y CL a partir de los cuales
elegir una célula inmunitaria tiene un repertorio mayor de secuencias con las cuales
trabajar para desarrollar la flexibilidad y la inmunidad inmunitaria, sin embargo la unidad
de transcripción de la cadena ligera de la IgG funcional solo contiene secuencias
codificadoras para una proteína única. Así antes de que pueda expresarse una cadena de
IgG particular deben combinarse secuencias codificadoras V L, JL y CL únicas para
generar una secuencia de trascripción contigua única, con exclusión de múltiples
segmentos no utilizados. Esta deleccion de información genética no usada se logra
mediante la recombinación de DNA codificador no deseado, mientras que retiene las
secuencias codificadoras requeridas: una secuencia V L, una JL y una CL. De esta manera,
las secuencias recién recombinadas forman una unidad de trascripción única y
competente para la trascripción mediada por RNA polimerasa II hacia mRNA
monocistronico único.

 El procesamiento de RNA alternativo es otro mecanismo de control.

Además de afectar la eficiencia de la utilización de promotor, las células eucarioticas

emplean el procesamiento de RNA alternativo para controlar la expresión génica. Esto

142
puede ocurrir cuando se usan promotores, sitios de empalme intron-exon, o sitios de
poliadenilación alternativos:
 Sitios de inicio de trascripción alternativos: origina un exón 5’ diferente en mRNA
que codifica para amilasa y cadena ligera de miosina de ratón, glucosilasa de rata
y alcohol deshidrogenasa y actina de Drosophila.
 Sitios de poliadenilación alternativos: en el trascrito primario de inmunoglobulina μ
dan por resultado mRNA que produce una región carboxilo terminal diferente de
las proteínas codificadas, de modo que la proteína μ m permanece fija a la
membrana del linfocito B y la inmunoglobulina μ s se secreta. El empalme y
procesamiento alternativos dan por resultado la formación de 7 mRNA que
codifican α-tropomiosina únicos en varios tejidos únicos.

 La regulación de la estabilidad de RNA mensajero proporciona otro

mecanismo de control

Casi todos los mRNA son muy estables, aunque algunos se recambian con mucha
rapidez. En ciertas circunstancias la estabilidad de mRNA se encuentra sujeta a
regulación, lo que tiene inferencias importantes debido a la relación directa entre la
cantidad d mRNA y su traducción hacia su proteína cognada.
Los mRNA existen en el citoplasma como partículas de ribonucleoproteina (RNP).
Algunas de estas proteínas protegen al mRNA contra digestión de nucleasas y otras
pueden promover el ataque por nucleasa. Se cree que los mRNA se estabilizan o
desestabilizan por la interacción de proteínas con estas diversas estructuras y
secuencias.
Parece ser que los extremos de moléculas d mRNA participan en la estabilidad de mRNA,
la estructura del casquete 5’ en el mRNA eucariotico evita ataque por 5’ exonucleasas, y
la cola poli(A) impide la acción de 3’ exonucleasas.

CARACTERÍSTICAS BÁSICAS DEL ADN EXPLOTADAS PARA LA TECNOLOGÍA DE

RECOMBINACIÓN DEL ADN

 El DNA es un biopolimero complejo que se organiza como una hélice doble

El elemento fundamental es la secuencia de bases purinicas (adenina [A] o guanina [G] y

pirimidinicas (citosina [C] o timina [T]). Estas bases están unidas a la posición C-1' del
azúcar desoxirribosa y se conservan juntas a través del enlace de los residuos de azúcar
en sus posiciones 3' y 5' por medio de un enlace fosfodiéster. La alternancia de los grupos
fosfato y desoxirribosa forma el esqueleto de la doble hélice. Estos enlaces 3'-5' definen
también la orientación de una tira dada de la molécula de DNA y puesto que las dos tiras
corren en dirección opuesta, se dice que con antiparalelas.

 El pareamiento de las bases es un concepto fundamental de la estructura y

función del DNA

La adenina y la timina siempre forman un par por medio de puente de hidrógeno: lo

mismo ocurre con guanina y citosina. Se dice que estos pares de bases son
complementarios y el contenido de guanina de un fragmento de DNA de tira doble
siempre será igual a su contenido de citosina; del mismo modo, el contenido de timina y
adenina es igual. El pareamiento de bases y las interacciones hidrófobas de las pilas de

143
bases conservan juntas a las dos tiras del DNA. Estas interacciones pueden disminuir por
el calentamiento del DNA, que lo desnaturaliza. Las leyes del pareamiento de bases
predicen que dos tiras complementarias de DNA se realinean exactamente en la misma
posición al recuperar su forma natural, lo que sucede cuando la temperatura de la
solución se reduce lentamente a la normal. De hecho, el grado de complementariedad (o
su falta de pareamiento) puede calcularse por la temperatura requerida para el proceso de
desnaturalización-naturalización. L os segmentos con grados altos de complementariedad
de bases, requieren de más energía (calor) para que se logre su desnaturalización o,
dicho de otra manera, un segmento estrechamente pareado necesitara más calor para
separar las tiras. Esta reacción se utiliza para determinar si hay diferencias significativas
entre dos secuencias de DNA y en ella se basa el concepto de hibridación.
Hay aproximadamente 3x109 pares de bases (pb) en cada genoma haploide humano. Si
la Iongitud de un gen promedio es de 3x103 pb (3 kilo bases [kb]), el genoma podría
consistir en 106 genes, asumiendo que no hay traslape y que la transcripción procede en
una sola dirección. Se piensa que existen aproximadamente 105 genes en el genoma
humano y que solo 10% del DNA codifica para las proteínas. La función del 90% restante
aun no está definida.
El DNA de doble hélice esta empacado en una estructura muy compacta formada por
cierto número de proteínas, las más notables son las proteínas básicas llamadas historias.
Esta condensación puede tener una función reguladora y con certeza, un propósito
práctico. Si el DNA presente dentro del núcleo de una célula humana, se extendiera,
tendría aproximadamente un metro de longitud. Las proteínas cromosómicas condensan
esta tira larga de modo que el DNA pueda empacarse en un núcleo con un volumen de
unos cuantos micrones cúbicos.

 El DNA se organiza en genes

En general, los genes procarióticos consisten en una pequeña región reguladora (100 a
500 pb) y de un largo segmento codificador de proteínas (500 a 10 000 pb).
Con frecuencia los diversos genes se controlan por una sola unidad reguladora. La mayor
parte de los mamiferos son más complicados, ya que las regiones codificadoras se
interrumpen por regiones no codificadoras, las que se eliminan cuando la transcripción
primaria del RNA se procesa en el RNA mensajero (mRNA) maduro. Las regiones
codificadoras (aquellas regiones que aparecen en las especies de RNA maduro) se
llaman exones, y las regiones no codificadoras, que interrumpen o se interponen entre los
exones, se denominan intrones. Los intrones siempre se eliminan del RNA precursor
antes de que ocurra su transporte al citoplasma. El proceso por el cual los intrones se
retiran del RNA precursor y los exones se enlazan juntos, se conoce como escisión del
RNA. Las regiones reguladoras para genes eucarióticos específicos, por lo regular se
localizan en el DNA que flanquea el sitio de inicio de la transcripción en el extremo 5'
(secuencia del DNA 5' flanqueadora). En ocasiones, éstas se encuentran en el propio gen
o en la región próxima a su extremo 3'. En las células de los mamíferos, cada gen tiene su
propia región reguladora. Muchos genes eucarióticos (y algunos de virus que se replican
en las células de mamíferos) tienen regiones especiales, Ilamadas amplificadoras, que
incrementan la velocidad de la transcripción. Además algunos genes tienen secuencias de
DNA, conocidas como silenciadoras, que disminuyen la transcripción.

 Los genes se trascriben en el RNA

La información, por lo general, pasa del DNA al mRNA y de este a la proteína, Este
proceso es controlado rígidamente e implica un cierto número de pasos complejos, cada

144
uno de los cuales es sin duda regulado por una o más enzimas o factores; la función
deficiente de cualquiera de ellos puede causar enfermedad.

CONCEPTOS USADOS EN LA TECNOLOGÍA DE RECOMBINACIÓN DEL ADN

ARS: Secuencia replicante de manera autónoma; el origen de la replicación de levaduras.

Autorradiografía: La detección de moléculas radioactivas mediante visualización de sus
efectos sobre película fotográfica o de rayos X.
Bacteriófago: Un virus que afecta a una bacteria.
Biblioteca: Colección de fragmentos clonados que representa, en conjunto, todo el
genoma. Las bibliotecas pueden ser DNA genómico o cDNA.
cDNA: Una molécula de DNA monocatenario que es complementaria a una molécula de
mRNA y se sintetiza a partir de la misma por medio de la acción de trascriptasa inversa.
Clona: Un gran número de organismos, células o moléculas que son idénticas con un
organismo, célula o molécula progenitor único.
Código epigenético: Los modelos de modificación de DNA cromosómico y
modificaciones postraduccionales de histona nucleosomica. Estos cambios del estado de
modificación pueden llevar a alteraciones notorias de la expresión de gen. Aun así es
notable que la secuencia de DNA subyacente real involucrada no cambia.
Cósmido: un plásmido hacia el cual se han insertado las secuencias de DNA del
bacteriófago lambda que son necesarias para la aglomeración de DNA; esto permite que
el DNA del plásmido se aglomere in vitro.
DNA con extremo pegajoso: Cadenas únicas complementarias de DNA que sobresalen
desde extremos opuestos de un DNA dúplex o forman los extremos de diferentes
moléculas dúplex.
DNA con extremo romo: Dos cadenas de un DNA dúplex que tiene extremos que están
alineados entre sí.
DNA recombinante: El DNA alterado que se produce por la inserción de una secuencia
de Desoxinucleotidos no previamente presente hacia una molécula de DNA existente, por
medios enzimáticos o químicos.
Electrotransferencia Northern: Método para transferir RNA desde un gel de agarosa o
poliacrilamida hacia un filtro de nitrocelulosa, en el cual el DNA se puede detectar
mediante la sonda idónea.
Electrotransferencia Southwestern: Método para detectar interacciones entre proteína y
DNA al aplicar una sonda de DNA marcada a una membrana de transferencia que
contiene una proteína renaturalizada.
Electrotransferencia Western: Método para transferir proteína hacia un filtro de
nitrocelulosa, en el cual la proteína se puede detectar mediante una sonda idónea.
Empalme: La eliminación de intrones del RNA, acompañada por la unión de sus exones.
Empalmeosoma: El complejo macromolecular que se encarga del empalme de mRNA
precursor. Consta de al menos 5 RNA nucleares pequeños (snRNA; U2, U4, U5, U6) y
muchas proteínas.
ENCODE Project: Encyclopedia of DNA elements Project; un esfuerzo de múltiples
laboratorios de todo el mundo para proporcionar una representación detallada, informativa
desde un punto de vista bioquímico, del genoma humano usando métodos de
secuenciación de alta capacidad de procesamiento para identificar y catalogar los
elementos funcionales dentro de una parte restringida única de un cromosoma de ser
humano.
Endanucleasa: Enzima que separa enlaces internos en el DNA o en el RNA.

145
Enzima de restricción: Endodesoxinucleasa que separa las dos tiras del DNA en sitios
altamente específicos por la secuencia de bases.
Escinucleasa: La nucleasa de escisión implicada en la reparación del DNA por recambio
del nucleótido
Establecimiento de la huella digital: El uso de RFLP o de DNA de secuencia de
repetición para establecer un modelo único de fragmentos de DNA para un individuo.
Establecimiento de la huella digital del pie: El DNA con proteína unida es resistente a
la digestión por enzimas DNasa. Cuando se realiza una reacción de secuenciación
usando ese DNA, se detectara un área protegida, que representa la “huella digital del pie”
de la proteína unida, porque las nucleasas son incapaces de dividir el DNA directamente
unido a la proteína.
Exón: Secuencia de un gen que se representa (expresa) como mRNA.
Exonucleasa: Enzima que separa nucleótidos de los extremos 3' o 5' del DNA o del RNA.
FISH: Hibridación in situ fluorescente, método que se usa para mapear la ubicación de
secuencias de DNA especifica dentro de núcleos fijos.
Hibridación: Reunión específica de tiras complementarias de los ácidos nucleícos (DNA
con DNA, UNA con
RNA, o RNA con RNA).
Horquilla: Un tramo de doble hélice constituido por formación de cadenas de bases entre
secuencias complementarias vecinas de una cadena única de DNA o RNA.
Inserto: Un tramo adicional de pares de bases en el DNA, introducidas por lo general por
tecnología del DNA recombinante.
Intrón: La secuencia de un gen que codifica para mRNA que se transcribe pero que se
escinde antes de la traducción. Los genes que codifican para tRNA también pueden
contener intrones.
Ligadura: Unión catalizada por la enzima fosfodiéster de dos tramos de DNA o RNA
hacia uno; las enzimas respectivas son DNA ligasa y RNA ligasa.
Lineas: Secuencias repetidas entremezcladas largas.
miRNA: microRNA, especies de RNA de 21 a 22 nucleótidos de largo derivado a partir de
unidades de transcripción de RNA polimerasa II, de 500 a 1500 bp de longitud por medio
de procesamiento de RNA. Se cree que estos RNA, recién descubiertos, desempeñan
funciones cruciales en la regulación del gen.
Molécula quimérica: una molécula que contiene secuencias derivadas de dos especies
diferentes.
Oligonucleótido: Una secuencia corta y definida de nucleótidos unidos entre sí en el
enlace fosfodiester típico.
Ori: El origen de replicación de DNA.
PAC: Un vector de clonación de alta capacidad basado en el bacteriófago P1 de E. coli
lítico que se replica en bacterias como un elemento extra cromosómico.
Palíndromo: Secuencia de DNA dúplex que es la misma cuando las dos cadenas se leen
en direcciones opuestas.
Plásmido: Pequeña molécula circular, extra cromosómica, de DNA que se replica de
manera independiente del DNA huésped.
Polimorfismo micro satélite: Heterocigosidad de una cierta replicación micro satélite en
un individuo.
Primosoma: El complejo móvil de helicasa y primasa que está involucrado en la
replicación del DNA.
Proteosoma: Colección completa de proteínas expresadas en un organismo.
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR): Método enzimático para el copiado
repetido de las dos cadenas de DNA que constituyen una secuencia de gen particular.

146
RT-PCR: Metodo usado para cuantificar las concentraciones de mRNA, que se
fundamenta en un primer pasó de copia de cDNA de mRNA catalizado por la transcriptasa
inversa antes de amplificación con PCR y cuantificación.
Secuencias de repetición micro satélite: Secuencias de repetición dispersas o en
grupo, de 2-5 bp repetidas hasta 50 veces. Pueden suceder en 50 000 a 100 000
ubicaciones en el genoma.
Señal: El producto terminal observado cuando una secuencia especifica de DNA o RNA
se detecta mediante autorradiografia o algún otro método. Generalmente se usa
hibridación con un polinucleotido radiactivo complementario para generar la señal.
Seudogén: Un segmento de DNA inactivo que surge por mutación de un gen activo
progenitor; típicamente se genera por trasposición de una copia de cDNA de un mRNA.
Sines: Secuencias de repetición entremezcladas cortas
SiRNA: RNA silenciadores, de 21 a 25 nt de longitud, generados por degradación
nucleolitica selectiva de RNA bicatenarios de origen celular o viral. Los siRNA se
renaturalizan a diversos sitios específicos dentro del blanco en RNA que conducen a la
degradación de mRNA, de ahí el nombre “noqueo de gen”.
SNP: polimorfismo de nucleótido único. Se refiere al hecho de que la variación genética
de nucleótido único en la secuencia del genoma existe en loci separados en todos los
cromosomas. La medición de diferencias de SNP alélicas es útil para estudios de mapeo
de gen.
snRNA: RNA nuclear pequeño. Esta familia de RNA se conoce mejor por su función en el
procesamiento de mRNA.
Sonda: Una molécula usada para detectar la presencia de un fragmento de DNA o RNA
especifico en, por ejemplo, una biblioteca genética o durante el análisis por medio de
técnicas de electrotransferencia; las sondas comunes son moléculas de cDNA,
oligodesoxinucleotidos sintéticos de secuencia definida, o anticuerpos contra proteínas
especificas.
Tándem: Usado para describir múltiples copias de la misma secuencia que yacen
adyacentes entre sí.
Terminal transferasa: Enzima que añade nucleótidos de un tipo al extremo 3’ de
cadenas de DNA.
Traducción: Síntesis se proteína usando mRNA como plantilla.
Traducción de muesca: Técnica para marcar DNA que se basa en la capacidad de la
DNA polimerasa de E. coli para degradar una cadena de DNA que se ha mellado, y
después para volver a sintetizar la cadena; si se emplea un nucleósido trifosfato
radiactivo, la cadena reconstruida queda marcada, y puede usarse como una sonda
radiactiva.
Transcripción: Síntesis de ácidos nucleícos dirigida por DNA plantilla; típicamente
síntesis de RNA dirigida por DNA.
Transcripción inversa: Síntesis de DNA dirigida por RNA, catalizada por la transcriptasa
inversa.
Transcriptoma: La colección completa de mRNA expresados en un organismo.
Transgénico: Describe la introducción de DNA hacia células germinales por medio de su
inyección hacia el núcleo del huevo.
Variación del número de copias (CNV): Cambio de número de copias de regiones de
DNA genómicas especificas entre dos o más sujetos. Las CNV pueden ser tan grandes
como de 106 bp de DNA, e incluir deleciones o inserciones.
Vector: Un plásmido o bacteriófago hacia el cual pueden introducirse DNA extraño para
los propósitos de clonación.

147
PRINCIPALES MÉTODOS UTILIZADOS EN LABORATORIOS DE BIOLOGÍA
MOLECULAR PARA EL ANÁLISIS DE ÁCIDOS NUCLEÍCOS Y PROTEÍNAS: CORTE Y
PEGADO DE ADN, HIBRIDACIÓN, SECUENCIACIÓN, SOUTHERN (ADN), NORTHERN
(ARN), WESTERN (PROTEÍNAS) Y REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA
(PCR).

 Cortado: La tecnología del DNA recombinante comprende su aislamiento y

manipulación para formar moléculas quiméricas.

El aislamiento y manipulación del DNA, inclusive la unión de extremo a extremo de

moléculas de fuentes muy distintas para formar moléculas quiméricas, es la esencia de
la investigación del DNA recombinante.
Las endonucleasas que cortan el DNA en secuencias especificas dentro de la molécula,
son un recurso clave en la investigación del DNA recombinante. Estas enzimas se
conocen como enzimas de restricción porque su presencia en una bacteria dada restringió
el crecimiento de ciertos virus de bacterias, denominados bacteriófagos. Estas enzimas
defensivas protegen al DNA de la bacteria huésped contra el genoma de DNA de
organismos extraños al desactivar de manera específica el DNA del fago invasor por
digestión. De tal manera que las DNA metilasas especificas para sitio y las enzimas de
restricción siempre existen en pares en una bacteria.

Las enzimas de restricción se nombran en base a bacteria a partir de la cual fueron

aisladas. Tomando por ejemplo la EcoRI proveniente de Escherichea coli, las primeras
tres letras del nombre de la enzima corresponden a la primera letra del genero (E) y las
dos primeras de la especie (co). A estas puede seguir la designación de la cepa (R) y un
numero romano (I) que indica el orden de descubrimiento.

Cada enzima reconoce y divide una secuencia de DNA bicatenario especifica que
típicamente tiene de 4 a 7 pb de largo. Estos cortes dan por resultado extremos romos o
que se superponen (pegajosos), según el mecanismo empleado por la enzima. Los
extremos pegajosos son especialmente útiles para construir moléculas hibridas o
quiméricas. Un fragmento de DNA tiene una disposición lineal característica de sitios para
las diversas enzimas, dictada por la secuencia lineal de sus bases; por ende es posible
construir un mapa de restricción.

148
  Pegado: las enzimas de restricción y la DNA ligasa se usan para preparar
moléculas de DNA quiméricas:

Los extremos pegajosos de un vector pueden reconectarse consigo mismos, sin ganancia
neta de DNA. Los extremos pegajosos de fragmentos también se renaturalizan de manera
que se forman insertos en tándem heterogéneos. Asimismo, los sitios de extremo
pegajoso quizá no estén disponibles o en una posición conveniente. Para sortear estos
problemas, es factible emplear una enzima que genera extremos romos, mismos que se
pueden ligar de modo directo; empero la ligadura no es direccional. De esta manera hay
dos alternativas: se añaden extremos pegajosos sintéticos. Si se añade poli d(G) a los
extremos 3’ del vector, y se adiciona poli d(C) a los extremos 3’ del DNA extraño usando

149
transferasa terminal, las dos moléculas únicamente pueden renaturalizarse una con otra,
lo que sortea los problemas antes listados. Este procedimiento es llamado colocación de
cola de homopolimero. De modo alternativo, enlazadores de oligonucleótido dúplex, con
extremo romo, sintéticos, que contiene la secuencia de enzima de restricción conveniente
se ligan al DNA con extremo romo. Esto mediante el uso de la enzima bacteriófago T4
DNA ligasa. Aunque esta técnica es menos eficiente que la ligadura de extremo pegajoso,
plantea la ventaja de unir cualesquiera pares de extremos. Como método adjunto al uso
de endonucleasas de restricción los científicos han usado recombinasas procarioticas o
eucarioticas específicas para catalizar la incorporación específica de dos fragmentos de
DNA que portan las secuencias de reconocimiento apropiadas.

 Hibridación (Southern, Northern y Western)

Es la reconstrucción artificial de acidos nucleícos bicatenarios a partir de dos

monocatenarios y por complementariedad de bases. Cuando una solución de ADN que ha
sido calentada se enfría lentamente, se produce la re-hibridación, dando lugar a la
estructura inicial. Tal reasociacion ocurre solo si las secuencias de bases son
complementarias. Por lo tanto, está claro que la hibridación permite la formación de
complejos bicatenarios no naturales de ADN, ARN ó ADN-ARN.

Este es un método muy versátil que permite estudiar el grado de relación genética entre
dos ácidos nucleícos. También permite estudiar el grado de relación genética entre dos
ácidos nucleícos. También permite la detección de fragmentos de ADN que son
complementarios a fragmentos monocatenarios de secuencia conocida (sonda). La
hibridación se lleva a cabo normalmente sobre membranas de nitrocelulosa. Primero se
une al filtro de ADN monocatenario y es entonces cuando se añade la sonda. Cuando la
sonda no se une con el ADN problema, es arrastrada en los lavados subsiguientes. Si es
necesario, las condiciones de hibridación pueden manipularse con el fin de favorecer a los
híbridos ADN-ADN o los ADN-ARN.

La hibridación puede realizarse incluso después de la electroforesis. Las moléculas de

Acido nucleícos se transfieren a las membranas bien por capilaridad o con aplicación de
corriente eléctrica, y es entonces cuando se añade la sonda. El procedimiento de
transferencia más clásico cuando el acido nucleícos que está en el gel es el ADN se
conoce como Southern, cuando en el gen hay ARN se denomina Northern; existe otra
técnica denominada Western, que implica el uso de anticuerpos para la detección de
proteínas especificas.

Estos procedimientos son útiles para determinar cuántas copias de un gen hay en un
tejido dado o si hay una alteración gruesa en un gen, porque el paso de electroforesis que
constituye un requisito separa las moléculas con base en el tamaño.

 Secuenciación
Los segmentos de moléculas de DNA específicas obtenidas mediante tecnología de DNA
recombinante se pueden analizar para determinar su secuencia de nucleótido. Este
método depende de tener un numero grande de moléculas de DNA idénticas. Este
requisito puede satisfacerse al clonar el fragmento de interés. En el método enzimático

150
manual (Sanger) se emplean desoxinucleotidos específicos que terminan la síntesis de
cadena de DNA en nucleótidos específicos a medida que la cadena se sintetiza sobre
ácidos nucleícos plantilla purificado. Las reacciones se ajustan de manera que se obtiene
una población de fragmentos de DNA que representan terminación en cada nucleótido. Al
tener una marca radiactiva incorporada en el sitio de terminación, es posible separar los
fragmentos de de acuerdo con el tamaño usando electroforesis en gel de poliacrilamida.
Se obtiene una autorradiografia y cada uno de los fragmentos produce una banda en una
placa de rayos X o de imágenes. Otro método manual es el de Maxam y Gilbert, en que
se emplean métodos químicos para dividir las moléculas de DNA donde contienen
nucleótidos específicos.

 Reacción en cadena de la polimerasa.

La PCR se emplea para amplificar una secuencia blanco de DNA proporcionando un

medio sensible, selectivo y en extremo rápido para amplificar una secuencia de DNA
deseada. Su especificidad se basa en el uso de dos iniciadores oligonucleótidos que se
hibridan hacia secuencias complementarias en cadenas opuestas de DNA y flanquean la
secuencia en blanco.
La muestra de DNA primero se calienta para separar las dos cadenas del DNA platilla
que contiene la secuencia blanco; se permite que los iniciadores renaturalicen al DNA y
cada cadena se copia mediante una DNA polimerasa, empezando en los sitios
preparadores en presencia de los 4 dXTP. Cada única de las dos cadenas de DNA sirve
como una platilla para la síntesis de DNA nuevo a partir de dos iniciadores. Ciclos
repetidos de desnaturalización con calor, renaturalización de los iniciadores a sus
secuencias complementarias y extensión de los preparadores renaturalizados con DNA
polimerasa, producen la amplificación exponencial de segmentos de DNA de longitud
definida. Las reacciones de polimerasa se corren a 70°C usando una polimerasa estable
al calor que proviene de Thermus aquaticus. 20 ciclos proporcionan una ampliación de
secuencias de ADN de 106 y 30 ciclos una ampliación de 109.
La PCR además de tener aplicaciones en medicina forense es empleada para:
1) Determinar agentes infecciosos (especialmente virus latentes)
2) Hacer diagnósticos genéticos prenatales
3) Detectar polimorfismos alélicos
4) Establecer tipos de tejido exactos para trasplantes
5) Estudiar la evolución (usando DNA de muestras arqueológicas)
6) Análisis de RNA cuantitativos después de copia de RNA y cuantificación de mRNA
por medio de un método llamado RT-TCR.
7) Efectuar evaluación de ocupación de proteína-DNA in vivo usando valores de
inmunoprecipitacion de cromatina.

APLICACIONES PRÁCTICAS DE LA TECNOLOGÍA DE RECOMBINACIÓN DEL DNA

 Mapeo de genes:
La localización de gen puede un mapa de genoma humano; esto ya esta produciendo
información útil en la definición de enfermedad de seres humanos. La hibridación de
células somáticas y la hibridación in situ son usadas para esto. En la hibridación in situ el
procedimiento más simple y más directo, se añade una sonda radiactiva a una dispersión
de cromosomas en metafase sobre una laminilla de vidrio. El área precisa de hibridación
se localiza al colocar capas de emulsión fotografía sobre la laminilla y, después de
exposición, alinear los granos con alguna identificación histológica del cromosoma. La

151
FISH, en la que se utilizan sondas fluorescentes en lugar de sondas marcadas con
radiactividad, es también usada en este propósito. Una vez que el defecto se localiza en
una región del DNA que tiene la estructura típica de un gen, puede construirse una copia
de cDNA sintética del gen. Que únicamente contiene exones codificadores de mRNA, y se
expresa en un vector apropiado siendo así posible evaluar su función. Anticuerpos
dirigidos contra este péptido pueden usarse para evaluar si este péptido se expresa en
personas normales, si está ausente o esta alterado en personas que presentan
determinado síndrome.

 Producción de proteínas para investigación y diagnostico.

La tecnología del DNA recombinante también se emplea para la producción de materiales
biomédicos para proporcionar:
1) Grandes cantidades de material que no podría obtenerse mediante métodos de
purificación convencionales.
2) Material humano (como la insulina).
Aun cuando el objetivo primario es proporcionar productos para el tratamiento y
diagnostico de enfermedades, existen otras aplicaciones comerciales que son potenciales
como por ejemplo la agricultura.

TECNOLOGÍA DE RECOMBINACIÓN DEL DNA EN EL ANÁLISIS MOLECULAR DE

LA ENFERMEDAD

 Variaciones de gen normales

Existe una variación normal en la secuencia de DNA, estas variaciones o polimorfismo
ocurren cada 500 a 1000 nucleótidos. También hay delecciones genómicas e inserciones

152
de DNA, así como sustituciones de base única. En personas sanas estas alteraciones
suceden en regiones no codificadoras del DNA o en sitios que no se traducen en un
cambio de la función de la proteína codificada.
 Variaciones de gen que dan por resultado una enfermedad
Casi todas las enfermedades genéticas se deben a mutaciones puntuales que originan
una proteína alterada. Aunque puede producirse por la alteración de cualquiera de los
pasos que van desde la replicación hasta la síntesis de la proteína.
 Mutaciones puntuales
El ejemplo más clásico de esto corresponde a la enfermedad de las células falciformes,
que se produce por mutación de una base única de las 3x10 9 del genoma. Una sustitución
de T a A en el DNA que suscita un cambio de A a U en el mRNA que corresponde al
sexto codón que codifica para la globina β. El codón alterado produce un aminoácido
diferente y esto una estructura anormal para la hemoglobina β. En algunos casos la
producción nula de globina β; la talasemia β es el resultado de estas mutaciones.
 Deleciones, inserciones y reordenamientos del DNA
La deleción de un fragmento de DNA crucial, el reordenamiento de DNA dentro de un gen,
o la inserción o amplificación de un fragmento de DNA dentro de una región codificadora
reguladora, pueden causar cambios de la expresión génica que dan por resultado una
enfermedad. Las deleciones de la agrupación de globina α den cromosoma 16 producen
talasemia α.
 Análisis de ascendencia
El análisis de la ascendencia se ha aplicado a diversas enfermedades genéticas, y es
más útil y es más útil en las que se producen por deleciones e inserciones o los casos
más raros en los que hay afección de un sitio de corte de endonucleasa de restricción.
 Diagnostico prenatal
Si se extiende la lesión génica y se dispone de una sonda especifica, el diagnostico
prenatal se hace posible a partir de 10 ml de liquido amniotico mediante
inmunotransferencia de Southern.
 Polimorfismos de longitud de fragmento de restricción (RFLP) y
polimorfismo de un solo nucleótido (SNP)
Los polimorfismos de nucleótido único pueden detectarse en una PCR sensible. Una
diferencia hereditaria del modelo de digestión de enzima de restricción se conoce como
polimorfismo de longitud de fragmento de restricción. Esos se producen por cambios de
base únicos o por deleciones o inserciones y han resultado ser instrumentos de
diagnostico útiles. Los RFLP y SNP son hereditarios y se segregan de manera
mendeliana. Un uso importante de SNP/RFLP estriba en la definición de enfermedades
hereditarias en las cuales se desconoce el déficit funcional. Los SNP/RFLP pueden
usarse para establecer grupos de enlace que a su vez, por medio del proceso de
caminata cromosómica, definirán el locus de la enfermedad.
 VNTR en medicina forense
Los VNTR pueden ser hereditarios y sirven para establecer asociación genética con la
enfermedad en una familia o un clan, o pueden ser singulares para un individuo y así,
servir como una huella digital molecular de esa persona.

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 BIBLIOGRAFÍA:
Bioquímica de harper Capitulos 7-9, 33-36

Fundamentos de bioquímica, Escrito por Juli G Peretó Pgs: 123-125

Bioquímica, Escrito por Jeremy Mark Berg,Lubert Stryer,John L. Tymoczko Pgs: 288-292

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Genética médica Escrito por Rafael Oliva Virgili pgs 41-43

Fundamentos moleculares en medicina Escrito por Fernando Lizcano Losada pgs 50-
58

Fundamentos de bioquímica metabólica Escrito por TeijÓn, JosÉ MarÍa / Vv.aa. pgs
298.300

Apuntes previos de la materia.

Biblia original.

Texto ilustrado de biología molecular e ingeniería genética: conceptos ... Escrito por
Luque,José Luque Cabrera Tema 3

Biologia Celular Y Molecular/ Molecular and Cellular Biology Escrito por Arnold
Berk,Harvey Lodish pg 41

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Biología para médicos: conceptos básicos para las facultades de medicina... Escrito
por Konrad Bachmann Capitulo 8

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