UNIVERSIDAD NACIONAL
AUTÓNOMA DE MÉXICO
FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES
CUAUTITLÁN
CAMPUS 1
LABORATORIO BIOQUÍMICA MICROBIANA
Grupo: 1501- AB
REPORTE EXPERIMENTAL
PRÁCTICA No. 7:
METABOLISMO DE CARBOHIDRATOS PRUEBAS
BIOQUÍMICAS PRIMARIAS Y SECUNDARIAS
EQUIPO No. 1
De la Cruz Robles Dulce Rocío
Gutierrez Mendoza Brayan Eduardo
Olguin Loyola Gustavo Angel
PROFESORES:
Q.F.B. Jonathan Pablo Paredes Juárez
Q.F.B. Moises Missael Martinez Mejia
Q.F.B Victor Hugo Vazquez Valadez
FECHA DE ENTREGA: 24/ 10/19
OBJETIVOS
● conocer las pruebas bioquímicas primarias y secundarias.
● Identificar diferentes especies de bacterias, a través de su metabolismo
celular.
● Caracterizar en cada medio de cultivo el fundamento de la técnica empleada
● Analizar los respectivos resultados y por medio de estos hacer una
interpretación
● A Partir de las pruebas bioquímicas primarias y secundarias identificar el tipo
de especie y género de la bacteria.
INTRODUCCIÓN
Para que una célula viva, crezca y se reproduzca, debe ser capaz de incorporar y
transformar (mediante el metabolismo) los compuestos químicos que necesita para
obtener energía (catabolismo), así como las moléculas que pasarán a formar parte
de su material celular (anabolismo). Todas las reacciones químicas que se llevan a
cabo son catalizadas por enzimas (catalizadores biológicos de naturaleza proteica y
actividad específica), las cuales se clasifican, de acuerdo al lugar del ambiente
celular donde actúan, en exoenzimas y endoenzimas. Las pruebas bioquímicas se
emplean para identificar de forma clara y precisa, la presencia o ausencia de una
enzima, de un grupo de enzimas, o de una vía metabólica completa en uno o más
microorganismos. Los procedimientos que se llevan a cabo para la identificación de
bacterias van desde los que son simplemente descriptivos que incluyen morfología y
tinción, pasando por las pruebas bioquímicas simples las cuales sirven para la
detección de productos metabólicos o de una determinada reacción enzimática,
hasta llegar a técnicas muy sofisticadas, tal como el cálculo del porcentaje G+C en
bacterias o el empleo de sondas de ADN.
Las pruebas bioquímicas indican una serie de características metabólicas que, en
conjunto permiten diferenciar unas bacterias de otras. En otras palabras el empleo
de pruebas bioquímicas permite identificar de manera altamente precisa muchas
cepas, estas pruebas del metabolismo bacteriano son hechas especialmente para
cada bacteria. La mayoría de las pruebas utilizadas para estudiar la actividad
bioquímica o metabólica de bacterias, se lleva a cabo mediante el cultivo en un
medio con sustrato para la obtención de colonias aisladas, a las cuales
posteriormente se les realizará pruebas bioquímicas, y después de uno o dos días
de incubación pueden interpretarse los resultados obtenidos.
Fermentación de carbohidratos:
La fermentación es un proceso metabólico de óxido-reducción el cual ocurre en un
medio ambiente anaerobio, en el que en vez de utilizar oxígeno se utiliza un sustrato
orgánico que sirve como el aceptor final de hidrógeno (electrones). En pruebas
bacteriológicas este proceso se detecta observando cambios de color en
indicadores de pH a medida que se forman productos ácidos. Aquellas bacterias
que logran fermentar un hidrato de carbono por lo general son anaerobios
facultativos. Por medio de este proceso de fermentación un hidrato de carbono es
degradado y descompuesto en dos moléculas de carbono, las cuales son llamadas
triosas, estas son nuevamente degradadas en un número de compuestos de 1, 2, 3
y 4 carbonos. Los resultados varían de acuerdo a cada especie bacteriana, las
condiciones en las que se encuentra el medio ambiente y del sistema enzimático
existente en la especie. Al utilizarse un indicador de pH con determinado hidrato de
carbono se puede determinar si una bacteria ha degradado el mismo en varios
productos terminales, observando un cambio de color visible en el medio. Esta
prueba da positivo si presenta una coloración amarilla, en cambio es negativa si
presenta una coloración rosa-rojizo.
Prueba de TSI:
La prueba de agar con hierro de Kligler/ azúcar triple y hierro o TSI determina la
capacidad de una bacteria para atacar un específico hidrato de carbono que se
encuentre en un medio de desarrollo basal, además determina la posible producción
de ácido sulfhídrico. La prueba es positiva para la producción de ácido sulfhídrico si
se observa un precipitado negro (sulfuro ferroso) en todo el fondo, el cual
enmascara la acidez. La prueba es positiva para glucosa si se puede observar una
coloración amarilla en el fondo, es negativa si no se observa ningún cambio de
coloración. La prueba es positiva para sacarosa y lactosa si en la superficie puede
observarse una coloración amarilla, en cambio sí hay una coloración roja en la
superficie es negativa.
Prueba de LIA:
Esta prueba se realiza con medio de agar lisina hierro el cual posee una coloración
violeta y debe estar entubado en pico de flauta. Se debe sembrar sobre la superficie
inclinada por picadura y se deja incubando a una temperatura de 35°-37° C en un
tiempo de 18-24 horas. La prueba de la descarboxilación de la lisina es positiva si la
pendiente del pico de flauta y el fondo tienen una coloración violeta, en cambio la
prueba es negativa si el fondo tiene coloración amarilla y la pendiente tiene una
coloración violeta.
Las pruebas bioquímicas son una herramienta muy útil en el reconocimiento de un
microorganismo e identificación de su metabolismo, estas pruebas contienen sus
limitantes puesto que no se puede concluir una clasificación en base a estas, pero
cabe mencionar que la importancia es inmensa puesto que se comienza a conocer
el comportamiento y utilidades que podría tener el microorganismo basándose en
sus mismas rutas metabólicas que contienen. La importancia son las diferencias
estructurales con respecto a la forma, el tamaño y la disposición de las bacterias
ayudan muy poco en el proceso de identificación, porque hay muchas especies de
bacterias que tienen forma, tamaño y disposición similares. Por esta razón, en
última instancia la identificación de las bacterias se basa principalmente en las
diferencias de sus actividades bioquímicas. Cada especie de bacteria tiene un
conjunto bien definido de actividades metabólicas diferentes de todas las demás
especies.Así, las pruebas bioquímicas son importantes porque ayudan a
investigador a identificar correctamente los patógenos presentes en una muestra y,
de esta manera, poder recomendar el tratamiento adecuado al paciente.
MATERIALES Y MÉTODOS
MATERIALES MATERIALES EQUIPO REACTIVOS
BIOLÓGICOS
● 20 tubo de ● tubos de ● autoclaves ● HCl 1N (frasco
ensaye chicos ensaye con ● mecheros gotero) 50 mL
con tapón de tapón de rosca fisher ● H2O2 al 30%
rosca chicos y con ● microscopio (frasco gotero )
● 1 gradilla medio de oxido óptico 100 mL
● 1 matraz fermentación ● 1 parrilla ● NaOH 1N(frasco
Erlenmeyer de (OF). gotero) 100mL
500 mL ● Tubos de ● KOH 1N (frasco
● 1 matraz ensaye con gotero) 100 mL
Erlenmeyer de tapón de rosca ● ácido sulfanílico
250 mL chicos de al 0.8% (frasco
● 1 espátula metilo-Voges gotero) 50 mL
● 2 pipetas Proskauer ● Reactivo de
graduadas de ● Tubos de Kovack´s (frasco
10 mL ensaye con gotero) 50 mL
tapón de rosca ● rojo de metileno
chicos con al 0.2% (frasco
caldo rojo de gotero) 50 mL
fenol ● alfa-naftilamina
● Tubos de (frasco gotero) 50
ensaye con mL
tapón de rosca ● lugol (frasco
chicos con gotero) 50 mL
medio de citrato ● alfa naftol al 0.5%
de Simmons (frasco gotero) 50
● Tubos de mL
ensaye con ● reactivo para
tapón de rosca oxidasa (N,N,N,N-
chicos con tetrametil-p-fenile
medio KIA ndiamina)
● Tubos de
ensaye con
tapón de rosca
chicos con
medio de agar
hierro-triple
azucar (TSI)
● Tubos de
ensaye con
tapón de rosca
chicos con
caldo nitrato
● cepas problema
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
RESULTADOS
Tabla 1: Pruebas bioquímicas primarias
Antes Después Observaciones
*Tinción de Gram Se observan bacilos
rojos/rosas esto quiere
decir que es (-)
------
*Motilidad ------ Se observan bacilos en
forma de cadena (+)
*Oxidasa ------ No se observó ningún
cambio esto indica (-)
*Catalasa
Se observa un burbujeo
esto indica (+)
------
*Oxidación/Fermentación
Antes: Color verde
bandera claro
Después: Ambos tubos
viran a amarillo indica que
el microorganismo es
capaz de fermentar al
carbohidrato.
Tabla 1: Pruebas bioquímicas secundarias
Antes Después Observaciones
*Citratos Antes: Se observa un
medio sólido inclinado
color verde bandera.
Despues: Reacción
negativa, permanece
color verde.
*MIO
Antes: Color amarillo
Después: El tubo se
vuelve color púrpura lo
que indica un crecimiento
de pH
*KIA
Antes: Color de pico
naranja y fondo rojizo.
Después: No
fermentación de
carbohidratos Utilización
aeróbica y anaeróbica de
las peptonas
*SIM
Antes: Color amarillo
claro
Después: Color amarillo
turbio lo que indica
motilidad y sulfuro
negativo porque está
amarillo
Se le agregó un indicador
y se forma una anillo
color rojo.
*MR-VP *Rojo de metilo(MR):
Antes: Se observa un
caldo color amarillo.
Después:
*∝-naftol(VP) *La producción de ácidos
orgánicos baja y el pH a
menos de 4.3 y el rojo de
metilo vira a rojo
*No cambia entonces es
negativa no hay acetoina
en el medio.
Discusión de resultados
En esta práctica se emplearon pruebas bioquímicas para identificar el género y
especie de una cepa bacteriana, la cual es desconocida. Ya que estas con estas
pruebas bioquímicas primarias, secundarias y terciarias se obtiene la información de
una bacteria de forma una tal forma eficiente y rápida para su identificación.
Las pruebas o ensayos bioquímicos, son pruebas simples que se han desarrollado
para demostrar en forma clara una determinada característica bioquímica como
presencia o ausencia de una determinada actividad enzimática, grupo de enzimas o
determinada vía metabólica, crecimiento a una determinada temperatura,
crecimiento en presencia de inhibidores, etc. No significan de ninguna manera un
estudio profundo del metabolismo bacteriano
En este caso solo empleamos las pruebas bioquímicas primarias y secundarias con
una cepa bacteriana la cual debe tener ciertas características para poder obtener
resultados más acertados como son:
1) Obtener un cultivo rico en nutrientes, axénico y joven
2) Examen microscópico de células vivas y de frotis teñido por coloración Gram. Se
determina así la forma y el Gram del microorganismo en estudio. También es
importante determinar la agrupación y la presencia de esporas y otras
características morfológicas de interés.
3) Determinar las características nutricionales (en general se desprenden de los
métodos empleados en el aislamiento)
4) Realización de pruebas primarias: En la siguiente tabla, modificada del Cowan &
Steel's Manual of Identification of medical bacteria, se utilizan un grupo de pruebas,
denominadas pruebas primarias, con las cuales se puede determinar el género,
grupo de géneros o en algún caso familia a la que pertenece un aislamiento. Las
pruebas primarias son: Gram, morfología, catalasa, oxidasa, OF, esporas y
movilidad.
5) Realización de pruebas secundarias y terciarias a efectos de llegar a especie.
Estas dependen del género o familia determinado. (ej: producción de pigmentos,
producción de indol a partir de triptófano, producción de coagulasa, de fenilalanina
deaminasa, etc.)
En la primera prueba bioquímica Tinción de Gram, las bacterias en este caso
bacilos Gram negativas presentan dos membranas lipídicas entre las que se localiza
una fina pared celular de peptidoglicano. Aparte no retienen el colorante primario por
lo que se tiñen del colorante de contraste (safranina) = rojo
Por lo tanto al hacer la prueba de motilidad la prueba fue positiva ya que en el
despues del tubo de ensayo inoculado, el agar se torno turbio lo que indica que los
bacilos son móviles.
La prueba de citocromo oxidasa transfiere electrones de la cadena de transporte de
electrones al oxígeno (el aceptor final de electrones) y lo reduce a agua. En la
prueba de oxidasa se proporcionan moléculas donantes y aceptores artificiales de
electrones.
Cuando el donador de electrones se oxida por la acción de la citocromo oxidasa, el
medio se vuelve púrpura oscuro y se considera un resultado positivo pero para esta
bacteria el papel con solución N,N,N,N Tetrametil-p fenilendiamina se tornó sin
cambio de color por lo tanto la bacteria no posee la enzima oxidasa vinculada con la
respiración bacterias anaerobias.
La prueba de catalasa es una prueba simple utilizada por los microbiólogos para
ayudar a identificar especies de bacterias y para determinar la capacidad de algunos
microbios para descomponer el peróxido de hidrógeno mediante la producción de la
enzima catalasa. Si se observan burbujas de oxígeno significa que la bacteria posee
la enzima catalasa, porque esta cataliza la descomposición del peróxido de
hidrógeno en oxígeno y agua. Por lo tanto es una bacteria aerobia.
En la prueba oxido/fermentación es referente al metabolismo de un glúcido puede
seguir la vía oxidativa o fermentativa. En vía oxidativa el aceptor final de electrones
debe ser el oxígeno y por consiguiente el proceso es aerobio y produce poca acidez,
mientras que en vía fermentativa el aceptor final de electrones es un compuesto
orgánico y el proceso es anaerobio, originando mucha acidez en poco tiempo.
La fermentación u oxidación del glúcido se puede ver en dos tubos con medio de
cultivo glucosado, uno abierto (aerobio) y otro cerrado con parafina (anaerobio).
Como los dos tubos tornaron de color amarillo por lo tanto es vía fermentativa
facultativo.
Ahora bien con estas pruebas bioquímicas primarias se determina el género de
nuestra cepa bacteriana problema, para eso existe una tabla:
Por lo tanto el género de la cepa problema acorde a las respuestas de la pruebas
bioquímicas experimentales es Enterobacterias.
Siguen las pruebas bioquímicas secundarias:
La prueba de citratos es un medio definido, selectivo y diferencial que prueba la
capacidad de un organismo para usar citrato como única fuente de carbono e iones
de amonio como única fuente de nitrógeno, Sólo las bacterias capaces de
metabolizar el citrato podrán multiplicarse en este medio y liberarán iones amonio lo
que, junto con el metabolismo del citrato, generará una fuerte basificación del medio
que será aparente por un cambio de color del mismo de verde a azul pero en este
caso fue negativa por que no ocurrió el cambio de vire en el medio.
(MIO) describe cada uno de los parámetros que se pueden observar en este medio;
motilidad, indol y ornitina. Motilidad fue positivo por lo tanto tiene presencia de
flagelos, la prueba de indol con gotas de reactivo Ehrlich que contiene
p-dimetilaminobenzaldehído esta prueba fue negativa o por lo menos no se alcanzo
a distinguir ya que no se formó un anillo de color rojo en la parte superior del agar.
La enzima ornitina descarboxilasa actúa sobre el grupo carboxilo del aminoácido
produciendo una amina llamada putrescina que alcaliniza nuevamente el medio y
para relevar la respuesta se utiliza indicador púrpura de bromocresol el cual vira a
morado completamente y esto indica que ocurre una descarboxilación de ornitina,
prueba positiva.
La prueba KIA contiene lactosa y glucosa son los hidratos de carbono fermentables,
el tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la producción de ácido sulfhidrico
los cuales se combinan y producen sulfuros que es de color negro, que es la
respuesta de la prueba. El rojo de fenol es el indicador de pH el cual debería virar a
amarillo cuando la respuesta es positiva ya que se realizó la fermentación de
azúcares que producen ácidos, esta prueba es negativa.
La prueba SIM medio de cultivo en el cual la tripteina y la peptona aportan nutrientes
para el desarrollo microbiano metabolismo, la prueba da tres respuestas la
producción de sulfuro de hidrógeno (H2S), la formación de indol y la motilidad. En
motilidad es positiva en la prueba de indol con gotas de reactivo Ehrlich que
contiene p-dimetilaminobenzaldehído de igual manera positiva ya que se formó una
anillo de color rojo en la superficie en cambio de la de sulfuro de hidrógeno una vez
formado el H2S-gas incoloro-, este reacciona con la sal de hierro presente en el
medio, formando sulfuro ferroso, claramente visible (precipitado negro). Las
bacterias que no forman H2S, dejan el medio del color original amarillo claro por lo
tanto la producción de H2S es negativa.
La última prueba se realiza en el medio de cultivo líquido llamado rojo de
metilo–Voges Proskauer, mejor conocido con las siglas RM/VP. Este medio está
compuesto por poli peptona tamponada, glucosa, fosfato dipotásico y agua destilada
con el fin de obtener ciertas enzimas y vías metabólicas. El test se fundamenta en la
capacidad que tiene el microorganismo de utilizar la glucosa por la vía
butilén-glicólica, y formar un producto final neutro denominado acetoína, en
presencia de oxígeno y de un pH alcalino. El α-naftol es un catalizador que
aumentará la intensidad del color de la reacción y en contacto con el oxígeno. De
esta manera la acetoína presente se oxida a diacetilo y otra reacción que ocurre es
el hidróxido de potasio o de sodio se encarga de absorber el CO2 y de reaccionar
con las peptonas. Esta reacción origina la formación de un color rosado-salmón, por
lo tanto si la prueba fuera positiva el medio estaría de color rosado, no fue así no
contiene la enzima y no requiere de oxígeno respectivamente entonces la prueba es
negativa.
Con las respuestas experimentales de las pruebas bioquímicas secundarias y
tomando en cuenta el género del microorganismo Enterobacterias y con las pruebas
secundarias se obtiene que el microorganismo es Escherichia Coli.
CONCLUSIONES
Al finalizar esta práctica podemos concluir con la importancia de conocer Las
diferencias estructurales con respecto a la forma, el tamaño y la disposición de las
bacterias en el proceso de identificación, porque hay muchas especies de bacterias
que tienen forma, tamaño y disposición similares.
Por esta razón, en última instancia la identificación de las bacterias se basa
principalmente en las diferencias de sus actividades bioquímicas.
Cada especie de bacteria tiene un conjunto bien definido de actividades metabólicas
diferentes de todas las demás especies. Estas “huellas” bioquímicas son
propiedades controladas por las enzimas bacterianas.Así, las pruebas bioquímicas
son importantes porque ayudan al investigador a identificar correctamente los
patógenos presentes en una muestra y, de esta manera, poder recomendar el
tratamiento adecuado al paciente.
REFERENCIAS
● Prescott, L.M., Harley, J.P. & Klemm, D.A. (2005). Microbiology. (6a
edición).México:McGraw Hill
● Nelson, D.L. & Cox, M.M. (2007). Lehninger: principios de bioquímica (5a
edicion). Barcelona:Omega.
● Lovitt, R.W.,Wright, C.J. Light microscopy.Encyclopedia of Food Microbiology,
2014,3,684-692.
● Gunning, P.A: Light microscopy: principles and applications to food
microstructure.Food microstructures.Microscopy, measurement and modeling
2013,254:62-95.
● Bailón Lira Lucia, Gonzales Meléndez Roberto Cruz, Cervantes Sandoval
Armando. 2003. Atlas de Pruebas Bioquímicas para identificar Bacterias.
Facultad de estudios superiores Zaragoza. Universidad Autónoma de México.
● Forbes, Sahm, Weissfeld. 2007. Bailey & Scott Diagnóstico microbiológico.
12ª Edición.
● Collins C. H. y Lyne M. P, 1989, Métodos microbiológicos, Acribia, España,
pp 35-56.
● Silva García, M. d., García Bermejo, M. J., Del Castillo Torres, L., Ania
Palacio, J. M., & Gómez Martínez, D. (2006). Técnico Especialista en
Laboratorio (Segunda edición ed.). Sevilla, España: Editorial MAD.
ANEXOS
Metabolismo de carbohidratos: glucólisis y la vía de la pentosa fosfato Si la célula
requiere más NADPH que moléculas de ribosa, puede derivar los productos de la
fase no oxidativa de la vía de la pentosa fosfato hacia la glucólisis. Como ilustra el
esquema general de las dos vías, el exceso de ribulosa-5-fosfato puede convertirse
en los intermediarios glucolíticos fructosa-6-fosfato y gliceraldehído-3-fosfato.
LOS CARBOHIDRATOS TIENEN NUMEROSAS FUNCIONES CRUCIALES EN
LOS PROCESOS METABÓLICOS DE LOS SERES VIVOS. SIRVEN COMO
FUENTES DE ENERGÍA Y como elementos estructurales de las células. Este
capítulo se enfoca en el estudio de una de las funciones de los carbohidratos, la
producción de energía. En virtud de que el monosacárido glucosa es una fuente de
energía notable en casi todas las células, se hace gran énfasis en su síntesis,
degradación y almacenamiento.
Las células se encuentran en un estado de actividad incesante. Para mantenerse
“vivas”, las células dependen de reacciones bioquímicas complejas y muy
coordinadas. Los carbohidratos son una fuente importante de la energía que
impulsa estas reacciones. En este capítulo se revisan las vías del metabolismo de
los carbohidratos. Durante la glucólisis, una vía antigua que se encuentra en casi
todos los organismos, se captura una cantidad pequeña de energía al convertir una
molécula de glucosa en dos moléculas de piruvato. El glucógeno, una forma de
almacenamiento de glucosa en los vertebrados, se sintetiza por glucogénesis
cuando la concentración de glucosa es alta y se degrada por glucogenólisis cuando
el aporte de glucosa es insuficiente. La glucosa también puede sintetizarse a partir
de precursores distintos de los carbohidratos por medio de reacciones denominadas
gluconeogénesis. La vía de las pentosas fosfato permite a las células convertir la
glucosa-6-fosfato, un derivado de la glucosa, en ribosa-5-fosfato (el azúcar que se
utiliza para sintetizar los nucleótidos y los ácidos nucleicos) y en otras clases de
monosacáridos; en esta vía también se produce NADPH (fosfato de dinucleótido de
nicotinamida y adenina reducido), un agente reductor celular importante. En el
capítulo 9 se considera el ciclo del glioxilato, utilizado por algunos organismos
(principalmente plantas) para producir carbohidratos a partir de ácidos grasos. En el
capítulo 13 se describe la fotosíntesis, un proceso en el cual se captura energía
lumínica para impulsar la síntesis de carbohidratos.
La síntesis y la utilización de la glucosa, el combustible principal de la mayoría de
los organismos, son el centro de cualquier exposición sobre el metabolismo de los
carbohidratos. En los vertebrados, la glucosa se transporta en la sangre por todo el
cuerpo. Cuando las reservas de energía celular son bajas, la glucosa se degrada
por la vía glucolítica. Las moléculas de glucosa que no se requieren para producir
energía inmediata se almacenan en forma de glucógeno en el hígado y en los
músculos.
También existen otros tipos de pruebas bioquímicas más específicas para
diferenciar un microbio de otro, muy útiles como herramienta de laboratoria ya que
algunas pruebas son de respuesta inmediata y otras requieren unos ciertos minutos
y a ciertas condiciones, sin embargo, son muy utilizadas en el ámbito microbiológico
aquí son algún ejemplo de esas:
Coagulasa
Coágulos formados por la reacción de la coagulosa en un tubo de ensayo.
Estudia la producción del enzima coagulosa, capaz de coagular el plasma.
Diferencia Staphylococcus aureus de otras especies.
Ureas
Estudia si el microorganismo posee el enzima ureasa que cataliza la hidrólisis de la
urea.
Reducción Nitratos
Estudia la capacidad de los microorganismos para reducir los nitratos por la
presencia de un conjunto de enzima denominado nitrato reductasa
β - D - Galactosidasa
Estudia la capacidad de producir β - D - galactosidasa, enzima necesario para
metabolizar la lactosa.
Descarboxilasas
Estudia si el microorganismo produce los enzimas que descarboxilan los
aminoácidos presentes en el medio.
