ESCUELA SUPERIOR POLITÉCNICA DEL LITORAL
FACULTAD DE INGENIERÍA EN MECÁNICA Y CIENCIAS DE LA
PRODUCCIÓN
INGENIERÍA EN ALIMENTOS
Microbiología de Alimentos
Tema: Explicación química molecular de la adaptación de la bacteria Lactobacillus
casei a las diferentes condiciones endógenas y exógenas de crecimiento.
Profesora: MSc. María Fernanda Morales
Integrantes:
Arianna Centeno
Evelyn Chumo
Ronald Intriago
Luis Mora
Fecha de entrega:
Miércoles 16 de Enero 2019
II TERMINO 2018-2019
HIPÓTESIS
La bacteria Lactobacillus casei es un microorganismo probiótico capaz de crecer
exponencialmente aún en condiciones de éstres debido a su capacidad de adaptación y
supervivencia.
RESUMEN DE PAPER
Tema: Production of L(+) Lactic Acid using Lactobacillus casei from Whey.
El suero, el líquido translúcido verdoso obtenido de la leche después de la precipitación de la
caseína, se ha visto como uno de los principales problemas de eliminación de la industria láctea,
debido a los altos volúmenes producidos y que tienen una demanda bioquímica de oxígeno alta.
Entre los nutrientes más abundantes en el suero, se encuentran la lactosa, las proteínas solubles,
los lípidos y las sales minerales. Actualmente, las sustancias que contienen almidón o azúcar se
utilizan para la producción de ácido láctico. Sin embargo, el suero de leche derivado de lactosa
puede ser un sustrato de bajo costo para la producción de ácido láctico. Por ende, la disponibilidad
del reservorio de carbohidratos de lactosa en el suero y la presencia de otros nutrientes esenciales
para el crecimiento de microorganismos hace que el suero sea uno de los posibles sustratos para
la producción de diferentes productos biológicos a través de medios biotecnológicos.
El presente trabajo, por lo tanto, se llevó a cabo para optimizar las condiciones del proceso de
fermentación para la conversión eficiente de lactosa en suero usando una cepa de Lactobacillus
casei NBIMCC 1013 y evaluando el efecto de diferentes parámetros del proceso, como el pH del
medio, la temperatura, el tamaño del inóculo, la edad del inóculo, la agitación y el tiempo de
incubación aplicados para mejorar la conversión de la lactosa en el suero a ácido láctico L (+).
Materiales y Métodos
- Microorganismo: Lactobacillus casei
- Medio: Caldo de MRS con pH de 6.2
- Preparación del cultivo indicador: El cultivo bacteriano se cultivó en 50 ml de medio MRS
en 250 ml de matraz Erlenmeyer. Después de la esterilización, el medio se inoculó con un asa
de siembra de células de cultivo inclinado de agar y se incubó a 37 ° C durante 24 h bajo
condiciones estacionarias.
- Medio de Fermentación: El suero en polvo de SigmaChemicals Company ([Link].) se
reconstituyó (6%, p/v) con agua para preparar suero líquido que tiene una concentración de
lactosa de 4% (p/v).
La clarificación de las proteínas se llevo a cabo mediante calentamiento del suero por 90°C
por 20 minutos, las proteínas precipitadas se centrifugaron a condiciones 4000 rpm durante
15 min. Al suero se le añadió extracto de levadura (0,75%, p/v), sulfato de manganeso (20
mg/L), y carbonato de calcio (1.5%, p/v). El medio de suero de leche se esterilizó a 121 °C
durante 20 min. El medio de fermentación preparado de esta manera se utilizó para la
producción de ácido láctico.
Resultados y Discusión
Efecto del pH
El efecto del pH sobre la producción de ácido láctico se evaluó mediante el uso de medio de
fermentación que tiene un intervalo de pH de 5.0 – 6.8 (Figs.1 y 2). La conversión máxima de
lactosa (95%, p/v) y la producción de ácido láctico (33,48 g/L) se observó a pH 6.5.
Figura1: Producción de acido láctico
Figura 2: Producción de lactosa
A niveles de pH más altos y más bajos, se observó una disminución tanto en la función, con una
disminución insignificante a pH 6.0 y 6.8. Un intervalo de pH de 6.0 – 6.5 ha informado ser
óptimo para la producción de ácido láctico usando la cepa L. casei. Sin embargo, el pH 5.5 se ha
utilizado para la producción de ácido láctico usando L. helveticus en estudios anteriores.
Efecto de la edad del inóculo
Para encontrar el efecto de la edad del inóculo sobre la producción de ácido láctico se inoculó
medio de suero con cultivos de 16 - 28 horas. Se observó un aumento en la utilización de la lactosa
y la producción de ácido láctico cuando se usó un cultivo bacteriano de 16-20 h de edad. La
utilización de lactosa y producción de ácido láctico d 95.92% y 33.71 g/L, respectivamente, se
observaron con 20 h siendo esta la máxima producción obtenida.
La baja conversión de lactosa con la edad del inóculo de 16 h podría atribuirse al hecho de que
cultivo bacteriano no podría haber ingresado aún en su fase logarítmica de crecimiento.
Efecto del tamaño del inóculo
Para estudiar la influencia del tamaño de inóculo en la producción de ácido láctico, se añadieron
diferentes niveles de inóculo (1-5%, v/v) al medio de fermentación (Fig. 4). La utilización de
lactosa y la producción de ácido láctico aumentaron con el aumento del tamaño del inóculo hasta
un 2% (v/v), luego no se observó ninguna mejora en ambas funciones. Se observó una producción
máxima de ácido láctico de 33,72 g/L con un inóculo del 2-4% (v/v) del cultivo bacteriano. La
baja producción de ácido láctico a un nivel de inóculo del 1% (v/v) se podría atribuir a la baja
densidad del cultivo iniciador. De las observaciones anteriores, un inóculo de 2-4% (v/v) se podría
considerar óptima para lograr la máxima producción de ácido láctico utilizando un cultivo
bacteriano de 20h de edad.
Efecto de la temperatura
Para encontrar la temperatura óptima para la producción de ácido láctico, el medio de suero de
leche después de la inoculación se incubó a un rango de temperatura de 30-45 °C. La utilización
de lactosa y la producción de ácido láctico aumentaron con el aumento de la temperatura hasta 37
°C; sin embargo, se encontró una disminución insignificante en ambas funciones a 40 °C. Otras
temperaturas probadas muestran valores bajos de utilización de lactosa y la producción de ácido
láctico. La producción máxima de ácido láctico de 33,72 g/L se observó a 37 °C; sin embargo,
una temperatura de 28 ºC tambien resulto ser optimá para L. casei en otros estudios aparte. Esto
de debe a que las enzimas son más activas a una temperatura óptima y la reacción enzimática
avanza a una velocidad máxima. Sin embargo, por debajo y por encima de la temperatura óptima,
la velocidad de reacción disminuye, lo que causa problemas en el metabolismo celular.
Efecto de la agitación
Para estudiar el efecto de la agitación sobre la producción de ácido láctico por el cultivo
bacteriano, el cultivo se realizó en condiciones estacionarias (control) en una incubadora de
demanda biológica de oxígeno y condiciones de agitación (100 rpm) en un agitador orbital (Fig.
6). El modo de agitación del cultivo no admite ningún aumento en la conversión de lactosa en
comparación con el cultivo mantenido bajo condiciones estacionarias, lo que podría atribuirse a
la naturaleza microaerofílica de las bacterias.
Efecto del periodo de incubación
Para averiguar el tiempo óptimo de incubación para la utilización máxima de lactosa y la
producción de ácido láctico, el medio de suero de leche inoculado con cultivo bacteriano se incubó
durante 48 h en las condiciones optimizados anteriores. Las muestras se extrajeron a intervalos
de tiempo especificados (resultados en Fig. 7).
Como es evidente a partir de los resultados, se encontó un aumento en la utilización de lactosa y
la posterior producción de ácido láctico hasta las 36 h y después de ello no hubo ninguna mejora
en ambas funciones. Esto podría atribuirse al crecimiento de que el cultivo alcanzó la fase
estacionaria y, como consecuencia del metabolismo, los microorganismos cambian
continuamente las características del medio y el medio ambiente. A la producción de ácido láctico
máximo de 33,73 g/L con utilización de lactosa de 95.62% (p/v) se observó después de 36 h de
incubación. La reducción en el período de fermentación es, además, ventajoso para mejorar la
economía del proceso. Por lo tanto, un tiempo de incubación de 36 h se consideró óptima para la
máxima conversión de la lactosa a ácido láctico.
MARCO TEÓRICO
Bacteria ácido láctica Lactobacillus casei
Lactobacillus casei es una especie de bacteria que forma parte del grupo denominado bacterias
lácticas, por ser útil en la fermentación de productos que contienen leche, como yogurt y una
variedad de quesos como el parmesano y el manchego, entre otros. Su nombre “casei”, cuya
nomenclatura se relaciona principalmente con la palabra queso, es decir, de la palabra en latín
“caseus”, que significa queso, y también con la caseína, que es la principal proteína de la leche.
Se caracterizan por ser bacilos anaerobios tolerantes Gram positivos, inmóviles y no forman
esporas. Son más pequeños que otras especies, como por ejemplo L. bulgarícus, L. acidophilus y
L. helveticus, aunque algunos autores lo describen como bacilos de gran variabilidad en forma,
tamaño y agrupación con gran tendencia a formar cadenas.
CARACTERÍSTICAS CULTURALES
Lactobacillus casei habita en la mucosa oral e intestinal de los humanos. También se encuentra
distribuido ampliamente en el ambiente, en vegetales fermentados, carnes y leche. Por lo general
son heterofermentadores, es decir, que no solamente producen ácido láctico, si no también C02,
pequeñas cantidades de etanol y otras sustancias aromáticas.
En relación a la temperatura óptima de crecimiento es a 37°C, por lo tanto, son mesófilos, aunque
algunas subespecies puedan resistir altas temperaturas por un tiempo determinado, siendo además
un complemento al crecimiento de L. acidophilus, un productor de la enzima amilasa (una enzima
digestiva de carbohidratos en la saliva y jugo pancreático de mamíferos).
Se consideran anaerobios aerotolerantes, es decir, crecen perfectamente en condiciones de
anaerobiosis (sin oxígeno), pero pueden crecer en presencia de este. De igual forma obtendrán
ATP a través de la fermentación de carbohidratos. Su capacidad para resistir al oxígeno
dependerá de poder eliminar o degradar los dos productos altamente tóxicos que se derivan de la
utilización de oxígeno, tales como el peróxido de hidrógeno y el ion superóxido. Esto es posible
con la producción de enzimas como la catalasa y el superóxido dismutasa.
Esta especie particular de lactobacilo es muy resistente a rangos muy amplios de pH y las sales
biliares, pudiendo vivir en un rango de pH 3 a 7. Estas características son necesarias para poder
habitar el intestino. Algo importante es que para ejercer su acción probiótica en el intestino deben
estar en cantidades suficientes y viables para alcanzar los beneficios deseados. Entre las
principales características bioquímicas de algunas de las subespecies de L. casei se tiene:
- Lactobacillus casei sub-esp casei: Crece a 10-40ºC y fermenta Ribosa, Sacarosa, citrato y
piruvato.
- Lactobacillus casei sub-esp paracasei: Crece a 10-40ºC y fermenta gran variedad de
carbohidratos.
- Lactobacillus casei sub-esp tolerans: Crecimiento óptimo a 10- 37ºC, pero es capaz de resistir
temperaturas de 70ºC por 40 min. Fermenta muy pocos carbohidratos.
- Lactobacillus casei sub-esp D-Rhamnosus: Crece a 15- 45ºC y fermenta rhamnosa
Los miembros de este grupo carecen de porfirinas y citocromos, no realizan fosforilación
oxidativa y la energía que requieren la obtienen por fosforilación a nivel de sustrato. La mayor
parte de las bacterias lácticas puede obtener energía solo del metabolismo de los carbohidratos y
compuestos relacionados, por esta razón su hábitat debe contenerlos.
La capacidad biosintética de Lactobacillus casei es muy limitada. Sus requerimientos
nutricionales son complejos, pues para crecer necesitan la presencia de vitaminas, purinas y
pirimidinas. También requieren de ácido lipóico para su crecimiento, pues lo utilizan para forma
Acetil Coenzima A a partir de piruvato.
ESTRUCTURAS CELULARES
El Lactobacillus casei es una bacteria Gram positiva, no motil, es decir, no posee ningún medio
de locomoción. Sus células son bastones de 0.7-1.1 x 2.0-4.0 µm, y tiende a formar cadenas,
empalizadas o frecuentemente aislados y no presentan ramificaciones.
Pared Celular
El estudio de la pared celular en Lactobacillus casei se remonta a unos 50 años atrás investigando
sus componentes, el modo de unión, las estructuras y las propiedades serológicas relacionadas
aún continúa siendo objeto de investigación, abordando su estudio desde aspectos inmunológicos
relacionados con sus propiedades probióticas. La pared celular de bacterias lácticas posee la
estructura típica presente en las bacterias Gram positivas y está compuesta por un grueso saco de
múltiples capas de peptidoglicano decorado con proteínas, ácidos teicoicos y polisacáridos y
rodeado en algunas especies por una cubierta de proteínas formando una capa paracristalina (S-
layer). Específicamente, la pared presenta cuatro componentes:
- Peptidoglicano, también llamado mureína
- Ácidos teicoicos
- S-layer
- Polisacáridos
En las bacterias lácticas, las cadenas glicosídicas del peptidoglicano están formadas por un
polímero de un disacárido de N-acetil-glucosamina-β(1-4)-N-acetil-ácido murámico. Los puentes
que entrecruzan estas cadenas son pentapéptidos que usualmente alternan L- y D- aminoácidos.
La secuencia consenso es L- alanina/D- glutamato/meso- ácido diaminopicolínico o L- lisina/D-
alanina/D- alanina. Los ácidos teicoicos poseen una estructura global en donde una cadena de
residuos ribitol o glicerol unidos por enlaces fosfodiéster, se enlaza con una “unidad de ligación
terminal” que permite la fijación covalente al peptidoglicano. Sin embargo, los ácidos teicoicos
no están presentes en la pared de Lb. casei y la carga aniónica de la pared celular se debe
exclusivamente a los ácidos lipoteicoicos.
Figura 1. Estructura del peptidoglicano de Lb. casei.
Los ácidos lipoteicoicos al igual que los teicoicos son liposolubles, se encuentran asociados a la
membrana celular y están unidos de forma covalente al glicolípido de la membrana. Conforman
largas cadenas cargadas negativamente de poliglicerolfosfatos, siendo el principal sustituyente,
en bacterias del género Lactobacillus, el éster de D-Alanina, promoviendo funciones relacionadas
no sólo con la elasticidad, porosidad y mantenimiento de un medio iónico apropiado sino
también con el tráfico de iones, nutrientes, proteínas y antibióticos.
Membrana Plasmática
Se encuentra debajo de la pared celular y es de vital importancia para la célula, corresponden al
30% o más del peso celular. Contiene entre 60 y 70% de proteinas, entre 30 y 40 % de lípidos y
pequeñas cantidades de hidratos de carbono.
Está constituida principalmente por fosfatidilenetanolaminas (75%), el fosfatidilglicerol (20%) y
los glicolípidos; los esteroides por lo general están ausentes. Los glicolípidos incluyen
diglicosildiglicéridos, hallados principalmente en las membranas de bacterias Gram positivas que
también contienen ácidos lipoteicoicos. Al igual que las gran negativas, diversas actividades
enzimáticas se asocian con las proteínas de membrana, sistemas de transporte a través de la
membrana plasmática y varios sistemas de síntesis de polímeros.
ADN
Los ribosomas se presentan libres en el citoplasma con coeficiente de sedimentación de 70S. Se
presentan también como polirribosomas que son cadenas de ribosomas asociados a ARN
mensajero y en parte en relación con el ADN cromosómico. Contienen todos los componentes
que permiten la síntesis proteica. Las células poseen más ribosomas si están creciendo en medios
ricos. El alto contenido de ARN determina gran afinidad por los colorantes básicos.
El ADN está compuesto de una estructura fibrilar, constituida por una doble cadena, enrollado
sobre sí mismo. Si bien se asocia a proteínas básicas, estas no son verdaderas histonas. Los
mesosomas son, al parecer, invaginaciones de la membrana citoplasmática y participan en la
división celular y en la replicación de ADN.
La baja eficiencia de transformación de estos microorganismos es uno de los problemas más
importantes para fines de estudios científicos. La limitada transformabilidad es en parte
consecuencia de su gruesa pared celular, que es altamente resistente, pero también de su deficiente
sistema de recombinación. Debido a que las cepas probióticas de Lactobacillus son utilizadas
tanto para la producción de cultivos iniciadores o en formulaciones de alimentos funcionales es
deseable que no haya riesgos de transferibilidad de resistencia a antibióticos (RA) una vez que se
encuentra en el medio gastrointestinal, el cual coloniza.
ALIMENTOS PREFERIDOS
En la Industria Alimentaria existe una gran cantidad de bacterias que son muy importantes para
la elaboración de alimentos, tales como la leche y sus derivados. Por ejemplo, el yogurt requiere
de bacterias como Lactobacillus bulgaricus y Sreptetococcus salivarius.
Las bacterias ácido lácticas son importantes tanto para la producción de alimentos como para los
seres humanos ya que estudios científico certifican que estas baceteria cuidan la flora intestinal
ya que convierten el azúcar de los derivados de la leche en ácido lácticos. El Lactobacillus casei
es una bacteria que se encuentra generalmente en el intestino, en la boca, en el ambiente y en
ciertos alimentos vegetales como la leche fermentada la cual básicamente es un yogurt, en donde
la base de su fermentación es el L. casei. Esta leche fermentada, como se mencionó, es muy
similar al yogurt convencional puesto que tiene los mismo efectos y la forma de elaboración es la
misma e incluso cumple con la misma función; su diferencia se basa en que requiere de otras
bacterias para su elaboración como la ya mencionada L. casei. La bacteria L. casei es muy
utilizada en la industria láctea para elaborar los alimentos probióticos ya que consumir estos
productos son beneficiosos para la salud ya que contienen bacterias vivas que ayudan a preservar
el entorno saludable de nuestra digestión.
Otro producto muy conocido y consumido en la Industria Alimentaria es el queso del cual existen
diferentes clases y tipos y, dentro de su producción la L. casei tiene un papel importante siendo
capaces de fermentarlas completamente es decir cambia el azúcar de la leche o de sus derivados
en otras sustancias necesarias para el cuerpo, por ejemplo el queso petit suisse. Existen muchos
producto que contienen estas bacterias a los cuales se los conoces como alimentos con probióticos
como el kéfir que es muy similar al yogurt, el chucrut que básicamente es la fermentación de las
hojas de repollo de salmuera, los pepinos agridulces que tiene una gran cantidad de bacterias
benficiosas para el ser humano incluyendo L. casei, kombucha entre otros.
Consumir estas bacterias no realiza ningún efecto negativo dentro del cuerpo humano, gracias a
que contiene las misma propiedades y beneficios que un yogurt normal, Esta bacteria se encuentra
en las paredes del intestino, por tanto el ser humano puede asimilarla sin problemas y puede pasar
sin problemas a través de todos los procesos del aparato digestivo, que se encarga de eliminar
bacterias, es decir resiste a los jugos gástricos y esto se debe ya que estas bacteria son capaces de
resistir ph muy bajos como el de los jugos gástricos.
CONCLUSION
En la experimentación se pudo observar que el pH óptimo para la producción de ácido láctico
usando la cepa de L. casei es de 6.0 y 6.5. Por otro lado, si el pH subía más o bajaba de lo óptimo
la producción de ácido láctico disminuía. Referente al tiempo, se pudo demostrar que el tiempo
máximo de producción de lactosa es a las 20 horas, en cambio a las 16 horas era notoriamente
más bajo, esto se debe a que el crecimiento bacteriano no entra a la fase logarítmica, en cambio a
las 24 había una diferencia mínima con la de 20 horas y a las 28 horas se nota una cierta supresión
entonces a las 20 hora es el máximo alcance de producción láctica
El tamaño del inóculo también afecta a la producción de ácido láctico tomando como referencia
niveles de inoculo de 1-5 % (v/v), se concluyó que el inóculo óptimo para la producción de ácido
láctico es de 2-4 % pero por costos se utilizó el inoculo de 2%. La temperatura es muy importante
para la producción de ácido láctico, por esa razón se incubó en un rango de temperatura de 30 a
45 ºC. La producción de ácido láctico aumentaba a medida que aumentaba la temperatura hasta
los 37 ºC y a 40 ºC se observó una disminución significativa, esto se debe a que existe muchas
enzimas que son más activas dentro de su temperatura optima por encima o por debajo de esa
temperatura optima la actividad enzimática disminuye.
La agitación no mostro ningún cambio en la producción de ácido láctico a diferencia de
incubación estacionario como no tuvo ningún efecto se consideró como la más óptima. La
incubación bacteriana estuvo durante 48 horas y se mostró un constante aumento de la producción
láctica hasta las 36 h, esto se debe que hasta ese tiempo el cultivo a alcanzado su tope en la fase
estacionaria y luego de eso muchos factores cambian en el medio.
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