ENZIMAS DE RESTRICCIÓN. Romero A. 19181060.
Medicina, universidad de
Santander (UDES). andresromero158@[Link]
RESUMEN
Conocidas también como endonucleasas, cortan los enlaces fosfodiéster a partir de
una secuencia que reconocen. Una unidad de enzima se define como la cantidad
de la misma que se necesita para cortar 1 microgramo de ADN en una hora. Toman
el nombre de la bacteria que las produce y están divididas en tres tipos de enzimas,
pero solo son utilizadas el tipo II en genética molecular puesto que permiten romper
el ADN en sitios específicos, y así, recuperar secuencias conocidas. Las tipo I
reconoce la secuencia especifica de ADN, metila y restringe. Pero la restricción no
ocurre en el sitio de reconocimiento, sino que es al azar y las tipo III son similar al
sistema tipo I, utilizan una enzima oligomérica que realiza todas las actividades
enzimáticas y rompen el ADN 25-27 pb, más allá del sitio de reconocimiento.
INTRODUCCION
El descubrimiento de las enzimas de restricción marcó un hallazgo fundamental
permitiendo el desarrollo de la genética y la Biología Molecular, así como también
sus aplicaciones en diferentes áreas. Este descubrimiento fue a finales de la década
de los 60 por Werner Arber, Hamilton Smith & Daniel Nathans llevándolos a ganar
el premio Nobel de 1978. En este informe se hace una descripción de las enzimas
de restricción, hablando de los diferentes tipos, así como también la utilización de
una enzima de restricción (NcoI) para la digestión de ADN y sus diferentes
aplicaciones en el campo de la biología molecular y la genética.
OBJETIVO GENERAL
Explicar el fundamento de las enzimas de restricción, basándose en la literatura
conociendo los diferentes tipos, su nomenclatura, aplicaciones e importancia en la
genética y biología molecular.
OBJETIVOS ESPECIFICOS
Reconocer el mecanismo de acción de las enzimas de restricción.
Identificar el tipo de enzima utilizado en biología molecular.
Realizar la digestión del ADN a partir de la endonucleasa NcoI.
Conocer las aplicaciones y nomenclatura de las enzimas de restricción.
PALABRAS CLAVE
Endonucleasas, NcoI, metilar, secuenciar.
METODOLOGIA
Para la realización de la práctica de laboratorio al momento de montar el análisis de
restricción, se debe primero:
Limpiar el área de trabajo, para evitar la contaminación de la enzima y los
reactivos.
Definir la cantidad de ADN a cortar (15 µL) y el volumen final de la reacción
(20 µL)
Determinar el volumen de la enzima según su concentración, necesaria para
digerir el ADN (1µL).
Cargar el Buffer D al (2,5 µL)
Después de realizar los cálculos y determinar el procedimiento a seguir se deben
preparar las muestras en el siguiente orden: buffer, BSA, H2O, enzima NcoI y el
plásmido o ADN total a digerir (20 µL)
Mezclar bien cada una de las muestras ya sea utilizando la pipeta o dando
golpes suaves con las yemas de los dedos.
Incubar las digestiones a la temperatura óptima (37°C) del trabajo de la
enzima, dejando actuar de 10-12 horas.
En este caso sería Digestión del gen del angiotensinógeno con la enzima de
restricción NcoI
RESULTADO
Se colocó los digeridos a 37°C con un espacio de 10-12 horas para que puedan
realizar su actividad.
DISCUSION
Las enzimas de restricción, también conocidas como endonucleasas, son enzimas
que cortan los enlaces fosfodiéster del material genético a partir de una secuencia
que reconocen. Las mismas permiten cortar ADN de hebra doble, donde reconocen
secuencias palindrómicas (secuencias que se leen igual en ambas direcciones).
Son extraídas de organismos procarióticos (bacterias), donde actúan como un
mecanismo de defensa, para degradar material genético extraño que entre en la
célula. Las bacterias tienen la capacidad de metilar su ADN, lo cual sirve para
distinguir entre el ADN extraño y el ADN propio. Las enzimas de restricción no
pueden cortar ADN metilado, de este modo solo afectan el ADN extraño y no el ADN
bacteriano. Las endonucleasas se nombran a partir de las bacterias de las que son
extraídas, su nombre está dado según el género y la especie de la bacteria de donde
se aisló por primera vez esta enzima.
La primera letra representa el género de la bacteria, las próximas dos indican la
especie, una cuarta letra indica la cepa, y un número al final indica la cantidad de
enzimas que se han aislado de esa cepa. Existen tres tipos de enzimas de
restricción, pero solo el tipo II son utilizadas en genética molecular puesto que
permiten romper el ADN en sitios específicos, y así, recuperar secuencias
conocidas. El tipo I y tipo III tienen actividad de restricción (cortan) y modificación
(metilan). Cortan a cierta distancia de la secuencia de reconocimiento, las Tipo I
cortan lejos de la secuencia de reconocimiento, ya sea río arriba o río abajo. Las
tipo III rompen el ADN 25-27 pb, más allá del sitio de reconocimiento. Las enzimas
tipo II, dependiendo de su especificidad, al romper el ADN provocan 2 tipos de
cortes, abruptos o romos y pegajosos o cohesivos. Sólo requieren Mg++ como
cofactor y no necesitan ATP.
Existen varios factores que son críticos al trabajar con enzimas de restricción y que
pueden afectar la actividad de las mismas: la temperatura de digestión es 37°C
debido a que las enzimas son muy sensitivas a temperatura y pH en lo que respecta
a su estabilidad y actividad. Pureza del DNA, la reacción de enzimas es muy
dependiente de la pureza, contaminantes como proteínas, fenol, cloroformo, etanol,
EDTA, SDS, altas concentraciones de sal, etc. inhiben la endonucleasa.
El rol regulador del sistema RAS (Renina-angiotensina-aldosterona) en el tono
vascular y la homeostasis hace que los genes involucrados en esta vía metabólica
puedan asociarse con la hipertensión. Varios genes de esta cascada enzimática
han sido localizados; se trata de los genes del angiotensinógeno (cromosoma 1,
sector 1q42), de la renina (1q32), de la enzima convertidora de la angiotensina I
(17q23) y del receptor tipo 1 de la angiotensina II (3q21-25). Los dos polimorfismos
más estudiados son el I/D del gen de la enzima conversiva de la angiotensina (ECA)
y el M235T del gen del angiotensinógeno. Ambos polimorfismos se caracterizan por
determinar de alguna manera la actividad de las proteínas que codifican.
La enzima de restricción NcoI, procedente del microorganismo Rhodococus ruber,
me permite digerir el gen del angiotensinógeno puesto que reconoce una secuencia
Hexa nucleotídica palindrómica en la molécula de ADN, y su secuencia de corte y
sitio de reconocimiento son:
5' ...C*CATGG... 3'
3' ...GGTAC*C... 5'
Por último, las enzimas de restricción tienen diferentes aplicaciones las cuales son
utilizadas en biología molecular como por ejemplo, son utilizadas para hacer mapa
de restricción de un plásmido o bacteriófago, fragmentan ADN genómico para
separación de electroforesis y “Southern Blot”, generan fragmentos para ser usados
como sondas marcadas de “Southern” y “Northern” blotting, generan fragmentos
para ser subclonados en los vectores apropiados, creación de ADN recombinante y
biotecnología, mecanismos de regulación y expresión génica, mapeo y cartografía
de genes, diagnóstico de enfermedades genéticas con cambio en la secuencia de
ADN y desarrollo de proteínas recombinantes.
CONCLUSIONES
Las enzimas tipo II son utilizadas en genética molecular puesto que permiten
romper el ADN en sitios específicos, y así, recuperar secuencias conocidas.
Se aíslan de bacterias quienes las utilizan como mecanismo de defensa ante
la entrada de virus o ADN extraño.
Su acción consiste en cortar los enlaces fosfodiéster del material genético a
partir de una secuencia que reconocen.
Existen varios factores que son críticos al trabajar con enzimas de restricción
y que pueden afectar la actividad de las mismas.
Tienen diferentes aplicaciones importantes en la genética y biología
molecular.
BIBLIOGRAFIA
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WATSON, James., et al. Biología molecular del gen. 5ed. Buenos aires:
Panamericana.2005.776p.
INVITACION AL ESTUDIANTE
Para complementar los conceptos y procedimientos durante la actividad del
aprendizaje responda las siguientes preguntas, investigue al respecto y confronte
los resultados con los de sus compañeros.
Plantee tres factores que afectan la actividad de las enzimas de restricción.
Temperatura y pH: las enzimas son sensibles a la temperatura y el pH en lo
que respecta a su estabilidad y actividad
Pureza del ADN: la acción de las enzimas es dependiente de la pureza del
ADN ya que son inhibidas por contaminantes como proteínas, fenol,
cloroformo, etanol, EDTA, SDS, altas concentraciones de sal, etc. inhiben la
endonucleasa.
DNAsas: Las DNAasas degradan el ADN en presencia de Mg2+
¿Cómo influye la acetilación y la metilación del ADN en la actividad de la
endonucleasa de restricción?
Debido a que las bacterias tienen la capacidad de metilar su DNA (lo cual
sirve para distinguir entre el DNA extraño y el DNA propio) su actividad
enzimática no se ve afectado, pero si el las endonucleasas son acetiladas.
