Universidad de Oriente

Núcleo Bolívar
Escuela de Ciencias de la Salud Dr. Francisco Battistini Casalta
Departamento de Bioanalisis
Laboratorio de Inmunología II
Grupo: Martes-A

Profesora: Bachilleres:

Alizar Abou Fakhr Moreno Rina C.I 17.747.324

Maurera Eduard C.I 24.701.609

Nadales Jennifer C.I 27.110.712

Márquez Grexi C.I 25.354.676

García Gabriela C.I 26.330.941

Ciudad Bolívar, octubre del 2019

 Practica #1 Sistema del complemento
El sistema del complemento consta de varias proteínas plasmáticas que se activan
por la presencia de microbios y que favorecen a su destrucción. Al igual que los
componentes del sistema de coagulación sanguínea, las proteínas del complemento
interactúan entre si en cascadas catalíticas.

Muchas proteínas del complemento se encuentran en el suero como precursores

enzimáticos inactivos (cimógenos); otras residen en las superficies celulares. El sistema del
complemento es el principal mecanismo de la inmunidad y debido a que su activación
puede causar inflamación y daño tisular, su papel en la patogénesis de muchas
enfermedades es de gran relevancia para la inmunología clínica.

El reconocimiento de los microbios por el sistema del complemento sigue tres vías:

 Vía Clásica: fue la primera en descubrirse, recurre a una proteína plasmática

denominada C1 para detectar anticuerpos IgM, IgG1 o IgG3 ligados a la superficie
del antígeno.
 Vía alterna: descubierta posteriormente pero más antigua que la clásica, se pone en
marcha por el reconocimiento directo de ciertas estructuras presentes en la
superficie de los microbiana, y por tanto, constituye un componente de la inmunidad
innata.
 Vía de la lectina: se dispara a partir de una proteína plasmática llamada lectina de
unión de manosa (MBL) que reconoce las manosas terminales en las glucoproteinas
y glucolipidos microbianos.

Utilidad clínica: para evaluación de pacientes con sospecha de déficit genético de alguno
de los componentes del complemento en el caso de aumento de infecciones, enfermedades
neurodegenerativas como Alzheimer, esclerosis múltiple, Guillain-Barre y otras como
glomerulonefritis o Lupus.

Diagnóstico de alteraciones del sistema del complemento.

Para evaluar el sistema del complemento se realizan pruebas cualitativas y
cuantitativas. Su utilidad está en la inmunología clínica. Las pruebas cuantitativas,
usualmente analizan las concentraciones de componentes específicos del complemento e
incluyen ensayos inmunoquímicos. Las pruebas cualitativas o ensayos funcionales miden la
actividad total del complemento (lisis) en las distintas vías de activación.

Las pruebas que producen hemólisis dan una perspectiva de la función de la

cascada enzimática completa del complemento. Una de ellas es la capacidad hemolítica 50
(CH50) del complemento. También se han desarrollado otros métodos que utilizan los
ensayos de inmunoabsorbancia asociados a enzimas(ELISA) para detectar el depósito de
C1q, C1s, C4, C3, factor B, proteína de unión a C4b, properdina y todos los componentes
terminales del complemento en la superficie plástica de un micro pocillo después de la
activación sérica.

La hemólisis inducida por la activación del complemento sobre antígenos de un

grupo sanguíneo que han sido reconocidos por anticuerpos correspondientes (Ej, antígeno
A con anticuerpo anti A), se presentará proporcionalmente a la concentración de
componentes del complemento. El método CH50 utiliza distintas diluciones para
determinar la cantidad de complemento necesaria para producir la lisis del 50% de
eritrocitos. Este tipo de lisis, mediada por el complemento se denomina inmunohemólisis y
refleja la integridad funcional de los 9 componentes del sistema de la vía clásica. Si en
estos existiera un déficit, la cadena enzimática no se activaría correctamente y habría
ausencia de inmunohemólisis.

Fijación del complemento

CH50: hemolisis, permite determinar la función completa del sistema del complemento.
Este método se basa en la medición de la capacidad de un suero de prueba para lisar el 50%
de una suspensión de eritrocitos de carnero (E) cubiertos con cantidades optimas de
anticuerpos de conejo anti glóbulos rojos de carnero (A), es una reacción que incluye la
activación completa de la vía clásica. Estos eritrocitos cubiertos con anticuerpo EA se
incuban por varias diluciones del suero de prueba, por un tiempo suficiente para culminar la
reacción, las mezclas se centrifugan y el porcentaje de hemolisis se determina
espectrofotométricamente. Cuando se grafica el porcentaje de hemolisis contra la cantidad
de suero adicionado se obtiene una gráfica típica sigmoide.

Existen 2 métodos para la determinación de esta prueba que son muy utilizados en el
laboratorio clínico que son:

 Método de KENT-FIFE: este mide la lisis de 0,6ml de una suspensión al 1% de EA

en un volumen total de 1,5ml.
 Método de MANFRED MAYER: este mide la lisis de una suspensión de EA al 5%
en un volumen total de 7,5ml.

Técnica KENT Y FIFE (CH50)- Vía clásica:

Fundamento de CH50: la reacción se inicia con la interacción antígeno (glóbulos rojos de

carnero) con el anticuerpo (hemolisina) al agregar el suero del paciente cuyos niveles de
complemento se desean investigar, se inicia la activación de la cascada de proteínas desde
C1-C9 con lo cual se obtiene la destrucción de los glóbulos rojos. El grado de hemolisis se
calcula mediante lectura espectrofotométrica. Los resultados se expresan en unidades
hemolíticas las cuales representan la cantidad de complemento requerido para lograr la
hemolisis del 50% de los glóbulos rojos de una suspensión estandarizada.
MATERIALES Y REACTIVOS

 Baño de hielo
 Eritrocitos de carnero conservados en solución de Alsever
 Hemolisina (2U 50% hemolíticas) en solución de TBS
 Pipetas graduadas de 1 y 5 ml
 Solución amortiguadora de TBS
 Suero a determinar su actividad del complemento
 Solución de TBS
 Tubos de 13x100mm

EQUIPOS

 Baño metabólico
 Centrifuga
 Espectrofotómetro

Procedimiento

1. Lave los eritrocitos de carnero por centrifugación a 2000rpm, por 5min, con
solución de TBS. Ajuste la suspensión de los eritrocitos de carnero al 2% en TBS.
2. En un tubo de 13x100mm añada 0,6 ml de la suspensión al 2% y adicione 3,4ml de
agua destilada. Lea la densidad óptica en el espectrofotómetro a 550nm usando
como blanco agua destilada.
Ajuste la densidad óptica a 0.5 con la siguiente ecuación.
D 0,1x V1= D 0,2x V2
3. Adicione un volumen de hemolisina titulada a 2U 50% hemolítica con un volumen
igual de la suspensión de eritrocitos de carnero e incube por 30 min a 37˚C en un
baño metabólico, con agitación frecuente. La suspensión quedara al 1%
4. Prepare las siguientes diluciones del suero problema:
- 0,4 ml de suero + 9,6 ml de TBS dilución 1:5
- 5 ml de dilución 1:25 + 5 ml de TBS dilución 1:50
- 5 ml de dilución 1:50 + 5 ml de TBS dilución 1:100
Deposite en baño de hielo
5. Introduzca una gradilla en baño de hielo y coloque 12 tubos, 4 para cada dilución
más 2 tubos (control positivo y control negativo). Realice una serie para cada
dilución:
Tubo 1 2 3 4 Control Control
pos. neg.
Dil. De suero 1 ml 0,7 ml 0,5 ml 0,3 ml 0 ml 0 ml
TBS 0,8 ml 1,1 ml 1,3 ml 1,3 ml 0 ml 1,8 ml
G.R carnero al 1,2 ml 1,2 ml 1,2 ml 1,2 ml 1,2 ml 1,2 ml
1%
 6. Mezcle e incube a baño de maría por 30 min a 37 ˚C, agitando frecuentemente
7. Transcurrido el tiempo de incubación, retire los tubos del baño de María y adicione
1ml de TBS frio para detener la reacción, excepto al tubo control que se le adiciona
2.8 ml de agua destilada.
8. Centrifugue los tubos a 2000rpm por 5 min. Decante el sobrenadante sobre un tubo
limpio y lea la densidad óptica a 550 nm usando como blanco el control negativo y
como 100% de la lisis el control positivo.

Ensayo CH50 Vía alterna

Fundamento: Los glóbulos rojos de conejo tienen la propiedad de activar las vías alternas
del sistema de complemento del suero humano, tratado previamente con solución buffer de
EDTA y concentraciones apropiadas de Mg produciendo hemolisis.

Pruebas para determinar proteínas del sistema del complemento

 Inmunodifusion radial: es una técnica que puede determinar la concentración de
un antígeno. Fue introducido por Mancini en 1965 y cuantifica de manera sencilla y
económica inmunoglobulinas de isótopo G, M, A y proteínas séricas (c3, c4,
transferrina, proteína C reactiva) presentes en muestras biológicas.

Fundamento: consiste en hacer reaccionar un antígeno con su respectivo anticuerpo en

un medio semisólido. Este medio puede ser gel de agar o agarosa en placa de cristal o
plástico cuyo espesor sea uniforme y el anticuerpos este distribuido en él.

 Nefelometría: mide la luz dispersada en dirección distinta a la luz emitida

(generalmente con ángulos que oscilan entre 15 y 90o). Es recomendable para
concentraciones más diluidas. Permite mayor sensibilidad con concentraciones
menores de partículas suspendidas. Constituye un método más exacto para la
medida de la opacidad. Se suele utilizar para medir concentraciones específicas de
colonias de bacterias en algún medio de cultivo, o de muchas proteínas utilizando el
principio de dispersión luminosa molecular. La nefelometría se usa principalmente
para medir en forma rápida y precisa el nivel específico de ciertas proteínas,
llamadas inmunoglobulinas, en la sangre. Específicamente, este examen busca las
inmunoglobulinas IgM, IgG e IgA.
 Turbidimetria: mide la disminución de la luz transmitida a través de una
suspensión de partículas utilizando para ello un espectrofotómetro (detector en la
misma dirección del haz de luz, se mide A o T). Se suele utilizar para soluciones
concentradas (para que haya una buena disminución de la luz transmitida) ej.
determinación de proteínas totales en suero, LCR u orina (haciendo que las
proteínas precipiten con TCA o ácido sulfosalicílico).
 La nefelometría y turbidimetria son muy similares, sin embargo no son iguales.
En el siguiente cuadro se nombran algunas diferencias:

Nefelometría Turbidimetria
Requiere un nefelómetro especialmente Pueden ser realizadas en la mayoría de
delicado los espectrofotómetros.
Sensibles para medir inmunocomplejos Sensibilidad incrementada para
pequeños inmunocomplejos pequeños con el uso de
partículas de látex sensibilizadas.
Menor precisión en determinación de Mayor precisión en la determinación de
inmunocomplejos grandes. inmunocomplejos grandes.
Los auto analizadores no poseen módulos Automatomatizacion adaptable a la de
de nefelometría estándar los auto analizadores
Debido a las velocidades de reacción más Las velocidades de reacción más lenta
rápida, por lo general es necesario permiten efectuar el blanco reactivo,
realizar blancos de reactivos y muestras muestra y la reacción en la misma cubeta
en forma separada

 Ensayo de inmunoabsorbacia asociado a enzima (ELISA): es una técnica que

permite detectar pequeñas partículas llamadas antígenos, que habitualmente son
fragmentos de proteínas. La identificación es específica, es decir, consigue que
pequeños segmentos de proteínas destaquen y no puedan ser confundidas con otras.
Para poder identificar los antígenos se utilizan moléculas con dos componentes
acoplados: un anticuerpo (que se une al antígeno de forma específica) y
una enzima (que se activa y señala la unión al antígeno). Antes del descubrimiento
del ELISA se utilizaban moléculas radioactivas en vez de enzimas, lo que suponía
un riesgo añadido innecesario en el laboratorio y un mayor coste.

Los diferentes tipos de ELISA son:

 ELISA directo: es la forma más básica de realizar la técnica. Consiste en recoger

una muestra a estudiar y ponerla en un pocillo (un recipiente pequeño) en frente de
una muestra igual pero contaminada con el germen a estudiar, y otra muestra en la
que se sabe que no hay germen. Se aplica el anticuerpo con la enzima en los tres
pozos y se compara la muestra a estudio con las otras dos.
 ELISA indirecto: se realiza de forma similar al ELISA directo, pero en este caso se
añade primero un anticuerpo sin enzima y después uno con enzima. De esa forma, la
señal que emite el enzima es mucho más potente y la prueba es más sensible.
 ELISA sándwich: en este caso en los pocillos primero se añade un anticuerpo y
después la muestra, para que los antígenos queden ya retenidos en el fondo del
pozo. Después se añade el anticuerpo con la enzima. Es la forma más eficaz de
realizar la prueba.
 ELISPOT: se trata de un tipo de ELISA que permite conocer de forma cuantitativa
el antígeno, incluso identifica el número concreto de células donde se encuentra
 Patologías donde el sistema del complemento se ve afectado
Las patologías o defectos en los componentes del complemento ponen en manifiesto
la importancia de este sistema, la mayoría de estas deficiencias se transmiten de forma
autosómica recesiva a diferencia de la deficiencia del C1 inhibidor que lo hace de forma
autosómica dominante y el defecto de properdina que se transmite de forma recesiva.

Los individuos con deficiencias del complemento tienen mayor susceptibilidad a

infecciones, enfermedades reumáticas, Angioedema o pueden permanecer asintomáticos.

En el siguiente cuadro se presentas algunas enfermedades asociadas al sistema del

complemento:

Componente Deficiencia Aumento

C1q Enfermedades tipo lupus Infecciones piógenas
C1r y C1s Lupus, infecciones bacterianas, glomerulonefritis
C2 Lupus Eritematoso Sistémico (LES), vasculitis, Infecciones piógenas
glomerulonefritis,
C3 Meningitis, osteomielitis, sepsis, neumonía,
infecciones bacterianas por Neumococo,
Neisseria, Haemophilus influenzae.
C4 LES, glomerulonefritis
C4a Les, enfermedades neurológicas y renales
C4b Infecciones bacterianas
C5 Meningitis, infecciones bacterianas
C6 Meningitis, lupus (en algunos casos)
C7 Infecciones por Neisseria (60% de los casos),
LES, artritis reumatoide, pioderma gangrenoso
C8 Meningitis meningococica, infecciones
gonocócicas
C9 Meningitis, infección por Neisseria
Factor D Infecciones pulmonares, meningitis de repetición
Factor I Infecciones bacterianas
Properdina Infecciones meningococica, LES y lupus
discoide (en algunos casos)
Inhibidor de Angioedema (cara y extremidades),
C1 enfermedades intestinales, Edema de Glotis
(manifestación más grave). También pueden
darse una serie de enfermedades asociadas LES
y glomerulonefritis por mal procesamiento de
inmunocomplejos por el consumo de C2 y C4
Factor H Enfermedades renales, síndrome hemolítico
urémico, infecciones por Neisseria.
 MBL Lupus, esta deficiencia se asocia con mayor
(Mannose frecuencia de infecciones en adultos y niños.
Binding
Lectin)

Referencias Bibliográficas

 Abbas, Abul K. et al: “INMUNOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR” 6TA

EDICION. Pág. 11, 321, 322, 323.
 Delves. Peter (2015): “SISTEMA DEL COMPLEMENTO”.
[Link]/es-ve/professional/inmunolog%c3%Ada-y-transtornos-
al%C3%A9rgicos/biolog%C3%Ada-del-sistema-inmunitario/sistema-del-
complemento
 Flores Maurilio. Et al. (2017): “MANUAL DE LABORATORIO DE
INMUNOLOGIA CLINICA”. PDF.
[Link]
 Lopez T, Margarita: “DEFICIENCIAS DEL COMPLEMENTO,
DIAGNOSTICOS DE LABORATORIO”. PDF.
Inmunologí[Link]/upload/articles/5/0/[Link]